Profilierung von permethylierten Mucin-O-Glykanen mittels matrixgestützter Laserdesorption/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Freisetzung von O-Glykanen aus Muzinen und die anschließende Entsalzung, Permethylierung und Analyse mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie vor.

Zusammenfassung

Die matrixgestützte Laserdesorptions-/Ionisationszeit-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) ist ein leistungsstarkes Werkzeug für die Profilierung von Muzinglykanen, das eine hohe Empfindlichkeit und einen hohen Durchsatz bietet. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Analyse von O-verknüpften Glykanen aus Muzinen mittels MALDI-TOF MS zur Verfügung, das die Glykanfreisetzung, Entsalzung, Permethylierung sowie Datenerfassung und -analyse umfasst. Diese Studie zeigt, dass die Entsalzung auf Basis der Ionenaustauschchromatographie im Vergleich zur Festphasenextraktion mit porösem graphitiertem Kohlenstoff (PGC) zu einer verbesserten Rückgewinnung größerer Glykane und einer besseren Qualität der erzeugten Spektren führt. Darüber hinaus deutet diese Arbeit darauf hin, dass eine längere Permethylierungsreaktionszeit als derzeit für eine effiziente Modifikation von sialylierten Strukturen erforderlich sein könnte. Wir zeigen auch die Bedeutung und Notwendigkeit von Fragmentierungsdaten und Vorkenntnissen über die O-Glykan-Biosynthesewege für die genaue Identifizierung der Glykanzusammensetzung und -struktur auf und diskutieren die inhärenten Vorteile und Einschränkungen, die MALDI-TOF bei der Analyse von Mucin-O-Glykanen aufweist.

Einleitung

Muzine sind große Glykoproteine, die die meisten strukturellen Bestandteile im Schleim ausmachen. Sie werden von spezialisierten Epithelzellen, den sogenannten Becherzellen, produziert und durchlaufen eine umfangreiche O-Glykosylierung, bevor sie an der Schleimhautoberfläche sezerniert werden. Die Glykosylierung von Mucinen findet im Golgi-Apparat statt, wo eine Familie spezialisierter Glykosyltransferasen, Polypeptid-N-Acetylgalactosamintransferasen (ppGalNAc-T), den Prozess einleitet, indem sie einen GalNAc-Rest an ein Serin (Ser) oder ein Threonin (Thr)¹ anhängen. Dann erweitert ein Arsenal von Glykosyltransferasen die Glykanstrukturen durch Zugabe von Galaktose (Gal), N-Acetylglucosamin (GlcNAc), GalNAc, N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) und Fucose (Fuc)-Resten, während andere kohlenhydratmodifizierende Enzyme Reaktionen wie die Sulfatierung der Glykane durchführen können¹. Die Glykane, die das Rückgrat des Muzinproteins dekorieren, kommen hauptsächlich in Clustern in Proteinregionen vor, die reich an Ser- und Thr-Resten sind, da die Hydroxylgruppen auf der Seitenkette dieser Reste als O-Glykosylierungsstellen dienen. Diese dichte Glykosylierung verleiht den Muzinen das Aussehen einer "Flaschenbürste" und ist für ihre physikalischen Eigenschaften verantwortlich, wie z. B. die Fähigkeit, große Mengen Wasser zurückzuhalten, ihre gelbildende Fähigkeit und ihre hohe Viskoelastizität ^2,3. Aufgrund dieser Eigenschaften sorgen Muzine für Schmierung, schützen das Epithel vor Dehydrierung und körperlichen Verletzungen und bilden eine physikalische Barriere zwischen dem Epithel und seiner Mikroumgebung ^4,5. Mucinglykane können auch als Bindungsstellen und Kohlenstoffquelle für kommensale oder pathogene Bakterien dienen ^6,7,8. Die Organisation und Zusammensetzung des Schleims tragen maßgeblich zum Schutz des Epithels bei, indem Mikroben in der Nähe, aber von der Epitheloberfläche ferngehalten werden. Mucinglykane sind auch an der Zell-Zell-Kommunikation und -Adhäsion beteiligt⁹.

Mucin-Glykane spielen eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Mukosa-Homöostase, und aberrante Muzin-Glykosylierungsprofile sind mit einer beeinträchtigten Barrierefunktion, einer veränderten Mikrobiota-Zusammensetzung, einer erhöhten Tumormetastasierung, entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) und anderen Krankheiten verbunden 10,11,12. Daher ist die Untersuchung der Muzin-Glykosylierung wichtig, um die Rolle von Schleim und Muzinen für die menschliche Gesundheit zu verstehen und kann zu neuen Ansätzen für das Management oder die Behandlung von Krankheiten führen.

