Methodenartikel

Eine effiziente Methode zur Extraktion von Epithelien aus menschlichen Eileitern für Einzelzellanalysen

DOI:

10.3791/67753

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28. März 2025

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1Department of Obstetrics and Gynecology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles, 3Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 4Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6Parker Institute for Cancer Immunotherapy, University of California, Los Angeles, 7The Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California Los Angeles, 8The VA Greater Los Angeles Healthcare System, 9Department of Medical and Molecular Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt eine eintägige Methode zur Isolierung von humanen Eileiterepithelzellen. Isolierte Epithelzellen können in 2-dimensionalen (2D) Kulturen plattiert oder in Einzelzellsuspensionen dissoziiert und in nachgelagerten Experimenten, einschließlich Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung, verwendet werden.

Zusammenfassung

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Menschliche Eileiter sind ein wesentlicher Bestandteil der Fortpflanzung. Der Zweck der Eileiter besteht darin, den Transit der Spermien, der Eizelle und bei erfolgreicher Befruchtung des Embryos zu ermöglichen. Die Epithelzellen, die die innere Oberfläche der Eileiter auskleiden, sind sowohl für normale als auch für abnormale Eileiterprozesse, einschließlich der Krankheitsauslösung, integraler Bestandteil. Nach der Menopause spielen die Eileiter keine bedeutende Rolle mehr im Körper und die Zusammensetzung der intraepithelialen Zellen verändert sich. Wir beschreiben eine Methode, bei der diese Epithelzellen aus frischen Eileitern mit minimaler Stromazellkontamination in eine Einzelzellsuspension isoliert werden können. Diese Zellen können in Kultur gezüchtet oder für weitere Analysen wie Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung verwendet werden. Dieses Isolationsprotokoll kann in 4-6 Stunden erreicht werden und liefert lebensfähige Zellen, die für die sofortige Downstream-Analyse verwendet werden können. Dieses effiziente Protokoll erleichtert die Isolierung von Eileiterepithelzellen mit einer angereicherten Epithelpopulation.

Einleitung

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Die Eileiter bestehen aus mehreren Teilen. Vom Eierstock bis zur Gebärmutter besteht der Eileiter aus den Fimbrien, der Ampulle, dem Isthmus und dem intramuralen Teil. Die Fimbrien erstrecken sich vom Ende des Eileiters, wo sie die vom Eierstock freigesetzte Eizelle erfassen. Die Eizelle wandert dann durch die Ampulle, wo sie am ehesten befruchtet wird, zum Isthmus und wird schließlich durch den intramuralen Teil in die Gebärmutter übertragen1. Die innerste Schleimhaut des Eileiters, die den Transport der Eizelle erleichtert, besteht aus einer Schicht aus luminalem Epithel, einschließlich Flimmer- und Sekretzellen. Flimmerzellen neigen dazu, stärker an den Fimbrienkonzentriert zu sein 2. Sie spielen eine wesentliche Rolle bei der physischen Bewegung der Eizelle durch den Eileiter vom Eierstock zur Gebärmutter. Ihre Anhänge ermöglichen es den Flimmerzellen, nicht nur die Eizelle zu bewegen, sondern auch genotoxischen Stress nach dem Eisprung abzubauen3.

Sekretorische Eileiter-Epithelzellen sezernieren eine Flüssigkeit, die bei der Ernährung und dem Aufbau von Gameten hilft4. Der Anteil der Flimmerzellen und sekretorischen Zellen entlang des Eileiterepithels unterscheidet sich im postmenopausalen Zustand mit einer Abnahme der Flimmerzellen, da der Eileiter keine kritische Funktion mehr beim Transport erfüllt5. Darüber hinaus wird angenommen, dass die Eileiter in Abwesenheit von Östrogen verkümmert sind 1,6. Es wird angenommen, dass dieser Verlust von Flimmerzellen im Eileiter das Risiko für die Entwicklung seröser Karzinome erhöht7. Darüber hinaus wird angenommen, dass sekretorische Epithelzellen der Eileiter zu serösen intraepithelialen Tubenkarzinomläsionen (STIC) führen, einem bekannten Vorläufer des aggressivsten Subtyps des tubo-Eierstockkarzinoms, dem hochgradigen serösen Karzinom 7,8.

Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, Epithelzellen aus menschlichen Eileitern zu isolieren und sie in Einzelzellsuspensionen zu dissoziieren. Dieses Protokoll liefert eine angereicherte einzellige Epithelpopulation, die für viele Analysen verwendet werden kann. Wie in diesem Manuskript gezeigt, haben wir eine durchflusszytometrische Analyse durchgeführt und Zellen nach der Isolierung in 2D plattiert. Die durchflusszytometrische Analyse zeigt das Vorhandensein einzelner Zellen, die meist lebensfähig und epithelial sind. In diese Analysen schlossen wir vier Marker ein, e506 für die Lebensfähigkeit, EpCAM für Epithelzellen, CD45 für Immunzellen und CD10 für Stromazellen. Tote Zellen wurden mit dem e506-Viabilitätsmarker ausgeschlossen und Immunzellen mit CD45 ausgeschaltet. Es ist möglich, dass die Suspension eine Immunzellpopulation aufweist; Um jedoch eine relativ reine Population von Epithelzellen zu erreichen, können CD45-positive Zellen mit einem CD45-Depletionskit depleziert werden. Darüber hinaus vermehren sich die CD45-positiven Zellen in Kultur oft nicht, wenn sie plattiert werden. Zellen, die mit dieser Methode isoliert und in 2D gezüchtet wurden, zeigen adhärente kopfsteinpflasterartige Epithelpopulationen. Mit dieser Methode lassen sich zelluläre Präparate erzeugen, die zu Einzelzell-RNA-Bibliotheken weiterentwickelt werden können.

Die Forschung zur Bestimmung der zellulären Abstammung von Eileiterepithelien, Veränderungen in diesen Abstammungslinien während verschiedener Phasen des reproduktiven Lebens und auslösende Ereignisse, die zu malignen Veränderungen und Genese führen, hat in den letzten vier Jahren an Bedeutung gewonnen 6,9,10,11,12 . Dieses Protokoll wird der Forschung in diesem Bereich einen erheblichen Nutzen bringen, indem es eine effiziente Möglichkeit bietet, Eileiterepithelien zu isolieren und zu einzelnen Zellen zu verarbeiten.

Protokoll

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Dieses Protokoll wurde von einer zuvor beschriebenen Methode zur Isolierung von Uterusepithelzellen adaptiert13,14. Frische Proben von deidentifizierten Eileitern wurden im Rahmen unseres IRB-zugelassenen Protokolls #10-0727 der University of California, Los Angeles (UCLA) entnommen und innerhalb von etwa 4–6 Stunden zu einer einzelligen Suspension verdaut.

1. Entnahme und Vorbereitung der Eileiter

  1. Frische menschliche Eileiter (Abbildung 1A) in Dissoziationsmedien (DMEM [4,5 g/l D-Glukose] mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 5 ml L-Glutamin und 5 ml Penicillin/Streptomycin) in 15 ml- oder 50-ml-Röhrchen sammeln und auf Eis zum Labor transportieren.
  2. Übertragen Sie die Eileiter in eine sterile Petrischale mit frischem Dissoziationsmedium.
  3. Präparieren Sie unter einem Präpariermikroskop Fett, Bindegewebe und alle Gefäße, die die Eileiter umgeben, mit einer feinen Pinzette und einer Vannas Tübinger Schere (Abbildung 1B).
  4. Schneiden Sie unter dem Präpariermikroskop mit einer Schere durch die koronale Ebene der Eileiter, um kleine Zylinder mit einem Durchmesser von jeweils ~3–5 mm zu bilden (Abbildung 1C), wobei Sie die feine Pinzette verwenden, um das Gewebe zu stabilisieren.

