Direktes Vagusnerv-Injektionsprotokoll für Ratten

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll für die direkte Injektion des Vagusnervs bei Ratten vor, das die direkte Verabreichung von Medikamenten in den Nerv ohne Komplikationen nach der Injektion ermöglicht. Diese Methode gilt für präklinische neurologische Studien, bei denen das autonome Nervensystem manipuliert wird. Es kann für die direkte Nerveninjektion für andere Nerven bei Ratten und anderen Spezies verwendet werden, mit den notwendigen Modifikationen.

Zusammenfassung

Es gibt eine relative Fülle von Strategien und Methoden, um die Verabreichung von Medikamenten an das zentrale Nervensystem zu erleichtern. Die direkte Verabreichung von Medikamenten an das periphere Nervensystem ist jedoch seltener, da weniger detaillierte Methodenpublikationen zur Verfügung stehen, um Forschern zu helfen. Hier beschreiben wir eine direkte Nerveninjektionsmethode für die Medikamentenabgabe im peripheren Nervensystem, wobei der Vagusnerv als Modellnerv verwendet wird. Diese Methode kann bei der Behandlung von Störungen des autonomen Nervensystems durch gezielte Behandlung des linken Vagusnervs angewendet werden, obwohl diese allgemeine Injektionsmethode mit geringfügigen Modifikationen auf die Injektion anderer Nerven extrapoliert werden kann. Diese Methode erklärt alle kritischen Schritte des mikrochirurgischen Eingriffs bei anästhesierten erwachsenen Ratten unter einem Präpariermikroskop. Die Verwendung eines Tracking-Farbstoffs wird beschrieben, um die Überwachung der Injektionstreue in Echtzeit zu erleichtern. Es werden Abbildungen von erfolgreichen und fehlgeschlagenen Injektionen bereitgestellt. Bei sachgemäßer Durchführung können direkte Vagusnerv-Injektionen auf sichere und von der Ratte gut vertragene Weise durchgeführt werden, ohne dass es zu Komplikationen nach der Entbindung kommt. Nachdem die Chirurgen in dieser Methode geschult waren, wurden beispielsweise sechs von sechs Ratten erfolgreich und ohne Komplikationen injiziert. Diese Methode der direkten Nerveninjektion für präklinische Studien an Ratten ist in der Lage, Wirkstoffe (einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Gentherapie) an periphere Nerven abzugeben.

Einleitung

Die Anwendung der richtigen Methode der Arzneimittelverabreichung ist einer der entscheidenden Faktoren für das Erreichen erfolgreicher therapeutischer Ergebnisse. Trotz der Fülle an Methoden zur Verabreichung von Therapeutika an das Zentralnervensystem (ZNS) werden nur wenige Methoden für die Verabreichung des peripheren Nervensystems (PNS) durch direkte Nerveninjektion berichtet. Die direkte Injektion von Nerven, wie z. B. die Injektion in die Spinalganglien (DRG) bei Ratten, wurde in präklinischen Studien zum besseren Verständnis der Schmerzmechanismen, der Arzneimitteltoxizität, des Gentransfers ^1,2,3 und der^{allgemeinen Methodenentwicklung 1,4} versucht. Weitere Berichte über die direkte Nerveninjektion umfassen die Injektion des Spinalnervs⁴, die Ischiasnerv-Injektion¹ und die Injektion des Vagusnervs bei Ratten⁵ und Mäusen⁶. Vor kurzem wurde ein Verfahren zur suprachondrialen Injektion zur besseren Verteilung von Therapeutika in den Sehnervenkopf bei Kaninchen vorgeschlagen⁷.

DRG gilt aufgrund der sensorischen Funktion der Zellkörper im DRG² als idealer Ort für die direkte Injektion von transgenbeladenen Vektoren wie dem Adeno-assoziierten Virus (AAV). Sowohl chirurgische als auch nicht-chirurgische Methoden der DRG-Injektionen wurden beschrieben ^1,8. Es wurden jedoch kontroverse Schlussfolgerungen über die Konsistenz der Ergebnisse mit der nicht-chirurgischen Methode der DRG-Injektion¹ gefunden. Es wurde vorgeschlagen, dass eine chirurgische Methode, die eine partielle Laminektomie beinhaltet, für die DRG-Injektion bei Ratten ohne Veränderung der Verhaltensergebnisse^zu 100 % erfolgreich ist 3, sowie eine Methode mit partieller Osteotomie bei Mäusen⁹. Mehrere Studien berichten über die DRG-Injektionsmethoden der Arzneimittelverabreichung, die in der präklinischen Gentherapieforschung bei Ratten und Mäusen eingesetzt wurden ^1,2,10. Vektorbasierte Gentherapiestudien mit lokalisierten Injektionen können die folgenden Vorteile umfassen: verminderte Off-Target-Expression, Verringerung der systemischen Toxizität und kleinere Viruslasten und Injektionsvolumina, verringertes Risiko immunogener Komplikationen^11,12.