Massenspektrometrie-basierte Techniken gehören zu den beliebtesten Optionen zur Untersuchung von Muzinglykanen. MALDI-TOF MS ist eine weiche Ionisationstechnik, die die Analyse großer, nichtflüchtiger Biomoleküle wie Glykane und Glykoproteine ermöglicht¹³. Dieser Ansatz bietet eine hohe Empfindlichkeit und einen weiten Massenbereich, der den Nachweis und die Identifizierung von wenig häufigen und vielfältigen Glykangemischen ermöglicht. Darüber hinaus können die Fragmentierungsmuster, die aus Tandem-Massenspektrometrie-Experimenten (MS/MS) gewonnen werden, wertvolle strukturelle Informationen über die Glykanzusammensetzung und -sequenz^{liefern 13}.

Typischerweise umfasst die Analyse von O-verknüpften Glykanen aus Muzinen mittels MALDI-TOF MS einen mehrstufigen Arbeitsablauf, bei dem die O-Glykane zunächst chemisch aus dem Proteinrückgrat freigesetzt werden, indem Methoden wie die reduktive β-Eliminierung verwendet werden, dann entsalzt werden, um die Salze aus der chemischen Freisetzung zu entfernen, und derivatisiert werden, um die Ionisation und Detektion zu verbessern. Die gereinigten, derivatisierten Glykane werden anschließend mit einer geeigneten MALDI-Matrix auf einer MALDI-Zielplatte cokristallisiert und Massenspektren aufgenommen, die Aufschluss über die Massen der intakten Glykanionen geben. Anschließend werden die Glykane in MS/MS-Experimenten fragmentiert, um Informationen über die Struktur der Glykane^{zu erhalten 14}. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Freisetzung, Entsalzung und Permethylierung von Glykanen zur Verfügung und analysieren sie mittels MALDI-TOF MS.

Protokoll

HINWEIS: In Abbildung 1 finden Sie eine schematische Darstellung des Arbeitsablaufs.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des experimentellen Arbeitsablaufs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Freisetzung von Glykanen

