Methodenartikel

Bewertung der antioxidativen und anthelmintischen Eigenschaften von Tithonia diversifolia-Extrakten gegen gastrointestinale Nematodeneier mittels In-vitro-Assays

DOI:

10.3791/67760

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1. August 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Multidisciplinary Center for Technological Research, National University of Asunción (CEMIT - UNA), 2Centre of Marine Sciences (CCMAR/CIMAR LA), University of Algarve, 3Department of Food Biochemistry, Biodiversity, Food and Health Group (BIOALSA), Faculty of Chemical Sciences, National University of Asunción (FCQ - UNA), 4Carleton College

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In dieser Studie wurden die biologischen Aktivitäten von Tithonia diversifolia-Extrakten unter Verwendung radikalbasierter Methoden und eines in vitro Egg Hatching Assay (EHA) untersucht, um ihre Auswirkungen auf gastrointestinale Nematoden bei kleinen Wiederkäuern zu bewerten. Die Methodik und die wichtigsten Ergebnisse werden beschrieben und das Potenzial dieser Extrakte zur Bekämpfung von Parasiten hervorgehoben.

Zusammenfassung

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Parasitäre Krankheiten, die durch gastrointestinale Nematoden (GIN) verursacht werden, gelten weltweit als wichtige limitierende Faktoren für die Tierproduktion, da sie das Tierwohl erheblich beeinträchtigen und die Produktionskosten erhöhen. Jahrelang stützte sich die Parasitenbekämpfung ausschließlich auf den Einsatz synthetischer Drogen. Weltweit wird zunehmend über die Resistenz von GIN gegen kommerzielle Anthelminthika berichtet. Daher haben sich alternative Ansätze für die Kontrolle von GIN bei Nutztieren herausgebildet, einschließlich der Erforschung von Pflanzen mit bioaktivem Potenzial. Tithonia diversifolia kann das ganze Jahr über geerntet werden, und alle Teile der Pflanze wurden in der Volksmedizin für eine Vielzahl von Krankheiten verwendet. In dieser Studie wurden die antioxidativen Eigenschaften von Wasser und 70 % wässrigen Acetonextrakten aus oberirdischen Teilen von T. diversifolia, einschließlich Blättern, Ästen und Blüten, unter Verwendung radikalbasierter Methoden untersucht und ihr anthelmintisches Potenzial durch ein Parasitenmodell unter Verwendung des Egg Hatching Assay (EHA) mit Wasserextrakten bewertet. Zusätzlich wurde der Gesamtpolyphenolgehalt der Extrakte bestimmt. Diese Ergebnisse unterstreichen T. diversifolia als vielversprechende natürliche Quelle für antioxidative und anthelmintische Verbindungen.

Einleitung

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Parasitäre Erkrankungen, die durch gastrointestinale Nematoden (GIN) verursacht werden, gelten weltweit als wichtige limitierende Faktoren für die Tierproduktion, da sie das Tierwohl erheblich beeinträchtigen und die Produktionskosten erhöhen1. Die Beziehung zwischen dem Parasiten und dem Vieh wird von mehreren Faktoren beeinflusst, die mit dem Wirt zusammenhängen, nämlich den genetischen Merkmalen der Resistenz und Widerstandsfähigkeit der Tiere, dem Ernährungszustand der Tiere, dem Grad des Parasitismus und der Pathogenität der beteiligten Parasitenpopulationen2.

Jahrelang hat sich die Parasitenbekämpfung ausschließlich auf synthetische Antiparasitika verlassen. Die anhaltende und ausschließliche Anwendung hat jedoch zum Aufkommen von Resistenzen geführt, was ihre Wirksamkeit verringert und die Suche nach alternativen Strategien erforderlich gemacht hat3. Die Resistenz von Nematoden gegen verschiedene Anthelminthika wird weltweit zunehmend beschrieben, was insbesondere in tropischen Regionen ein besorgniserregendes Szenario darstellt4. Darüber hinaus sind sich die Verbraucher zunehmend der Notwendigkeit bewusst, die Rückstände von Antiparasitika in tierischem Fleisch und in der Umwelt zu reduzieren5. Daher haben sich alternative Ansätze zur Bekämpfung von Nematodenparasiten bei Nutztieren herauskristallisiert6.

