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Hitzetoleranz-Assays mit dem Drosophila Activity Monitor System: Ein Leitfaden für eine ausführbare Anwendung zur Datenanalyse

DOI:

10.3791/67814

⸱

December 13th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Nebraska at Kearney, 2School of Computing, University of Nebraska-Lincoln, 3Department of Psychology, University of Nebraska at Kearney, 4School of Biological Sciences, University of Nebraska-Lincoln

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Bericht beschreibt eine Methode zur Messung der Zeit bis zum Knockdown bei adulten Drosophila melanogaster mit einem Drosophila Activity Monitor (DAM2) als Reaktion auf einen Luftleitungs-Wärmestressor in einer Inkubatorkammer. Das DAM2 misst die Aktivität, indem es einzelne Flugbewegungen aufzeichnet, wenn sie einen Infrarotstrahl überqueren. Die Datenanalyse wird durch eine neuartige ausführbare Datei erleichtert, die von den Autoren erstellt wurde.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Untersuchung der Hitzetoleranz bei Drosophila melanogaster ist seit Jahrzehnten von besonderem Interesse für Forscher, wobei ein gängiger Ansatz zur Bewertung der Hitzetoleranz darin besteht, die Zeit bis zum Knockdown (TKD) nach Exposition gegenüber einer erhöhten Temperatur zu überwachen. Klassischerweise werden Fliegen in einzelnen Fläschchen untergebracht und in ein beheiztes Wasserbad gelegt. TKD wird dann manuell von Forschern überwacht. Obwohl diese manuellen Assays sehr gut etabliert sind, gibt es nach wie vor Probleme der Subjektivität und der konsequenten Anwendung einer greifbaren Definition der Beendigung aller Bewegungen, einschließlich Muskelkrämpfe, bei der Durchführung dieser manuellen Assays. Wir haben eine Hochdurchsatzmethode zur Automatisierung von Hitzetoleranz-Assays mit den TriKinetics Drosophila Activity Monitoren (DAM2) entwickelt. Um das DAM2-System zu begleiten, haben wir ein Programm geschrieben und eine einfach zu bedienende ausführbare Datei erstellt, die automatisch den Zeitpunkt der letzten Bewegung aus den generierten Aktivitätsdaten ausliest. Dieses Skript schreibt dann die Zeit bis zur Hitzelähmung (TKD) für jede Fliege in eine .csv Datei. Unsere Daten zeigen, dass diese automatisierte DAM2-Methode konsistent und zuverlässig ist. In der Zwischenzeit sind Aktivitätsprofile von Interesse, die aus den Aktivitätszähldaten erstellt wurden. Diese Aktivitätsprofile können zusammengestellt werden und haben das Potenzial, Hitzetoleranz-Assays um die relativ ununtersuchten Verhaltenskomponenten der Hitzetoleranz zu erweitern. In diesem Protokoll wird ausführlich beschrieben, wie das DAM2-System und das HoTDAM verwendet werden! Software zur Abschätzung der Hitzetoleranz bei D. melanogaster.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ektotherme reagieren auf Hitzestress typischerweise mit erhöhter Bewegungsaktivität. Dieses Phänomen ist für Forscher seit Jahrzehnten offensichtlich, mit der charakteristischen Verhaltensreaktion, die von Cowles und Bogert 1944 beschriebenwurde. Sie beschrieben, wie ein Organismus unter Hitzestress zunächst eine vermehrte Bewegung des Fortbewegungsapparates zeigt. Wenn sich der Hitzestress aufbaut, wechseln sich kurze Aktivitätsausbrüche mit Perioden der Inaktivität ab. Die Temperatur, bei der der Organismus keine koordinierte Bewegung mehr zeigen kann, ist das kritische thermische Maximum (CTmax). Es folgen muskuläre Spams, und schließlich bricht der Organismus zusammen 1,2. Dieser Zusammenbruch ist schwer zu definieren und stellt so etwas wie "Hitzestarre, Koma oder Tod"2 dar. Hier werden wir den Begriff physiologischer Kollaps verwenden, um uns theoretisch auf diesen verschwommenen Endpunkt von Hitzestress zu beziehen.

Drosophila, melanogaster und andere kleine Insekten waren wertvolle Modelle zur Untersuchung von Hitzestress. Um zumindest einen Teil der komplexen Sammlung von Merkmalen abzuschätzen, die die Hitzetoleranz ausmachen, haben viele Forscher die Zeit und die Temperatur, bei der der physiologische Kollaps auftritt, manuell beobachtet, was der Zeit bis zum Knockdown (TKD) bzw. CTmax entspricht. Obwohl diese manuellen Assay-Methoden sehr gut etabliert sind, weisen sie einige Nachteile auf. Es kann schwierig sein, eine operationelle Definition des physiologischen Kollapses zu etablieren und angemessen auf alle Fälle anzuwenden, insbesondere wenn die Beobachter weniger erfahren sind. An welchem Punkt geht der Organismus zum Beispiel von Muskelkrämpfen zum Zusammenbruch? Das Muster von Muskelkrämpfen und Anfallsaktivität vor dem Kollaps kann unvorhersehbar sein und eine genaue Beobachtung erschweren 2,3, was die Genauigkeit und Präzision gefährdet. Gleichzeitig begrenzt die Schwierigkeit der Beobachtung auch die Anzahl der Organismen, die gleichzeitig untersucht werden können, was die Skalierbarkeit einschränkt.

