Method Article

Hochdurchsatzmethode zur Beobachtung von Motilitätsphänotypen bei Pseudomonas aeruginosa

DOI:

10.3791/67761

⸱

June 20th, 2025

 , 
1Département de biologie, Faculté des sciences, Université de Sherbrooke

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll stellt eine schnelle und effiziente Methode zur Identifizierung genetischer Faktoren dar, die an verschiedenen Arten von Motilitäten bei Pseudomonas aeruginosa beteiligt sind.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Motilitätsverhalten spielt oft eine wichtige Rolle für die Fähigkeit eines Bakteriums, die in seiner Umgebung verfügbaren Ressourcen zu nutzen. Dies gilt insbesondere für den vielseitigen Erreger Pseudomonas aeruginosa, der verschiedene Arten von Motilitäten aufweisen kann, darunter Schwärmen und Zucken, wichtige pathogene Merkmale, die zur Oberflächenbesiedlung, zur Biofilmbildung und zur Umgehung der Wirtsabwehr beitragen. Dieses Manuskript stellt ein Hochdurchsatz-Motilitätsprotokoll vor, um das Motilitätsverhalten von P. aeruginosa zu untersuchen. Das Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung mehrerer Stämme von P. aeruginosa aus einer genomweiten Mutantenbibliothek, um beispielsweise die genetischen Faktoren zu identifizieren und zu analysieren, die an seiner Motilität beteiligt sind. Der Ansatz bietet die Möglichkeit, die Motilität umfassend zu untersuchen und Einblicke in die molekularen Mechanismen zu erhalten, die der Motilität von P. aeruginosa zugrunde liegen. Das hier beschriebene Protokoll kann auch modifiziert werden, um verschiedene Arten von Motilitätsassays sowie andere Bakterienarten aufzunehmen und bietet somit eine leistungsfähige Plattform, um das Verständnis des bakteriellen Verhaltens in verschiedenen Kontexten voranzutreiben.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der aufgrund seiner bemerkenswerten metabolischen Vielseitigkeit verschiedene Umgebungen besiedeln kann 1,2. Diese Vielseitigkeit ist entscheidend für den Übergang von einer planktonischen Wachstumsweise zu Biofilmen, was dazu beiträgt, dass sie in einer Vielzahl von Nischen gedeiht, die vom Wasser biszum menschlichen Körper reichen 3,4,5. Der Übergang zwischen diesen Wachstumsmodi wird durch eine umfangreiche Fähigkeit unterstützt, sich mit verschiedenen Arten von Motilität, einschließlich Schwimmen, Schwärmen und Zucken, durch diese Umgebungen zu bewegen 1,6. Jede Art von Motilität wird durch unterschiedliche Mechanismen und zelluläre Strukturen vermittelt und ermöglicht es P. aeruginosa, auf Umweltreize zu reagieren 7,8. Die Schwimmmotilität wird von einem einzigen polaren Flagellum angetrieben und wird verwendet, um sich durch flüssige Medien zu Nährstoffen zu bewegen, z. B.9. Die Schwarmmotilität ist eine koordinierte Bewegung, die durch die Produktion von Flagellen und Biotensiden erleichtert wird und es den Kolonien ermöglicht, sich über halbfeste Oberflächen auszubreiten10,11. Schließlich ist die zuckende Motilität unabhängig von Geißeln. Stattdessen wird das Zucken durch Typ-IV-Pili (T4P) vermittelt und verwendet, um sich auf Oberflächen zu bewegen12,13. Die zuckende Motilität trägt auch zu den frühen Schritten der Biofilmbildung von P. aeruginosa bei, indem sie eine anfängliche Oberflächenanhaftung ermöglicht. Nach der ersten Anheftung ermöglicht das Zucken den Bakterien, sich über Oberflächen zu bewegen und Mikrokolonien zu bilden, die sich dann zu reifen Biofilmen entwickeln können 1,4,13.