2. Isolierung und Dissoziation von Epithelzellen

  1. Saugen Sie das Dissoziationsmedium vorsichtig aus der Schale ab.
  2. Waschen Sie die Taschentuchstücke 2x mit kalter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), indem Sie ~2 mL vorsichtig pipettieren, um die Stücke zu bedecken, und die Platte leicht drehen.
  3. Aspirieren Sie die letzte 1x PBS-Wäsche, inkubieren Sie die Gewebestücke 5 Minuten lang in kalter 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei Raumtemperatur und wiederholen Sie dies für insgesamt zwei Inkubationen. Aspirieren Sie die 5 mM EDTA nach jeder Inkubation.
  4. Die Gewebefragmente werden in kalter 1%iger Trypsin/Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) suspendiert und 40 Minuten lang bei 4 °C inkubiert (Abbildung 1D).
  5. Aspirieren Sie das 1%ige Trypsin/HBSS und waschen Sie die Gewebestücke 2x in kalten Dissoziationsmedien, um das Trypsin zu inaktivieren.
  6. Inkubieren Sie die Gewebefragmente in 2 mL Dissoziationsmedium mit 0,4 mg DNase für mindestens 30 min bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Eine längere Inkubationszeit kann erforderlich sein, sollte jedoch 45 Minuten vor Beginn von Schritt 2.7 nicht überschreiten.
  7. Halten Sie unter einem Präpariermikroskop, während Sie sich noch mit DNase im Medium befinden, ein Fragment des Eileiters, dessen Lumen parallel zum Boden der Schale verläuft, mit einer Pinzette an Ort und Stelle. Drücken Sie mit der anderen Hand wiederholt mit einer Pinzette auf das Eileiterstück, um Epithelzellen aus dem Lumen des Eileiters auszustoßen. Vergewissern Sie sich, dass ein Zellhalo um das Gewebe herum zu sehen ist, wenn Zellen aus dem Lumen der Röhre freigesetzt werden. Wiederholen Sie den Vorgang für jedes Fragment des Eileiters in der Schale (Abbildung 1E).
  8. Übertragen Sie das zellhaltige Medium in ein steriles 15-ml-Röhrchen, waschen Sie die Petrischale mindestens 2x mit Dissoziationsmedium und kombinieren Sie die Waschgänge in das 15-ml-Röhrchen. Entsorge die Fragmente des Stromarohrs.
  9. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 500 × g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL Dissoziationsmedium.
  10. Zählen Sie die Zellen, indem Sie 10 μl der Zellsuspension aliquotieren und 1:1 mit Trypanblau mischen. Pipettieren Sie 10 μl der Mischung in einen Kammerzählobjektträger und setzen Sie ihn in einen Zellzähler ein (Abbildung 1F).

3. Aufschluss zur Einzelzellsuspension

  1. Resuspendieren Sie die Zellen in 9 ml Dissoziationsmedium, 1 ml 8 mg/ml Kollagenase (Typ 1) und 0,4 mg DNase. Inkubieren Sie bei 37 °C für 30–45 min in einem Orbitalschüttler bei 200 U/min (Abbildung 1G).
  2. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 500 × g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml Dissoziationsmedium, um die Kollagenase abzuwaschen.
  3. Die Zellsuspension wird durch ein 100-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Röhrchen geleitet (Abbildung 1H).
  4. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 500 × g für 5 min.
  5. Wenn das Zellpellet rot erscheint, führen Sie die Lyse der roten Blutkörperchen (RBC) durch, wie in den Schritten 3.6 bis 3.8 beschrieben. Wenn das Zellpellet nicht rot ist, fahren Sie mit Schritt 3.9 fort.
  6. 500 μl Erythrozyten-Lysepuffer in 4,5 ml Reinstwasser verdünnen.
  7. Aspirieren Sie das Medium, fügen Sie 5 ml des verdünnten RBC-Lysepuffers hinzu und inkubieren Sie es 3 Minuten lang auf Eis.
  8. Um die Erythrozytenlyse zu stoppen, geben Sie 45 ml 1x PBS in das 50-ml-Röhrchen.
  9. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 500 × g für 5 min.
  10. Zählen Sie die Zellen, indem Sie 10 μl der Zellsuspension aliquotieren und 1:1 mit Trypanblau mischen. Pipettieren Sie 10 μl der Mischung in einen Kammerzählobjektträger und setzen Sie ihn in den Zellzähler ein (Abbildung 1I).

4. Färbung durch Durchflusszytometrie

  1. Aliquotieren Sie 250.000 Zellen in zwei separate 5-ml-Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden für die primäre konjugierte Antikörper- und Isotypkontrolle zur Verwendung für die Oberflächenmarker-Durchflusszytometrie.
    HINWEIS: Es können weniger Zellen verwendet werden, um die Zellzahl und die Anzahl der Zellen zu berücksichtigen, die für die nachgelagerte Analyse benötigt werden. Um optimale Durchflussergebnisse zu erzielen, sollten mindestens 50.000 Zellen in die Analyse einbezogen werden.
  2. Verdünnen Sie den Antikörper (z. B. Anti-Human-EpCAM und CD10) und den Isotyp gemäß der vom Hersteller empfohlenen Verdünnung in 1x PBS. Enthält einen fixierbaren Viabilitätsfarbstoff (e506) und einen konjugierten Anti-Human-CD45-Antikörper, um lebende menschliche Immunzellen auszuscheiden. Stellen Sie genügend Antikörpermischung für mindestens 50 μl pro Röhrchen her. Im Dunkeln auf Eis lassen bis Schritt 4.4.
  3. Waschen Sie die Zellen mit 1 mL 1x PBS. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 500 × g für 5 min bei 4 °C geerntet.
  4. Aspirieren Sie das 1x PBS. Das Pellet wird im Antikörper- oder Isotyp-Panel resuspendiert und 15 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln inkubiert.
  5. Nach der Inkubation in 1 mL 1x PBS verdünnen und die Zellen durch Zentrifugation bei 500 × g für 5 min bei 4 °C ernten.
  6. Aspirieren Sie das 1x PBS und resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl 1x PBS.