Die direkte Injektionsmethode in den Ischiasnerv, den längsten Nerv des Körpers, wurde ausprobiert, indem der rechte Ischiasnerv in der Mitte des Oberschenkels einer Ratte freigelegt wurde. Bei der Methode wurde eine gezogene Glaspipette verwendet, die mit einem mikroprozesseurgesteuerten Injektionssystem ausgestattet war, um ein Gesamtvolumen von 10 μl Farbstoff mit einer Flussrate von 1,2 μl/min zu injizieren¹. Dieses Experiment zeigte einen Mangel an Farbstoffverteilung auf dem Niveau von DRG, und die Verteilung war meist um die Injektionsstelle herum begrenzt. In ähnlicher Weise wurden andere Methoden der direkten Nerveninjektionen, wie z. B. Spinalnerveninjektionen, mit Farbstoff ausprobiert, um die angemessene Menge an Injektionsvolumen und das Farbstoffverteilungsmuster bei Ratten zu bewerten. 2 μl werden als optimal für die Injektion des Spinalnervs empfohlen, während 3 μl Farbstoff durch DRG-Injektion die Verteilung sowohl in den dorsalen als auch in den ventralen Wurzelganglien bei Ratten^{zeigten 1}. Es wurde berichtet, dass das Volumen für die DRG-Injektion bei Mäusen von 1,0 μl bis 1,5 μl auf der Grundlage des Stammes und der Körpergröße ^2,9 optimal ist.

Die direkte Vagusnerv-Injektionsmethode wurde bei Ratten⁵ und Mäusen⁶ verwendet, um die Rolle der neuronalen Verletzung oder der zellulären Integrität bei der Übertragung von humanem α-Synuclein zu bewerten. Diese beiden Studien, die von derselben Forschergruppe durchgeführt wurden, beschreiben eine kurze Methode zur direkten Injektion von AAV-Vektoren in den linken Vagusnerv im Gebärmutterhalsbereich. Bei Ratten wurde eine Glaskapillare mit einem Spitzendurchmesser von 60 μm verwendet, um einen 2-μl-Vektor mit einer Flussrate von 0,5 μl/min mit einer 5-μl-Hamilton-Spritze zu injizieren. Bei Mäusen wurde ein Gesamtvolumen von 750 nL Vektorlösung mit einer Flussrate von 160 nL/min unter Verwendung einer 36-G-Nadel aus stumpfem Stahl injiziert, die auf eine 10 μl NanoFil-Spritze^{aufgesetzt wurde 6}. Diese Experimente zeigten, dass das Transgen in Axonen im Pons und Mittelhirn der Ratten und Mäuse abgegeben und exprimiert wurde. In ähnlicher Weise zeigte der dorsale motorische Kern des linken Vagusnervs eine positive Immunreaktion mit dem Transgen. Diese Beweise zeigen, dass die direkte Vagusnerv-Injektionsmethode eine zuverlässige Methode in der Gentherapie sein könnte, bei der die zelluläre Transduktion auf mehrere Stellen des Gehirns ausgedehnt wird, die Axone durch den Vagusnerv projizieren. Bei diesen Methoden wird jedoch nicht die Verwendung eines Farbstoffs zur Verfolgung der Injektionstreue erwähnt.

Hier wird ein Verfahren zur direkten Injektion in den linken Vagusnerv unter Verwendung von ungiftigen Tracking-Farbstoffen beschrieben, die für Forscher in präklinischen Studien weitgehend anwendbar sind. Mögliche Fallstricke, die Schwierigkeiten bei der Verabreichung von Medikamenten verursachen können, und die Möglichkeiten, diese zu überwinden, werden diskutiert. Diese Situationen werden mit Bildern illustriert, um zu zeigen, was die Lieferung nicht erfolgreich macht und wie sie erfolgreich sein kann.

Protokoll

Das folgende Protokoll wird in Übereinstimmung mit den institutionellen Ethikrichtlinien und der Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt.

1. Vorbereitung des Gehäuses

HINWEIS: Dieses Protokoll gilt für erwachsene Ratten im Alter von mindestens 2 Monaten. Kleinere Tiere (einschließlich Mäuse und jüngere Ratten) sind möglich, werden aber nicht empfohlen und sind erheblich schwieriger.

