Gehalt an Flavonoiden während des Wachstums und der Blütenentwicklung von Calendula officinalis L.

Das wachsende Interesse an Sekundärmetaboliten aus Heilpflanzen wird durch ihre vielfältigen Anwendungen in der pharmazeutischen, therapeutischen, kosmetischen und anderen Industrie vorangetrieben. Zu ihnen gehört Calendula officinalis L., eine einjährige krautige Pflanze aus der Familie der Asteraceae, die im Mittelmeerraum beheimatet^{ist 1} , aber weltweit weit verbreitet ist und aufgrund der vielfältigen Verwendungsmöglichkeiten ihrer Blüten Anerkennung erlangt hat, darunter dekorative, medizinische, industrielle und kulinarische Anwendungen². Derzeit ist England der weltweit größte Produzent von C. officinalis³.

Die Blütenköpfe sind das am meisten genutzte Organ dieser Pflanze, da sie bioaktive Verbindungen wie Flavonoide, Carotinoide, Terpenoide, ätherische Öle, Tannine, Cumarine, Kohlenhydrate und Fettsäuren^enthalten 3,4,5,6. Diese natürlichen Verbindungen tragen zu seinen pharmakologischen Eigenschaften bei, einschließlich entzündungshemmender, antioxidativer, antimikrobieller und wundheilender Wirkung⁷. In der Vergangenheit wurde C. officinalis, allgemein bekannt als Ringelblume, in der traditionellen Medizin wie Ayurveda und Homöopathie zur Linderung einer Vielzahl von Beschwerden eingesetzt, von Hautwunden und Magen-Darm-Erkrankungen bis hin zu Menstruationsstörungen und entzündlichen Erkrankungen⁸. Moderne Anwendungen erstrecken sich auf die Pharma-, Lebensmittel- und Kosmetikindustrie, wo Ringelblumenextrakte in Cremes, Seren, Tinkturen und Arzneimittelverabreichungssysteme eingearbeitet werden⁹. Trotz umfangreicher Forschung gibt es nach wie vor Herausforderungen, wenn es darum geht, das therapeutische Potenzial von C. officinalis voll auszuschöpfen. Die Variabilität in der Konzentration bioaktiver Verbindungen aufgrund von Umwelt- und Anbaufaktoren unterstreicht die Notwendigkeit standardisierter Extraktions- und Formulierungsprozesse. Die biologische Aktivität von Flavonoiden und ihre Identifizierung in pflanzlichen Geweben sind wesentliche Aspekte der Qualitätskontrolle^10,11.

In Mexiko wird die Ringelblume oft ohne ein detailliertes Verständnis ihrer Wachstumsprozesse und ihrer Blütenentwicklung angebaut, was ihre physiologische Leistung, ihren Ertrag und die Korrelation zwischen bioaktiven Verbindungen und agronomischen Faktoren einschränkt. Die Konzentration und Verteilung von Flavonoiden im Pflanzengewebe wird von den Wachstums- und Kultivierungsbedingungen beeinflusst, was die Bedeutung der Untersuchung der physiologischen und Entwicklungsprozesse dieser Art unterstreicht.

Ziel dieser Studie war es, die Biomasseverteilung und die Senken-Quell-Beziehungen in vegetativen und Fortpflanzungsorganen von C. officinalis zu analysieren, Schlüsselereignisse in der Blütenentwicklung zu identifizieren und die Gesamtflavonoidkonzentration in Blütenköpfen mit Hilfe einer hier vorgeschlagenen mikrospektrophotometrischen Methode zu quantifizieren. Die Ergebnisse zielen darauf ab, die landwirtschaftlichen Praktiken zu optimieren und die Qualität der aus dieser Pflanze gewonnenen Produkte zu verbessern.