5. Datenerfassung durch Durchflusszytometrie

  1. Melden Sie sich am FACS-Gerät an.
    HINWEIS: Wir präsentieren das Protokoll unter Verwendung des referenzierten Durchflusszytometers (siehe Materialtabelle). Bei anderen Durchflusszytometern halten Sie sich an die Anweisungen des Herstellers. Die Spannungseinstellung des Durchflusszytometers wurde für eine optimale Leistung mit menschlichen PBMCs vorkonfiguriert, sodass keine Spannungsanpassungen vor jedem FACS-Lauf erforderlich sind.
  2. Wenn sich das Gerät im Erfassungsmodus befindet, fahren Sie mit Schritt 5.3 fort. Wenn sich das Gerät im Datenanalysemodus befindet, wechseln Sie in den Erfassungsmodus , indem Sie die Ein-/Aus-Taste oben rechts drücken. Wenn ein Popup-Fenster angezeigt wird, drücken Sie die Taste, die den Aufnahmemodus anzeigt.
  3. Wenn das Gerät unten links Kalibrierung erforderlich anzeigt, fahren Sie mit Schritt 5.3.1 fort. Wenn auf dem Gerät Kalibrierung ok angezeigt wird, fahren Sie mit Schritt 5.4 fort.
    1. Um das Gerät zu kalibrieren, nehmen Sie die Kalibrierperlen aus dem 4 °C Kühlschrank und wirbeln Sie sie auf.
    2. Geben Sie 1 Tropfen Kalibrierperlen in ein 5-ml-Polystyrol-Rundbodenröhrchen und setzen Sie das Röhrchen in den Einzelröhrchenhalter ein.
    3. Drücken Sie die Barcode-Taste oben rechts und scannen Sie die Kalibrierperlenflasche. Ein Pop-up-Fenster wird angezeigt. Wenn alles eingerichtet ist, klicken Sie auf Ja | OK und lassen Sie die Kalibrierung laufen.
    4. Wenn die Kalibrierung erfolgreich war, melden Sie sich ab und wieder im Erfassungsmodus an. Fahren Sie mit Schritt 5.4 fort.
  4. Klicken Sie oben links auf Öffnen | Neuer Arbeitsbereich .
  5. Wählen Sie Chill 5 Rack; Wählen Sie drei der Vertiefungen aus. Wählen Sie die erste Vertiefung aus und geben Sie ihr eine Beschreibung (z. B. FTX Ab). Wählen Sie die nächste Vertiefung aus und geben Sie ihr eine eindeutige Beschreibung (z. B. FTX Iso). Wählen Sie die letzte Vertiefung aus und geben Sie ihr die Beschreibung Bleichmittel.
    HINWEIS: Fügen Sie immer nach jeweils 4–5 Versuchsproben eine Bleichprobe hinzu, um eine rechtzeitige Reinigung der Zellproben zu gewährleisten.
  6. Wählen Sie alle Vertiefungen aus und richten Sie die Versuchsbedingungen wie folgt ein: Geräteeinstellungen: Menschliche PBMCs; Durchflussmenge: hoch; Mischprobe: schonendes Mischen; Modus: Standard; Gesamtvolumen der Probe 200 μL; Probenaufnahme 150 μL; Anmerkung: Eingangsantikörper und ihre Fluorophor-Markierung.
  7. Wählen Sie Bearbeiten | Optionen und geben Sie der Datei unter Beschreibung| Anwenden | OK einen Namen.
  8. Nehmen Sie das Gitter aus dem Kühlschrank und legen Sie es mit dem Barcode in Richtung Maschine auf das Tablett. Legen Sie die Probenröhrchen in das Rack, um die Reihenfolge der Proben auf dem Bildschirm wiederzugeben, und drücken Sie die Wiedergabetaste , um das Experiment zu starten.
  9. Schließen Sie nach Abschluss des Experiments den USB-Stick an, wählen Sie Datei | Kopieren, erweitern Sie den privaten Ordner, wählen Sie das Experiment aus, und klicken Sie auf Kopieren und auswerfen.
  10. Verwenden Sie nach der Datenerfassung eine Software, um das Datenblatt zu analysieren.
  11. Beginnen Sie mit der Isotypsteuerung. Verwenden Sie das Polygon-Werkzeug , um Zellen im Diagramm der Vorwärtspunktung (FSC) und der Seitenstreuung (SSC) auszuwählen.
  12. Gate dead-Cells aus, indem Sie die Y-Achse auf e506 und die X-Achse auf FSC ändern. Verwenden Sie das Polygonwerkzeug , um die e506-negative lebende Zellpopulation auszuwählen.
  13. Doppelklicken Sie auf die ausgewählte Population. Ändern Sie die Y-Achse auf menschliches CD45. Verwenden Sie das Polygon-Werkzeug , um die Zellenpopulation auszuwählen. Dies ist die humane CD45-negative Zellpopulation.
  14. Doppelklicken Sie auf die CD45-negative Zellpopulation. Ändern Sie die Y-Achse in ein Histogramm und die X-Achse in eine menschliche EpCAM. Klicken Sie mit dem Bereichsauswahlwerkzeug auf das Ende des Histogramms und markieren Sie den leeren Raum bis zum Ende des Diagramms. Dies stellt die EpCAM-positive Population dar. Wiederholen Sie den Vorgang für CD10-Flecken beim Menschen.
  15. Ziehen Sie das Isotyp-Gating unter den Antikörper-Arbeitsbereich. CD45-positive Zellen werden ausgeblendet und EpCAM-positive und CD10-positive Populationen werden ausgewählt.
  16. Um repräsentative Histogramme zu erstellen, wählen Sie Layout-Editor aus. Ziehen Sie die gewünschten Histogramme auf die Layout-Seite. Um die Isotyp- und Antikörperfärbung zu vergleichen, überlagern Sie das Isotyp-Histogramm mit dem Antikörper-Histogramm. Gate der positiven Zellen basierend auf der Isotypsteuerung.

