Eine vereinfachte Operation für das endovaskuläre Perforations-Mausmodell der Subarachnoidalblutung

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine vereinfachte Operation für das endovaskuläre Perforations-Mausmodell der Subarachnoidalblutung in Kombination mit neurologischem Scoring vor.

Zusammenfassung

Das endovaskuläre Perforationsmodell wird häufig als Methode zur Simulation von Subarachnoidalblutungen (SAB) in experimentellen Studien verwendet. So umfassend und zuverlässig es auch ist, es erfordert komplizierte Techniken. Dieses Protokoll vereinfacht das Modell in einigen Details, kombiniert mit neurologischem Scoring. Wir verwenden eine Nylonnaht, um die Arteria carotis communis (CCA) zu schlingen und zu ziehen, um den Blutfluss vorübergehend zu blockieren, anders als bei der herkömmlichen Ligatur, die ein klares Operationsfeld bietet. Die Verwendung des Elektrokauterstifts zur Verschmelzung der Blutgefäße verringert das Risiko von Blutungen. Darüber hinaus verwenden wir ein Filament mit einer schwarzen Markierung, um die Tiefe der Punktion leicht bestimmen zu können.

Das ungehinderte Vorschieben des schwarzen Markers an der Halsschlagadergabelung vorbei, an der die Arteria carotis communis (CCA) in die Arteria carotis interna (ICA) abzweigt, begleitet von minimalem Widerstand, deutet darauf hin, dass das Filament erfolgreich zum intrakraniellen Übergang der Arteria cerebraralis anterior (ACA) und der Arteria cerebral media (MCA) gelangt ist. Dieses Phänomen deutet darauf hin, dass sich das Filament an einem kritischen zerebrovaskulären Konvergenzpunkt befindet. Dann ermöglicht das leichte Vorschieben des Filaments nach vorne, um das Blutgefäß zu punktieren, eine einfachere Operation für die endovaskuläre Perforation bei Mäusen und erleichtert dadurch die Anwendung des endovaskulären Perforationsmodells bei genetisch veränderten Mäusen. Dies kann für die molekulare Forschung und die pharmazeutische Forschung und Entwicklung von entscheidender Bedeutung sein.

Einleitung

Subarachnoidalblutungen (SAB), eine schwere Unterform des Schlaganfalls, sind mit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten verbunden, insbesondere bei Menschen Mitte fünfzig. Die spontane SAB wird hauptsächlich durch die Ruptur von intrakraniellen Aneurysmen verursacht, die überwiegend im Kreis von Willis ^1,2 auftritt. Klinisch stellen sich die Patienten häufig mit Donnerschlagkopfschmerzen, neurologischen Funktionsstörungen und einem raschen Bewusstseinsabfall^{vor 3}. Trotz Fortschritten in der neurologischen Intensivmedizin sterben fast 40 % der Patienten innerhalb eines Monats nach der Blutung⁴. Nach einer aneurysmatischen SAB können mehrere sekundäre Komplikationen auftreten, die zu einer fortschreitenden neurologischen Verschlechterung führen. Die Pathophysiologie und die klinischen Merkmale der SAB sind jedoch noch wenig verstanden.

Um die zugrundeliegenden Mechanismen besser zu verstehen und die therapeutischen Strategien zu verbessern, sind umfassende und zuverlässige Modelle bei Kleintieren unabdingbar. Bisher wurden zahlreiche Protokolle zur Etablierung von SAH-Modellen vorgelegt. Ein Ansatz ist zum Beispiel die Injektion von autologem Blut in die Cisterna magna. Ein weiteres modifiziertes Protokoll beinhaltet zwei getrennte Injektionen, eine in die Cisterna magna und die andere in die Chiasma-Zisterne opticum. Die autologe Blutinjektion hat sich aufgrund ihrer technischen Einfachheit und der günstigen Sterblichkeitsrate weit verbreitet ^5,6. Um die Möglichkeit zu erreichen, ein kleineres und kostengünstigeres Versuchstier zu verwenden, beschrieben Barry et al. 1979 das erste SAH-Modell an Ratten, bei dem die Arteria basilaris mit Wolfram-Mikroelektroden nach Entfernung des Schädels punktiert wurde⁷.