1. Allgemeine Materialien und Methoden

1. Feldversuch zum Nachweis der Blüteninitiation
   1. Richten Sie das Experiment unter Feldbedingungen ein. Verpflanzen Sie Ringelblumensetzlinge auf einer Fläche von 153^m2 mit einer Pflanzdichte von Pflanzen pro Quadratmeter im Abstand von 60 cm.
   2. Einrichtung des lokalisierten Tropfbewässerungssystems mit 16/8000 Gauge HINWEIS: Die in diesem Experiment verwendete Saatgutpartie wurde von einem einzigen Genotyp geerntet und dann durch die Massenselektionszuchtmethode in drei vorangegangenen Anbauzyklen ausgewählt. In einem gemäßigten Klima ist die Aussaat am besten im Frühjahr, gefolgt von einem Umtopfen etwa 2 Monate später, wenn die Sämlinge fertig sind. Eine Irrigation wird einmal pro Woche empfohlen. Schädlinge und Krankheiten sollten vermieden werden, und das agronomische Management sollte auf der Grundlage der Bedürfnisse der Pflanzen durchgeführt werden.
2. Entnehmen Sie alle zwei Tage Proben von ausgewählten Pflanzen, beginnend 14 Tage nach dem Umpflanzen. Suchen Sie unter einem stereoskopischen Mikroskop (ca. 40x) nach dem apikalen Meristem, um das Datum des Auftretens des Blütenstandsprimordiums zu bestimmen.
   HINWEIS: Wenn das Blütenmeristem (FM) in mindestens der Hälfte der Proben auftritt, kann dieses Datum als das richtige Alter für FM aufgezeichnet werden. Die experimentelle Einheit zur Beobachtung der Blüteninitiierung bestand aus fünf Meristemen in einer einzigen Pflanze mit acht Replikationen (Pflanzen). Analyse des Wachstums und der Blütenentwicklung
   1. Sammeln Sie das apikale Kapitulum, wenn sich die Blütenknospe öffnet.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die ligulierten Blüten sichtbar sind.
   2. Führen Sie während der letzten sieben Blütenphasen Blütenorgansammlungen durch¹² (Abbildung 1).
      HINWEIS: In diesem Experiment wurden in jedem phänologischen Stadium fünf Capitulen von acht verschiedenen Pflanzen verwendet. In allen Fällen wurden die Blüten aus dem apikalen Teil der Pflanze gesammelt.
   3. Probiere ganze Pflanzen sechsmal durch den biologischen Zyklus.
   4. Trocknen Sie die gesammelten Proben 48 h lang. Messen Sie das Trockengewicht der vegetativen und Fortpflanzungsorgane.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, bei 40 °C im Umluftofen zu trocknen.
   5. Berechnen Sie die Sinkstärke (SS) und die Sinkaktivität (SA) sowohl für die vegetativen als auch für die Fortpflanzungsorgane¹³.
      HINWEIS: Verwenden Sie für SS und SA die Formeln, die der absoluten Wachstumsrate (AGR) bzw. der relativen Wachstumsrate (RGR) entsprechen.
   6. Zeichnen Sie Wachstumskurven mit einer Tabelle.

2. Quantifizierung der Gesamtflavonoide¹⁴

1. Trocknen Sie das Pflanzenmaterial im Umluftofen bei 40 °C für 48 h.
2. Bewahren Sie das getrocknete Material in Papiertüten auf. Bewahren Sie sie im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT) auf.
3. Frieren Sie das Pflanzenmaterial mit flüssigem Stickstoff ein, um es für das Mahlen vorzubereiten.
4. Mahlen Sie das gefrorene Material in einem Porzellanmörser, bis es eine gleichmäßige Textur erreicht.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit flüssigem Stickstoff, da dieser bei Kontakt mit dem Pflanzenmaterial spritzen kann.
5. Probenvorbereitung: Wiegen Sie 25 mg pulverisierte Trockenmasse aus jeder Probe. 500 μl 80%iges Methanol zugeben.
6. Extraktion von Flavonoiden: Inkubieren Sie die Mischung im Ultraschall bei 70 °C für eine h. Dann zentrifugieren Sie es bei 731 g für 13 min¹⁵.
7. Aliquote vorbereiten: Nehmen Sie 150 μl des erhaltenen Extrakts und fügen Sie 37 μl 80%iges Methanol hinzu.
8. Mischen Sie 50 μl des Extrakts, 100 μl 10 % Aluminiumchlorid und 100 μl 1 M Kaliumacetat. Fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 5 ml zu bringen.
9. Lassen Sie die Lösung 30 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.
10. . Mit einem Spektralphotometer wurde die Extinktion bei 415 nm gemessen.
11. Kalibrierkurve erstellen: Bereiten Sie eine Stammlösung vor, indem Sie 2,7 mg Quercetin in 10 ml 80%igem Methanol lösen. Bereiten Sie aus diesem Stamm eine Reihe von 5 Quercetinlösungen im Bereich von 50, 100, 175, 250 und 350 μl vor und verdünnen Sie sie auf 10 ml.
12. Kalibrierproben vorbereiten: Für jede Quercetinlösung (500 μl) fügen Sie 100 μl 10 % Aluminiumchlorid und 100 μl 1 M Kaliumacetat, 1,5 ml 80 % Methanol und 2,8 ml destilliertes Wasser hinzu.
13. Lassen Sie die Lösung 40 Minuten bei Raumtemperatur ruhen.
14. Messen Sie die Extinktion der Kalibrierproben bei 415 nm mit dem Spektralphotometer. Notieren Sie die Absorptionswerte, um die Kalibrierkurve zu erstellen.
    HINWEIS: Vergleichen Sie die Gesamtkonzentration an Flavonoiden in Strahlenblüten, röhrenförmigen Blüten und ganzen Blütenköpfen. In diesem Experiment wurde ein vollständig randomisiertes Versuchsdesign mit fünf Wiederholungen pro Behandlung verwendet. Die Antwortvariable war die Konzentration von Flavonoiden; Die Behandlungsmittel wurden mit dem Tukey-Test verglichen (SAS Institute, 2003).

