Gehalt an Flavonoiden während des Wachstums und der Blütenentwicklung von Calendula officinalis L.

Zusammenfassung

Hier stellen wir die kolorimetrische Aluminiumchlorid-Methode vor, eine direkte Analysetechnik zur quantitativen Bestimmung von Flavonoiden in Ringelblumen. Bei diesem Ansatz wird eine einfache chemische Reaktion verwendet, bei der der Ringelblumenextrakt mit einem Aluminiumchlorid-Reagenz behandelt wird, wodurch ein farbiger Komplex entsteht. Die Farbintensität, die mittels Spektrophotometrie bestimmt wird, korreliert mit der Flavonoidkonzentration.

Zusammenfassung

Ringelblume (Calendula officinalis L.) vielseitig verwendbar, insbesondere ihre medizinischen Anwendungen aufgrund ihres Reichtums und ihrer Vielfalt an sekundären Metaboliten wie Flavonoiden, die entzündungshemmende und antioxidative Eigenschaften besitzen. In dieser Studie wurden das Pflanzenwachstum und die Biomasseverteilung sowie die Gesamtflavonoidkonzentration in röhrenförmigen, ligulären Blüten und Blütenköpfen während der gesamten Blütenentwicklung analysiert. . Die Initiierung und Differenzierung der Blüten erfolgte fünf Wochen nach der Transplantation und folgte einem sigmoiden Muster der Biomasseakkumulation in den Organen sowie in der Pflanzenhöhe. Die Oberorgane erreichten am Tag 69 eine maximale Biomasse von 76 g/g/Pflanze. Die maximale absolute Wachstumsrate betrug 2,38 g/Tag nach 62 Tagen, während die höchste relative Wachstumsrate in den Fortpflanzungsorganen am Tag 48 (0,137 g/g/Tag) verzeichnet wurde. Flavonoide, ausgedrückt als Quercetin-Äquivalente, zeigten höhere Konzentrationen in Stadien, die von den kurz vor dem Öffnen stehenden Blütenknospen bis hin zu vollständig geöffneten Blütenköpfen reichten (145-177 mg/g Trockenmasse). Diese Ergebnisse unterstreichen, wie wichtig es ist, in optimalen Stadien zu ernten, um den Flavonoidgehalt zu maximieren und ihr Potenzial für therapeutische und kommerzielle Anwendungen zu nutzen.

Einleitung

Das wachsende Interesse an Sekundärmetaboliten aus Heilpflanzen wird durch ihre vielfältigen Anwendungen in der pharmazeutischen, therapeutischen, kosmetischen und anderen Industrie vorangetrieben. Zu ihnen gehört Calendula officinalis L., eine einjährige krautige Pflanze aus der Familie der Asteraceae, die im Mittelmeerraum beheimatet^{ist 1} , aber weltweit weit verbreitet ist und aufgrund der vielfältigen Verwendungsmöglichkeiten ihrer Blüten Anerkennung erlangt hat, darunter dekorative, medizinische, industrielle und kulinarische Anwendungen². Derzeit ist England der weltweit größte Produzent von C. officinalis³.

Die Blütenköpfe sind das am meisten genutzte Organ dieser Pflanze, da sie bioaktive Verbindungen wie Flavonoide, Carotinoide, Terpenoide, ätherische Öle, Tannine, Cumarine, Kohlenhydrate und Fettsäuren^enthalten 3,4,5,6. Diese natürlichen Verbindungen tragen zu seinen pharmakologischen Eigenschaften bei, einschließlich entzündungshemmender, antioxidativer, antimikrobieller und wundheilender Wirkung⁷. In der Vergangenheit wurde C. officinalis, allgemein bekannt als Ringelblume, in der traditionellen Medizin wie Ayurveda und Homöopathie zur Linderung einer Vielzahl von Beschwerden eingesetzt, von Hautwunden und Magen-Darm-Erkrankungen bis hin zu Menstruationsstörungen und entzündlichen Erkrankungen⁸. Moderne Anwendungen erstrecken sich auf die Pharma-, Lebensmittel- und Kosmetikindustrie, wo Ringelblumenextrakte in Cremes, Seren, Tinkturen und Arzneimittelverabreichungssysteme eingearbeitet werden⁹. Trotz umfangreicher Forschung gibt es nach wie vor Herausforderungen, wenn es darum geht, das therapeutische Potenzial von C. officinalis voll auszuschöpfen. Die Variabilität in der Konzentration bioaktiver Verbindungen aufgrund von Umwelt- und Anbaufaktoren unterstreicht die Notwendigkeit standardisierter Extraktions- und Formulierungsprozesse. Die biologische Aktivität von Flavonoiden und ihre Identifizierung in pflanzlichen Geweben sind wesentliche Aspekte der Qualitätskontrolle^10,11.