Traditionell werden bakterielle Motilitätsassays einzeln, einen Stamm nach dem anderen, auf einer weichen Agarplatte oder unter Verwendung von Mikroskopiemethodendurchgeführt 6,14,15. Halbfeste Medien werden seit vielen Jahren bei der Untersuchung der bakteriellen Motilität eingesetzt. Heutzutage werden diese Techniken immer noch verwendet, um Motilitätsphänotypen bei Bakterien zu identifizieren. Zum Beispiel wird traditionell eine Schwarmmotilität beobachtet, indem 2,5 μl einer P. aeruginosa-Kultur in der Mitte einer Petrischale, die M9-Medien enthält, mit einer Agarkonzentration von 0,5 % bis 0,8 % inokuliertwerden 16. Die Twitching-Motilität wird in der Regel gemessen, indem man sich die Ausbreitung der Bakterien an der Grenzfläche zwischen Agar (bei 1%) und dem Boden einer Petrischale ansieht, nachdem ein Stich P. aeruginosa durch die Nährmedien geimpft hat. Ein großer Halo der interstitiellen Kolonieexpansion wird nach 48 Stunden Inkubation erreicht, während nicht-twitchende Stämme keine solche Zone der Kolonieexpansion erzeugen 1,17,18.

In jüngerer Zeit wurden im Rahmen von Transposon-Mutagenese-Ansätzen neue Gene entdeckt, die an der Motilität oder Biofilmbildung in P. aeruginosa beteiligt sind 19,20,21. Zum Beispiel wurden neue Gene, die an der zuckenden Motilität beteiligt sind, unter Verwendung einer Transposon-Mutantenbibliothek mit hoher Dichte in P. aeruginosa19 gefunden. Ein weiteres nützliches Werkzeug in der funktionellen Genomik ist die Verwendung geordneter Mutantensammlungen22,23. Die Keio-Sammlung24, die Einzelgendeletionen für alle nicht-essentiellen Gene in Escherichia coli enthält, ist wahrscheinlich die bekannteste Sammlung von Mutanten und wurde verwendet, um Gene zu definieren, die verschiedene Phänotypen beeinflussen, vom Wachstum in verschiedenen Medien25 bis zur Zellmorphologie26 und mehr. Solche Sammlungen gibt es auch für Salmonella enterica serovar Typhimurium27, Bacillus subtilis28, P. aeruginosa29 sowie viele andere Arten. Diese Sammlungen eignen sich auch gut, um die Motilität genomweit zu untersuchen, was zur Entwicklung einer Hochdurchsatzmethode zur Untersuchung der Motilität von P. aeruginosa führte. Hier wurde die Methode getestet, indem der Beitrag von Mutanten von P. aeruginosa zur Twitch- und Schwarmmotilität auf Platten mit hoher Dichte untersucht wurde. Diese Hochdurchsatzmethode kann für verschiedene Motilitätsphänotypen eingesetzt werden und eignet sich auch für die Untersuchung der Motilität anderer Bakterien.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HINWEIS: Der allgemeine Arbeitsablauf dieses Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Experimenteller Arbeitsablauf. (1) Bereiten Sie die erforderliche Menge an Motilitätsmedien basierend auf der Art der Motilität vor, die in den Experimenten von Interesse ist. (2) Bereiten Sie unter Verwendung eines manuellen oder automatisierten Replikatorsystems die Quell-Stammplatten für die P. aeruginosa-Transposon-Insertions-Mutantenbibliothek der Mutantensammlung bei der entsprechenden Dichte vor, wobei der Schwerpunkt auf Präzision und gleichmäßiger Inokulation über alle Vertiefungen der Platten liegt. (3) Übertragen Sie Proben von den Quellplatten der Mutantensammlung auf die Motilitätsplatten. (4) Beobachten und analysieren Sie nach der Inkubation Motilitätsphänotypen und identifizieren Sie die Gene, die an der interessierenden Motilität beteiligt sind, anhand hochwertiger Bilder. (5) Durchführung traditioneller Motilitätsassays zur Validierung der Treffer, die durch Hochdurchsatz-Motilitätsexperimente identifiziert wurden. Erstellt mit BioRender. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Schwarmplatten - M9 MedienTwitching Platten - LB mediaQuellplatten - LB media
200 mL einer 5x M9 Salzlösung10 g NaCl10 g NaCl
10 ml 20% Glukose10 g Trypton10 g Trypton
25 ml Casaminosäuren5 g Hefe-Extrakt5 g Hefe-Extrakt
1 ml 1M MgSO410 g Agar15 g Agar
500 mL 1% AgarFügen Sie dH2O zu 1L hinzuFügen Sie dH2O zu 1L hinzu
Fügen Sie dH2O zu 1L hinzuGentamicin (Endkonzentration 15 μg/ml)

Tabelle 1: Medienzusammensetzung für die verschiedenen Platten, die im Assay verwendet werden.

