Sexuelle Kreuzungen mit dem Mucoromyceten Phycomyces blakesleeanus

Luke Stanley; Jesús  F. Peña

doi:10.3791/67790

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Methodenartikel

Sexuelle Kreuzungen mit dem Mucoromyceten Phycomyces blakesleeanus

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DOI:

10.3791/67790

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6. Juni 2025

Luke Stanley¹ , Jesús F. Peña¹

¹Organismal Biology and Ecology Department, Colorado College

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein grundlegendes Protokoll für die Induktion der Paarung von P. blakesleeanus vor.

Zusammenfassung

Phycomyces blakesleeanus, ein filamentöser Pilz aus dem Stamm der Mucoromycota, zeichnet sich durch seine bemerkenswerte Fähigkeit zur Umweltwahrnehmung und adaptiven Reaktionen aus. Während frühere Arbeiten gezeigt haben, dass Umweltreize wie Schwerkraft, Licht, Feuchtigkeit und Nährstoffverfügbarkeit die Wachstumsdynamik und die Fortpflanzungsstrategien beeinflussen, bleiben die zugrunde liegenden Mechanismen ein Schwerpunkt der Forschung. Umwelteinflüsse lösen sexuelle oder asexuelle Fortpflanzung aus. Die sexuelle Fortpflanzung beginnt mit der Pheromonsignalisierung, die eine Hyphen-Chemoattraktion auslöst und schließlich zu seriellen morphologischen Übergängen führt, die in der Bildung einer Zygospore gipfeln.

In einer Laborumgebung führen Kreuzungen von P. blakesleeanus zu komplementären Myzelien, die den Sexualzyklus in verschiedenen Stadien durchlaufen. Unsere Arbeit zielt darauf ab, zu testen, ob Umweltreize eine Paarung über das Myzel von P. blakesleeanus auslösen können. Kreuzungen von P. blakesleeanu s,die auf nährstoffbegrenzten Medien gezüchtet werden, werden nährstoffbegrenztem Agar unterzogen, um eine sexuelle Reaktion in Übereinstimmung mit dem Nährstoffmangel auszulösen. Die erfolgreiche Auslösung der Paarung bei P. blakesleeanus wird zukünftige Studien erleichtern, die eine große Menge an sexuell reproduzierenden Myzelien in bestimmten Stadien erfordern. Das Ergebnis dieser Forschung wird unser Verständnis darüber, wie die Fortpflanzungsmechanismen von P. blakesleeanus durch Umweltfaktoren beeinflusst werden, weiter verbessern und zu einer breiteren Wissensbasis über die sexuelle Fortpflanzung von filamentösen Pilzen beitragen.

Einleitung

Die Induktion der Paarung in Pilzsystemen unter Laborbedingungen hat das Verständnis der eukaryotischen Genetik, Zellbiologie, Evolutionsbiologie und Biotechnologie vorangetrieben. Die dikarischen Pilze, insbesondere die Ascomycota, verfügen über das umfangreichste Wissen über die Paarungsinduktion in einer Laborumgebung¹. Interessanterweise ist der erste Pilz, bei dem die sexuelle Fortpflanzung vorgeschlagen wurde, Syzygites megalocarpus, kein Mitglied der Ascomycota, sondern ein Mitglied des Stammes Mucoromycota². Der Stamm Mucoromycota ist eine frühe divergierende Gruppe, die früher als "Zygomycota" klassifiziert wurde, heute aber als Schwester der dikaryischen Linien gilt ^3,4. Die Mucoromycota sind zusammen mit Zoopagomycota evolutionär bedeutsam, da diese Stämme den Übergang von Pilzen zu terrestrischen Ökosystemen darstellen ^4,5. Wie andere Pilze auch, verwenden die Mukoromyceten asexuelle und sexuelle Fortpflanzungsstrategien als Reaktion auf ihre Umwelt ^3,6. Unter nährstoffarmen Bedingungen beginnen Mukoromyceten den Sexualzyklus⁶. Mukoromyceten weisen sowohl homothallische als auch heterothallische Paarungsmechanismen auf, wobei die Kompatibilität durch die Paarungstyp-Gene sexM und sexP bestimmt wird, die als (-) bzw. (+) bezeichnet werden ^7,8,9.

Blakeslee¹⁰ betonte die Empfindlichkeit des Mukoromyceten-Sexualzyklus gegenüber äußeren Bedingungen und stellte fest, dass Feuchtigkeit für ihre Bildung entscheidend ist und dass die Nährstoffverfügbarkeit im Substrat eine wichtige Rolle spielt. Komplementäre Paarungstypen beginnen den Sexualzyklus durch kooperative Synthese von Trisporinsäuren (TA) unter Verwendung von Beta-Carotin als Vorläufer 11,12,13. Nach dem Nachweis von TA verdicken sich die reagierenden vegetativen Hyphen und werden zu stark verzweigten Zygophoren 14,15,16. Die Zygophoren setzen die Produktion von TA fort und ziehen sich gegenseitig chemoan. In P. blakesleeanus differenzieren sich Zygophoren innerhalb des Substrats und sind auf festen Agarmedien nicht ohne weiteres sichtbar¹⁷. Bei Kontakt verflechten sich die Zygophoren und werden zu Zygophoren in der Luft.