1. Vorbereitung des β-Eliminationspuffers
   HINWEIS: Diese muss vor jedem Gebrauch frisch zubereitet werden.
   1. Wiegen Sie ein Pellet Natriumhydroxid (NaOH) und lösen Sie es in einer geeigneten Menge H₂O in einem 50-ml-Röhrchen auf, um eine 0,1 M-Lösung zu erhalten.
   2. In einem 5-ml-Röhrchen werden 189 mg Natriumborhydrid (NaBH₄) in 5 ml der oben in Schritt 1.1.1 hergestellten alkalischen Lösung gelöst.
      ACHTUNG: NaOH ist ätzend und NaBH₄ ist ätzend, giftig, brennbar und stellt eine Gesundheitsgefahr dar. Beide Chemikalien sollten unter einem Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung gehandhabt werden. NaBH₄ darf nicht direkt in H₂O gelöst werden, da es sich zersetzt und Wasserstoff freisetzt, der sich selbst entzünden kann.
2. Aufbau der β-Eliminationsreaktion
   1. In einem 4-ml-Glasfläschchen werden bis zu 100 μg gereinigte Muzine in 250 μl H₂O gelöst.
      HINWEIS: Einige Muzine lösen sich möglicherweise nicht vollständig auf und bilden stattdessen eine Suspension aus sehr kleinen Partikeln.
   2. Fügen Sie 250 μl des β-Eliminationspuffers hinzu und verschließen Sie das Fläschchen fest mit einer PTFE-ausgekleideten Kappe. Die Reaktion wird 16 Stunden lang bei 45 ^°C inkubiert.
3. Stoppen der Reaktion
   1. In einer 100-ml-Glasflasche 5 ml Eisessig zu 95 ml H₂O (5 % (v/v) Konzentration) hinzufügen.
      HINWEIS: Dies kann bei Raumtemperatur gelagert und wiederverwendet werden.  ACHTUNG: Essigsäure ist brennbar und ätzend und sollte in einem Abzug mit der erforderlichen persönlichen Schutzausrüstung verwendet werden.
   2. Auf Eis wird bei jeder Reaktion (Schritt 1.2.3) 1 ml der 5%igen Essigsäurelösung tropfenweise zugegeben. Achten Sie an dieser Stelle auf ein Aufschäumen durch die Freisetzung von Wasserstoff aus dem Überschuss an NaBH₄. Wenn das Aufschäumen nach der Zugabe von 1 ml 5%iger Essigsäure nicht aufgehört hat, wiederholen Sie diesen Schritt.
      HINWEIS: Wenn bei Zugabe von 5 % Essigsäure kein Aufschäumen auftritt, kann die β-Eliminationsreaktion unvollständig oder erfolglos sein.
4. Entsalzung der Proben
   1. Bereiten Sie in einer 100-ml-Glasflasche eine dichte Suspension aus Kationenaustauscherharz, H⁺ -Form, 200-400 mesh in 5 % (v/v) Essigsäure vor.
   2. Verstopfen Sie eine Glaspipette mit einer kleinen Menge Glaswolle. Geben Sie 1,5 mL der Harzsuspension von oben auf die Glaspipette und lassen Sie sie absetzen und abtropfen. Dadurch wird die Entsalzungssäule erstellt.
   3. Waschen Sie das Harz mit 2 mL 5%iger Essigsäure. Verwerfen Sie den Durchfluss.
   4. Geben Sie die Muzinprobe in die Entsalzungssäule. Sammeln Sie den Durchfluss in einem 5-ml-Röhrchen.
   5. Spülen Sie die Probengefäße mit 1 mL 5%iger Essigsäure und laden Sie diese in die Entsalzungssäule. Sammeln Sie den Durchfluss im selben Rohr.
   6. Waschen Sie die Säule 2x mit 1 mL 5%iger Essigsäure. Sammeln Sie den Durchfluss im selben Rohr.
   7. Verwenden Sie einen Zentrifugalverdampfer, um die Essigsäure zu entfernen und die Proben zu konzentrieren (5 mbar, 30 ^°C, 2 h).
   8. Frieren Sie die Proben bei -80 ^°C ein und trocknen Sie sie über Nacht in einem Gefriertrockner.
      HINWEIS: Alternativ kann die Zentrifugalverdunstung weiter trocknen, erschwert jedoch das erneute Auflösen der Proben.
   9. In einer 100-ml-Glasflasche 5 ml Essigsäure zu 95 ml Methanol (5 % (v/v) Konzentration) hinzufügen.
      ACHTUNG: Methanol ist brennbar und giftig. Es sollte in einem Abzug mit der erforderlichen persönlichen Schutzausrüstung verwendet werden.
   10. Die Proben werden in 0,5 mL Methanolessigsäure aufgelöst und unter einem Stickstoffstrahl getrocknet. Wiederholen Sie diesen Schritt 3-5x. Die getrockneten Proben werden bei 4 ^°C gelagert.
5. Permethylierung der Glykane
   1. Mischen Sie in einem 8-ml-Glasfläschchen 50% NaOH-Lösung (0,2 ml) mit 0,4 mL Methanol und wirbeln Sie es gründlich ein. Es bildet sich ein weißer Niederschlag, der sich schnell wieder auflöst.
   2. Mit einer Glasspritze 4 ml wasserfreies Dimethylsulfoxid (DMSO) zugeben und gründlich vortexen.
   3. Zentrifugieren Sie die Lösung 2 min lang bei 2.000 × g. Dadurch bildet sich ein Gel am Boden des Röhrchens, eine flüssige Phase in der Mitte und Salze an der Oberseite.
   4. Dekantieren Sie den Überstand und die Salze vorsichtig, ohne das Gel zu stören.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 1.5.2-1.5.4 5x, bis sich keine Salze mehr bilden. Wenn die Salze an den Wänden des Röhrchens kleben bleiben, schwenken Sie das Röhrchen vorsichtig, um die Salze in Suspension zu bringen, ohne das Gel am Boden zu stören, oder entfernen Sie sie mit einer Pasteurpipette aus Glas.
   6. Nachdem sich keine Salze mehr gebildet haben, resuspendieren Sie das Gel in 4 ml wasserfreiem DMSO. Diese Suspension ist die Permethylierungsbase.
      HINWEIS: Diese Menge an Permethylierungsbase reicht für ~25 Proben. Die Mengen können entsprechend angepasst werden.
   7. Zu den getrockneten Proben werden 100 μl wasserfreies DMSO und 150 μl der Permethylierungsbase gegeben. Fügen Sie mit einer Glaspipette so schnell wie möglich 80 μl Jodmethan hinzu, um eine Feuchtigkeitsaufnahme aus der Umgebung zu vermeiden.
      ACHTUNG: Jodmethan ist giftig und stellt eine Gefahr für Gesundheit und Umwelt dar. Es sollte in einem Abzug mit der erforderlichen persönlichen Schutzausrüstung verwendet werden.
   8. Die Permethylierungsreaktionen werden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter kräftigem Schütteln inkubiert.
   9. Fügen Sie 0,5 ml H₂O hinzu, um die Reaktion zu beenden. Die Proben werden trüb.
      HINWEIS: Wenn die Proben nicht trüb werden, ist es möglich, dass die Permethylierungsreaktion unvollständig war.
   10. Spülen Sie die Proben mit Stickstoff, bis sie klar sind.
   11. Laden Sie die Proben auf eine hydrophil-lipophil-ausgewogene (HLB) 96-Well-Extraktionsplatte (60 mg) oder HLB-Kartuschen. Üben Sie Überdruck aus, um die Proben mit einer Flussrate von ~1 mL/min durch die feste Phase zu drücken. Wenn Sie HLB-Kartuschen verwenden, verwenden Sie einen Gummisauger oder einen Vakuumverteiler, um Druck auf die Proben auszuüben. Verwerfen Sie den Durchfluss.
   12. Spülen Sie die Vertiefungen mit 2 x 1 mL H₂O. Üben Sie Überdruck aus und verwerfen Sie den Durchfluss.
   13. Eluieren Sie die Glykane von der HLB-Platte mit 1 ml Methanol. Üben Sie nur so lange Druck aus, bis Methanol aus der Platte austritt. Dann reicht die Schwerkraftströmung aus, um die erforderliche Durchflussrate zu erreichen. Sammeln Sie den Durchfluss.
   14. Wiederholen Sie den Elutionsschritt noch einmal.
   15. Trocknen Sie die Proben mit einem Zentrifugalverdampfer
   16. Bereiten Sie in einer 4-ml-Durchstechflasche aus Glas TA50-Puffer vor, indem Sie 1 ml Acetonitril, 998 μl H₂O und 2 μl Trifluoressigsäure mischen.
       ACHTUNG: Acetonitril ist brennbar und Trifluoressigsäure ist ätzend. Beide sollten in einem Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung verwendet werden.
   17. Bereiten Sie die Matrixlösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen vor, indem Sie 10 mg Super-DHB [9:1 (w/w) Gemisch aus 2,5-Dihydroxybenzoesäure und 2-Hydroxy-5-methoxybenzoesäure] in 1 ml TA50 auflösen.
   18. Die getrockneten Proben werden in 10 μl TA50 aufgelöst.
   19. Mischen Sie 1 μl der Probe mit 1 μl der Matrixlösung, tupfen Sie sie auf eine MALDI-Zielplatte aus Stahl und lassen Sie sie trocknen.