1. Vorbereiten von Nährbodenplatten

HINWEIS: Siehe Materialtabelle zur Vorbereitung von Stammlösungen und Lagerbedingungen. Die Platten sollten auf einer ebenen Fläche gefüllt werden. Beim Trocknen sollten die Platten flach auf der Oberfläche liegen (d. h. nicht gestapelt). Dadurch wird sichergestellt, dass das Nährmedium in der Platte gleichmäßig trocknet. Alle Uniwell-Platten mit einem typischen Footprint können verwendet werden, aber Platten mit größeren Innenabmessungen (ohne Innenwände), wie z. B. die Singer Instruments Plus Plates oder die VWR Single-Well-unbehandelten Gewebekulturplatten, erleichtern das Arbeiten mit einer höheren Dichte an Kolonien pro Platte.

  1. Bereiten Sie eine geeignete Menge an Medien für die Versuche gemäß dem Rezept in Tabelle 1 vor. Halten Sie das Medium bei ~45 °C - 50 °C, um zu verhindern, dass sich der Agar verfestigt.
    1. Bereiten Sie für Quellplatten 59-l-Platten (Lysogenbrühe) vor, die 1,5 % Agar und 15 μg/ml Gentamycin enthalten, die zur Replikation der gesamten PA14-Bibliothek benötigt werden - 59 x 25 mL =~ 1500 mL. Bereiten Sie weitere 15 Platten LB 1,5 % Agar und 15 μg/ml Gentamycin vor, um die Bibliothek im Format mit 384 Dichten zu skalieren - 15 x 25 mL = ~400 mL.
    2. Twitching Plates: Wenn Sie im Format mit 96er Dichte arbeiten, bereiten Sie 59 Twitching Plates (LB 1% Agar) vor. Bereiten Sie 15 zuckende Platten vor, wenn Sie im Format mit 384er Dichte arbeiten.
    3. Schwarmplatten: Bereiten Sie 15 (Format mit 384er Dichte) oder 59 (Format mit 96er Dichte) Schwarmplatten (M9-Glukose 0,5 % Agar) vor
  2. Nehmen Sie den Deckel von einer Platte und gießen Sie 25 ml Medium pro Platte ein. Verteilen Sie das Medium gleichmäßig auf der Platte, indem Sie jede Ecke der Platte vorsichtig einzeln anheben. Wiederholen Sie diese Wackelbewegung 2x-3x. Den Deckel wieder auf den Teller legen.
  3. Lassen Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur (RT) erstarren und trocknen. Wenn die Platten nicht sofort verwendet werden, legen Sie sie in hermetische Beutel und bewahren Sie sie an einem trockenen Ort auf. Sie können 3 Wochen gelagert werden.

2. Vorbereitung der Quellplatten der P. aeruginosa-Transposon-Mutantenbibliothek

HINWEIS: Quellplatten beziehen sich auf LBA-Gentamycin-Platten, die eine Kopie der PA14-Bibliothek enthalten, die später zum Beimpfen der Motilitätsplatten verwendet werden. Die P. aeruginosa-Transposon-Mutantenbibliothek (PA14-Bibliothek) besteht aus einem Satz von 59 gefrorenen 96-Well-Platten29. Die Schritte zum Vorbereiten von Quellplatten für jedes Format werden im Folgenden beschrieben. Dieses Protokoll ist für Labore anpassbar, die keinen Zugang zum Rotor+ Replikator haben. Die Forscher können die gleichen experimentellen Verfahren erfolgreich mit manuellen Replikatoren durchführen, wie z. B. den federbelasteten 96-Pin-Replikatoren, die hier für die Replikation der gefrorenen Platten der PA14-Bibliothek während Tag 1 verwendet werden (siehe Materialtabelle) oder anderen 96-Pin-Replikatoren. Manuelle Replikatoren müssen sterilisiert werden und zwischen jedem Gebrauch abkühlen lassen.