Tithonia diversifolia ist ein tropischer Strauch, der in Mittelamerika beheimatet ist und einzigartige Eigenschaften besitzt, die ihn für die Produktion von Wiederkäuern wertvoll machen. Sie kann das ganze Jahr über geerntet werden, und alle Teile der Pflanze werden traditionell von indigenen Gemeinschaften in der Volksmedizin zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten verwendet. Topisch wurde es zur Linderung von Bauchschmerzen, Wunden, Dermatose und Muskelerkrankungen angewendet, während die orale Verabreichung zur Behandlung von Infektionen, Malaria, Fieber, Hepatitis und Diabetes eingesetzt wurde. Diese vielfältigen therapeutischen Anwendungen unterstreichen sein breites medizinisches Potenzial7.

Oxidativer Stress spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und dem Fortschreiten parasitärer Infektionen, sowohl im Wirtsorganismus als auch im parasitären Organismus, der ums Überleben kämpft8. Aus diesem Grund ist der Nachweis der antioxidativen Aktivität entscheidend für die Bewertung der biologischen Aktivität von Heilpflanzenextrakten mit anthelminthischem Potenzial. Aufgrund einer parasitären Infektion nimmt die Konzentration von Antioxidantien im Wirt ab, während die Konzentration von Oxidationsprodukten der zellulären Bestandteile zunimmt. Im Falle von Parasiten ist die Aufrechterhaltung des oxidativen Gleichgewichts unerlässlich, um ihre Interaktion mit dem Wirt zu verlängern und sich gegen den im Wirtsorganismus erzeugten oxidativen Stress zu verteidigen9.

Die Hinweise auf die Entwicklung und rasche Ausbreitung von Resistenzen gegen Anthelminthika geben Anlass zur Befürchtung, dass häufig verwendete Behandlungen unwirksam werden könnten. Daher wird ein In-vitro-Test, der sogenannte Egg Hatch Assay (EHA), verwendet, um die Empfindlichkeit oder Resistenz gegenüber Benzimidazol (BZ) bei gastrointestinalen Nematoden zu beurteilen. Dieser Test wird häufig verwendet, um die anthelmintische Wirkung von Pflanzenextrakten auf Eiern zu bewerten und ihre Aktivität in Abhängigkeit von der Dosis zu vergleichen. Eine der Haupteinschränkungen dieses Assays ist die Variabilität des Eierschlüpfens zwischen den Tests. Die Lebensfähigkeit der Eizellen ist auf maximal 3 Stunden begrenzt, was eine schnelle Erholung und eine unverzügliche Einleitung erfordert. Trotzdem kann der Schlupfprozentsatz variieren. Aus diesem Grund wird festgelegt, dass mindestens 70 % der Eier in der Kontrollgruppe geschlüpft sein müssen, damit das Ergebnis als gültig angesehen wird10,11. Es handelt sich um einen günstigen, schnellen, einfachen und reproduzierbaren Test 12,13,14.

Die Verwendung von Pflanzenextrakten zur Erforschung von Alternativen zur GIN-Kontrolle basiert auf dem Vorhandensein von Sekundärmetaboliten und deren bioaktivem Potenzial. Eine der Herausforderungen in diesem Forschungsbereich ist die Menge und Stabilität der Sekundärmetaboliten, da diese je nach biotischen und abiotischen Faktoren sowie aufgrund des durch den Extraktionsprozess induzierten chemischen Stresses variieren 15,16,17.

In dieser Studie wurde die Hypothese aufgestellt, dass je nach Art des für die Extraktion verwendeten Lösungsmittels Unterschiede in den biologischen Aktivitäten (antioxidative und anthelmintische Wirkungen) auftreten könnten, was die Zusammensetzung der Polyphenole und damit ihre Bioaktivität beeinflussen könnte. Das Ziel dieses Manuskripts war es, die Schritte bei der Bewertung von Extrakten unter Verwendung eines In-vitro-Modells zu skizzieren, das leicht repliziert werden kann.