2. MALDI TOF-Analyse der Proben

1. Einrichten zum Abrufen von Eltern-Ionen-Daten
   1. Feuert 1.000 Schüsse mit dem Laser mit einer Intensität von 50 % ab.
      HINWEIS: Diese können je nach den globalen Geräteeinstellungen variieren und nach Bedarf angepasst werden.
   2. Legen Sie auf der Registerkarte Laserträger die Einstellung für den Random Walk auf Stichprobe abschließen fest.
   3. Legen Sie auf der Registerkarte Erkennung den Massenbereich auf 500 - 3.000 fest. Erhöhen Sie diesen Bereich, wenn starke Spitzen bei 2.500-3.000 m/z beobachtet werden. Stellen Sie die Detektorverstärkung auf 20x ein.
      HINWEIS: Die Verstärkung kann je nach den globalen Einstellungen des Geräts variieren und kann nach Bedarf angepasst werden.
   4. Stellen Sie auf der Registerkarte Spektrometer die Polarität auf positiv und die Matrixunterdrückung auf Ablenkung, 300 Da, ein.
   5. Klicken Sie auf Start | Sobald die Datenerfassung abgeschlossen ist, Speichern unter , um die Daten in einem geeigneten Verzeichnis zu speichern.
2. Öffnen der übergeordneten Spektren zur Erfassung von Fragmentierungsspektren
   1. Nachdem Sie mit der rechten Maustaste auf die Spektren geklickt haben, wählen Sie die Liste Masse suchen.
   2. Wählen Sie aus der generierten Liste die relevanten Ionen für die Fragmentierung aus und klicken Sie auf Zur MS/MS-Liste hinzufügen , nachdem Sie mit der rechten Maustaste auf die ausgewählten Peaks geklickt haben.
   3. Klicken Sie erneut mit der rechten Maustaste auf die Massenliste und wählen Sie MS/MS-Liste.
   4. Klicken Sie auf An flexControl senden.
   5. Laden Sie in flexControl die LIFT-Methode , und navigieren Sie zur Registerkarte LIFT .
   6. Wählen Sie jeden geladenen Peak nacheinander aus und erfassen Sie sowohl Eltern- als auch Fragment-Ionen, indem Sie zwischen dem Eltern- und dem Fragmentmodus wechseln. Passen Sie die Laserintensität und die Anzahl der Schüsse nach Bedarf an. Klicken Sie auf Speichern , um die Daten nach der Fragmentierung der einzelnen Eltern-Ionen zu speichern.
   7. Exportieren Sie die Spektren im '.ascII'-Format.
      HINWEIS: Dies kann später zur weiteren Analyse in Glycoworkbench importiert werden.
3. Datenanalyse mit glycoworkbench
   1. Laden Sie in Glycoworkbench die exportierte .ascII-Datei des Massenspektrums und führen Sie eine Basislinienkorrektur und Rauschfilterung mit den entsprechenden Schaltflächen am unteren Rand des Fensters durch, bevor Sie die Peak-Schwerpunkte berechnen. Wählen Sie im Popup-Fenster den entsprechenden Massenbereich, das minimale Signal-Rausch-Verhältnis und die minimale MS-Spitzenintensität aus.
   2. Nachdem die Peakschwerpunkte berechnet wurden, verwenden Sie das Werkzeug Glyko-Peakfinder , um Strukturzusammensetzungen zu finden, die der Peakliste entsprechen. Wählen Sie perMe als Derivatisierung, redEnd als reduzierendes Ende und die minimale und maximale Anzahl der erwarteten Reste aus.
      1. Wählen Sie für Muzine Hexose, N-Acetyl-Hexosamin, Desoxy-Hexose und N-Acetyl-Neuraminsäure. Für sulfatierte Glykane verwenden Sie die andere Rückstandsoption mit einer Masse von 87,9. Für MALDI-TOF-Daten stellen Sie Max # Na-Ionen und Max # Ladungen auf 1 und die Genauigkeit auf 0,5 Da ein.
         HINWEIS: Die Genauigkeit muss je nach Kalibrierung des Massenspektrometers möglicherweise weiter erhöht werden.
   3. Wählen Sie alle korrekten Anmerkungen aus, indem Sie die Strg-Taste gedrückt halten und auf die einzelnen Anmerkungen klicken. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf die Anmerkung und klicken Sie auf Zur Liste der annotierten Peaks hinzufügen.
   4. Um einen Bericht zu erstellen, in dem mehrere kommentierte Spektren verglichen werden, wählen Sie auf der Registerkarte "Werkzeuge " unter "Berichterstellung" die Option "Bericht erstellen" aus, in dem verschiedene Profile verglichen werden. Drucken Sie den Bericht als PDF aus, um ihn zu speichern.
   5. Nachdem Sie die Glykanpeaks identifiziert haben, berechnen Sie die relative Häufigkeit jeder einzelnen Struktur als Prozentsatz der Gesamtfläche unter der Kurve aller Glykanpeaks.
   6. Für die Analyse der Fragmentierungsspektren laden Sie die Spektren auf Glycoworkbench und generieren die Peakliste wie in Schritt 2.3.1.
   7. Zeichnen Sie mutmaßliche Glykanstrukturen, die den annotierten Glykanzusammensetzungen entsprechen. Generieren Sie Fragmente für jede gezeichnete Struktur, indem Sie die entsprechende Option zum Berechnen von Fragmenten im Werkzeug Fragmente auswählen. Wählen Sie dann alle Fragmente aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste darauf und klicken Sie auf Fragmente in die Leinwand kopieren.
   8. Um die Analyse der Fragmentierung weiter zu unterstützen, wählen Sie einen Peak of Interest aus, indem Sie ihn im Spektrum-Viewer anklicken. Indem Sie anschließend mit der rechten Maustaste klicken und Alle Strukturen suchen, die den Peaks entsprechen, auswählen, fragen Sie die m/z des ausgewählten Peaks mit Online-Datenbanken nach mutmaßlichen Glykanstrukturen ab.
   9. Wählen Sie vermeintliche Strukturen von Interesse aus und kopieren Sie sie in das Canvas-Fenster der Software, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken und die entsprechende Option auswählen.
   10. Um die möglichen Fragmente zu berechnen, die aus jeder Glykanstruktur generiert werden können, wählen Sie die gewünschte Struktur im Zeichenbereich aus, und wählen Sie dann auf der Registerkarte Tools die Option Fragmente und Fragmente berechnen für die aktuelle Struktur aus.
   11. Wenn Fragmente für mehr als eine Glykanstruktur berechnet wurden, zeigen Sie die Vergleichstabelle auf der Registerkarte Zusammenfassung unter der Tabellenansicht Fragmente an.
   12. Wählen Sie die Fragmente aus, die der Peakliste für jede potenzielle Glykanstruktur entsprechen, und wählen Sie im Kontextmenü mit der rechten Maustaste die Option Fragmente in Canvas kopieren aus.
   13. Wählen Sie auf der Registerkarte Werkzeuge unter Profiler die Option Peaks mit allen Strukturen beschriften und klicken Sie dann auf Werkzeuge | Berichterstattung | Erstellen Sie einen Bericht mit den Anmerkungen. Drucken Sie den Bericht als PDF aus, um ihn zu speichern.