  1. Tag 1: Replikation der PA14-Bibliothek von den 59 gefrorenen 96-Well-Platten auf Quellplatten
    1. Sterilisieren Sie einen federbelasteten 96-poligen Replikator, indem Sie ihn 8 Minuten lang bei maximaler Temperatur auf eine Heizplatte stellen. Lassen Sie den Replikator nach der Sterilisation ausreichend abkühlen (~10 min), um das Abtöten von Bakterien zu vermeiden.
    2. Schnappen Sie sich eine Quellplatte. Tauchen Sie die Replikatorstifte mit dem sterilen 96-Pin-Replikator vorsichtig in eine 96-Well-Platte und übertragen Sie die Zellen dann direkt auf die Oberfläche der Quellplatte. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle 59 gefrorenen 96-Well-Platten der PA14-Bibliothek auf Quellplatten repliziert wurden.
    3. Inkubieren Sie die Quellplatten mit 96er Dichte bei 37 °C für 16-18 Stunden.
      HINWEIS: Wenn Sie das Verfahren mit einem Format mit 96er Dichte verwenden, können diese Quellplatten dann zum Beimpfen der Motilitätsplatten verwendet werden.
  2. Tag 2: Hochskalieren vom Format mit 96er Dichte auf das Format mit 384er Dichte
    HINWEIS: Tag 2 kann übersprungen werden, wenn mit einer Dichte von 96 gearbeitet wird.
    1. Lassen Sie die Platten nach der Inkubation (flach auf einer Oberfläche, nicht gestapelt) bei Raumtemperatur (~1 h) abkühlen. Wenn sich Kondenswasser auf den Deckeln befindet, entfernen Sie das Kondenswasser mit einem feinen Tuch, um zu verhindern, dass Wassertropfen auf die Platten fallen, die zu einer Kreuzkontamination zwischen den Kolonien führen könnten.
    2. Konfigurieren Sie den Replikator mit den folgenden Parametern, um eine genaue Kolonieübertragung zu gewährleisten. Schalten Sie den Replikator ein . Wählen Sie im Abschnitt Auswählen eines Betriebsmodus die Option Gespeicherte Programme auswählen und ausführen.
    3. Wählen Sie im Abschnitt Quellplatten auswählen die Option PlusPlate 96 Agar aus. Wählen Sie im Abschnitt Zielplatten auswählen die Option PlusPlate 384 Agar aus. Wählen Sie im Abschnitt Pads auswählen die Option Short Pin 96 aus.
    4. Wählen Sie im Abschnitt Programmoptionen replizieren die Option Allgemein und klicken Sie auf Recyceln > Keine.
    5. Wählen Sie im Abschnitt Quelle die Option Versatz und klicken Sie auf Zufällig > Standardradius. Wählen Sie im Abschnitt Ziel die Option Anheften und stellen Sie den Druck auf 20 % ein. Behalten Sie alle anderen Einstellungen als Standard bei.
    6. Setzen Sie die Short Pin RePads 96 in das entsprechende Fach ein.
    7. Positionieren Sie die Quell- und Zielplatten auf der dafür vorgesehenen Plattform des Replikators. Setzen Sie die Quellenplatten mit 96er Dichte (Platten 1, 2, 3 und 4) und die neue leere Quellenplatte (LBA-Platten) auf die Plattform. Unter Verwendung der ausgewählten Parameter wird der mikrobielle Array-Pinning-Roboter Kolonien von den Platten mit 96 Dichten auf die neue Platte mit 384 Dichten übertragen. Drücken Sie Ausführen.
    8. Ändern Sie alle Platten auf der Plattform (die nächsten vier Quellplatten mit 96er Dichte und eine neue leere Quellplatte), und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Platten hochskaliert wurden. Verwenden Sie für den letzten Satz Platten die Platten 57, 58, 59 und 1. Jede Platte mit 384er Dichte besteht aus abwechselnden Kolonien aus vier Platten mit 96er Dichte (siehe Abbildung 2). Inkubieren Sie die LBA-Platten mit einer Dichte von 384 μC bei 37 °C für 16-18 Stunden.
      HINWEIS: Diese 384-Dichte-Quellplatten können dann verwendet werden, um die Motilitätsplatte zu impfen, um das Protokoll bei 384-Dichte durchzuführen. Bei jedem Schritt nach der Inkubation können die Platten bis zu 3 Wochen bei 4 °C gelagert werden.