Da eine Erhöhung der Aktivität eine konsistente Reaktion auf Hitze ist und TKD und CTmax letztendlich der Punkt sind, an dem die Aktivität aufhört, haben wir versucht, die Drosophila Activity Monitore (DAM2) von TriKinetics zur Automatisierung von Hitzetoleranz-Assays einzusetzen. Wir haben kürzlich eine Methode für einen automatisierten Assay zusammen mit einer einfach zu bedienenden Software unter Verwendung des DAM2-Systems4 veröffentlicht. Der Assay wurde validiert, indem die Messungen der Hitzetoleranz in Bezug auf TKD mit einem klassischen manuellen beobachtungsbasierten TKD-Assay über mehrere Faktoren hinweg verglichen wurden. Wir untersuchten auch die lokomotorische Aktivitätskomponente von TKD-Assays, um den induzierbaren Thermotoleranz-Phänotyp weiter zu charakterisieren. Wir nannten den Assay und die dazugehörige Software HoTDAM! (Hitzetoleranz-Assays mit dem Drosophila Activity Monitoring System). Hier finden Sie eine detaillierte Beschreibung der automatisierten Hitzetoleranz-Assay-Methode mit dem DAM2-System und dem HoTDAM! Software. Der Assay ist einfach zu bedienen und leicht skalierbar, um die Messung vieler Organismen gleichzeitig zu ermöglichen.

In diesem Manuskript führten wir TKD-Assays an thermosensorischen mutierten Fliegen durch (transientes Rezeptorpotential Ankyrin 1; TRPA1) und ihre genetischen Kontrollen (weiß1118; W1118). Diese Organismen wurden ausgewählt, um die Bedeutung der charakteristischen erhöhten Aktivität, die bei Hitzestress beobachtet wurde, für den Assay hervorzuheben. TRPA1-Organismen zeigen dieses Fluchtverhalten nämlich, was den intrinsischen Zusammenhang zwischen konservierten Verhaltensreaktionen und Schätzungen der Hitzetoleranz, wie z. B. TKD, verdeutlicht. Wir führten den Assay sowohl für Weibchen als auch für Männchen durch und führten eine wärmehärtende Vorbehandlung durch. Bei den hier vorgestellten repräsentativen Ergebnissen handelt es sich um Daten von völlig neuen Assays als denen, die in den zuvor veröffentlichten ursprünglichen Validierungsassays verwendet wurden.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fliegenhaltung

  1. Wählen Sie den passenden Fliegenstock/die passende Linie für die Untersuchung.
    HINWEIS: Zur Veranschaulichung des Assays verwendeten wir den TRPA1-Knockout-Stamm des transienten Rezeptorpotentials und seine genetische Kontrolle, den w1118-Stamm .
  2. Bewahren Sie die Fliegenbestände gegebenenfalls unter gleichbleibenden Bedingungen auf. Um dieses Protokoll zu befolgen, sollten die Lagerbestände bei 25 °C und einem Tageszyklus von 12:12 Uhr mit Standardfutter (Maismehl, Melasse und Torula-Hefe) gelagert werden.
  3. Trennen Sie Männchen und Weibchen mit leichter Betäubung.
    HINWEIS: Je nach Versuch können jungfräuliche oder verpaarte Fliegen verwendet werden.
    1. Lassen Sie erwachsene Männchen und Weibchen (getrennt für beide Stämme) 5 Tage lang paaren und Eier ablegen. Befreien Sie die Erwachsenen von den Flaschen.
    2. Wenn Erwachsene einige Tage später anfangen, sich zu verschließen, räumen Sie die Flaschen wieder auf. Nach 2 Tagen trennen Sie die Männchen und Weibchen mit leichter Äthernarkose und lassen Sie sie getrennt bei einer Dichte von 25 Fliegen pro Fläschchen reifen.

2. Vorbehandlung

  1. Wenden Sie die Vorbehandlung oder die unabhängige Variable an, die die Versuchsgruppen definiert (genetisch, umweltbedingt, pharmakologistisch oder anderweitig).
    1. Um dieses Protokoll zu befolgen, trennen Sie die Erwachsenen nach Geschlecht und behandeln Sie nach 5 Tagen die Hälfte der Erwachsenen, indem Sie ein versiegeltes Fläschchen mit den Organismen 1 h lang in ein Wasserbad bei 37 °C tauchen. Halten Sie die Regler im Inkubator bei 25 °C. Lassen Sie die Fliegen nach der Vorbehandlung 24 Stunden lang erholen, bevor Sie die Hitzetoleranz testen.