Das Wachstum von C. officinalis zeigte eine Kinetik der Akkumulation von sigmoider Biomasse in der gesamten Pflanze und ihren Organen. Diese Beobachtung stimmt mit Berichten anderer Autoren überein, die durchweg eine sigmoide Wachstumskurve aufweisen. Unter den Oberorganen reicherten die Stängel die meiste Biomasse (Abbildung 3). Das anfängliche Wachstum in allen oberirdischen Organen verlief langsam, wobei die Blüte und Knospenentwicklung am 41. Tag begannen. Am Tag 69 erreichte die Pflanze ihre maximale Biomasse von durchschnittlich 76 g pro Pflanze.

Das kinetische Verhalten der Sinkstärke (SS) für die Organe der Hauptpflanze wurde von der Bestäubung bis zu 77 Tage nach der Transplantation untersucht (Abbildung 3). Die Ergebnisse zeigen, dass die vegetativen Organe (Wurzel, Stängel, Blatt) weiter wuchsen, während sich die Blütenköpfe entwickelten. Daher gab es eine Konkurrenz um Nährstoffe zwischen vegetativen und Fortpflanzungsorganen. Vegetative Organe zeigten eine signifikant höhere SS als die Blütenköpfe. Die vegetativen Organe erreichten ihre maximale SS (2,2 g/Tag) an Tag 50, während die Fortpflanzungsorgane ihre höchste Wachstumsrate (0,64 g/Tag) an Tag 62 erreichten.
Die relative Wachstumsrate (RGR) der Ringelblume und ihrer Organe (Abbildung 4) nahm mit zunehmender Reife der Pflanze ab. Dieser Rückgang ist auf die proportionale Reduktion des meristematischen Gewebes der Pflanze zurückzuführen. Spitzenwerte der RGR wurden an Tag 48 in den Fortpflanzungsorganen beobachtet, die die schnellste Wachstumsrate (0,137 g/g/Tag) aufwiesen, während die vegetativen Organe die schnellste Wachstumsrate (0,16 g/g/Tag) viel früher, am Tag 21, aufwiesen. Die Fortpflanzungsorgane konnten die vegetativen Organe erst nach Tag 44 überholen. Von diesem Tag an reduzierte die Pflanze nach und nach die meristematische Aktivität für die Bildung von Blättern und erhöhte gleichzeitig die Aktivität der Fortpflanzungsmeristeme.

Die Blüteninitiation stellt den Übergang eines Meristems von vegetativ (nur Blätter produzierend) zu reproduktiv (Bildung von Blütenprimordien, die sich zu Blütenköpfen entwickeln) dar. Morphologisch vollzieht sich dieser Übergang schnell und ist unter dem Mikroskop visuell erkennbar durch den Wechsel von einer kleinen kuppelförmigen vegetativen Spitze zu einer größeren, spitzen Fortpflanzungsspitze mit kleinen seitlichen Vorsprüngen16. Eine solche Differenzierung beinhaltet histologische, physiologische und biochemische Veränderungen in den Spitzen17.

Bei Topfdotterblumenpflanzen, deren Blütenköpfe die primären Organe sind, die zu medizinischen und dekorativen Zwecken geerntet werden, erfolgte die Blüteneinleitung in der fünften Woche nach der Transplantation, wenn sie in den zentralen Hochtälern Mexikos angebaut wird (Tabelle 1).