1. Stellen Sie feuchtes Futter oder anderes weiches Futter (tierärztliches Erholungsgel) für 48 Stunden vor der Operation des Vagusnervs bereit. Da die Tiere nach dem Eingriff Schwierigkeiten beim Fressen haben können, sollten Sie den Tieren diese Artikel vor der Operation vorstellen, um ihnen zu helfen, sich mit dem Geschmack dieser Artikel vertraut zu machen und die Essmotivation zu induzieren.
2. Halten Sie Ratten mindestens 1 Woche vor der Operation sowie 1 Woche nach der Operation einzeln in einem Käfig unter. Das ermöglicht es ihnen, sich an den Stress des Alleinseins zu gewöhnen und das Kratzen von Wunden nach der Operation durch einen Wurfgeschwister zu verhindern.

2. Vorbereitung der chirurgischen Gegenstände und des Raumes

1. Erstellen Sie im Voraus eine Liste aller notwendigen Artikel und überprüfen Sie, ob alle Artikel für die Operation verfügbar sind.
2. Sterilisieren Sie alle Gegenstände vor der Operation mit geeigneten Sterilisationsmethoden.
3. Richten Sie den sterilen Operationsraum unter dem Präpariermikroskop ein. Legen Sie ein Heizkissen unter das Mikroskop, um die Ratte während der Operation warm zu halten.
4. Legen Sie alle chirurgischen Materialien auf einen Operationstisch auf einem sterilen Tuch. Lassen Sie genügend Platz für Operationen unter dem Präpariermikroskop. Stellen Sie sicher, dass der Fokus des Mikroskops optimal ist und den Operationsbereich umfasst, um den Nerv sichtbar zu machen.
5. Platzieren Sie die Spritzenpumpe in der Nähe des Operationstisches, so dass die Länge des Schlauchs ausreicht, um die Injektionsstelle zu erreichen.
6. Platzieren Sie die chirurgischen Instrumente an der Seite der dominanten Hand des Chirurgen.

3. Herstellen einer Mischung aus dem Wirkstoffkandidaten und dem Tracking-Farbstoff

1. Stellen Sie sicher, dass der Wirkstoffkandidat verdünnt ist, um die erforderliche Konzentration im empfohlenen Verdünnungsmittel zu erreichen, so dass 5 μl des Arzneimittels, gemischt mit Farbstoff, die erforderliche Menge des zu verabreichenden Arzneimittelkandidaten ergibt. Es wird empfohlen, dass das maximale Injektionsvolumen nach der Methode des direkten Vagusnervs 5 μl beträgt (einschließlich Tracking-Farbstoff, siehe Schritt 3.2).
2. Mischen Sie einen kompatiblen Farbstoff mit dem Wirkstoffkandidaten, um die Injektionstreue in Echtzeit verfolgen zu können. Zum Beispiel ist eine Endkonzentration von entweder 1 % Luxol Fast Blue oder 0,002 % Fluorescein kompatible Farbstoffe.
   ACHTUNG: Verwenden Sie den Farbstoff in seiner optimalen Konzentration in der Mischung aus Farbstoff und Wirkstoffkandidat. Wenn die Farbstoffkonzentration in der Mischung zu niedrig ist, ist die Injektion möglicherweise nicht sichtbar. Wenn die Farbstoffkonzentration zu hoch ist, kann dies zu einer zu dicken Mischung mit hoher Viskosität führen, die die Injektionsnadel blockiert.

4. Laden des Wirkstoff- und Farbstoffgemisches in den Schlauch

1. Verbinden Sie eine 100-μl-Glasspritze mit entferntem Kolben mit einer 27-G-Nadel.
2. Verbinden Sie ein Ende von ca. 45 cm sterilisiertem Polyethylenschlauch mit der 27-G-Nadel.
3. Nehmen Sie eine 3-ml-Plastikspritze und setzen Sie sie mit einer 27-g-Nadel ein. Befüllen Sie die Spritze mit etwa 0,5 ml 0,9 % normaler Kochsalzlösung.
4. Füllen Sie den Polyethylenschlauch mit der 0,9%igen normalen Kochsalzlösung aus dem offenen Ende, um die gesamte Länge des Schlauchs und den gesamten Zylinder der Glasspritze zu füllen, bis er herausläuft.
   HINWEIS: Es ist wichtig zu vermeiden, dass Luftblasen im Schlauch eingeschlossen werden.
5. Entfernen und entsorgen Sie die 3-ml-Spritze und die Nadel.
6. Führen Sie den Spritzenkolben in den Zylinder der Glasspritze ein und schieben Sie ihn leicht nach vorne bis zur Mitte des Zylinders.
7. Setzen Sie die Glasspritze in die Spritzenpumpe ein.
8. Ziehen Sie den Kolben mit der Spritzenpumpe leicht nach hinten, so dass am offenen Ende in der Länge des Schlauches ein Luftraum von ca. 1,5 cm entsteht.
9. Pipettieren Sie mindestens 5 μl des Farbstoff-Wirkstoff-Gemisches mit einer 10-μl-Mikropipette und geben Sie es auf ein sterilisiertes Stück Parafilm.
10. Ziehen Sie das Wirkstoffkandidatengemisch in den Schlauch zurück, indem Sie den Kolben über die Spritzenpumpe zurückziehen. Halten Sie die Luftblase zwischen der 0,9%igen Kochsalzlösung und der Injektionslösung, aber vermeiden Sie es sonst, Luftblasen in der Injektionslösung einzuschließen. Markieren Sie den Füllstand des Injektionsgemisches im Schlauch mit einem Marker.
    HINWEIS: Der Luftspalt zwischen dem Wirkstoff-Farbstoff-Gemisch und der sterilen Kochsalzlösung im Schlauch ist entscheidend, um eine Vermischung der beiden Lösungen zu verhindern.
11. Setzen Sie die 35 G Nadel in den Schlauch ein. Befestigen Sie die Nadel mit Klebeband auf der sauberen Oberfläche des Operationstisches, so dass die Nadel nicht locker ist, sich nicht bewegt und nichts anderes berührt und sterilisiert bleibt.