3. Einrichtung des DAM2-Systems

  1. Laden Sie die Fliegen in die DAM2-Monitorröhrchen und verschließen Sie die Röhrchen an beiden Enden mit Watte. Wenn die Fliegen sofort auf ihre Hitzetoleranz beurteilt werden sollen, verwenden Sie keine Anästhesie, während Sie die Organismen in die Monitorröhrchen laden, um mögliche Störeffekte im Zusammenhang mit der Anästhesieexposition zu vermeiden. Stattdessen werden einzelne Fliegen aus den Haltegefäßen in die Monitorröhrchen abgesaugt.
  2. Setzen Sie die Analysenröhrchen in die Aktivitätsmonitore ein und notieren Sie sich, mit welchen Steckplatznummern die verschiedenen Gruppen geladen sind.
    HINWEIS: Diese können je nach Experiment randomisiert werden, wenn die Position innerhalb des Monitors als Störvariable angesehen werden könnte.
  3. DAM2 Datenerfassungssoftware
    HINWEIS: Das DAM2-System und die Software werden im DAMSystem3-Software-Datenblatt, das auf der Website des Unternehmens verfügbar ist, ausführlich beschrieben (siehe Materialtabelle). In den DAM2-Anweisungen finden Sie Informationen zur Fehlerbehebung und allgemeinen Funktionalität. Hier geben wir eine Anleitung für die Verwendung des Systems im Rahmen unseres Hitzetoleranz-Assays.
    1. Das DAM2-System überwacht, wie oft eine einzelne Fliege in jeder Röhre einen Infrarotstrahl bricht. Die Datenerfassungssoftware indiziert diese Zählung dann und setzt sie in jedem definierten Zeitintervall zurück. Wählen Sie unter "Einstellungen" das Leseintervall aus, das im Assay verwendet werden soll. Wir haben ein Leseintervall von 15 s gefunden, um ein gutes Gleichgewicht zwischen Auflösung und Lesefehlern zu erreichen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, das Leseintervall in Sekunden nicht kürzer zu halten als die Anzahl der verwendeten Monitore. Ein kürzeres Leseintervall sorgt für eine bessere zeitliche Auflösung des Assays, erhöht aber möglicherweise auch die Anzahl von Lesefehlern. Die Software kann beim Versuch, die Messwerte zu indizieren, ins Hintertreffen geraten. Darüber hinaus trägt ein neuerer, schnellerer Computer wesentlich dazu bei, Lesefehler zu vermeiden.
    2. Stellen Sie bei der Berücksichtigung von Lesefehlern sicher, dass der Computer, auf dem die DAM2-Datenerfassungssoftware ausgeführt wird, so eingestellt ist, dass er nie in den Ruhezustand versetzt wird, um den Assay nicht zu unterbrechen. Stellen Sie außerdem sicher, dass automatische Updates (einschließlich aller von der Einrichtung gesteuerten Netzwerkupdates) während der Datenerfassung deaktiviert sind.
    3. Vergewissern Sie sich, dass alle Monitore angeschlossen sind und mit der Software kommunizieren. Vergewissern Sie sich, dass der Status jedes Monitors auf der Registerkarte Aktuelle Daten grün ist.
      HINWEIS: Im Datenblatt der DAMSystem3-Software finden Sie Einzelheiten zu den Problemen, auf die sich verschiedene Farbcodes beziehen.
    4. Die Datenerfassungssoftware schreibt die Aktivitätszählungen automatisch in Textdateien im Datenordner innerhalb der Systemdateien. Um die Datenanalyse zu vereinfachen, löschen Sie alle Textdateien in diesem Datenordner , bevor Sie die Datenerfassungssoftware für einen Assay starten.
      HINWEIS: Die Textdateien werden automatisch ausgefüllt, daher ist es zulässig, sie aus diesem Ordner zu entfernen, um alte Daten zu löschen, ohne das Programm zu behindern.

4. Hitzetoleranz-Assay

  1. Legen Sie die Monitore in den Assay-Inkubator.
  2. Starten Sie die Erfassungssoftware und lassen Sie die Software für eine definierte Zeitspanne (z. B. 40 Indizes oder 10 min, wenn das Leseintervall auf 15 s eingestellt ist) indizieren, bevor Sie die Wärmespannung anwenden.
    HINWEIS: Dies ermöglicht eine gewisse Eingewöhnung an die Röhren und eine Erholung von der Bewegung der Monitore beim Aufstellen. Insbesondere wenn die Aktivität während des Assays analysiert wird, etabliert diese Akklimatisierungszeit eine Ausgangsaktivität vor der Induktion von Hitzestress. Abhängig von der spezifischen Art des durchzuführenden Assays kann diese Akklimatisierungsphase übersprungen werden, wobei die Monitore bereits bei der Stresstemperatur direkt in den Inkubator gestellt werden.
  3. Wenn Sie einen statischen (TKD) Assay durchführen, stellen Sie den Inkubator so ein, dass er nach der Eingewöhnungsphase so schnell wie möglich auf die eingestellte schädliche Temperatur hochfährt. Die Antwortvariable wird als die letzte aufgezeichnete Zeit der Bewegung (d. h. der letzte Index ungleich Null) operationalisiert, um die TKD zu schätzen.
    1. Wenn Sie einen dynamischen Assay durchführen, bestimmen Sie die Geschwindigkeit, mit der die Temperatur nach der Eingewöhnungsphase ansteigt. Hier ist die gemessene Antwortvariable technisch gesehen wieder die Zeit. Der Zeitpunkt, zu dem die letzte Bewegung aufgezeichnet wird, stimmt mit einer Temperatur (CTmax) überein, die von der Rampengeschwindigkeit abhängt.
    2. Überwachen Sie die Aktivitätszahlen in Echtzeit auf dem DAM-Systemdisplay in der Erfassungssoftware oder untersuchen Sie direkt die Textdateien im Datenordner in den DAMSystem3-Programmdateien. Kopieren Sie die Textdateien, und öffnen Sie die Kopie im Gegensatz zur Originaldatei im Datenordner, um Probleme bei der Live-Datenaufzeichnung zu vermeiden.
    3. Nachdem mehrere Minuten lang keine Bewegung in einer der Fliegen zu sehen ist, stoppen Sie die Erfassungssoftware.
      HINWEIS: Bei unseren Assays haben wir festgestellt, dass einige bis mehrere Minuten Inaktivität auf einen physiologischen Kollaps aufgrund von Hitzestress hinweisen, ähnlich wie bei den klassischen manuellen TKD-Assays. Dies hängt jedoch vom spontanen Fluchtverhalten ab. Berücksichtigen Sie daher mögliche Störvariablen, wenn die spezifische Behandlung in der Untersuchung diese Verhaltensreaktion verändern könnte. Darüber hinaus variiert die Länge des Assays natürlich in Abhängigkeit von den spezifischen Parametern des Assays (z. B. Temperatur, Behandlung).

5. Datenorganisation und -analyse

HINWEIS: Im Ergänzenden Video S1 finden Sie eine exemplarische Vorgehensweise zum Herunterladen der ausführbaren Anwendung von GitHub sowie die grundlegenden Funktionen der Software.