Im Jahr 1995 wurde ein weiteres endovaskuläres Perforationsmodell vorgestellt, eine modifizierte Version des Zea-Longa-Modells der zerebralen Ischämie, dessen heutige Form sich später als das am häufigsten verwendete Modell zur Untersuchung von SAH⁸ erwies. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass Mäuse und Menschen eine ähnliche intrakranielle Gefäßstruktur besitzen, die als Willis-Kreis bezeichnet wird und in dem das intrakranielle Aneurysma überwiegend auftritt⁹. Diese nicht-kraniotomie Methode repliziert die Rupturmechanismen des menschlichen Aneurysmas durch präzise ICA-Bifurkationsperforation¹⁰. Darüber hinaus wird die genetisch veränderte Maus häufig bei der Erforschung molekularer Mechanismen eingesetzt. Aufgrund seiner komplizierten Techniken bei Kleintieren wird das endovaskuläre Perforationsmodell jedoch überwiegend bei Ratten oder Kaninchen eingesetzt, während seine Anwendung bei Mäusen vergleichsweise seltener ist. Daher ist es von großer Bedeutung, das endovaskuläre Perforations-Mausmodell zu vereinfachen und die hohe Mortalitätsrate zu senken.

In dieser Arbeit präsentieren wir eine vereinfachte Modifikation des endovaskulären Perforations-Mausmodells, die eine modifizierte Version der neurologischen Garcia-Bewertungsskala¹¹ integriert. Unsere Modifikation bietet ein einfaches, bequemes und zuverlässiges Modell für zukünftige experimentelle Studien der SAB.

Protokoll

C57BL/6 männliche Mäuse (6-8 Wochen alt), frei von spezifischen Krankheitserregern, wurden in einer Tiereinrichtung mit regulierten Temperatur- und Akklimatisierungsbedingungen gehalten, die auf einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten wurden. Die Mäuse erhielten unbegrenzten Zugang zu einer Standard-Nagetiernahrung und sterilisiertem Leitungswasser. Vor Beginn der Experimente wurde eine 2-wöchige Akklimatisierungsphase eingeräumt. Alle Eingriffe mit Tieren wurden von der Tierethikkommission des Longhua-Krankenhauses genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Nationalen Wissenschafts- und Technologiekomitees Chinas für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

1. Vorbereitung der Tiere

1. Stellen Sie die Maus auf ein auf 37 °C vorgeheiztes Heizkissen und halten Sie diese Temperatur bis zum Abschluss der Operation.
2. Betäuben Sie die Maus durch Inhalation von 2-2,5% Isofluran. Halten Sie während des Betriebs mit 1-1,5 % Isofluran bei einer Durchflussrate von 0,4-0,6 l/min.
3. Positionieren Sie die Maus auf dem Operationstisch, stabilisieren Sie ihren Kopf, halten Sie sie in Rückenlage und sichern Sie ihre Gliedmaßen mit Klebeband.

2. SAH-Induktion

1. Schneiden Sie die Haut mit einer Schere in der Mitte des vorderen Halses ein (Abbildung 1A).
2. Präparieren Sie das Bindegewebe und legen Sie die linke Arteria carotis communis (CCA) und ihre Verzweigungen frei.
   HINWEIS: Schützen Sie den Vagusnerv und die angrenzenden Drüsen vorsichtig (Abbildung 1B).
3. Schlingen Sie das CCA mit einer 6-0-Nylonnaht und lassen Sie die beiden Enden ohne Ligatur frei (Abbildung 1C).
4. Verbinden Sie beide Enden der Naht mit dem Tape und ziehen Sie die Naht vorsichtig nach unten und rechts in einem Winkel von 45° zur horizontalen Ebene. Befestigen Sie das Klebeband am Operationstisch, um den CCA vorübergehend zu blockieren (Abbildung 1D).
   HINWEIS: Wenn der Blutfluss innerhalb des verschlossenen Gefäßes fadenförmig wird, deutet dies auf einen erfolgreichen Verschluss hin.
5. Lizieren Sie die Arteria carotis externa (ECA) mit einer Nylonnaht (Abbildung 1E).
   HINWEIS: Die Kauterisationsstelle sollte so nah wie möglich am oberen Ende liegen, mit einer Länge von ca. 2 mm von der Halsschlagadergabelung.
6. Verschmelzen Sie den ECA distal mit einem Elektrokauterstift an der Ligaturstelle (Abbildung 1F).
7. Ziehen Sie die ECA langsam nach unten, bis die Arteria carotis interna (ICA) freiliegt. Richten Sie ECA und ICA in einer geraden Linie aus, um die richtige Position für den nächsten Eingriff sicherzustellen (Abbildung 1G).
8. Schärfen Sie die Oberseite des Filaments. Ein Markierungspunkt auf dem Filament befindet sich 8 mm von der Oberseite entfernt.
9. Machen Sie mit einer Schere einen kleinen Schnitt für das Einsetzen des Filaments in die ECA. Führen Sie das Filament mit einer Pinzette ein (Abbildung 1H).
10. Schieben Sie das Filament vorsichtig mit einer Pinzette vor, bis die schwarze Markierung vollständig durch die Bifurkation von CCA und ICA geht. Schieben Sie das Blutgefäß leicht um 2 mm vor (Abbildung 1I).
    HINWEIS: Es ist ein signifikanter Widerstand zu spüren, der darauf hinweist, dass die Bifurkation der vorderen Hirnarterie (ACA) und der mittleren Hirnarterie (MCA) erreicht wurde.
11. Ziehen Sie das Filament sofort nach der Perforation zurück.
12. Fixieren Sie den ECA mit einem Elektrokauterstift (Abbildung 1J).
13. Entfernen Sie das Klebeband und ziehen Sie die Nylonnaht des CCA zurück, um den Blutfluss wiederherzustellen. Beobachten Sie die offensichtliche Pulsation des CCA (Abbildung 1K).
14. Verschließen Sie den Halsschnitt mit 5-0 resorbierbaren Nähten.