Im weiteren Verlauf des Sexualzyklus heften sich die Spitzen der Zygophoren an, und die Mitte der Zellen schiebt sich heraus, um eine ringförmige Struktur mit einer koralloiden Schwellung an der Basis zu bilden, die den Übergang zum Progametangium vervollständigt. Die Spitzen der Zellen, die das Progametangium bilden, beginnen zu verschmelzen und entwickeln sich zum Gametangium. Im Gametangia-Stadium weisen die Zygophoren dornenartige Verzierungen auf. Die Zellwand an den Spitzen löst sich auf und es erscheinen Adventivsepten, die den Bereich abgrenzen, in dem sich die Zygospore bilden wird, und die Zygophoren wirken als zangenartige Suspensoren¹⁸. Die Zygospore wird pigmentiert, wenn sich ihre Zellwand verdickt und sie zusätzliche dornenartige Verzierungen erhält^17,18. Sobald sich die Zygospore gebildet hat, tritt sie in eine Ruhephase ein, bevor sie den Wachstumszyklus wieder aufnimmt.

Phycomyces blakesleeanus ist ein heterothallischer Mukoromycet, der sich durch seine großen Zellen und umweltrelevanten Sporangiophoren auszeichnet ^6,8,18. Dieser Organismus lässt sich leicht im Labor kultivieren und die Teile des Sexualzyklus, die zur Bildung von Zygosporen führen, können innerhalb von 8-10 Tagen beobachtet werden. Als Modell wurde P. blakesleeanus auf seine Fähigkeit untersucht, Licht in seiner Umgebung wahrzunehmen^17,19. Die einfache Kultivierung und die Fähigkeit, Paarungen zu induzieren, machten sie auch zu einem idealen Modell, um den Mechanismus hinter ihrer Fähigkeit, Licht wahrzunehmen, zu untersuchen²⁰; Diese Ergebnisse unterstreichen auch die evolutionäre Konservierung der Lichtsensormechanismen in Pilzen. Bei P. blakesleeanus wurde gezeigt, dass Licht die sexuelle Fortpflanzung über diese konservierten lichtempfindlichen Proteine hemmt²¹. Neuere evolutionäre Entwicklungsstudien haben versucht zu verstehen, welche Gene zur Zelldifferenzierung während des Sexualzyklus von P. blakesleeanus beitragen⁶. Die Korrelation der Morphogenese mit bestimmten Genen würde erfordern, dass ausreichend Gewebe derselben Zelltypen isoliert wird, um Genexpressionsstudien durchführen zu können.

Während Protokolle zur Induktion der Paarung von P. blakesleeanus in einer Laborumgebung bereits beschrieben wurden, erwähnen einige nur die Art des zu verwendenden Mediums und die relevanten Stämme¹⁸. Einige Protokollbeschreibungen enthalten keine spezifische Medienformulierung, beschreiben jedoch, wo mutmaßliche komplementäre Stecktypen auf einer Platte¹⁰ positioniert werden müssen. Neuere Protokolle ermöglichen eine erhöhte Produktion von Zygosporen, indem entweder Sporen jedes Paarungstyps gemischt und mit der gemischten Sporensuspension²¹ geimpft werden, oder indem die Paarungstypen in einiger Entfernung voneinander platziert und die Kultur 20 Tage lang inkubiert wird²². Diese Ansätze sind nützlich für die Erzeugung großer differenzierter Zellen, insbesondere Zygosporen, sind aber möglicherweise nicht geeignet für die Beobachtung eines Entwicklungszeitverlaufs oder die Auswahl sexueller Strukturen, die sich vor den Zygosporen für die Einzelzelltranskriptomik bilden. Andere Arbeiten haben sich damit befasst, indem sie komplementäre Paarungstypen mit Abstand voneinander auf festen Medien platzierten, um die Beobachtung serieller morphologischer Übergänge zu Beginn des Sexualzyklus zu ermöglichen ^6,22,23. Wie andere Pilze auch, dehnt sich das Myzel von P. blakesleeanus radial aus^24,25. Wenn also komplementäre Paarungstypen auf derselben Platte gezüchtet werden, kommen verschiedene Teile ihres Myzels zu unterschiedlichen Zeiten in Kontakt. Da der Kontakt zwischen Myzelien zu einem der ersten Schritte im Sexualzyklus von P. blakesleeanus gehört, bedeutet dies, dass sich verschiedene Teile des interagierenden Myzels in unterschiedlichen Stadien des Sexualzyklus befinden. Diese Asynchronität könnte sich auf das Ergebnis einer Genexpressionsstudie auswirken, so dass es schwierig wäre, die Rolle eines Gens einer bestimmten Struktur zuzuschreiben, wenn differenzierte Zelltypen gemischt werden und wenn sie unterschiedliche Genexpressionsprogramme haben.

Neben dem Wert von P. blakesleeanus als Modell für die Untersuchung von Genen, die an der Morphogenese während des Sexualzyklus beteiligt sind, machen sein kräftiges Wachstum und seine Fähigkeit, sich innerhalb weniger Tage zu differenzieren, ihn zu einem idealen Pilz für die Ausbildung von Studenten, die sich für früh divergierende filamentöse Pilze interessieren, und für den Einsatz in einem Bachelor-Klassenzimmer, um mehr über die Vielfalt von Pilzen und ihre Entwicklungsprozesse zu erfahren. Das hier vorgestellte Protokoll verwendet drei Konzentrationen von zwei verschiedenen Arten von Medien, um die Wirkung der Nährstoffverfügbarkeit auf das Aussehen des Myzels, die Induktion der Paarung und die Anreicherung für bestimmte Sexualstrukturen zu demonstrieren, entweder zur Quantifizierung, zur Beobachtung oder zur potenziellen Einzelzell-Transkriptomik.