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Abbildung 2: Hochskalieren von Platten mit 96er Dichte auf Platten mit 384er Dichte. Kolonien von vier Quellplatten mit 96er Dichte werden übertragen und zu einer einzigen Platte mit 384er Dichte zusammengeführt. Jeder Quadrant der Platte mit 384er Dichte entspricht einer der ursprünglichen 96-Well-Platten (rot, blau, gelb und grün), wobei die Position jeder Mutante beibehalten wird. Erstellt mit BioRender. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Hochdurchsatz-Motilitätsexperiment

HINWEIS: Das Protokoll wurde hier im 384-Density-Format durchgeführt, aber das gleiche Protokoll kann an ein 96-Density-Format angepasst werden, indem die Parameter am Replikator so geändert werden, dass von Quellplatten auf Motilitätsplatten mit der Auswahl 96 anstelle von 384 übertragen wird.

  1. Lassen Sie die Platten nach der Inkubation (flach auf einer Oberfläche, nicht gestapelt) bei Raumtemperatur (~1 h) abkühlen. Wenn Kondenswasser auf den Deckeln auftritt, entfernen Sie es mit einem feinen Tuch, um zu verhindern, dass Wassertropfen auf die Platten fallen, die zu einer Kreuzkontamination zwischen den Kolonien führen könnten.
  2. Nehmen Sie die entsprechende Anzahl von Platten (59 für ein Format mit 96 Dichten oder 15 für ein Format mit 384 Dichten) für den gewünschten Assay: M9-Glukose 0,5 % Agarplatten zum Schwärmen, LB und 1 % Agarplatten zum Zucken.
  3. Konfigurieren Sie den Replikator mit den folgenden Parametern, um eine genaue Kolonieübertragung zu gewährleisten.
    1. Schalten Sie den Replikator ein . Wählen Sie im Abschnitt Auswählen eines Betriebsmodus die Option Gespeicherte Programme auswählen und ausführen. Wählen Sie im Abschnitt Quellplatten auswählen PlusPlate 384 Agar aus.
    2. Wählen Sie im Abschnitt Zielplatten auswählen die Option PlusPlate 384 Agar aus. Wählen Sie im Abschnitt Pads auswählen die Option Short Pin 384 aus. Wählen Sie im Abschnitt Programmoptionen replizieren die Option Allgemein > Recyceln > Keine.
    3. Wählen Sie in Singer-Programmen die Option Viele replizieren aus.
    4. Wählen Sie im Abschnitt Quelle die Option Offset > Random > Default Radius aus. Wählen Sie im Abschnitt Ziel die Option Anheften und stellen Sie den Druck auf 2 % ein. Behalten Sie alle anderen Einstellungen als Standard bei.
  4. Setzen Sie die Short Pin RePads 384 in das entsprechende Fach ein.
  5. Positionieren Sie die Quell- und Zielplatten auf der dafür vorgesehenen Plattform des Replikators. Platzieren Sie die Quellplatten mit 384er Dichte und die leeren Motilitätsplatten auf der Plattform. Drücken Sie Run Using the Selected Parameters, der mikrobielle Array-Pinning-Roboter überträgt Kolonien von den 384-Density-Quellplatten auf die Motilitätsplatten. Jede Platte mit 384er Dichte besteht aus einer Kopie einer Quellplatte mit 384er Dichte.
  6. Stellen Sie sicher, dass der Transfer gleichmäßig ist und dass alle Kolonien ordnungsgemäß auf der Agaroberfläche der Motilitätsplatten verankert sind. Legen Sie die geimpften Motilitätsplatten in Plastiktüten. Legen Sie die Beutel mit den Platten vorsichtig für 18 Stunden in einen auf 37 °C eingestellten Inkubator.
    HINWEIS: Die Platten werden in Beutel gelegt, um die Feuchtigkeit zu halten und ein ungleichmäßiges Austrocknen zu verhindern. Legen Sie die Platten mit den Deckeln nach oben in den Inkubator.
  7. Überprüfen Sie nach der Inkubation die Motilitätsplatten auf gleichmäßiges Koloniewachstum und keine Kontamination.
  8. Tag 3: Bildgebende Motilitätsplatten
    HINWEIS: Die Singer Instruments PhenoBooth wird verwendet, um hochauflösende Bilder der Motilitätsplatten aufzunehmen. Es verwendet eine wissenschaftliche Kamera und erzeugt 23-Megapixel-Bilder. Es verfügt über fünf Beleuchtungskanäle, um hochauflösende Bilder von Kolonien aus Petrischalen und rechteckigen Platten aufzunehmen. Andere hochwertige Imager funktionieren ebenfalls.
    1. Nach der Inkubationszeit sind die Motilitätsplatten bereit für den bildgebenden Prozess. Schalten Sie Phenobooth ein und klicken Sie auf das Symbol für die Phenobooth-Software.
    2. Die Seite "Projekt auswählen" wird geöffnet. Klicken Sie auf Neues Projekt > Koloniezählung. Wählen Sie den gewünschten Dateipfad aus, um die Bilder im Feld Speicherort zu speichern. Wählen Sie im Feld Auflösung die Option 5626 x 4220 aus. Klicken Sie auf OK, das Gerät ist jetzt bereit, Bilder aufzunehmen.
    3. Setzen Sie die Platte mit der mittleren Seite nach oben in das Lesegerät ein, nachdem Sie den Deckel entfernt haben. Stellen Sie sicher, dass die Platte richtig positioniert ist, bevor Sie das Lesegerät schließen, um ein Verklemmen der Platte zu vermeiden.
    4. Legen Sie den Parameter auf der Registerkarte Beleuchtung auf weißes Licht fest. Klicken Sie auf Vorschau. Passen Sie die Belichtungseinstellungen auf der Registerkarte "PhenoBooth-Einstellungen" an, um die optimalen Parameter für die Beobachtung von Motilitätsphänotypen zu erhalten.
    5. Klicken Sie auf Erwerben; Die aufgenommenen Bilder werden auf der linken Seite des Bildschirms angezeigt. Wenn Sie fertig sind, schließen Sie die Software (alle aufgenommenen Bilder werden in der zuvor ausgewählten Datei auf der Registerkarte Standort gespeichert).
      HINWEIS: Phenobooth speichert Bilder im JPEG-Format, aber für die nachgelagerten Analyseschritte können Bilder im TIFF-, JPEG- oder PNG-Format vorliegen.