5. Grundierung der Injektionsnadel

1. Stellen Sie das Spritzenpumpenprogramm auf 0,5 μl/min ein.
2. Starten Sie die Spritzenpumpe für ca. 10-15 s, bis die Injektionslösung aus der Nadelspitze austritt. Eine winzige Menge der Mischung an der Spitze der Nadel ohne Leck an der Verbindung von Schlauch und Injektionsnadel (oder an einer anderen Stelle entlang der Länge der Spritze, des Schlauchs oder der Nadel) zeigt an, dass die Einstellung korrekt ist.
   HINWEIS: Wenn kein winziges Tröpfchen an der Spitze der Nadel zu sehen ist, deutet dies auf eine Verstopfung der Nadel hin. Eine Verstopfung der Nadel kann aufgrund der hohen Viskosität des Wirkstoff- und Farbstoffgemisches, der im System eingeschlossenen überschüssigen Luft und der nicht richtig in der Spritzenpumpe sitzenden Glasspritze auftreten. In Abbildung 1 sehen Sie ein Beispiel für eine Leckage an der Verbindungsstelle zwischen Nadel und Schlauch. Das Priming ist von entscheidender Bedeutung, da es hilft zu erkennen, ob die Nadel frei ist und die Injektion in den Nerv reibungslos verläuft.

6. Vorbereitung der Ratte auf die Operation

1. Ermitteln Sie das Körpergewicht der Ratte, um die erforderliche Dosis von Analgetika zu berechnen. Zum Beispiel wird Carprofen in einer Dosierung von 5 mg/kg subkutan bei Ratten angewendet.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, Carprofen vor der Injektion bei 4 °C zu lagern.
2. Betäuben Sie die Ratte mit einem Isofluran-Verdampfer mit einer Flussrate von 3%-4% zur Einleitung der Anästhesie für ca. 2-3 Minuten. Reduzieren Sie die Isofluran-Flussrate auf etwa 1,75 % bis 2 % zur Aufrechterhaltung der Anästhesie.
3. Bringen Sie die Ratte auf einen separaten Tisch mit einer Einrichtung für die Haarentfernung und die Vorbereitung der Stelle. Stellen Sie sicher, dass sich diese Liege in der Nähe des Operationsraums befindet.
4. Tragen Sie künstliche Tränensalbe auf beide Augen der Ratte auf, um übermäßige Trockenheit zu verhindern.
5. Verabreichen Sie Analgetika gemäß dem genehmigten institutionellen Tierprotokoll, um die Schmerzen zu kontrollieren, wenn die Ratte wieder zu Bewusstsein kommt.
6. Rasieren Sie den Operationsbereich mit einem Haarschneider an der Bauchseite des Halses im Halsbereich. Rasieren Sie bis zu ca. 2 cm senkrechten Abstand von der Mittellinie auf beiden Seiten vom Kinn bis zum Brustbein.
7. Sterilisieren Sie den Bereich mit 70 % Ethylalkohol und 10 % Betadin und wischen Sie den Bereich dreimal abwechselnd mit einem Alkoholtupfer und Povidon-Jod ab. Wischen Sie von der Mitte des Bereichs in einem kreisförmigen Muster nach außen.
8. Bringen Sie die Ratte in Rückenlage unter dem Mikroskop in den Operationstisch. Passen Sie den Fokus des Mikroskops an, um den Operationsbereich im Gebärmutterhalsbereich sichtbar zu machen.

7. Durchführung einer Rattenoperation zur direkten Injektion des Wirkstoffkandidaten in den linken Vagusnerv (Abbildung 2, Abbildung 3 und Abbildung 4)

HINWEIS: Für diesen Teil der Methode ist eine zweite Person erforderlich, die den Chirurgen unterstützt.