3. Scheingruppe

1. In der Scheingruppe ist der gleiche chirurgische Eingriff durchzuführen, mit dem Unterschied, dass das Filament in der ICA teilweise vorgeschoben und ohne Punktion¹² zurückgezogen wird.

4. Ende des Versuchs

1. Vierundzwanzig Stunden nach der Operation bewerten Sie die neurologische Leistung gemäß der modifizierten Version des Bewertungssystems, das von Sugawara et ^al.11 (aus dem ursprünglichen Garcia et ^al.13) berichtet wurde. Führen Sie die folgenden sechs Bewertungen verblindet durch: spontane Aktivität, Bewegung aller Gliedmaßen, Bewegung der Vordergliedmaßen, Klettern an der Drahtkäfigwand, Reaktion auf Berührung auf beiden Seiten des Rumpfes und Reaktion auf Vibrissae-Stimulation. Bewerten Sie die neurologische Funktion anhand der Verhaltensbewertungstabelle (Tabelle 1).
2. Betäuben Sie die Maus mit inhalativem Isofluran. Legen Sie die Maus in Rückenlage und befestigen Sie sie mit Klebeband auf dem Operationstisch, um ihre Gliedmaßen zu fixieren. Machen Sie dann mit einer Schere einen Schnitt entlang der Mittellinie des Bauches, schneiden Sie die Bauchdecke durch und legen Sie die Brusthöhle frei. Schneide vorsichtig das Brustbein auf, um das Herz freizulegen.
3. Führen Sie vorsichtig eine Infusionsnadel in den linken Ventrikel ein und stellen Sie sicher, dass die Nadel stabil ist und nicht in das Herz eindringt.
4. Beginnen Sie mit der Perfusion mit vorgekühltem 1x PBS (4 °C) bei einer geeigneten Durchflussrate (ca. 10 ml/min), bis die ausströmende Flüssigkeit klar und transparent wird, was darauf hinweist, dass das Blut vollständig ersetzt wurde.
5. Sobald die Perfusion abgeschlossen ist, entfernen Sie die Infusionsnadel und stoppen Sie die Flüssigkeitsinfusion. Fahren Sie mit der Entnahme von Hirngewebe fort.

5. Postoperatives Management

1. Verabreichen Sie beim Verschließen der Haut eine intramuskuläre Injektion von Lornoxicam, um die Schmerzen der Mäuse zu lindern.
2. Tragen Sie während der Operation Augensalbe mit Erythromycin auf beide Augen auf, um die Trockenheit der Augen zu lindern.
3. Injizieren Sie nach der Operation basierend auf der Menge des Blutverlusts während des chirurgischen Prozesses 0,2-0,4 ml Kochsalzlösung intraperitoneal in die Maus zum Flüssigkeitsersatz.
4. Injizieren Sie intramuskulär Penicillin in einer Dosis von 40.000 Einheiten pro Tag an 3 aufeinanderfolgenden Tagen, um eine Infektion zu verhindern.
5. Kontrollieren Sie die Tiere in den ersten Stunden nach der Operation regelmäßig auf Spontanatmung und überwachen Sie sie zweimal täglich auf vordefinierte humane Endpunkte. Euthanasieren Sie die Mäuse sofort mit CO₂, wenn bei ihnen Atemprobleme festgestellt werden, die durch die Operation verursacht wurden, oder wenn sie Endpunkte erreichen, einschließlich >20 % Gewichtsverlust gegenüber dem Ausgangswert, anhaltende Unfähigkeit, Zugang zu Nahrung/Wasser zu erhalten, oder schwere neurologische Defizite.
   HINWEIS: Das Tier wird nicht unbeaufsichtigt gelassen, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrechtzuerhalten, und wird erst wieder in die Gesellschaft anderer Tiere zurückgebracht, wenn es sich vollständig erholt hat.