6. Immunzytochemie

  1. Kultivieren Sie Zellen nach dem letzten Isolationsschritt in der gewünschten Kammerglas, bis sie konfluent sind.
  2. Um die Zellen zu fixieren, fügen Sie 500 μl kaltes 4%iges Paraformaldehyd (PFA) hinzu und inkubieren Sie es 10 min lang bei Raumtemperatur.
  3. Aspirieren Sie das 4% PFA und waschen Sie 3x mit 1x PBS.
  4. Um die Zellen zu permeabilisieren, fügen Sie mindestens 200 μl 0,25% Triton-X in PBS hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  5. Bereiten Sie während der Permeabilisierung den Blockierungspuffer vor (4 % normales Ziegenserum [NGS] für Antikörper, die nicht bei Ziegen gebildet werden).
  6. Aspirieren Sie das 0,25% Triton-X und waschen Sie es 3x mit 1x PBS.
  7. Fügen Sie mindestens 200 μl Blockierungspuffer (4 % NGS in PBS) hinzu. 1 h bei Raumtemperatur blockieren.
  8. Bereiten Sie primäre Antikörperverdünnungen in 1% NGS in 1x PBS gemäß den Empfehlungen des Herstellers vor.
  9. Nach der Blockierung mindestens 200 μl der primären Antikörperlösung zugeben. 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    HINWEIS: Einige Primärantikörper bevorzugen möglicherweise eine Inkubation bei 4 °C über Nacht; Überprüfen Sie das Antikörper-Datenblatt.
  10. Bereiten Sie Sekundärantikörperlösungen in 1% NGS in 1x PBS vor. Wickeln Sie die Röhrchen in Alufolie ein und bereiten Sie Lösungen im Dunkeln vor, da die Sekundärantikörper lichtempfindlich sind. Bis zur Zubereitung im Dunkeln lagern.
  11. Nach der Inkubation des primären Antikörpers 3x mit 1x PBS waschen.
  12. Fügen Sie mindestens 200 μl der Sekundärantikörperlösung hinzu. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 1 h inkubieren.
    HINWEIS: Versuchen Sie bei den folgenden Schritten, die Folie so weit wie möglich im Dunkeln zu halten.
  13. Nach der Inkubation von sekundären Antikörpern 3x mit 1x PBS waschen.
  14. Entfernen Sie die Kammern, indem Sie sie entweder einfach von Hand entfernen oder das Werkzeug verwenden, das mit den Schlitten geliefert wird. Befolgen Sie zur Entnahme die Anweisungen auf der Verpackung des Kammerobjektträgers.
  15. Geben Sie einen Tropfen 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Eindeckserum hinzu und legen Sie ein Deckglas darauf. Begrenzen Sie die Anzahl der Blasen und stellen Sie sicher, dass alle Zellen bedeckt sind. Optionaler Schritt: Verwenden Sie Nagellack an den Rändern, um das Deckglas zu versiegeln.
  16. Legen Sie den Objektträger zum Trocknen flach in eine Objektträgerbox und legen Sie ihn bis zur Bildgebung bei 4 °C auf.
  17. Bild auf einem Mikroskop, das mit einer korrekten Fluoreszenz auf der Grundlage einer sekundären Antikörperkonjugation ausgestattet ist, um ein sauberes Bild zu gewährleisten.