1. Legen Sie die Ratte in Rückenlage unter das Präpariermikroskop, das mit einer montierten Lampe verbunden ist, auf ein Heizkissen.
2. Haken Sie die vorderen Oberkieferzähne der Ratte mit einem Stück nicht resorbierbarer Naht ein und fixieren Sie das offene Ende der Naht im Nasenkonus, so dass sich das Nasenloch der Ratte während der gesamten Narkose immer im Nasenkonus befindet.
3. Positioniere die Ratte so, dass ihr Kopf auf der linken Seite des rechtshändigen Chirurgen (oder der rechten Seite eines linkshändigen Chirurgen) liegt. In dieser Position steht die Vorderseite des Chirurgen senkrecht zum Körper der Ratte. Legen Sie ein Kissen aus sterilisiertem Messgerät unter den Hals und stellen Sie den Winkel des Gebärmutterhalsbereichs der Ratte so ein, dass der Gebärmutterhalsbereich gerade wird. Dies erleichtert die Lokalisierung des linken Vagusnervs und die Durchführung der Injektion.
4. Drapieren Sie den gesamten Körper der Ratte mit einem sterilisierten Tuch und halten Sie den Operationsraum offen.
5. Befestigen Sie vier Retraktorstifte einzeln mit 4 magnetischen Fixateuren mit Elastomeren und platzieren Sie die Fixateure an den vier Ecken des Operationstisches.
6. Injizieren Sie Lokalanästhetika epidermal an der Mittellinie des Gebärmutterhalsbereichs, wo der Schnitt gemacht wird. Zum Beispiel wird in der Regel eine Mischung aus Lidocain und Bupivacain verwendet.
7. Machen Sie einen etwa 2 cm langen Längsschnitt der Haut an der Mittellinie zwischen Kinn und Brustbein mit einer Skalpellklinge an der ventralen Seite des Halses im Halsbereich (Abbildung 3A).
8. Trennen Sie die Schnittkanten der Haut mit sterilisierten Wattespitzen ab.
9. Ziehen Sie die Hautränder mit Hilfe von Retraktorspitzen in entgegengesetzte Richtungen von der Stelle des Schnitts zurück.
10. Trennen Sie die Gesichtsmaske mit Wattestäbchen, um tiefer zu gehen. Schiebe die Speicheldrüsen in Richtung der Seitenseite.
11. Trennen Sie die Sternomastoideusmuskeln mit Wattestäbchen und ziehen Sie sie mit den Stecknadeln zur Seite. Wenn die Trennung des Sternomastoideusmuskels weit voranschreitet, erscheint in der Mitte die Luftröhre, die mit dem M. sternohyoideus bedeckt ist (Abbildung 3B).
    HINWEIS: Achten Sie darauf, keinen Druck auf die Luftröhre auszuüben.
12. Schieben Sie die Gewebetrennung auf der linken Seite der Luftröhre der Ratte voran, bis die Halsschlagaderscheide erscheint, in der sich die gemeinsame Halsschlagader befindet, die zusammen mit dem linken Vagusnerv verläuft.
13. Stechen Sie vorsichtig mit einer feinen Pinzette ein kleines spitzes Loch in die Halsschlagaderscheide und achten Sie darauf, die Halsschlagader unter dem Mikroskop nicht zu verletzen. Trennen Sie den linken Vagusnerv mit einer feinen Pinzette von der Halsschlagader.
    HINWEIS: Das Operationsgebiet ist anatomisch kritisch. Die Wand der Halsschlagader ist dick, rutschig und nicht leicht zu verletzen, aber die scharfe Spitze einer feinen Pinzette kann sie verletzen und es kann zu Blutungen kommen. Achten Sie gleichzeitig darauf, den Nerv nicht zu verletzen.
14. Sobald der Nerv durch die Pinzette von der Arterie getrennt ist, verwenden Sie eine gebogene 25-G-Nadel, die an eine 1-ml-Spritze aus diesem Loch angebracht ist, um den Nerv mit der nicht dominanten Hand zu "haken" und zu halten (Abbildung 4A).