Ergebnisse

In den folgenden Ergebnissen wurde porzines Magenmuzin (PGM) verwendet, um die Entsalzungs- und Permethylierungsschritte zu optimieren. Um zwei häufig verwendete Entsalzungsansätze zu vergleichen, wurden die Proben nach der Freisetzung der Glykane entweder durch Kationenaustausch (wie im obigen Protokoll beschrieben) und Co-Verdampfung von Borat mit Methanol oder durch Festphasenextraktion mit porösen graphitierten Kohlenstoffpatronen (PGC) entsalzt. Dies erfordert eine Vorkonditionierung der Kartusche mit 80 % Acetonitril und 100 %_H2O, einen Waschschritt mit 0,1 % (v/v) Trifluoressigsäure (TFA) und eine Elution der Glykane mit 2 mL 25 % Acetonitril in 0,1 % TFA, 2 mL mit 50 % Acetonitril in 0,1 % TFA und 2 mL mit 80 % Acetonitril in 0,1 % TFA.

Die resultierenden Spektren nach der Permethylierung wurden im Bereich von m/z 500 bis m/z 2.500 analysiert. In der durch Ionenaustausch und Boratentfernung entsalzten Probe wurden insgesamt 33 Glykanstrukturen identifiziert, während in der durch PGC-Extraktion entsalzten Probe 32 Strukturen identifiziert wurden (Abbildung 2A). Eine Glykanstruktur wurde in der entsalzten PGC-Probe nicht identifiziert (in Abbildung 2A mit einem Sternchen gekennzeichnet). Diese vergleichende Analyse zeigte, dass die Rückgewinnung größerer Glykane nach der PGC-Extraktion im Vergleich zum Ionenaustausch nicht so effizient war. Dies zeigt sich auch in der relativen Häufigkeit größerer Glykane, die nach der PGC-Extraktion 21 % der Gesamtglykane ausmachen, im Gegensatz zu 31 % für den Ionenaustausch. Darüber hinaus führte die Entsalzung durch Ionenaustausch und Boratentfernung zu Spektren mit erhöhten Signal-Rausch-Verhältnissen im Vergleich zu denen, die nach der Entsalzung durch Festphasenextraktion mit PGC erzeugt wurden (Abbildung 2B).