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Protokoll

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Die Tierethikkommission CEMIT genehmigt alle Versuche, bei denen Tiere manipuliert werden. Die Eizellspenderinnen gehören landwirtschaftlichen Betrieben, die mit dem CEMIT zusammenarbeiten, indem sie Kotproben für die vorbeugende Diagnostik zur Verfügung stellen. Bei diesen Tieren handelt es sich um Schafe oder Ziegen (keine spezifische Rasse) beiderlei Geschlechts, die älter als ein Jahr sind und nicht innerhalb von 15 Tagen vor der Probenentnahme entwurmt worden sein dürfen. Alle teilnehmenden Betriebe werden über die Verwendung der Proben zu Forschungszwecken informiert und geben ihr Einverständnis, an der Studie teilzunehmen. Für die Eizellentnahme werden zunächst die nahe gelegenen Betriebe benachrichtigt, und nach Erhalt der Genehmigung werden Vor-Ort-Besuche organisiert, um frische Kotproben zu entnehmen und eine Verarbeitung innerhalb von drei Stunden sicherzustellen. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Aufbereitung des Pflanzenmaterials

  1. Wählen Sie einen geeigneten Ort für die Sammlung der Pflanzenarten.
  2. Sammeln Sie mindestens zwei Exemplare von Tithonia diversifolia zur taxonomischen Identifizierung und zur Herbarvorbereitung.
  3. Sammeln Sie mindestens 1000 g T . diversifolia-Teile aus der Luft.
  4. Die gesammelte Biomasse wird bei Raumtemperatur (ca. 26 °C; siehe Abbildung 1) getrocknet.
  5. Mahlen Sie die getrocknete Biomasse mit einer elektrischen Mühle.
  6. Das Mahlgut im Kühlschrank bei 4 °C lagern.

2. Vorbereitung der Extrakte

  1. Bereiten Sie den Wasserextrakt vor:
    1. Mischen Sie 10 g getrocknete Biomasse mit 100 mL destilliertem Wasser bei 100 °C.
    2. Lassen Sie die Mischung 24 Stunden lang unter ständigem Schütteln bei 120 U/min mazerieren.
    3. Filtern Sie den Extrakt durch Filterpapier (Whatman Nr. 5 oder gleichwertig).
    4. Den gefilterten Extrakt gefriertrocknen.
  2. Bereiten Sie den Aceton-Extrakt vor:
    1. Mische 10 g getrocknetes Pflanzenmaterial mit 70% wässrigem Aceton im Verhältnis 1:3.
    2. Lassen Sie die Mischung 24 Stunden lang unter ständigem Schütteln bei 120 U/min mazerieren.
    3. Filtern Sie den Extrakt durch Filterpapier (Whatman Nr. 5 oder gleichwertig).
    4. Den gefilterten Extrakt gefriertrocknen.
      HINWEIS: Lagern Sie die lyophilisierten Extrakte zur besseren Konservierung bei -20 °C (siehe Abbildung 2). Stellen Sie sicher, dass mindestens 5 g lyophilisierte Extrakte erhalten werden.

3. Herstellung der Stammlösung

  1. Für den Antioxidans-Assay:
    1. Die getrockneten Extrakte werden in den entsprechenden Lösungsmitteln (destilliertes Wasser oder 70 % wässriges Aceton) auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml aufbereitet.
  2. Für den Ei-Brut-Assay:
    1. Verdünnen Sie 12 mg lyophilisierte Extrakte in 5 ml destilliertem Wasser, um eine Stammlösung von 2,4 mg/ml zu erhalten.
    2. Bereiten Sie fünf Konzentrationen vor: 1,2 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,3 mg/ml und 0,15 mg/ml (siehe Abbildung 3).
      HINWEIS: Passen Sie das Volumen der Stammlösung basierend auf der Anzahl der verwendeten Vertiefungen und Platten an. Wenn z. B. 48 Vertiefungen anstelle von 12 verwendet werden, reduzieren Sie das Volumen entsprechend. Bereiten Sie 6 mg in 2,5 mL anstelle von 12 mg in 5 mL zu.