    HINWEIS: Die Spitze der gebogenen Nadel ist stumpf gemacht, um den Nerv und die Arterie nicht zu verletzen. Der Krümmungswinkel der Nadelspitze wird mit Hilfe eines Blutstillers auf ca. 90° individuell angepasst (Abbildung 2).
15. Halten Sie mit der dominanten Hand die mit dem Wirkstoff-Farbstoff-Kandidatengemisch beladene Nadel und stechen Sie vorsichtig in die gleiche Richtung, in die der Nerv verläuft, so dass die Abschrägung der Nadel nach oben zeigt.
    1. Für einen leichten Stich halten Sie den Nerv gerade, indem Sie vorsichtig mit dem 25-G-Haken ziehen. Führen Sie die Nadel in den Nerv ein und schieben Sie sie mehr als 0,5 cm nach vorne, während Sie die Nadel parallel zum Vagusnerv halten. Ziehen Sie dann leicht nach hinten, so dass etwa 0,4-0,5 cm Nadel im Nerv verbleibt.
       HINWEIS: Der Winkel der Nadel sollte flach genug sein, um in das Innere des Nervs einzudringen, ohne auf die andere Seite zu gelangen.
16. Es kann vorkommen, dass die Nadel zum Zeitpunkt des Primings außerhalb des Nervs frei ist, aber das Wirkstoff-Farbstoff-Gemisch nicht reibungslos innerhalb des Nervs verläuft. Um diese Situation zu vermeiden, begrenzen Sie die Anzahl der Nervenstiche mit einer einzigen Nadel nicht mehr als 3 Mal. Wenn die Nadel abgestumpft wird, steigt die Wahrscheinlichkeit, dass sie blockiert oder anderweitig schlecht injiziert wird.
17. Stellen Sie sicher, dass sich die Nadel vollständig im Nerv befindet. Halten Sie die Position unbeweglich und schalten Sie die Spritzenpumpe ein.
    HINWEIS: Überprüfen Sie sorgfältig an der Injektionsstelle, ob das Wirkstoff-Farbstoff-Gemisch nicht aus dem Nerv zurückfließt.
18. Prüfen Sie während der Injektion ständig, ob die Infusion im Nerv verbleibt und reibungslos fließt. Verwenden Sie die Markierung auf dem Infusionsschlauch, um die Bewegung des Arzneimittel-Farbstoff-Gemisches vom Ausgangspunkt aus zu überwachen.
    1. Wenn das Wirkstoff-Farbstoff-Gemisch nicht gleichmäßig fließt, ziehen Sie die Nadel heraus und wiederholen Sie den Ansaugschritt (Schritt 5.2). Führen Sie dann die Nadel wieder in den Nerv ein und setzen Sie die Infusion fort.
19. Der Nerv beginnt, die Farbe des Farbstoffs zu entwickeln (Abbildung 4B). Setzen Sie die Infusion bei 0,5 μl/min für 10 Minuten fort, um alle 5 μl des Wirkstoff-Farbstoff-Kandidatengemisches zu infundieren.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, das freiliegende Gewebe bei Bedarf mit einer kleinen Menge warmer 0,9% steriler Kochsalzlösung zu spülen, um übermäßige Trockenheit und Beschädigung zu vermeiden.
20. Nachdem die 5 μl infundiert wurden und die Spritzenpumpe gestoppt wurde, halten Sie die Nadel für weitere 1 Minute an Ort und Stelle, damit sich das gesamte Wirkstoff-Farbstoff-Gemisch von der Injektionsstelle ausbreiten kann. Entfernen Sie die Nadel.
21. Die 25 g gebogene Nadel entfernen. Verwenden Sie sterile Wattestäbchen, um das Taschentuch vorsichtig wieder an seine ursprüngliche Position zu bringen. Entfernen Sie die Aufrollspitzen.
22. Verschließen Sie die Wunde mit einer nicht resorbierbaren Naht (es kann auch resorbierbares Nahtmaterial verwendet werden). Tragen Sie bei Bedarf eine winzige Menge Gewebekleber zwischen den Nähten auf, um die Wunde perfekt zu schließen.