Ergebnisse

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Wir haben sieben Eileitersammlungen eingeschlossen, in denen wir eine angereicherte Epithelzellpopulation isoliert haben (Abbildung 2A und ergänzende Abbildung S1A). Um die Lebensfähigkeit und Epithelzellanreicherung dieser Einzelzellsuspensionsmethode zu beurteilen, wurde eine Durchflusszytometrie durchgeführt. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen, wurden die Zellen mit dem Viabilitätsmarker e506 gefärbt. Dies ermöglichte es auch, bei der Analyse alle Ablagerungen und abgestorbenen Zellen auszublenden.

Um die Zusammensetzung der mit dieser Methode isolierten Zellen zu bestimmen, wurden die Proben mit einem Epithelzellmarker (EpCAM), einem Stromazellmarker (CD10) und einem Immunzellmarker (CD45) gefärbt. Wie in Abbildung 2B zu sehen ist, isolierten wir eine lebensfähige und angereicherte Epithelzellpopulation aus Eileitergewebe. Die Durchführbarkeit der Proben lag bei durchschnittlich 82 %. Bei allen Proben beobachteten wir nach dem Ausscheiden von CD45-positiven Zellen eine angereicherte Epithelzellpopulation mit EpCAM-positiven Zellen, die durchschnittlich 80% der Probe ausmachten. Es gab eine gewisse Kontamination der Stromazellen, aber im Durchschnitt nur 7,8 %. Abbildung 2C zeigt isolierte Zellen in 2D 4-6 Tage nach der Beschichtung. Es ist offensichtlich, dass Epithelzellen isoliert wurden, da sie konsistent haftende, kopfsteinpflasterartige Cluster bildeten. In der ergänzenden Abbildung S1B wurden die Zellen nach der Isolierung plattiert und 2-6 Tage lang kultiviert. Die Immunzytochemie wurde verwendet, um die in Kultur wachsenden Zellen zu charakterisieren. Die meisten Zellen in der Kultur waren positiv für EpCAM und den sekretorischen Zellmarker PAX8 gefärbt. Nur wenige Zellen wurden als Vimentin-positiv identifiziert. Flimmerzellen wurden in Kultur gesehen, wie auf Video festgehalten wurde, wie im ergänzenden Video S1 gezeigt.