4. Phytochemische Zusammensetzung

  1. Gesamtphenolgehalt von Extrakten (TPC)
    1. 5 μl der Proben werden mit 100 μl Folin-Ciocalteu (F-C)-Reagenz gemischt, das zu 10 × in destilliertem Wasser in transparenten Kunststoffplatten mit 96 Vertiefungen verdünnt ist.
    2. 10 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
    3. 100 μl Natriumcarbonatlösung (75 g/l in Wasser) zugeben.
    4. 90 Minuten bei RT inkubieren.
    5. Messen Sie die Extinktion bei 650 nm.
      HINWEIS: Geben Sie TPC als Gallussäureäquivalente (GAE) an. Erstellen Sie eine Kalibrierkurve mit mindestens fünf Konzentrationen von Gallussäure.
  2. Gesamtgehalt an Flavonoiden (TFC)
    1. Mischen Sie 50 μl der Extrakte mit 50 μl 2%igem Aluminiumchlorid in Methanol in transparenten 96-Well-Kunststoffplatten.
    2. 10 Minuten bei RT inkubieren.
    3. Messen Sie die Extinktion bei 405 nm.
      HINWEIS: Exprimieren Sie TFC als Quercetin-Äquivalente (QE). Erstellen Sie eine Kalibrierkurve mit mindestens fünf Konzentrationen von Quercetin.
  3. Gesamter Tanningehalt (TTC)
    1. Mischen Sie 10 μl der Extrakte mit 200 μl 1 % DMACA in Methanol und 100 μl 37 % HCl in transparenten 96-Well-Kunststoffplatten.
    2. 15 min bei RT inkubieren.
    3. Messen Sie die Extinktion bei 640 nm.
      HINWEIS: Geben Sie TTC in mg/ml Catechin an.

5. Antioxidans-Assay - ABTS

  1. 0,003514 g Kaliumpersulfat und 0,0203 g ABTS zu 5 ml destilliertem Wasser geben.
  2. Die Lösung in Alufolie einwickeln und bei 4 °C im Kühlschrank 12-16 h inkubieren.
  3. Messen Sie die Extinktion bei 734 nm und stellen Sie sie durch Zugabe von Ethanol auf ca. 0,7 ein. Mischen Sie zunächst 5 μl ABTS-Lösung mit 195 μl Ethanol.
  4. Mischen Sie in transparenten Kunststoffplatten mit 96 Vertiefungen 10 μl der Extrakte mit 190 μl ABTS-Lösung.
  5. Für die Positivkontrolle (C+) mischen Sie 10 μl Trolox (bestimmen Sie die Konzentration anhand einer Standardkurve auf der Grundlage der Extinktion der Probe) mit 190 μl ABTS-Lösung.
  6. Für die Negativkontrolle (C-) mischen Sie 10 μl des Lösungsmittels, das zum Auflösen der Extrakte verwendet wird (Wasser oder wässriges Aceton), mit 190 μl ABTS-Lösung.
  7. Inkubieren Sie die Platten 6 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT).
  8. Messen Sie die Extinktion bei 734 nm.
    HINWEIS: Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für einen ABTS-Assay.