8. Nachsorge einer Ratte

1. Nach dem Schließen der Wunde etwa 3 ml 0,9% warme Kochsalzlösung subkutan infundieren. Dies hilft den Ratten, sofort zu rehydrieren.
2. Setzen Sie die Ratte in eine Wärmequelle, bis sie sich vollständig von der Narkose bis zum Normalzustand erholt hat. Notieren Sie alles, was während des Erholungsprozesses beobachtet wurde, was abnormal ist.
   HINWEIS: Die Erholungsdauer kann länger sein, wenn die Nerveninjektion lange dauert.
3. Setzen Sie die Ratte in ihren Heimkäfig mit feuchtem Futter auf dem Boden des Käfigs um. Stellen Sie sicher, dass jederzeit Wasser zur Verfügung steht. Beobachten Sie die Ratte postoperativ etwa 2 Stunden lang, um sicherzustellen, dass sie sich nicht friert.
   HINWEIS: Stellen Sie die Ratte für weitere Stunden in eine Wärmequelle, wenn es sich kalt anfühlt.
4. Überwachen Sie die Ratte 12 h, 24 h, 36 h, 48 h und 72 h nach der Operation mit schriftlichen Notizen der Beobachtungen. Wiederholen Sie die Analgetika gemäß dem genehmigten institutionellen Tierprotokoll, um die Schmerzen zu kontrollieren. Zum Beispiel wird Carprofen in einer Menge von 5 mg/kg zweimal im Abstand von 24 h subkutan dosiert. Konsultieren Sie einen Tierarzt, wenn die Schmerzen bei der Ratte länger als 48 Stunden anhalten.
5. Wiederholen Sie die subkutane Injektion von etwa 3 ml 0,9% warmer Kochsalzlösung nach 24 Stunden, je nach dem Zustand der Ratte.
6. Fahren Sie mit der Untersuchung der Wunde fort. Stellen Sie sicher, dass die Wunde trocken ist und gerade heilt.
   HINWEIS: Rötung, Schwellung und schmerzhafter Zustand der Wunde mit Inaktivität und Stumpfheit der Ratte können ein Hinweis auf eine Wundentzündung sein und können eine zusätzliche tierärztliche Beratung rechtfertigen. Eine Ratte mit Schmerzen zeigt einen gekrümmten Rücken, ein zerzaustes Fell, rote Augen und einen inaktiven Zustand. Er befindet sich normalerweise in einer Ecke des Käfigs.
7. Entfernen Sie die nicht resorbierbaren Nähte innerhalb von 2 Wochen, sobald die Wunde verheilt ist.

Ergebnisse

In der vorliegenden Studie wurden sechs erwachsene Ratten (3 Männchen und 3 Weibchen) verwendet. Von sechs Ratten wurde eine Ratte mehrfach injiziert, um einen Zustand des Versagens der Injektion zu demonstrieren, der eine Diffusion des Farbstoffs um die Injektionsstelle herum zeigt Abbildung 5A. Alle anderen Ratten zeigten eine glatte Injektion und Nervenflecken, wie in Abbildung 4B und Abbildung 5B...

Diskussion

Die Methode zur direkten Injektion in den linken Vagusnerv kann bei Ratten sicher und ohne postoperative Komplikationen durchgeführt werden. Die Verabreichung von Medikamenten an den Vagusnerv kann verwendet werden, um das autonome Nervensystem (ANS) zu bekämpfen. Dies beinhaltet bestimmte kritische Schritte, die Übung und ein mittleres bis hohes Maß an chirurgischer Geschicklichkeit erfordern.