4. Analyse der Motilitätsphänotypen

HINWEIS: Die Bildanalyse wird durchgeführt, wie von French et al.30,31 ausführlich beschrieben. Ein Skript zum Durchführen der Datenanalyse ist von31 (ImageJ Makro) verfügbar.

  1. Kurz gesagt, die Bilder werden in ImageJ32 verarbeitet, das einen Wert für jede Kolonie auf der Motilitätsplatte erzeugt. Konvertieren Sie zunächst Bilder in das 8-Bit-Format und segmentieren Sie die Kolonien und die zugehörigen Motilitätsbereiche mit dem Befehl threshold vom Hintergrund aus. Zeichnen Sie einen Region of Interest (ROI) um jede Kolonie und messen Sie die Motilitätsfläche. Dadurch wird eine Tabelle mit einem integrierten Dichtewert für jede Vertiefung generiert, die nach Zeilen geordnet ist. Diese Tabelle kann zur weiteren Analyse als CSV-Datei gespeichert werden.
    1. Führen Sie das Makro in ImageJ aus und öffnen Sie den Ordner mit den Bildern.
    2. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, passen Sie die Drehung der Platte an, indem Sie den Winkel der Platte mit der Option Vorschau so ändern, dass die Platte gerade ist. Wenn Sie zufrieden sind, klicken Sie auf die Schaltfläche OK .
    3. Verschieben Sie als Nächstes das Rechteck um die Völker und verwenden Sie es, um den Teil der Platte mit den Bienenvölkern zu beschneiden. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf die Schaltfläche OK .
    4. Die nächste Eingabeaufforderung definiert das Raster, das zum Zeichnen des ROI um jede Kolonie herum verwendet wird, und misst den Motilitätsbereich. Wählen Sie die entsprechende Koloniedichte aus. Passen Sie die verschiedenen Parameter bei Bedarf an, sodass sich jeder Kreis um eine Kolonie herum befindet. Wenn Sie fertig sind, aktivieren Sie die Schaltfläche Okay? und klicken Sie auf die Schaltfläche OK . Dadurch wird der Motilitätsbereich für jede Kolonie gemessen und eine CSV-Datei in dem Ordner gespeichert, der die Daten enthält.
  2. Kombinieren Sie diese CSV-Datei mit der Plattenlegende, die ebenfalls nach Zeilen geordnet ist, um jeden Motilitätsbereich mit der entsprechenden Mutante zu identifizieren. Niedrigere integrierte Dichtewerte entsprechen den Mutanten, die nicht beweglich waren oder eine verminderte Motilität aufwiesen.