  1. Nachdem die Daten erfasst wurden, scannen Sie die Textdateien mit der referenzierten Software (siehe Materialtabelle) auf Fehler und wählen Sie bestimmte Start- und Endpunkte für das Binning von Aktivitätsdaten aus. Wenn ein Akklimatisierungsintervall von 10 Minuten implementiert wurde, starten Sie das Binning nach 10 Minuten in der Aktivitätsaufzeichnung. Weitere Informationen zum Binning finden Sie in der Diskussion.
  2. Öffnen Sie das HoTDAM! und importieren Sie die gescannten Monitordatendateien, indem Sie auf Datei | Monitordaten laden klicken.
    HINWEIS: Die Software und die ausführbare Anwendung sind auf GitHub (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) oder auf der Website des Unternehmens im Abschnitt Analysesoftware verfügbar. Beachten Sie, dass die ausführbare Anwendung derzeit nur mit Windows-Betriebssystemen kompatibel ist.
  3. Fügen Sie Gruppenbezeichnungen hinzu, um anzugeben, welche Behandlungsgruppen welcher Zelle innerhalb der DAM2-Monitore entsprechen.
    HINWEIS: Das Layout der Softwareoberfläche entspricht dem Layout der Monitore.
  4. Klicken Sie auf Multigruppendefinition starten , um ein Dialogfeld aufzurufen, in dem Sie eine Gruppenbezeichnung hinzufügen können, die auf mehrere Zellen angewendet wird. Sobald die Gruppenbezeichnung akzeptiert wurde, klicken Sie auf die Zellen, um die Gruppenbezeichnung zu übernehmen, und klicken Sie dann auf Multigruppenzuordnung stoppen.
    HINWEIS: Die Software organisiert und exportiert DAMSystem3-Daten in .csv Dateien, die in der Statistiksoftware analysiert werden sollen.
  5. Exportieren Sie die TKD (d.h. den letzten Index ungleich Null) für jede Fliege innerhalb der Monitore in eine .csv Datei, indem Sie auf Datei | Exportieren von Knockdown-Daten | Exportieren Sie alle Monitore oder exportieren Sie ausgewählte Monitore. TKD für jede Fliege wird in der Ausgabe nach Gruppenbezeichnung organisiert.
  6. Exportieren Sie die Aktivitätsdaten für jede Fliege, indem Sie auf Datei | Exportieren von Aktivitätsdaten | Exportieren Sie alle Monitore oder Exportieren Sie ausgewählte Monitore in eine .csv Datei, wobei nur der Zeitstempel und die Zähldaten beibehalten werden, um die Arbeit mit der Datendatei zu erleichtern und gleichzeitig bestimmte Gruppenbeschriftungen für jede Fliege zuzuweisen.
    HINWEIS: Die ersten Spalten in den DAMSystem3-Datendateien entsprechen den internen Daten für die Monitore (z. B. Lichtüberwachung oder Fehlermeldungen) während der Erfassung. Die Zähldaten befinden sich in den Spalten 11-42 (weitere Informationen finden Sie im DamSystem3-Datenblatt). Beim Exportieren der Aktivitätsdaten mit der Analysesoftware werden alle Spalten mit Ausnahme des Zeitstempels und der Zähldatenspalten entfernt.
  7. Wenn Sie ein CTmax-Experiment durchführen, verwenden Sie den TKD, um den CTmax anhand der Rate des Temperaturanstiegs zu bestimmen.
    figure-protocol-1
    HINWEIS: Die Analysesoftware wurde objektorientiert in C# geschrieben (Quellcode auf GitHub verfügbar; https://github.com/MatthewR47/HoTDAM), so dass Aspekte des Programms leicht geändert werden können, um eine Anpassung an bestimmte Zwecke zu ermöglichen.

6. Statistik

HINWEIS: Zur Analyse der TKD-Daten können viele verschiedene Tests verwendet werden, abhängig von den Besonderheiten des Versuchsaufbaus.

  1. Verwenden Sie Überlebensanalysen (z. B. Cox-Regression, Kaplan-Meier), um den Knockdown als ein Ereignis zu konzeptualisieren, das jede Fliege innerhalb des Assays erleben wird.
    HINWEIS: Für eine detaillierte Übersicht siehe Bradburns und Clarks 4-Artikel-Serie, in der die Überlebensanalyse und ihre Umsetzungdiskutiert 5,6,7,8.
  2. Verwenden Sie die ANOVA, um Gruppenunterschiede zu bewerten und Modalitäten zu vergleichen, insbesondere bei der Validierung des automatisierten Assays für bestimmte Bedingungen.
  3. Analysieren Sie die TKD-Daten mit der Kaplan-Meier-Überlebensanalyse. Teilen Sie die Datei nach Aktien auf, so dass die Analyse separat durchgeführt wird (z. B. für TRPA1- und w1118-Lagerzeilen). Wählen Sie die Zeitvariable als TKD (in min), den Knockdown als Ereignis, die Vorbehandlung als Faktor und das Geschlecht als Schicht.
  4. Führen Sie die Log-Rank-, Breslow- und Tarone-Ware-Tests durch, um die Vorbehandlung für jede Schicht (d. h. das Geschlecht) zu vergleichen, und zeigen Sie zur Veranschaulichung verschiedene Methoden.
  5. Konstruieren Sie Überlebenspläne.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Analysen für TRPA1 - und w1118-Bestände wurden getrennt durchgeführt. Perzentile, TKD-Zeiten und andere Deskriptive sind in Tabelle 1 zu finden.