6. Parasitologische Verfahren

  1. Sammeln Sie Kotproben direkt aus dem Enddarm von natürlich infizierten Ziegen.
    HINWEIS: Entnehmen Sie Kotproben direkt aus dem Enddarm von natürlich infizierten Ziegen und Schafen, um die Frische zu gewährleisten und eine Kontamination der Umwelt zu vermeiden. Halten Sie die Tiere vorsichtig mit geschultem Personal fest, um den Stress zu minimieren. Führen Sie mit sauberen Einweghandschuhen einen geschmierten, behandschuhten Finger in das Rektum ein und entnehmen Sie ca. 5-10 g Stuhl. Die Proben werden in saubere, beschriftete Kunststoffbehälter gegeben und bei 4-8 °C gelagert. Alle Proben werden innerhalb von 3 Stunden nach der Entnahme verarbeitet, um die Lebensfähigkeit der Helmintheneier zu erhalten. Befolgen Sie die institutionellen Tierschutzrichtlinien und holen Sie die Einverständniserklärung der Farmbesitzer ein.
  2. Identifizieren Sie die Tierarten, die mit jeder Probe verbunden sind.
  3. Mischen Sie 30 g jeder Stuhlprobe mit 50 ml gesättigter Salzlösung (Dichte = 1,2), um sich auf kognitive Assays vorzubereiten.
  4. Verwende eine McMaster-Folie, um die Eier zu zählen.
    1. Homogenisieren Sie 3 g Stuhlprobe in 50 mL gesättigter NaCl-Lösung. Die Mischung durch ein Käsetuch filtrieren, beide Kammern eines Objektträgers füllen und 5 Minuten stehen lassen.
    2. Untersuchen Sie den Objektträger unter einem Mikroskop mit 10× Vergrößerung und zählen Sie Eier vom Strongyle-Typ. Berechnen Sie Eier pro Gramm (EPG) nach der Formel: EPG = (Anzahl der Eier) × 50. Diese Methode standardisiert die Quantifizierung von gastrointestinalen Nematoden bei kleinen Wiederkäuern.
  5. Geben Sie die Anzahl der Eier in Eiern pro Gramm (EPG) an.
  6. Wählen Sie Stuhlproben mit einem EPG von mindestens 800 für die Vorbereitung der Stuhlkultur aus.
  7. Gewinnung von L3-Larven aus Kotkulturen und Identifizierung ihrer Gattungen oder Arten.
    HINWEIS: Gastrointestinale Nematodeneier werden während des Lebenszyklus im Gras abgelegt (siehe Abbildung 5). Kleine Wiederkäuer bei Nutztieren weisen häufig Polyparasitismus auf. Abbildung 6 zeigt die Schritte zum Durchführen der koprologischen Analyse.

7. In-vitro-Tests - Egg Hatch Assay (EHA)

  1. Sammeln Sie frische Stuhlproben.
  2. Filtern Sie den Kot zweimal mit steriler Gaze.
  3. Filtern Sie die entstandene Suspension und geben Sie sie in ein Sieb.
  4. Waschen Sie das Material auf dem Sieb mit destilliertem Wasser.
  5. Sammeln Sie die gewaschene Suspension in 15-ml-Röhrchen.
  6. Zentrifugieren Sie die Proben bei ~4800 × g für 5 min bei Raumtemperatur mit einer Tischzentrifuge, die mit einem schwingenden Schaufelrotor ausgestattet ist. Zweimal mit destilliertem Wasser und einmal mit gesättigter Kochsalzlösung zentrifugieren, um die Eier am Boden zu konzentrieren (siehe Abbildung 7 zur Eimorphologie).
  7. Die Eier in PBS resuspendieren.
  8. Stellen Sie die Eikonzentration für die Assay-Einrichtung auf 100 Eier/ml ein.
  9. Bereiten Sie die Positivkontrolle vor, indem Sie Thiabendazol (TBZ) in PBS bei 0,025 mg/ml auflösen.
  10. Bereiten Sie die Negativkontrolle mit der Eisuspension in PBS vor.
  11. Verwenden Sie für den Assay 48-Well-Multiwell-Platten.
  12. Bereiten Sie ein Endvolumen von 250 μl in jeder Vertiefung mit einer 50/50 (v/v) Mischung aus Extrakt und Eisuspension vor.
  13. Geben Sie ca. 100 Eier/ml in jede Vertiefung.
  14. Testen Sie jede Konzentration in vierfacher Ausführung (vier Wiederholungen).
  15. Zählen Sie die Eier unter einem inversen Mikroskop bei 40× Vergrößerung.
  16. Verwenden Sie nur Platten mit einer Schraffurrate von ≥70 %.
  17. Für jede Konzentration sind Larven (L1), ungeschlüpfte Eier (UnE), Eier mit Larven (LFE) und zerbrochene Eier (ME) zu zählen.
    HINWEIS: Eine repräsentative Zusammenfassung des Assay-Protokolls für den Eischlüpf ist in Abbildung 8 dargestellt.