Unterschiede in der Gesamtflavonoidkonzentration (ausgedrückt als Quercetin-Äquivalente) wurden zwischen den Stadien der Blütenentwicklung festgestellt. Die höchsten Gehalte wurden zwischen den Stadien acht und elf beobachtet, was den Knospen mit getrennten Kelchblättern bis hin zu vollständig geöffneten Blütenköpfen entspricht. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Ernte von Ringelblumenblütenköpfen zu therapeutischen Zwecken in diesen Phasen erfolgen sollte, um den Flavonoidgehalt zu maximieren. In früheren Stadien (Knospen mit vereinigten Kelchblättern) oder späteren Stadien (seneszente Blütenköpfe) waren die Flavonoidkonzentrationen um 22 % bis 27 % niedriger als bei vollständig geöffneten Blütenköpfen.

Betrachtet man die Flavonoidproduktion pro Pflanze (Tabelle 2), so ergaben die Stadien sieben und acht den höchsten Flavonoidgehalt in den Blütenköpfen. Diese Informationen sind für die kommerzielle Ringelblumenproduktion von Bedeutung, da sie nicht nur die maximale Ausbeute an Flavonoiden, sondern auch die Standardisierung für die Herstellung von Phytopharmaka ermöglichen.
Abbildung 1: Stadien der Blütenentwicklung bei Ringelblumen. Die Abbildung veranschaulicht die Stadien der Blütenentwicklung bei Calendula officinalis L., allgemein bekannt als Ringelblume. Es bietet eine visuelle Darstellung des Verlaufs vom anfänglichen Knospenstadium bis zur Seneszenz des Blütenkopfes und dem Beginn der Fruchtbildung (Achäne). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Kinetik der Biomasseverteilung in Ringelblume. Diese Abbildung zeigt, wie die Biomasse im Laufe der Zeit auf verschiedene Pflanzenorgane verteilt ist, und verdeutlicht die Veränderungen in der Biomasseakkumulation in verschiedenen Teilen der Pflanze, wie Stängeln, Blättern, Blüten und Wurzeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Sinkfestigkeitskinetik (SS) der vegetativen und Fortpflanzungsorgane in der Ringelblume über ihren Zyklus. Diese Abbildung zeigt, wie die Sinkstärke zwischen den Pflanzenorganen wie Stängeln, Blättern und Blüten vom Anfang bis zum Ende des Lebenszyklus der Pflanze variiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Kinetik der Sinkaktivität (SA) in vegetativen und fortpflanzungsfähigen Organen der Ringelblume entlang ihres Zyklus. Die Abbildung zeigt, wie sich das Aktivitätsniveau im Zusammenhang mit dem Ressourcenbedarf für verschiedene Pflanzenteile wie Stängel, Blätter und Blüten im Laufe der Zeit ändert. Sie spiegelt die Verschiebung der Sinkbewegungen der Pflanze von den frühen Wachstumsstadien zur Reife und Fortpflanzungsentwicklung wider. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Gesamtkonzentration der Flavonoide (mg/g Trockenmasse) während der Blütenentwicklung der Ringelblume. Die Abbildung zeigt die Mengen an Flavonoiden, die in der Trockenmasse der Ringelblumenblüten in verschiedenen Entwicklungsstadien vorhanden sind. Diese Kennzahl hilft zu lernen, wie sich der Flavonoidgehalt entwickelt, wenn die Blüten reifen. Die Ergebnisse sind die Mittelwerte, die mit dem Tukey's HSD-Test verglichen wurden (p > 0,05) n=5. Balken stellen den Standardfehler dar. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf deutliche Unterschiede hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Abfolge der Blütenentwicklungsereignisse in der Ringelblume. Diese Tabelle hilft, den Fortschritt der Blütenentwicklung bei Ringelblume zu verstehen, indem sie die Stadien von der ersten Knospenbildung bis zur vollen Blüte und Fruchtentwicklung (Achäne) beschreibt. *Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardfehler (n = 5) angezeigt. Laut Varianzanalyse zeigten sich signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen (p ≤ 0,05). Die unterschiedlichen Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede zwischen dem Tukey-Mittelwerttest hin ( α = 0,05, n = 5). ND: Nicht erkannt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Gesamtgehalt an Flavonoiden in Ringelblumenblütenköpfen während der gesamten Blütenentwicklung. Diese Tabelle zeigt, wie sich die Flavonoidkonzentration von der ersten Knospenbildung bis zur vollen Blüte und Fruchtentwicklung (Achäne) verändert. Die Daten zeigen die optimalen Stadien für die Ernte und die Maximierung des Flavonoidgehalts. Flavonoidproduktion (g/Pflanze) = [Trockengewicht des Blütenorgans (g/Pflanze) × Flavonoidkonzentration (mg/g) Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.