Perzentilea
SexBehandlung25.00%50.00%75.00%
NSchätzenStd.-FehlerSchätzenStd.-FehlerSchätzenStd.-Fehler
Nr. W1118
WeiblichSteuerung1642.500.4340.752.0038.750.43
Gehärtet1648.754.5543.252.5038.501.95
MännlichSteuerung1643.251.8839.750.2537.002.38
Gehärtet1646.505.6335.502.0030.753.03
TRPA1
WeiblichSteuerung1634.252.1729.257.5021.500.72
Gehärtet1537.254.8428.751.7725.750.86
MännlichSteuerung1538.253.2932.001.2924.507.92
Gehärtet1627.500.7225.751.0022.756.06

Tabelle 1: Deskriptive Statistik für Kaplan-Meier-Überlebensanalysen von w1118 und TRPA1 Fliegen. Perzentil-TKD-Werte werden in Minuten angegeben. Gehärtet bezieht sich auf eine Vorbehandlung von 37 °C, gefolgt von einer 24-stündigen Wiederherstellung vor dem Hitzeschock bei 39 °C. Die Kontrollen wurden für die Dauer der Vorbehandlung bei 25 °C gehalten. HINWEIS: Bei Überlebensanalysen ist das 75. Perzentil der späteste Zeitpunkt, zu dem 75 % der Stichprobe weiterhin Aktivität zeigen.

Für die w1118 Fliegen ergab der Log-Rank-Test einen signifikanten Unterschied in der Wahrscheinlichkeit eines Knockdowns zwischen gehärteten und Kontrollweibchen (p = 0,026), so dass gehärtete Weibchen eine geringere Wahrscheinlichkeit hatten, im Verlauf des Assays durch den Hitzestressor niedergeschlagen zu werden. In der Zwischenzeit fanden Log-Rank-Tests keinen signifikanten Unterschied in der Wahrscheinlichkeit eines Knockdowns zwischen gehärteten und Kontroll-Männchen w1118 (p = 0,798). Für die TRPA1-Weibchen wurde kein signifikanter Unterschied in der Wahrscheinlichkeit eines Knockdowns zwischen gehärteten und Kontrollorganismen (p = 0,547) mittels logarithmischer Rangprüfung gefunden. Für die TRPA1-Männchen schließlich fanden Log-Rank-Tests einen signifikanten Unterschied in der Wahrscheinlichkeit eines Knockdowns zwischen gehärteten und Kontrollorganismen (p = 0,014), so dass die Kontrollorganismen eine geringere Wahrscheinlichkeit hatten, durch den Hitzestressor niedergeschlagen zu werden. In Tabelle 2 finden Sie alle Ergebnisse der Überlebensanalysen (einschließlich generalisierter Wilcoxon- und Tarone-Ware-Tests) und in Abbildung 1 die Überlebenskurven.

Sexχ2Dfp-Wert
Nr. W1118
WeiblichLogarithmus-Rang (Mantel-Cox)4.9610.026
Breslow (generalisiertes Wilcoxon)1.7210.190
Tarone-Ware3.0710.080
MännlichLogarithmus-Rang (Mantel-Cox)0.0710.798
Breslow (generalisiertes Wilcoxon)0.8610.353
Tarone-Ware0.3210.572
TRPA1
WeiblichLogarithmus-Rang (Mantel-Cox)0.3610.547
Breslow (generalisiertes Wilcoxon)0.4510.503
Tarone-Ware0.3610.549
MännlichLogarithmus-Rang (Mantel-Cox)6.0110.014
Breslow (generalisiertes Wilcoxon)4.1910.041
Tarone-Ware5.2010.023

Tabelle 2: Signifikanztest zum Vergleich der Wahrscheinlichkeit, aktiv zu bleiben, zwischen vorbehandelten und Kontrollfliegen mitw 1118 und TRPA1 weiblichen und männlichen Fliegen. Gehärtet bezieht sich auf eine Vorbehandlung von 37 °C, gefolgt von einer 24-stündigen Wiederherstellung vor einem Hitzeschock bei 39 °C. Die Kontrollorganismen wurden für die Dauer der Vorbehandlung bei 25 °C gehalten.

figure-results-1
Abbildung 1: Überlebenskurven, die den Anteil der Organismen mit Restaktivität im Verlauf des TKD-Assays für w1118- und TRPA1-Fliegen darstellen. Gehärtet bezieht sich auf eine Vorbehandlung von 37 °C, gefolgt von einer 24-stündigen Wiederherstellung vor einem Hitzeschock bei 39 °C. Die Kontrollorganismen wurden für die Dauer der Vorbehandlung bei 25 °C gehalten. TKD ist in Minuten seit der Einführung des 39 °C heißen Stressors vergangen. Abkürzungen: TKD = Zeit bis zum Niederschlagen; TRPA1 = transientes Rezeptorpotential Ankyrin 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die durchschnittliche Aktivität über die Zeit aufgetragen ist in Abbildung 2 für verhärtete und Kontroll-TRPA1 und w1118 Männchen und Weibchen zu sehen.

figure-results-2
Abbildung 2: Durchschnittliche Aktivität über die Zeit für w1118 und TRPA1 Fliegen für die Dauer des TKD-Assays. Abkürzungen: TKD = Zeit bis zum Niederschlagen; TRPA1 = transientes Rezeptorpotential Ankyrin 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Es gibt wahrscheinlich unzählige und neuartige Möglichkeiten, die Aktivitätsdaten zu analysieren, insbesondere wenn man Gruppeneffekte berücksichtigt und TKD einbezieht. Da die Aktivitätsanalyse während der Hitzetoleranz relativ wenig untersucht ist, haben wir keine potenziell neuen statistischen Ansätze zur Analyse von Aktivitätsdaten untersucht. Solche statistischen Tests würden eine viel umfangreichere Literaturrecherche und Diskussion rechtfertigen, als es hier angemessen ist. Stattdessen haben wir einfach die durchschnittliche Aktivität für jede Gruppe (Vorbehandlung oder Kontrolle) über die Zeit grafisch dargestellt, da wir diese Methode zuvor veröffentlicht haben, um die Aktivität mit einer geeigneten Literaturrecherche zu veranschaulichen.