5. Traditionelle Motilitätsassays zur Validierung von Treffern

HINWEIS: Nach der Beobachtung von Mutanten mit beeinflusster Motilität im Hochdurchsatz-Motilitätsprotokoll ist es wichtig, die erhaltenen Treffer einzeln zu validieren. Das individuelle Motilitätsprotokoll unterscheidet sich von dem, das für Hochdurchsatztests verwendet wird, aber die verwendeten Medien sind die gleichen.

  1. Motilitäts-Assay für Schwärmen
    HINWEIS: Die Schwarmmotilität wird wie von Ha et al.16 detailliert beschrieben durchgeführt.
    1. Kurz gesagt, autoklavieren Sie eine Agarlösung mit M9 (0,5 % Agar), Glukose, Casaminosäuren und MgSO4. Gießen Sie den abgekühlten, gemischten Agar in Petriplatten (25 mL pro Platte).
    2. Mit 2,5 μl Bakterienkultur über Nacht impfen. Inkubieren Sie 18 h lang bei 37 °C mit den Lidern nach oben, um die Motilitätsphänotypen zu beobachten.
  2. Assay für zuckende Motilität
    HINWEIS: Die zuckende Motilität wird wie von Haley et al.33,34 detailliert beschrieben durchgeführt.
    1. Kurz gesagt, einen LB 1% Agar autoklavieren (siehe Tabelle 1). Gießen Sie den abgekühlten, gemischten LB 1% Agar in Petriplatten (25 mL pro Platte).
    2. Stechen Sie Bakterien auf den Boden von Twitch-Platten (1% Agar). Die Platten werden 48 h lang bei 37 °C und anschließend weitere 48 h bei RT inkubiert. Nehmen Sie den Agar von der Platte und visualisieren Sie die zuckende Zone, indem Sie die Petrischale mit 1% Kristallviolett färben.
    3. Fotografieren Sie die Petrischalen mit der PhenoBooth mit den gleichen Parametern, die in Schritt 3 beschrieben wurden.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir haben dieses Protokoll verwendet, um den Effekt der Geninaktivierung auf die Motilität von P. aeruginosa im Hochdurchsatz zu charakterisieren. Hier haben wir detailliert beschrieben, wie es verwendet wird, um die schwärmende und zuckende Motilität in einer genomweiten Deletionssammlung von P zu untersuchen. aeruginosa Stamm PA14 (PA14-Bibliothek). Das Protokoll bietet eine große Vielseitigkeit und Benutzerfreundlichkeit und ermöglicht Änderungen an verschi...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das hier beschriebene Hochdurchsatz-Motilitätsprotokoll ermöglicht es uns, den Motilitätsphänotyp vieler Kolonien mit Präzision und Reproduzierbarkeit zu verarbeiten und zu analysieren. Im Vergleich zu herkömmlichen manuellen Methoden erhöht dieser halbautomatische Ansatz die Skalierbarkeit und den Durchsatz von Motilitätsassays, um die genomweite Beurteilung der bakteriellen Motilität zu ermöglichen. Das Protokoll wurde für die Verwendung mit der PA14-Bibliothek optimiert, aber dieser A...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keine Offenlegungen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken dem Surette-Labor an der McMaster University für die Bereitstellung einer Kopie der PA14-Bibliothek. Wir danken Dr. Fabrice Jean-Pierre für seine hilfreichen Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde vom Natural Science and Engineering Research Council of Canada (RGPIN-2019-06044) und einem Starting Grant für neue Forscher des Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS; #295613) unterstützt. J.-P.C. ist Stipendiatin des Chercheur boursier junior 2 des Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 Brunnenplatten   Corning   3701 