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Abbildung 1: Experimentelles Schema. (A) Eileiter werden erworben. (B) Überschüssiges Fett und Bindegewebe werden entfernt. (C) Die Rohre werden in ~3-5 mm große Stücke geschnitten. (D) Die Stücke werden in PBS gewaschen, dann 2x für 5 min in EDTA inkubiert und 40 min bei 4 °C in 1% Trypsin inkubiert. (E) Mit zwei Pinzettenpaaren, eine zum Halten und eine zum Schieben, stoßen Sie Epithelzellen aus den Eileiterstücken aus. (F) Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen, drehen Sie sie und zählen Sie. (G) Resuspendieren Sie in DMEM, Kollagenase und DNase. 30-45 Min. (H) Mit einem 100 μm Sieb abseihen. (I) Ernte durch Zentrifugation und Zählung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Charakterisierung isolierter Epithelzellen. (A) Tabelle mit den klinischen Informationen des Patienten und den Ergebnissen der Durchflusszytometrie. (B) Nach der Isolierung wurde eine Durchflusszytometrie durchgeführt, um zu zeigen, dass eine angereicherte Population von Epithelzellen (EpCAM-positiv) isoliert worden war. Die Isotyp-Negativkontrolle ist schwarz und das Versuchsergebnis rosa dargestellt. (C) Die Zellen wurden nach der Isolierung plattiert. Die Fotos wurden 4-6 Tage nach dem Plattieren aufgenommen. Maßstabsleisten = 100 μm. Abkürzungen: AUB = Abnorme Gebärmutterblutungen; EIN = Endometriale intraepitheliale Neoplasie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung S1: Zusätzliche Charakterisierung isolierter Epithelzellen in Kultur. (A) Tabelle mit den klinischen Informationen des Patienten. (B) Isolierte Zellen wurden kultiviert und 2-6 Tage nach der Beschichtung auf EpCAM, einen sekretorischen Zellmarker (PAX8) und einen Stromazellmarker (Vimentin) gefärbt, um den Zelltyp in Kultur zu charakterisieren. Maßstabsleisten = 50 μm. Abkürzungen: EIN: Endometriale intraepitheliale Neoplasie; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.

Ergänzendes Video S1: Videos von schlagenden Flimmerzellen wurden mit 30-facher Vergrößerung aufgenommen, um Flimmerzellen in Kultur zu demonstrieren. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Diskussion

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Es besteht ein erhebliches Interesse an der Untersuchung des Eileiterepithels, da Eileiter eine wichtige Rolle bei der Fortpflanzung spielen und der Ursprungsort der meisten HGSOC sind. Zu diesem Zweck haben viele Forscher Protokolle zur Isolierung von Eileiterzellen sowohl in menschlichen als auch in Mausmodellen beschrieben 10,11,12,15,16,17,18,19,20,21. Die von uns beschriebene Methode zur Extraktion und Anreicherung von Eileiterepithelzellen ergänzt die bestehenden Protokolle zur Isolierung von Eileiterzellen. Obwohl es Überschneidungen innerhalb dieser Protokolle gibt, gibt es zwei allgemeine Arten von Methoden, die bei Mäusen und Menschen beschrieben werden. Die erste beinhaltet das Zerkleinern und enzymatische Verdauen des gesamten Eileiters, was eine Gesamtzellsuspension 10,12,15,16,17 ergibt. Die zweite beinhaltet das Ablösen durch Rühren oder Schaben, was zu Gewebeschichten 11,18,19,20,21 führt. Beide Methoden ermöglichen die Analyse von Epithelzellen über nachgelagerte Experimente wie Durchflusszytometrie, Sequenzierung und In-vitro-Kultur. Ein großer Vorteil unserer Methode besteht darin, dass das Protokoll eine Population von Eileiterzellen ergibt, die bereits durch enzymatischen Verdau und mechanische Druckschritte für Epithelzellen angereichert sind. Diese mit Epithelien angereicherte Population kann weiter verdaut werden, was zu einer Einzelzellsuspension führt, die für viele Anwendungen wie Durchflusszytometrie, 2D-Kultur, Immunzytochemie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung verwendet werden kann.

Zu den wichtigsten Schritten, die wir gefunden haben, um die Zellausbeute zu beeinflussen, gehört die Dauer, für die die Eileiterfragmente in 1% Trypsin/HBSS und DMEM/DNase inkubieren. Eine Überinkubation in beiden Lösungen degradiert die Zellen und verringert die Lebensfähigkeit der Zellen erheblich. Eine unzureichende Inkubationszeit wird jedoch die Fähigkeit des Forschers hemmen, während des Protokollschritts 2.6 viele Epithelzellen herauszuschieben, da sie weiterhin aneinander haften. Es ist auch wichtig, eine 1%ige Trypsinlösung zu verwenden, da sowohl niedrigere als auch höhere Konzentrationen von Trypsinlösungen die Ausbeute an lebensfähigen Eileiterepithelzellen verringerten. Durch die Kombination von chemischer und mechanischer Isolierung und einem Verdauungsschritt (Protokollschritt 3.1) können wir die Zeitspanne, die von der Gewebe- zur Einzelzellsuspension benötigt wird, exponentiell verkürzen. Dies gewährleistet eine gute Rentabilität und Zeit, um die nachgelagerte Analyse noch am selben Tag durchzuführen.