Um die Permethylierungsreaktionszeit zu optimieren, wurden Aliquots derselben Permethylierungsreaktion durch Zugabe von H₂O zu unterschiedlichen Zeitpunkten (d. h. 5 min, 30 min oder 90 min) abgeschreckt. Die Ergebnisse zeigten, dass in den Proben, die 30 oder 90 min permethyliert wurden, 33 Glykanpeaks im Bereich von m/z 500 bis m/z 2.500 identifiziert werden konnten, wobei die resultierenden Spektren ähnlich waren. Im Gegensatz dazu konnten nur 31 Glykan-Peaks identifiziert werden, wenn die Permethylierung über 5 min durchgeführt wurde (Abbildung 3). Interessanterweise handelt es sich bei den beiden Strukturen, die in dieser kürzeren Reaktionszeit nicht identifiziert wurden (in Abbildung 3 mit einem Sternchen gekennzeichnet), um die beiden sialylierten Strukturen, was darauf hindeutet, dass die Modifikation von Sialinsäuren unter den getesteten Bedingungen in 5 Minuten nicht effizient ist.

Die Fragmentierung wurde für jeden PGM-Glykan-Peak verwendet, um die Glykanzusammensetzung zu bestätigen und die Glykanstruktur zu bestimmen. Im Folgenden werden zwei Beispiele vorgestellt (Abbildung 4). In Abbildung 4A ist das Fragmentierungsspektrum eines Peaks bei 983 m/z dargestellt. Die Glykanzusammensetzung wird als HexNAc₂Hex₂ zugeordnet. Es gibt zwei mögliche Strukturen für diese Glykanzusammensetzung, entweder Gal-(Gal-GlcNAc-Gal-)-GalNAc (Glykan 1) oder Gal-GlcNAc-Gal-GalNAc (Glykan 2). Die Fragmentierung dieser Verbindung erzeugte ein Massenspektrum mit Peaks, die verschiedenen Fragmenten des Glykans zugeordnet werden können. Der Peak bei m/z 529 und der Peak bei m/z 708 sind charakteristisch für die Strukturen 1 bzw. 2, und wir können daraus schließen, dass sowohl Glykane 1 als auch 2 im PGM-Glykan-Mix vorhanden sind.

In Abbildung 4B ist das Fragmentierungsspektrum eines Peaks bei m/z 2.026 dargestellt. Glycoworkbench berechnete zwei potentielle Glykanzusammensetzungen für diesen Peak, Hex₃HexNAc₁Neu5Ac₃ und Hex₃HexNAc₄dHex₂. Die sialylierte Zusammensetzung hat eine geringere Genauigkeit (~160 ppm bzw. 178 ppm), was darauf hindeutet, dass die erste die richtige Wahl sein muss. Das Fragmentierungsprofil weist jedoch auf das Vorhandensein von Fuc und nicht auf Neu5Ac hin. Daher ist die zweite Zusammensetzung die richtige. Hier werden vier putative Glykanstrukturen vorgestellt, und das Spektrum wurde mit den berechneten Fragmenten jeder putativen Glykanstruktur annotiert. Im annotierten Spektrum können wir sehen, dass nur Peaks vorhanden sind, die für die Glykane 4 und 6 charakteristisch sind, während keine für die Glykane 3 und 5 charakteristischen Peaks identifiziert wurden. Basierend auf diesen Daten können wir daraus schließen, dass die Glykane 4 und 6 vorhanden sind.

Abbildung 2: Vergleich der Glykanpeaks nach der Entsalzung und der Festphasenextraktion. (A) Vergleich des PGM-Glykanprofils nach der Entsalzung entweder durch Kationenaustauschchromatographie und Boratentfernung oder durch PGC-Festphasenextraktion. (B) Vergleich der beiden Entsalzungsansätze im resultierenden Signal-Rausch-Verhältnis für jeden identifizierten Glykanpeak. Das Sternchen gibt das Glykan an, das nur in den Proben identifiziert wurde, die durch Kationenaustausch und Entfernung von Borat entsalzt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Vergleich des PGM-Glykanprofils nach Permethylierung für 5, 30 oder 90 min. Die Sternchen kennzeichnen die sialylierten Glykane, die erst nach 30 oder 90 min Permethylierung identifiziert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Beispiele für Fragmentierungsspektren von PGM-Glykanen. (A) Fragmentierung des Glykanpeaks bei m/z 983. (B) Fragmentierung des Glykanpeaks bei m/z 2026. Die Kästchen zeigen mögliche Glykanstrukturen. Die Zahlen über den Fragmenten geben an, aus welcher Glykanstruktur sie abgeleitet werden konnten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Um Glykane zu untersuchen, wenden die Forscher eine Vielzahl von Methoden an, die von der Verwendung von Lektinen zur Identifizierung spezifischer Epitope bis hin zu ausgefeilteren Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS) und Kernspinresonanz (NMR) reichen, um eine detaillierte Charakterisierung der Glykanstrukturen zu erhalten. Die Hauptvorteile von MALDI-TOF MS gegenüber alternativen Ansätzen sind die Sensitivität und der Hochdurchsatzcharakter der Methode¹³. Da es jedoch keine Möglichkeit gibt, isobare Verbindungen zu trennen, erzeugen unterschiedliche Glykanstrukturen mit dem gleichen m/z-Wert unter MS/MS eine Mischung von Fragmenten, die dann schwer zu dekonvolutieren ist¹³. Wenn die Bestimmung der genauen Struktur von Muzinglykanen erforderlich ist, sollte die LC-MS die Methode der Wahl sein.