Ergebnisse

Neurologische Scores
Neun Mäuse jeder Gruppe wurden 24 h postoperativ unter Verwendung einer Modifikation des von Sugawara et ^al.11 berichteten Scoring-Systems zur Bewertung der SAB untersucht. Die maximal erreichbare Punktzahl beträgt 18. Unter ihnen erzielten n = 9 Tiere in der Scheingruppe alle 18 Punkte. In der SAH-Gruppe lag die durchschnittliche Punktzahl bei 11 (p < 0,0001) (Abbildung 2).

Krankhafte Ver...

Diskussion

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie ein vereinfachtes und zuverlässiges Mausmodell der Subarachnoidalblutung (SAB) darstellt, die durch endovaskuläre Filamentinsertion induziert wird und einen bequemen und effektiven Ansatz bietet. Im Vergleich zum bestehenden endovaskulären Perforationsmodell ist dieses Protokoll im Perforationsschritt dasselbe: Das Filament wird in die Arteria carotis externa (ECA) eingeführt, durch die Arteria carotis communis (CCA) vorgeschoben und an...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
C57BL/6 Mäuse	Shanghai Jiesjie Labortier Co., Ltd
Elektrokauterstift	Zhuoyu Angel Medical Equipment Co., Ltd	GermanV50	Geeignet für den Einsatz bei oberflächlichen kleineren Operationen, Gewebekoagulation und Kauterisation der Vegetation.
Isoflurance	RWD	R650-IE	Isofluran ist ein inhalatives Vollnarkosemittel. Es hat einen kleinen Blut-Gas-Verteilungskoeffizienten. Wenn es für die Tieranästhesie verwendet wird, kann es eine Anästhesie reibungslos, schnell und bequem einleiten, mit einer schnellen Genesung, einer guten Muskelentspannung und ohne erregende Wirkung auf das sympathische Nervensystem. Die Stoffwechselrate von Isofluran in der Leber ist niedrig, so dass es für die Leber wenig toxisch ist und es auch bei wiederholter Anwendung keine offensichtlichen Nebenwirkungen gibt. Um die nachteiligen Auswirkungen von Anästhesieabgasen auf die Umwelt und das Laborpersonal zu vermeiden, wird empfohlen, es zusammen mit einem Gasrückgewinnungssystem zu verwenden.
MACO Filament	Beijing Cinontech Co.LTD	1620-A2	Hauptsächlich für Mäuse mit einem Gewicht von 20-25 g verwendet, wird die Nahtspitze in eine halbkugelförmige Form geschmolzen, ohne Polylysin- oder Silikonbeschichtung, 9-10 mm von der Spitze entfernt markiert, desinfiziert und kann direkt verwendet werden. Dieses Modell verfügt über drei Verpackungsspezifikationen. Es wird empfohlen, vor dem formalen Experiment einen Vorversuch durchzuführen, um das geeignete Modell zu bestimmen.
Mikroskop	Olympus	BX61VS	Ein vollmotorisiertes aufrechtes Mikroskop, das mit dem optischen System UIS2 ausgestattet ist und für hochauflösende und hochpräzise Bildgebung entwickelt wurde. Zu den Merkmalen gehören ein motorisierter Objektivrevolver, ein Tisch und ein Fokus sowie virtuelle Objektträgerfunktionen zur Erstellung großer, hochauflösender digitaler Bilder von Proben. Geeignet für fortgeschrittene Forschungsanwendungen in der Pathologie, Zellbiologie, Neurowissenschaften und Materialwissenschaft.
Nylon-Naht	Huawei Medical Supplies Co., Ltd	J1110	Ein nicht resorbierbares chirurgisches Nahtmaterial aus hochfesten, biokompatiblen Materialien.