Im Protokollschritt 1.4 ist es wichtig sicherzustellen, dass die geschnittenen Eileiterstücke 3-5 mm dick sind. Wenn die Stücke zu groß sind, wird es schwierig sein, Protokollschritt 2.7 durchzuführen und letztendlich die Zellausbeute zu verringern, da eine längere Inkubationszeit in DMEM/DNase erforderlich ist.

Obwohl die Zellsuspension für Epithelzellen angereichert ist, ist eine Kontamination der Stromazellen unvermeidlich. Wenn es sich um reine Epithelzellen handeln soll, kann eine Sortierung mit Hilfe der Durchflusszytometrie und der von uns beschriebenen Marker durchgeführt werden, um Epithelzellen zu isolieren und Stromazellen zu depletieren.

In dieser Studie wurden postmenopausale Eileiter verwendet. Diese Methode wurde jedoch in unserem Labor erfolgreich an prämenopausalen Eileitern eingesetzt. Der Hauptunterschied zwischen prä- und postmenopausalen Eileitern ist die Zusammensetzung der Flimmer- und Sekretepithelzellen1. Dieses Protokoll funktioniert für alle Fortpflanzungsstadien.

Dieses effiziente Protokoll wird die Untersuchung von Zelltypen des Eileiterepithels erleichtern, einschließlich der Abgrenzung der zellulären Abstammungslinien, ihrer dynamischen Veränderungen während der Fortpflanzungszyklen sowie nach der Menopause und ihrer Rolle bei der Entstehung von hochgradigem serösem Eierstockkrebs.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren Ruegg L, James-Allan LB und DiBernardo G werden teilweise von den Projekten 1I01BX006019-01A2 und I01BX006411-01 der Greater Los Angeles Veterans Association bis Memarzadeh S unterstützt. Autor Ochoa C wird unterstützt von UCLA Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Rose Hills Foundation Graduate Scholarship Training Program. Wir danken dem Translational Pathology Core Laboratory an der UCLA und insbesondere Ko Kiehle und Chloe Yin für die Unterstützung bei der Gewebebeschaffung. Wir möchten uns auch bei Ken Yamauchi und dem BSCRC Microscopy Core für ihre Unterstützung bei der Bildgebung bedanken. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com (Vereinbarungsnummer JL27QWDYNT) erstellt. Abschließend möchten wir uns bei Felicia Cordea und dem BSCRC-Kern für Durchflusszytometrie für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie bedanken.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1% Trypsin Thermo Scientific J63993.09
100 & Mikro; m ZellsiebCorning431752
4% ParaformaldehydElektronenmikroskopie Sciences15710-S
5 mL Röhrchen mit rundem BodenCorning352008
60 mm ZellkulturplatteCorning CLS430589-500EA
6-Well-ZellkulturplatteCorning353046
Anti-CD10BioLegend312212
Anti-CD326 (Ep-CAM)BioLegend324218
Anti-CD45 BioLegend304026
Anti-EpCAMAbcamab223582
Anti-IgG2a PerCP BioLegend400250
Anti-PAX8Sigma-Aldrich363M-15
Anti-VimentinAgilent TechnologiesM072501-2-Kammer-Gleitsystem
Thermo Scientific154917PK
Kollagenase Thermo Scientific 
DMEMThermo Scientific 10569-010
DNase ISigma10104159001
EDTASigma3690
eFluor 506Invitrogen65-0866-14
FBSSigmaF2442
Zange mit feiner Spitze VWR102091-526Jede feine Pinzette Ihrer Wahl funktioniert
Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor 506Invitrogen65-0866-14
FlowJo Softwareversion 9 BD BiosciencesDatenanalyse-Software
GlutaMAXGibco35050-061
HBSSThermo Scientific 14175-095
MACSQuant Analyzer 10 Durchflusszytometer Miltenyi Biotec
MACSQuant KalibrierperlenMiltenyi Biotec130-093-607
Mammocult Stemcell Technologies5620
Normales ZiegenserumFisher ScientificPI31873
PBS Thermo Scientific 14190-144
Penicillin-Streptomyocin Gibco15140-122
PerCP konjugierter CD45BioLegend304026
Lysepuffer für rote Blutkörperchen Tonbo BiosciencesTNB-4300-L100 
Triton X-100Thermo Scientific BP151-100
Vannas-Tübingen Federschere Fine Science Tools15003-08
VECTASHIELD mit DAPIFisher ScientificNC9524612
17100017

Referenzen

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