Dieses Protokoll stellt eine schnelle und effiziente Methode zur Identifizierung genetischer Faktoren dar, die an verschiedenen Arten von Motilitäten bei Pseudomonas aeruginosa beteiligt sind.
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Methodenartikel
Hochdurchsatzmethode zur Beobachtung von Motilitätsphänotypen bei Pseudomonas aeruginosa
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Motilitätsverhalten spielt oft eine wichtige Rolle für die Fähigkeit eines Bakteriums, die in seiner Umgebung verfügbaren Ressourcen zu nutzen. Dies gilt insbesondere für den vielseitigen Erreger Pseudomonas aeruginosa, der verschiedene Arten von Motilitäten aufweisen kann, darunter Schwärmen und Zucken, wichtige pathogene Merkmale, die zur Oberflächenbesiedlung, zur Biofilmbildung und zur Umgehung der Wirtsabwehr beitragen. Dieses Manuskript stellt ein Hochdurchsatz-Motilitätsprotokoll vor, um das Motilitätsverhalten von P. aeruginosa zu untersuchen. Das Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung mehrerer Stämme von P. aeruginosa aus einer genomweiten Mutantenbibliothek, um beispielsweise die genetischen Faktoren zu identifizieren und zu analysieren, die an seiner Motilität beteiligt sind. Der Ansatz bietet die Möglichkeit, die Motilität umfassend zu untersuchen und Einblicke in die molekularen Mechanismen zu erhalten, die der Motilität von P. aeruginosa zugrunde liegen. Das hier beschriebene Protokoll kann auch modifiziert werden, um verschiedene Arten von Motilitätsassays sowie andere Bakterienarten aufzunehmen und bietet somit eine leistungsfähige Plattform, um das Verständnis des bakteriellen Verhaltens in verschiedenen Kontexten voranzutreiben.
Einleitung
Pseudomonas aeruginosa ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der aufgrund seiner bemerkenswerten metabolischen Vielseitigkeit verschiedene Umgebungen besiedeln kann 1,2. Diese Vielseitigkeit ist entscheidend für den Übergang von einer planktonischen Wachstumsweise zu Biofilmen, was dazu beiträgt, dass sie in einer Vielzahl von Nischen gedeiht, die vom Wasser biszum menschlichen Körper reichen 3,4,5. Der Übergang zwischen diesen Wachstumsmodi wird durch eine umfangreich....
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Protokoll
HINWEIS: Der allgemeine Arbeitsablauf dieses Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1: Experimenteller Arbeitsablauf. (1) Bereiten Sie die erforderliche Menge an Motilitätsmedien basierend auf der Art der Motilität vor, die in den Experimenten von Interesse ist. (2) Bereiten Sie unter Verwendung eines manuellen oder automatisierten Replikatorsystems die Que....
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Ergebnisse
Wir haben dieses Protokoll verwendet, um den Effekt der Geninaktivierung auf die Motilität von P. aeruginosa im Hochdurchsatz zu charakterisieren. Hier haben wir detailliert beschrieben, wie es verwendet wird, um die schwärmende und zuckende Motilität in einer genomweiten Deletionssammlung von P zu untersuchen. aeruginosa Stamm PA14 (PA14-Bibliothek). Das Protokoll bietet eine große Vielseitigkeit und Benutzerfreundlichkeit und ermöglicht Änderungen an verschi.......
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Diskussion
Das hier beschriebene Hochdurchsatz-Motilitätsprotokoll ermöglicht es uns, den Motilitätsphänotyp vieler Kolonien mit Präzision und Reproduzierbarkeit zu verarbeiten und zu analysieren. Im Vergleich zu herkömmlichen manuellen Methoden erhöht dieser halbautomatische Ansatz die Skalierbarkeit und den Durchsatz von Motilitätsassays, um die genomweite Beurteilung der bakteriellen Motilität zu ermöglichen. Das Protokoll wurde für die Verwendung mit der PA14-Bibliothek optimiert, aber dieser A.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Offenlegungen.