Ergänzendes Video S1: Exemplarische Vorgehensweise zum Herunterladen der ausführbaren Anwendung von GitHub und grundlegende Funktionen der Software. Die neueste Version (derzeit nur mit Windows kompatibel) finden Sie auf dem referenzierten GitHub (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) oder über einen indizierten Link im Abschnitt "Analysesoftware " auf der Website des Unternehmens. Sobald die Version heruntergeladen ist, müssen die Dateien extrahiert werden und das HoTDAM! kann geöffnet werden. Antivirensoftware kann die Ausführung der Anwendung verhindern. Möglicherweise müssen der Anwendung Berechtigungen erteilt werden. Sobald die Schnittstelle läuft, kann das gescannte DAM2 (File Scan Software) hochgeladen werden (Datei | Monitordaten laden). Die Gruppendesignationsschnittstelle stellt das Layout des Aktivitätsmonitors dar und ermöglicht es dem Benutzer, Behandlungsgruppen einzeln oder mehreren gleichzeitig mit der Multi-Select Group Definition-Funktion den Schläuchen zuzuweisen. Alle Monitore schließen sich hinsichtlich der Funktionalität der Gruppenbezeichnung gegenseitig aus und müssen separat definiert werden. TKD- und Aktivitätsdaten können dann in .csv Dateien exportiert werden (Menüpunkt Datei | Knockdown-Daten oder -Datei exportieren | Aktivitätsdaten exportieren) für einen ausgewählten Monitor einzeln oder für alle Monitore auf einmal. Wenn alle Monitore auf einmal exportiert werden, werden die TKD- oder Aktivitätsdaten in eine einzige .csv Datei exportiert, aber die Daten für jeden Monitor werden innerhalb der Datei getrennt. Die exportierten TKD-Dateien gruppieren Fliegen in Gruppen, die für jede Röhre den Index der letzten Aktivität ungleich Null anzeigen. Aktivitätsdateien halten alle Röhren getrennt, verknüpfen jedoch Gruppenbezeichnungen und entfernen alle Informationen aus den Dateien, mit Ausnahme von Zeitstempeln und Zähldaten für jede Röhre. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die hier beschriebene Hitzetoleranz-Assay-Methode ist vielseitig und skalierbar. Wir haben bereits eine Validierungsstudie veröffentlicht, in der wir die HoTDAM! Methode mit einem klassischen, beobachtungsbasierten TKD-Assay verglichen und stellte fest, dass der automatisierte Assay den gleichen allgemeinen Trend über mehrere Faktoren hinweg zeigte4 (Abbildung 3). Mit anderen Worten, auf die gleiche Weise wie der klassische manuelle TKD-Assay war der automatisierte DAM2-Assay in der Lage, Organismen nach Geschlecht, Assay-Temperatur, Härtungsvorbehandlung und Erholungszeit nach der Härtungsvorbehandlung vor dem Assay zu unterscheiden. Obwohl davon ausgegangen wird, dass der automatisierte Assay objektiver ist, da TKD nicht auf die Beobachtung durch Forscher angewiesen ist, deuten unsere Daten nicht darauf hin, dass der DAM2-Assay dem manuellen Assay in Bezug auf die Entdeckung einer Wirkung deutlich überlegen ist. Wir stellten fest, dass die Assays in Bezug auf die Präzision recht ähnlich sind, und wenn überhaupt, sind die Effektstärken innerhalb des automatisierten Assays etwas kleiner (siehe Rokusek et al.4 ergänzendes Material für detaillierte deskriptive statistische und ANOVA-Daten sowohl für den automatisierten DAM2 als auch für die manuellen beobachtungsbasierten Assays aus unseren Validierungsstudien). Der Grund dafür hat wahrscheinlich mit dem inhärenten Unterschied in den Messungen der Assays in Bezug auf TKD zu tun, der im Folgenden ausführlich erörtert wird.

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Abbildung 3: Vergleich des automatisierten DAM2-Assays mit einem klassischen beobachtungsbasierten TKD-Assay. Diagramme zeigen den mittleren TKD in Minuten an, und Fehlerbalken sind der Standardfehler des Mittelwerts. Unabhängige Faktoren, die verglichen werden, sind (A) Geschlecht nach Assay-Temperatur, (B) Härtung nach Assay-Temperatur, (C) Geschlecht nach Erholungszeit, (D) Härtung nach Geschlecht, (E) Assay-Temperatur nach Erholungszeit und (F) Härtung nach Erholungszeit. Die absolute TKD ist im automatisierten Assay tendenziell länger, aber die allgemeinen Trends zwischen den Faktoren sind zwischen den Assays konsistent. Diese Abbildung stammt aus Rokusek et al. 4. Abkürzung: TKD = time to knockdown. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die hier vorgestellten illustrativen Daten stellen völlig andere Experimente dar als unsere ursprünglichen Verifizierungsversuche, bei denen ebenfalls unterschiedliche Fliegenschnüre verwendet wurden. Der Assay (TKD und Aktivität) reagierte empfindlich auf die Auswirkungen der Härtungsvorbehandlung im w 1118-Stamm (wir verwendeten in den ursprünglichen Experimenten einen Wildtyp-Stamm aus Canton S), was zeigt, dass die grundlegende Funktionalität des Assays unter variablen Bedingungen stabil ist, obwohl bisher nur wenige Linien getestet wurden. Der Assay ist vielseitig, da er nicht auf TKD-Messungen beschränkt ist. Da TKD in unserem Assay als Beendigung der lokomotorischen Aktivität definiert ist, kann die CTmax bestimmt werden, wenn die Temperaturanstiegsrate bekannt ist. Schließlich ist der Assay vollständig automatisiert und kann durch Hinzufügen von mehr Aktivitätsmonitoren leicht skaliert werden, was viel größere Probenahmegrößen ermöglicht, als dies mit einer manuellen Beobachtungsmethode möglich wäre.