Agar Fisher Scientific   BP1423-2 Endkonzentration beträgt 0,5 % für Schwarmbeweglichkeit bzw. 1 % für zuckende Motilität.
Casaminosäuren   Fisher Scientific   223050 Bereite einen 20%-Fond in Wasser vor. Filter sterilisiert mit 0,22 μ m filtern und speichern bei 4 °C. Endkonzentration 0,5 % im M9-Minimalmedium.
Crystal Violet Bio Basic   CB0331Bereiten Sie eine 1%-Lösung in Wasser vor. 
D-Glukose   Bio Basic   GB0219 Bereiten Sie eine 20%ige Brühe (1,1 m) in Wasser vor und sterilisieren Sie sie durch Autoklavierung. Endkonzentration 0,2 % im M9-Minimalmedium.
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001
Gentamycinsulfat   Bio Basic   GB0217 Bereiten Sie eine Brühe mit 30 mg/ml in Wasser vor. Filter sterilisiert mit 0,22 μ m Filtern und Speichern bei 4 & Grad; C & Strich; Endkonzentration in Platten 15 & Mikro; g/mL..    
Inokulationsschleife und Nadel Fisher Scientific 22363597
M9 Minimale Salze, 5X&nblffel;Fisher Scientific 248510Bereiten Sie eine 1-Meter-Brühe in Wasser vor und sterilisieren Sie sie per Autoklav. Endkonzentration 1 mM im M9-Minimalmedium.  
Magnesiumsulfat (MgSO4)   Fisher Scientific M63-500  Bereite eine 1 M MgSO4-Brühe in Wasser vor. Filter sterilisiert mit 0,22 μ m Filter und Lagerung bei Raumtemperatur. Abschließende Schwerpunkt  
PA14 Transposon Insertion Mutant Library   Liberati et al., 2006 (siehe Referenz 29)59 Platten mit 96 Brunnen für die gesamte Sammlung. Jede Bohrung enthält einen einzelnen Mutanten in LB mit 25 % Glycerol.
Petrischale 92x16mm Sarstedt 82.1473.001
PhenoBooth+ Singer Instruments https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/ Lösen Sie 11,3 g des Pulvers in 200 ml gereinigtes Wasser. Autoklaven bei 121 °C; C für 15 Min. 
Kunststoffspritze 10 mL Fisher Scientific 14955459
Rotor+     Singer Instruments https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-had/ 
Short Pin RePads 384 Dichten Singer Instruments   REP-004 
Short Pin RePads 96 Dichten   Singer Instruments   REP-002 
Natriumchlorid (NaCl)   Fisher Scientific BP358-212 
Federbelasteter 96-poliger ReplikatorEnzyScreen   CR1000 
Chirurgische Klinge Edelstahl Nr. 25 Fisher Scientific 08-918-5F
Tryptone Oxoid   LP0042B 
Uniwell-PlattenSinger Instruments   PlusPlates: PLU-003   Plattenmaß: 54 & mal; 34 & Times; 38 cm – ohne Innenwände, die größere Innenmaße bieten. 
Uniwell-PlattenVWREinzelwell-Gewebekulturplatten: 75780-348Gleiche Maße wie die PlusPlates.
Hefeextrakt Fisher Scientific 248510 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burrows, L. L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annu Rev Microbiol. 66, 493-520 (2012).
  2. Khan, F., Pham, D. T. N., Oloketuyi, S. F., Kim, Y. M. Regulation and controlling the motility properties of Pseudomonas aeruginosa. Appl Microbiol Biotechnol. 104 (1), 33-49 (2020).
  3. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa new insights into pathogenesis and host defenses. Pathog Dis. 67 (3), 159-173 (2013).
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