Hier stellen wir ein Protokoll für die Analyse von Muzinglykanen mittels MALDI-TOF MS vor, das alle kritischen Schritte des Prozesses umfasst, von der Glykanfreisetzung über die Entsalzung und Permethylierung bis hin zur Datenerfassung und -analyse. Es ist wichtig zu erkennen, dass jeder dieser Schritte mit unterschiedlichen Ansätzen durchgeführt werden kann und alle damit verbundene Vorteile und Einschränkungen mit sich bringen.

In diesem Protokoll verwendeten wir eine reduktive β-Eliminierung, um die Glykane freizusetzen. Die Reaktion findet unter grundlegenden Bedingungen statt. Befinden sich die Muzinproben bereits in Suspension und wurden sie nicht zuvor gereinigt, so muss der pH-Wert mit einem pH-Indikatorpapier überprüft werden. wenn es sauer ist, muss es auf einen pH-Wert von ~8-9 erhöht werden. Eine Einschränkung dieses Ansatzes besteht darin, dass die für die Freisetzung der Glykane erforderlichen Grundbedingungen auch zur Hydrolyse und damit zum Verlust von O-Acetylgruppen führen, die häufig auf Sialinsäuren zu finden sind, in einer Reaktion, die als Verseifung bekannt ist.

Während in der Literatur andere Methoden für die Freisetzung von Glykanen 15,16,17,18 beschrieben wurden, von denen einige die labilen O-Acetylgruppen erhalten können, bleibt die reduktive β-Elimination der Goldstandard auf diesem Gebiet. Dieser Ansatz erfordert eine hohe Konzentration an Salzen. Salze und andere Ionensuppressionsverunreinigungen müssen dann vor der MALDI-TOF-Analyse^{entfernt werden 19}, da sie die Ionisationseffizienz und die Quantifizierung von Glykanen beeinträchtigen können. Hier erwies sich die Kationenaustauschchromatographie, gefolgt von der Entfernung von Borat durch Methanolverdampfung, als der effizienteste Ansatz zur Entsalzung der freigesetzten Glykane aus Mucin. In diesem Fall interagieren die Glykane nicht mit dem Harz, sondern fließen durch es hindurch, während Natriumionen auf dem Harz eingeschlossen werden. Die Vorbereitung der Ionenaustauschsäulen ist jedoch aufwendig und macht diesen Ansatz für großtechnische Experimente mit zahlreichen Proben ineffizient. In solchen Fällen kann eine PGC-Entsalzung bevorzugt werden, da dieses Harz auch in einem 96-Well-Plattenformat erhältlich ist. Wie oben dargestellt, kann die Entsalzung durch PGC-Extraktion jedoch zu einer ineffizienten Elution führen, insbesondere von größeren Glykanen, und dies sollte bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden.

Obwohl native Glykane auch mit MALDI-TOF analysiert werden können, wird in der Regel eine Permethylierung eingesetzt, da diese Reaktion die Nachweisempfindlichkeit deutlich erhöht, da native Glykane eine geringe Ionisationseffizienz^{aufweisen 20}. Darüber hinaus erleichtert die Permethylierung den Nachweis negativ geladener Glykane, wie z. B. sulfatierte oder sialylierte Glykane, im positiven Modus und bewahrt labile Glykan-Epitope, wie Sialinsäuren oder Fucose²⁰. Am häufigsten wird die Permethylierung 5-10 min lang laufen gelassen^14,21, wobei einige Berichte zulassen, dass die Reaktion bis zu 40 min anhält²². Hier zeigten wir, dass unter den getesteten Bedingungen sialylierte Glykane nach 5 min Permethylierung nicht effizient nachgewiesen werden konnten und eine längere Inkubation erforderlich war.