Im Folgenden sind einige wichtige Punkte zu berücksichtigen, die bei der Durchführung der Analyse und Analyse zu beachten sind. Verwenden Sie einen Inkubator, der schnell eine eingestellte Temperatur erreichen kann, so dass die Monitore bei der Aufzuchttemperatur in den Inkubator geladen und ruhig sitzen gelassen werden können, um sich an die neue Umgebung zu gewöhnen, bevor der Hitzestressor angewendet wird. Wenn die Temperatur zu langsam ansteigt, ähnelt der Assay eher einem dynamischen CTmax-Assay als einem statischen TKD-Assay. Wenn die Software beispielsweise vor der Induktion des Hitzestresses 40x indexieren durfte, um eine Baseline zu etablieren, kann die Software die Datendatei ab Index 40 zur Ermittlung des TKD und zur Datenanalyse ausgeben. Der Ausgangspunkt bezieht sich auf den von der Software aufgezeichneten Zeitstempel, achten Sie also auf das Indexintervall (z. B. 40 Indizes sind 10 Minuten, wenn das Indexintervall 15 s beträgt).

Die File Scan Software kann auch verwendet werden, um Indizes zu "bin" und die Anzahl entweder zu summieren oder zu mitteln. Wenn wir beispielsweise Aktivitätsdaten grafisch darstellen (siehe unten), haben wir alle vier Indizes zusammengerechnet und die Anzahl summiert (d. h. wir haben die Aktivität jede Minute und nicht alle 15 Sekunden exportiert). Beachten Sie, dass die Dateiscan-Software beim Binning in Bezug auf den Zeitstempel keine anfänglichen Startzeiten von Minuten zulässt. Wenn der erste Index z. B. bei 12:10:15 lag und das Indexintervall auf 15 s festgelegt ist, beginnt die Klassierung bei 1 Minute bei der nächstgelegenen Minute (z. B. 12:11:00). Wenn also eine Aktivität in Minutenschritten für die Analyse verwendet werden soll, aber die Auflösung von 15 s-Intervallen für TKD gewünscht wird, starten Sie die Erfassungssoftware innerhalb von 15 s nach der nächsten ganzen Minute (z. B. irgendwann nach 12:09:45 und vor 12:10:00). Diese Komplikation ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass die Datenerfassungssoftware die Uhr des Computersystems als Zeitstempel verwendet, da das DAMSystem3 wahrscheinlich für Schlafstudien entwickelt wurde.

In Bezug auf statistische Ansätze zum TKD-Vergleich argumentieren wir, dass die Überlebensanalyse mehr Informationen bietet als der einfache Vergleich der mittleren oder mittleren Knockdown-Zeiten zwischen den Gruppen. Überlebenskurven können einen visuellen Einblick in den zeitlichen Verlauf des Knockdowns für die Populationen während des Assays geben. In ähnlicher Weise können statistische Tests auf die spezifische Fragestellung zugeschnitten werden, die innerhalb der Studie gestellt wird. Bei generalisierten Wilcoxon-Tests wird z. B. bei frühen Ereignissen mehr Gewicht beigemessen, während bei logarithmischen Rangfolgetests alle Zeitpunkte gleich gewichtet werden und Unterschiede zu späteren Zeitpunkten empfindlicher berücksichtigt werden. Wenn die Hazard Ratios nicht proportional sind (d. h. die Überlebenskurven kreuzen), ist Tarone-Ware strenger. Da es keine Zensur der Daten geben sollte, da alle Organismen das Ereignis (Knockdown) erlebt haben, könnte ein Argument für die Verwendung von nicht-parametrischen Rangordnungstests wie Mann-Whitney U und Kruskal-Wallis zusammen mit den Kapan-Meier-Überlebenskurven9 angeführt werden. Wenn eine Untersuchung an einem Knockdown nach einer definierten Zeitspanne und nicht an TKD nach dem Ausschalten aller Organismen interessiert ist, wäre die Verwendung der Überlebensanalyse und des Log-Rank- oder generalisierten Wilcoxon-Tests robust gegenüber zensierten Daten (d. h. ein Szenario, in dem nicht alle Organismen am Ende des Assays aufgehört hätten, sich zu bewegen oder kollabiert wären). Zur Veranschaulichung haben wir die Ergebnisse aus Log-Rank, generalisiertem Wilcoxon und Tarone-Ware in Tabelle 2 bereitgestellt.

Während des Hitzestresses und vor der CTmax dienen Verhaltensänderungen (z.B. Fluchtverhalten) als Bewältigungsmechanismen. Diese angeborenen Verhaltensstrategien sind im gesamten Tierreich konserviert, sind aber für Ektotherme besonders wichtig, da sie eine geringere Fähigkeit zur metabolischen Thermoregulation haben10,11. Offensichtlich ist das Verhalten ein wichtiger Aspekt des ektothermen Hitzestress-Phänotyps, aber relativ spärliche Forschung hat diese Verhaltensaspekte der Hitzetoleranz untersucht. Da der von uns beschriebene Assay auf der charakteristischen Zunahme der lokomotorischen Aktivität als Reaktion auf Hitzestress beruht, eignet er sich gut, um die lokomotorischen Aspekte von Hitzestressreaktionen zu untersuchen. Gleichzeitig bringt dieses Vertrauen auf spontane Aktivität einige Einschränkungen mit sich. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, insbesondere bei der Untersuchung von Komponenten der Bewegungsreaktionen auf Hitzestress, dass sowohl TKD als auch Aktivität intrinsisch miteinander verbunden sind. Um eine Situation zu demonstrieren, in der dies für unseren Assay einschränkend wäre, haben wir hier Daten von TRPA1-Organismen zur Verfügung gestellt, die einen Mangel an Thermoempfindung aufweisen. Wenn den Organismen der TRPA1-Rezeptor fehlt, zeigen Fliegen nicht die charakteristische lokomotorische Reaktion auf Hitze12. In den hier gezeigten repräsentativen Daten ist die Aktivitätsantwort in den TRPA1-Organismen abgestumpft. Die TKD-Messungen wären nicht ohne weiteres mit Wildtyp-Organismen vergleichbar, da das Maß eine andere lokomotorische Reaktion darstellt.