8. Statistische Analyse

  1. Führen Sie deskriptive statistische Analysen mit Excel durch.
  2. Verwenden Sie eine unidirektionale Varianzanalyse (ANOVA) und t-Tests , um Unterschiede zwischen Konzentrationen bei einem Signifikanzniveau von 0,05 zu bewerten.
  3. Berechnen Sie die effektive Konzentration von 50 % (EC50) mit Hilfe der Probit-Analyse auf der Grundlage von log10-transformierten Konzentrationsdaten (siehe Zusatzdatei 1).

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Ergebnisse

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Gesamtphenolgehalt (TPC), Gesamtgehalt an Flavonoiden (TFC) und Gesamtgehalt an Tanninen (TTC)
Die Ergebnisse von TPC, TTC, TFC und ABTS an Tithonia diversifolia sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Werte werden ausgedrückt als mg Gallussäureäquivalente pro Gramm Trockenmasse (mg GAE/g TM) für TPC, mg Quercetinäquivalente pro Gramm Trockenmasse (mg QE/g TM) für TFC und mg Catechinäquivalente pro Gramm Trockenmasse (mg CE/g TM) für TTC. Die anti...

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Diskussion

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In diesem Artikel werden einige wesentliche Schritte zur Förderung der Forschung an Heilpflanzen beschrieben. In-vitro-Tests, wie der Egg Hatch Assay (EHA), sind besonders attraktiv, weil sie unter kontrollierten Laborbedingungen durchgeführt werden können. Die EHA wurde entwickelt, um die Aktivität von Pflanzenextrakten in verschiedenen Konzentrationen auf Nematodeneiern zu bewerten und die Ergebnisse sowohl mit Positiv- als auch mit Negativkontrollen zu vergleichen. Die erziel...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

An alle Produzenten, die uns vertrauen, dass wir die Probenahme mit ihren Tieren durchführen. Luísa Custódio erhielt portugiesische nationale Mittel von der Stiftung für Wissenschaft und Technologie (FCT) im Rahmen der Projekte UIDB/04326/2020 ( D O I: 1 0 . 5 4 4 9 9 / U I D B / 0 4 3 2 6 / 2 0 2 0 ), U I D P / 0 4 3 2 6 / 2 0 2 0 (DOI:10.54499/UIDP/04326/2020), LA/P/0101/2020 (DOI:10.54499/LA/P/0101/2020) und CEECIND/00425/2017. Rocio Avila erhielt den Nini's Endowed Internship Fund dafür, dass sie dieses Projekt ermöglicht hat, indem sie mich finanziell unterstützt hat, und das Carleton Career Center für professionelle Beratung und Unterstützung. Griselda Meza erhielt eine Beca de Investigación BINV02 -52 CONACYT - 2. Convocatoria, um nach Portugal zu reisen und phytochemische Untersuchungen durchzuführen. Ismael Llano erhielt die Beca Movility-Form PINV01 -306, CONACYT, um den Eischlupftest in Brasilien durchzuführen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15-mL-RöhrenVor Ort
48-Loch-PlatteVor Ort
96 BrunnenplattenVWR 734-0126
ABTSEnzymatischA1088.0005Vor Ort
Akademisches optisches Mikroskop und Invertiertes MikroskopVor Ort
AcetonEnzymatischA/0600/17
Aluminiumchlorid Sigma Aldrich6911
DMACA-ReagenzSigma Aldrich49825
Ethanol 96 %EnzymatischVR11202
Kot von TierenGesammelt auf Farmen in der Nähe der Universität
Folin CiocalteauSigma AldrichF9252
Gallische SäureSigma Aldrich91215
HClSigma Aldrich258148
McMaster-KameraVor Ort
MethanolEnzymatischM/4000/17
PBSVor Ort
PflanzenextrakteVor Ort
Kaliumpersulfat  Sigma Aldrich216224
QuercetinSigma AldrichQ4951
SalzVor Ort
Natriumcarbonat & nbsp;Sigma Aldrich1063920500
ThiabendazolVor Ort
TroloxSigma Aldrich648471Vor Ort
WasserVor Ort
Whatmann Nr. 5VWR WHAT97039654

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Schlagwörter

Antioxidative Eigenschaftengastrointestinale NematodenEi Schlupf Assaypolyphenolischer GehaltParasitenbek mpfungEier vom Strongylus TypDosis Wirkungs Beziehung

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