Neben der Reaktionszeit ist ein weiterer Faktor, der die Permethylierungseffizienz beeinflussen kann, der Wassergehalt in der Reaktion. Das Vorhandensein von Wasser kann zu einer Untermethylierung oder teilweisen Methylierung der Glykane führen, wobei nicht alle Hydroxylgruppen in Methylgruppen²³ umgewandelt wurden. Dies kann leicht festgestellt werden, da bei einer Untermethylierung Gruppen von Peaks beobachtet werden können, die sich um 14 Da (die Massendifferenz zwischen Hydroxyl- und Methylgruppe) unterscheiden. Dieses Problem kann durch Wiederholen der Permethylierungsreaktion und erneutes Analysieren der Daten behoben werden.

Ein limitierender Faktor bei der Glykananalytik ist die Interpretation der Spektren. Trotz der jüngsten Fortschritte ist dieser Prozess immer noch weitgehend manuell und erfordert eine gute Kenntnis und ein gutes Verständnis der Glykan-Biosynthesewege, um die Spektren genau zu kommentieren. Tools wie Glycoworkbench²⁴ können helfen, indem sie mögliche Annotationen, Glykanstrukturen und Zusammensetzungen bereitstellen, aber aufgrund der inhärenten Heterogenität von Glykanmischungen müssen Forscher immer noch die Entscheidung treffen, welche Wahl die richtige ist. In dem oben vorgestellten Beispiel mit PGM bot Glycoworkbench zwei potenzielle Glykanzusammensetzungen für den Peak bei mz 2.025,7620 an, und basierend auf dem Fragmentierungsprofil schlossen wir, dass die fucosylierte Struktur und nicht die sialylierte Struktur vorhanden war. Wenn jedoch kein Fragmentierungsspektrum zur Verfügung stand (was bei geringen Glykanen häufig der Fall ist), können die Forscher die Annotation auf die Kenntnis stützen, dass Glykane mit einer Zusammensetzung von Hex3HexNAc1Neu5Ac3 auf Gangliosiden und nicht auf Muzinen zu finden sind, und diese Option daher im Zusammenhang mit PGM nicht in Betracht gezogen werden sollte. Daher sollten identifizierte Glykanstrukturen oder -zusammensetzungen mit früheren Veröffentlichungen abgeglichen werden und mit den Prinzipien der O-Glykan-Biosynthese übereinstimmen. Insgesamt stellt dieses Protokoll eine wertvolle Ressource dar, insbesondere für Forscher, die neu auf dem Gebiet der Glykobiologie sind und ein Interesse an der Untersuchung von Wechselwirkungen an der Schleimhautschnittstelle haben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
150-mm-Glaspasteur-Pipetten	Fisher Scientific	15202699	Verbrauchsmaterialien Referenz im Text (falls zutreffend): Glaspipette
5-mL-Röhren	Eppendorf	30122305	Verbrauchsartikel
96-Bohrloch-HLB-Extraktionsplatte	Fisher Scientific	16553290	Verbrauchsartikel
Essigsäure	Sigma-Aldrich	A6283	Reagenz
Acetonitril	Fisher Scientific	15624520	Reagenz
Wasserfreies DMSO	Sigma-Aldrich	5.89569	Reagenz
Wasserfreies Methanol	Sigma-Aldrich	5.89596	Reagenz
Autoflex-Massenspektrometer	Bruker		Ausrüstung
DOWEX 50w x8 Harz, H+ Form, 200-400 Mesh	Sigma-Aldrich	44519	Reagenz Referenz im Text (falls zutreffend): Kationenaustauschharz
Trockenblockheizer	Gewähren	QBD2	Ausrüstung
Verdampfer/Konzentrator für Blockheizer	Cole-Palmer	WZ-36610-99	Ausrüstung
flexAnalysis	Bruker		Software, proprietär
flexControl	Bruker		Software, proprietär
Genevac EZ-2	Biopharma	EZ-2	Equipment Referenz im Text (falls zutreffend): Zentrifugalverdampfer
Glasphiolen mit passenden PTFE-Kappen (4 ml)	Wheaton	DWKW224582-144EA	Verbrauchsartikel
Glasphiolen mit passenden PTFE-Kappen (8 ml)	Fisher Scientific	11587413	Verbrauchsartikel
Glaswolle	Supelco	1.04086	Verbrauchsartikel
Glykoarbeitsbank	NA		Software; Herunterladbar bei https://glycoworkbench.software.informer.com/
HLB SPE-Patronen	Supelco	57493-U	Verbrauchbar als Alternative zur 96-Well-HLB-Extraktionsplatte
Iodomethan	Sigma-Aldrich	289566	Reagenz
MALDI-Zielplatte	Bruker		Ausrüstung
ModulyoD-Gefriertrockner	Thermo Fisher	ModulyoD-230	Ausrüstung Referenz im Text (falls zutreffend): Gefriertrockner
NaBH4	Sigma-Aldrich	452882	Reagenz
NaOH-Pellets	Sigma-Aldrich	567530	Reagenz
NaOH-Lösung 50 %	Sigma-Aldrich	415413	Reagenz
positiver Druck-96-Prozessor	Gewässer	186006961	Ausrüstung
super DHB	Sigma-Aldrich	50862	Reagenz
Trifluoressigsäure	Sigma-Aldrich	T6508	Reagenz