Danksagungen
Wir danken dem Surette-Labor an der McMaster University für die Bereitstellung einer Kopie der PA14-Bibliothek. Wir danken Dr. Fabrice Jean-Pierre für seine hilfreichen Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde vom Natural Science and Engineering Research Council of Canada (RGPIN-2019-06044) und einem Starting Grant für neue Forscher des Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS; #295613) unterstützt. J.-P.C. ist Stipendiatin des Chercheur boursier junior 2 des Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 96 Brunnenplatten | Corning | 3701 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | Endkonzentration beträgt 0,5 % für Schwarmbeweglichkeit bzw. 1 % für zuckende Motilität. |
| Casaminosäuren | Fisher Scientific | 223050 | Bereite einen 20%-Fond in Wasser vor. Filter sterilisiert mit 0,22 μ m filtern und speichern bei 4 °C. Endkonzentration 0,5 % im M9-Minimalmedium. |
| Crystal Violet | Bio Basic | CB0331 | Bereiten Sie eine 1%-Lösung in Wasser vor. |
| D-Glukose | Bio Basic | GB0219 | Bereiten Sie eine 20%ige Brühe (1,1 m) in Wasser vor und sterilisieren Sie sie durch Autoklavierung. Endkonzentration 0,2 % im M9-Minimalmedium. |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Gentamycinsulfat | Bio Basic | GB0217 | Bereiten Sie eine Brühe mit 30 mg/ml in Wasser vor. Filter sterilisiert mit 0,22 μ m Filtern und Speichern bei 4 & Grad; C & Strich; Endkonzentration in Platten 15 & Mikro; g/mL.. |
| Inokulationsschleife und Nadel | Fisher Scientific | 22363597 | |
| M9 Minimale Salze, 5X&nblffel; | Fisher Scientific | 248510 | Bereiten Sie eine 1-Meter-Brühe in Wasser vor und sterilisieren Sie sie per Autoklav. Endkonzentration 1 mM im M9-Minimalmedium. |
| Magnesiumsulfat (MgSO4) | Fisher Scientific | M63-500 | Bereite eine 1 M MgSO4-Brühe in Wasser vor. Filter sterilisiert mit 0,22 μ m Filter und Lagerung bei Raumtemperatur. Abschließende Schwerpunkt |
| PA14 Transposon Insertion Mutant Library | Liberati et al., 2006 (siehe Referenz 29) | 59 Platten mit 96 Brunnen für die gesamte Sammlung. Jede Bohrung enthält einen einzelnen Mutanten in LB mit 25 % Glycerol. | |
| Petrischale 92x16mm | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| PhenoBooth+ | Singer Instruments | https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/ | Lösen Sie 11,3 g des Pulvers in 200 ml gereinigtes Wasser. Autoklaven bei 121 °C; C für 15 Min. |
| Kunststoffspritze 10 mL | Fisher Scientific | 14955459 | |
| Rotor+ | Singer Instruments | https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-had/ | |
| Short Pin RePads 384 Dichten | Singer Instruments | REP-004 | |
| Short Pin RePads 96 Dichten | Singer Instruments | REP-002 | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Federbelasteter 96-poliger Replikator | EnzyScreen | CR1000 | |
| Chirurgische Klinge Edelstahl Nr. 25 | Fisher Scientific | 08-918-5F | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Uniwell-Platten | Singer Instruments | PlusPlates: PLU-003 | Plattenmaß: 54 & mal; 34 & Times; 38 cm – ohne Innenwände, die größere Innenmaße bieten. |
| Uniwell-Platten | VWR | Einzelwell-Gewebekulturplatten: 75780-348 | Gleiche Maße wie die PlusPlates. |
| Hefeextrakt | Fisher Scientific | 248510 |
Referenzen
- Burrows, L. L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annu Rev Microbiol. 66, 493-520 (2012).
- Khan, F., Pham, D. T. N., Oloketuyi, S. F., Kim, Y. M. Regulation and controlling the motility properties of Pseudomonas aeruginosa.<....
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Nachdrucke und Genehmigungen