Die Generalisierbarkeit und der direkte Vergleich der Ergebnisse, insbesondere zu den klassischen Hitzetoleranz-Assays, ist ebenfalls eine potenzielle Einschränkung (Abbildung 3). Häufig beinhalten beobachtungsbasierte Assays einen mechanischen oder anderen Stimulus, um sicherzustellen, dass ein unbeweglicher Organismus tatsächlich einen physiologischen Kollaps erfährt und nicht nur einen Mangel an spontaner Aktivität zeigt 3,13. Da unser Assay auf spontaner Aktivität beruht, gibt es einen inhärenten Unterschied in der operationellen Definition von TKD, der den Vergleich erschweren könnte. Mit anderen Worten, wir haben TKD als die Beendigung der lokomotorischen Aktivität definiert, während klassische Assays TKD im Allgemeinen als physiologischen Kollaps definieren. Darüber hinaus beruhen automatisierte Assays wie der von uns beschriebene auf erhitzter Luft, während manuelle Assays in der Regel ein Wasserbad und damit eine effizientere Wärmeübertragung beinhalten. All diese Einschränkungen beim Vergleich zwischen den Assay-Modalitäten stellen Nachteile für die Generalisierbarkeit der automatisierten Methode dar. Gleichzeitig wurde berichtet, dass beobachtungsbasierte Methoden auch bei direkten Vergleichen zwischen den Untersuchungen Komplikationen aufweisen 2,14,15. Wir argumentieren, dass automatisierte Assays trotz der Einschränkungen ein praktikables Mittel sind, um die Hitzetoleranz in Bezug auf TKD oder CTmax abzuschätzen.

Andere automatisierte Hitzetoleranz-Assays für TKD und CTmax wurden bereits in der Literatur implementiert und beschrieben 16,17,18,19, wobei einige die DAM2-Aktivitätsmonitore 18,19 verwendeten. Darüber hinaus wurden zumindest einige Untersuchungen videobasierte Methoden16, 20, 21 sowie die DAM2-Aktivitätsmonitore20 verwendet, um Fruchtfliegenaktivitätsprofile in Bezug auf die Hitzetoleranz im Kontext von akutem Hitzestress zu untersuchen. Daher ist die Automatisierung von Hitzetoleranz-Assays, auch mit dem DAM2-System, keine neue Idee. Was neu und wertvoll an unserem Assay ist, ist die einfache Datenverwaltung, wie sie durch den HoTDAM ermöglicht wird! (Analyse-)Software. Es ist schwierig, mit Aktivitätsdaten zu arbeiten, und es kann zeitaufwändig und umständlich sein, selbst die einfachsten Kennzahlen (z. B. TKD) aus den großen Datensätzen zu ziehen, ohne Software oder Skripte zu verwenden, die für jedes Szenario maßgeschneidert werden müssen. HoTDAM! ist kostenlos und als voll funktionsfähige ausführbare Anwendung mit einer einfachen und leicht zu bedienenden Oberfläche verfügbar. Es sind keine Vorkenntnisse im Programmieren erforderlich. Darüber hinaus wurde die Software objektorientiert geschrieben und mit Dokumentation versehen, um Änderungen zu erleichtern. Daher bietet HoTDAM! Kann leicht an spezifische Bedürfnisse angepasst werden. Der Quellcode ist zusammen mit der ausführbaren Anwendung verfügbar. Wir hoffen, dass HoTDAM! kann Labore bedienen, die noch keine Erfahrung mit Hitzetoleranz-Assays haben, indem es eine einfache Möglichkeit zur Messung von TKD und CTmax bietet, sowie Labore, die Erfahrung mit Hitzetoleranz-Assays haben, indem es anpassbare Software zur Erleichterung des Datenmanagements anbietet.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das beschriebene Projekt wurde durch Zuschüsse des Institutional Development Award (IDeA) des National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health (5P20GM103427 und 1U54GM115458) unterstützt. Das UNK Undergraduate Research Fellows Program und das UNMC Medical Student Summer Research Program.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
14 mL Polystyrol ReagenzgläserFalcon352057
30 Gallonen AquariumWal-Mart
8 oz FlaschenGenesee32-129F
Konstante KlimakammerMemmertHPP750eco
MaismehlLab ScientificFLY801010
DAM2  Drosophila AktivitätsmonitorTriKineticsDAM2(DAMSystem3 Datenblatt) https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf
DAMSystem DatenerfassungssoftwareTriKineticskostenloser Download
Drosophila agarLab ScientificFLY80201
EthanolFisher ScientificBP82011
EtherFisher ScientificE134-4
FileScan-SoftwareTriKineticszum Scannen nach Textfehlern, Binning-Daten und Ausgabe
FlyStuff Flights für FlaschenGenesee49-100
FlyStuff Flights für FläschchenGenesee49-102
FlyStuff FläschchenGenesee32-113RL
HoTDAM-SoftwareGithub oder Trikineticshttps://github.com/MatthewR47/HoTDAM
TauchheizkörperPolyScienceMX-CA11B
MelasseLab ScientificFLY80084
PropionsäureFisher ScientificA258-500
Pyrex Glasrohre 5 x 65 mm für DAM2TriKineticsPGT 5x65https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf
kleiner PinselWal-Mart
SPSS StatisticsIBM
tegoseptLab ScientificFLY55015
Torula-HefeMP Biomedicals290308505
TRPA1 mutant AktieBloomington Stock Center26504w[1118]; TI{w[+mW.hs]=TI}TrpA1[1]
w1118 stockBloomington Lager Zentrum3605

References

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