In Mexiko wird die Ringelblume oft ohne ein detailliertes Verständnis ihrer Wachstumsprozesse und ihrer Blütenentwicklung angebaut, was ihre physiologische Leistung, ihren Ertrag und die Korrelation zwischen bioaktiven Verbindungen und agronomischen Faktoren einschränkt. Die Konzentration und Verteilung von Flavonoiden im Pflanzengewebe wird von den Wachstums- und Kultivierungsbedingungen beeinflusst, was die Bedeutung der Untersuchung der physiologischen und Entwicklungsprozesse dieser Art unterstreicht.

Ziel dieser Studie war es, die Biomasseverteilung und die Senken-Quell-Beziehungen in vegetativen und Fortpflanzungsorganen von C. officinalis zu analysieren, Schlüsselereignisse in der Blütenentwicklung zu identifizieren und die Gesamtflavonoidkonzentration in Blütenköpfen mit Hilfe einer hier vorgeschlagenen mikrospektrophotometrischen Methode zu quantifizieren. Die Ergebnisse zielen darauf ab, die landwirtschaftlichen Praktiken zu optimieren und die Qualität der aus dieser Pflanze gewonnenen Produkte zu verbessern.

Protokoll

1. Allgemeine Materialien und Methoden

1. Feldversuch zum Nachweis der Blüteninitiation
   1. Richten Sie das Experiment unter Feldbedingungen ein. Verpflanzen Sie Ringelblumensetzlinge auf einer Fläche von 153^m2 mit einer Pflanzdichte von Pflanzen pro Quadratmeter im Abstand von 60 cm.
   2. Einrichtung des lokalisierten Tropfbewässerungssystems mit 16/8000 Gauge HINWEIS: Die in diesem Experiment verwendete Saatgutpartie wurde von einem einzigen Genotyp geerntet und dann durch die Massenselektionszuchtmethode in drei vorangegangenen Anbauzyklen ausgewählt. In einem gemäßigten Klima ist die Aussaat am besten im Frühjahr, gefolgt von einem Umtopfen etwa 2 Monate später, wenn die Sämlinge fertig sind. Eine Irrigation wird einmal pro Woche empfohlen. Schädlinge und Krankheiten sollten vermieden werden, und das agronomische Management sollte auf der Grundlage der Bedürfnisse der Pflanzen durchgeführt werden.
2. Entnehmen Sie alle zwei Tage Proben von ausgewählten Pflanzen, beginnend 14 Tage nach dem Umpflanzen. Suchen Sie unter einem stereoskopischen Mikroskop (ca. 40x) nach dem apikalen Meristem, um das Datum des Auftretens des Blütenstandsprimordiums zu bestimmen.
   HINWEIS: Wenn das Blütenmeristem (FM) in mindestens der Hälfte der Proben auftritt, kann dieses Datum als das richtige Alter für FM aufgezeichnet werden. Die experimentelle Einheit zur Beobachtung der Blüteninitiierung bestand aus fünf Meristemen in einer einzigen Pflanze mit acht Replikationen (Pflanzen). Analyse des Wachstums und der Blütenentwicklung
   1. Sammeln Sie das apikale Kapitulum, wenn sich die Blütenknospe öffnet.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die ligulierten Blüten sichtbar sind.
   2. Führen Sie während der letzten sieben Blütenphasen Blütenorgansammlungen durch¹² (Abbildung 1).
      HINWEIS: In diesem Experiment wurden in jedem phänologischen Stadium fünf Capitulen von acht verschiedenen Pflanzen verwendet. In allen Fällen wurden die Blüten aus dem apikalen Teil der Pflanze gesammelt.
   3. Probiere ganze Pflanzen sechsmal durch den biologischen Zyklus.
   4. Trocknen Sie die gesammelten Proben 48 h lang. Messen Sie das Trockengewicht der vegetativen und Fortpflanzungsorgane.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, bei 40 °C im Umluftofen zu trocknen.
   5. Berechnen Sie die Sinkstärke (SS) und die Sinkaktivität (SA) sowohl für die vegetativen als auch für die Fortpflanzungsorgane¹³.
      HINWEIS: Verwenden Sie für SS und SA die Formeln, die der absoluten Wachstumsrate (AGR) bzw. der relativen Wachstumsrate (RGR) entsprechen.
   6. Zeichnen Sie Wachstumskurven mit einer Tabelle.

2. Quantifizierung der Gesamtflavonoide¹⁴

1. Trocknen Sie das Pflanzenmaterial im Umluftofen bei 40 °C für 48 h.
2. Bewahren Sie das getrocknete Material in Papiertüten auf. Bewahren Sie sie im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT) auf.
3. Frieren Sie das Pflanzenmaterial mit flüssigem Stickstoff ein, um es für das Mahlen vorzubereiten.
4. Mahlen Sie das gefrorene Material in einem Porzellanmörser, bis es eine gleichmäßige Textur erreicht.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit flüssigem Stickstoff, da dieser bei Kontakt mit dem Pflanzenmaterial spritzen kann.
5. Probenvorbereitung: Wiegen Sie 25 mg pulverisierte Trockenmasse aus jeder Probe. 500 μl 80%iges Methanol zugeben.
6. Extraktion von Flavonoiden: Inkubieren Sie die Mischung im Ultraschall bei 70 °C für eine h. Dann zentrifugieren Sie es bei 731 g für 13 min¹⁵.
7. Aliquote vorbereiten: Nehmen Sie 150 μl des erhaltenen Extrakts und fügen Sie 37 μl 80%iges Methanol hinzu.
8. Mischen Sie 50 μl des Extrakts, 100 μl 10 % Aluminiumchlorid und 100 μl 1 M Kaliumacetat. Fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 5 ml zu bringen.
9. Lassen Sie die Lösung 30 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.
10. . Mit einem Spektralphotometer wurde die Extinktion bei 415 nm gemessen.
11. Kalibrierkurve erstellen: Bereiten Sie eine Stammlösung vor, indem Sie 2,7 mg Quercetin in 10 ml 80%igem Methanol lösen. Bereiten Sie aus diesem Stamm eine Reihe von 5 Quercetinlösungen im Bereich von 50, 100, 175, 250 und 350 μl vor und verdünnen Sie sie auf 10 ml.
12. Kalibrierproben vorbereiten: Für jede Quercetinlösung (500 μl) fügen Sie 100 μl 10 % Aluminiumchlorid und 100 μl 1 M Kaliumacetat, 1,5 ml 80 % Methanol und 2,8 ml destilliertes Wasser hinzu.
13. Lassen Sie die Lösung 40 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.
14. Messen Sie die Extinktion der Kalibrierproben bei 415 nm mit dem Spektralphotometer. Notieren Sie die Absorptionswerte, um die Kalibrierkurve zu erstellen.
    HINWEIS: Vergleichen Sie die Gesamtkonzentration an Flavonoiden in Strahlenblüten, röhrenförmigen Blüten und ganzen Blütenköpfen. In diesem Experiment wurde ein vollständig randomisiertes Versuchsdesign mit fünf Wiederholungen pro Behandlung verwendet. Die Antwortvariable war die Konzentration von Flavonoiden; Die Behandlungsmittel wurden mit dem Tukey-Test verglichen (SAS Institute, 2003).

Ergebnisse

Das Wachstum von C. officinalis zeigte eine Kinetik der Akkumulation von sigmoider Biomasse in der gesamten Pflanze und ihren Organen. Diese Beobachtung stimmt mit Berichten anderer Autoren überein, die durchweg eine sigmoide Wachstumskurve aufweisen. Unter den Oberorganen reicherten die Stängel die meiste Biomasse (Abbildung 3). Das anfängliche Wachstum in allen oberirdischen Organen verlief langsam, wobei die Blüte und Knospenentwicklung am 41. Tag begannen. Am Tag 69 erreichte di...

Diskussion

Es wurden zwei Arten von Blüten identifiziert, ligulate und röhrenförmige Blüten (Abbildung 5). Wir fanden heraus, dass liguläre Blüten eine geringere Konzentration an Flavonoiden enthalten als röhrenförmige Blüten, mit Unterschieden zwischen 11% und 53%. Dies deutet darauf hin, dass röhrenförmige Blüten mehr Flavonoide anreichern als liguläre Blüten, da die röhrenförmigen Blüten mehr Biomasse und eine höhere Konzentration dieser Verbindungen aufweisen.

...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Umluftofen	Precision 17 GCA Corp.	N/A	Ausrüstung
Insektenreiniger	Alternagro N	/A	Bekämpfung von landwirtschaftlichen Schädlingen mit Pflanzenölen und -extrakten
Methanol in analytischer Qualität	Merck	822283	Reagenz
Nitrofoska Spezial 12+12+17+2 MgO+8 S	EUROCHEM	7/548/CEE,1999/45/CE	NPK - körniger Dünger enthält: Ammoniumnitrat, Ammoniumsalze, Phosphate, Calciumsalze, Kalium, in einigen Fällen Magnesium und Spurenelemente. 1H-Pyrazol, 3,4-Dimethyl-,phosphat (1:1)
PHC Healthy Start	PHC Mexico	N/A	PHC Healthy Start 12-16-12 ist ein Dünger zur Verbesserung der Pflanzenernährung, -farbe und -vitalität.
Quercetin	Sigma-Aldrich	204-187-1	Standardsubstanz