Dieser chirurgische Eingriff erfordert bei Ratten eine ausgewogen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 ml BD  Tuberkulin-Spritze mit abnehmbarer 25 G x 5/8". Nadel	Becton, Dickinson and Company	Artikelnummer:309626	Wird verwendet, um eine Verbindung mit einer gebogenen Nadel herzustellen, um den Vagusnerv zu ziehen und ihn zum Zeitpunkt der Injektion zu halten.
0,5% Bupivacainhydrochlorid Injektion	Hospira	NDC 0409-1162-19	Lokalanästhetika zur Betäubung des lokalen Gewebes.
100 mL 0,9 % Natriumchlorid-Spülung USP	Stericare Solutions	Artikel #6240	Normale Kochsalzlösung, die zur Rehydrierung von Ratte und Gewebe verwendet wird.
20 stumpfe Retraktorspitzen, 7,5 mm	Kent Scientific Corporation	Surgi 5018	Wird verwendet, um das Gewebe zum Zeitpunkt der Operation auseinanderzuziehen und zu halten.
3 mL BD-Luer-Lok Spritze, steril, zum Einmalgebrauch	Becton, Dickinson and Company	SKU # 309657	Wird verwendet, um Kochsalzlösung in Ratten zu injizieren und die Kochsalzlösung in den Polyethylenschlauch zu füllen.
AK-Fluor10%	Akorn	NDC 17478-253-10	Fluorescein-Farbstoff, der im Nerv sichtbar ist. Wird verwendet, um die Einspritztreue zu verfolgen.
Tierwaage	Kent Scientific Corporation	SCL 4000	Wird verwendet, um das Körpergewicht von Ratten zu messen.
Ansell ENCORE Perry Style 42 PF OP-Handschuhe	Ansell	ASTM D3577	Sterilie-Handschuh, der zum Zeitpunkt der Operation von einem Chirurgen verwendet wird.
Künstliche Tränensalbe 3,5 g	Pivetal	NDC 46066-753-55	Wird bei Augen verwendet, um übermäßige Trockenheit der Augen zu verhindern.
Baby-Myxter Hämostat	Fine Science Tools	13013-14	Wird verwendet, um Blutungen im Notfall zu stoppen. Wird auch verwendet, um die 25 G x 5/8" Nadel zu biegen.
BD Intramedic PE-Schlauch	Becton, Dickinson and Company	14-170-12A	Wird im Injektionssystem verwendet, um eine Verbindung mit Hamilton-Nadeln und NanoFil-Nadeln herzustellen. Es hält auch die Injektionsmischung auf.
BD Precison Glide Nadel, 25 G x 5/8"	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	Wird verwendet, um Kochsalzlösung in Ratten zu injizieren und eine gebogene Nadel herzustellen.
BD Precison Glide Nadel, 27 G x ½ "	Becton, Dickinson and Company	REF#301629	Wird verwendet, um sterile Kochsalzlösung in den BD Intradermic-Schlauch zu füllen.
Benchmark Accuris " NextPette" Mikro-Starterset für Pipetten mit variablem Volumenenthält 4 Pipetten: 10/20/200/1000 μ L, plus Ständer	MilliporeSigma	BMSP7700S1	Wird zum Pippieren steriler Lösung verwendet.
Betadin, Povidin Jod 10%	Honestmed	67618015017	Wird zur Desinfektion des Operationsbereichs verwendet.
Carprofen Injektionslösung 50 mg/ml	Geliefert von Covtrus (6451506845)	SKU 591149	In unserem Fall haben wir verdünntes Carprofen in der Dosierung von 5 mg/kg verwendet, die vom Animal Resource Center des Southwestern Medical Center der University of Texas bereitgestellt wurde.
Gebogene Nadel (Sonderanfertigung)	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	BD PrecisionGlide 25 G x 5/8" in der Nadel wird mit Hilfe eines Hämostaten um 90 Grad gekrümmt. Die Spitze der Nadel ist stumpf gemacht. Es muss vor der Verwendung sterilisiert werden. Es wird verwendet, um den Vagusnerv einzuhaken und ihn zum Zeitpunkt der Trennung und Injektion zu halten.
Präpariermikroskop	Motic	SMZ-171-BLED (Binokular mit Lichtern)	Wird verwendet, um den kritischen anatomischen Bereich zum Zeitpunkt der Trennung des Vagusnervs und der Injektion zu vergrößern und das Auslaufen der Injektion zu überprüfen.
Tuch vorhängen	Dynarex	Nachbestellung#8122	Wird nach der Sterilisation als Abdecktuch verwendet.
Dukal Wattestäbchen-Applikatoren, unsteril	Dukal	Artikel 9003	Wird verwendet, um die Trennung von Gewebe abzuschwächen, muss vor Gebrauch sterilisiert werden.
Dumont #7 - Feine Pinzette	Fine Science Tools	11274-20	Wird verwendet, um den linken Vagusnerv von der Arteria carotis communis zu trennen. Es ist gebogen und so einfach zu bedienen.
Ethicon PDS II Ungefärbtes Monofilament-Nahtmaterial - Nahtmaterial, 4/0 18 PDS II CLR MONO PS	Ethicon	VA - Z682G	Wird zum Nähen der Wunde verwendet.
Ethilon Nylon Nahtmaterial Schwarz Monofilament	Ethicon	1856G	Wird zum Nähen der Wunde verwendet, wenn nicht absorbierendes Nahtmaterial verwendet wird. Wird auch verwendet, um den Rattenzahn einzuhaken, um die Nase im Nasenkonus zu fixieren.
Feine Pinzette - Hochglanz	Fine Science Tools	11412-11	Wird zum Zeitpunkt der Trennung des Vagusnervs von der Arteria carotis communis verwendet. Das ist gerade.
Feine Schere - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	zum Schneiden von Gewebe.
Hamilton Reinigungslösung	Hamilton	HT18311	Wird verwendet, um den Hamilton nach Gebrauch zu reinigen.
Hamilton Nadel, 27G, RN-Nadel mit kleiner Nabe, 2", PT3, 6/PK	Hamilton	7762-01	Wird verwendet, um BD Intramedic&Trade zu verbinden; PE-Schläuche.
Hamilton Spritze , 710RN	Hamilton	7638-01	Wird verwendet, um das Medikament zum Zeitpunkt der Vagusnerv-Injektion zu halten.
Insulinspritze	EXEL INT, Comfort point	REF 26027	Wird zur Injektion von Carprofen und Lokalanästhetika verwendet.
Lidocain 2% Injektion	Covetrus	Reorder#002468	Wird verwendet, um mit Bupivacain zu mischen und an der Stelle des Schnittes zu injizieren.
Luxol Fast Blue MBSN	Acros Organics	212170250	Farbstoff, der im Nerv sichtbar ist und zum Mischen mit dem Medikament verwendet wird, so dass die Injektionsmischung sichtbar ist.
Micro Bead Sterilisator mit Glasperlen	Fine Science Tools	Art.-Nr. 18090-46	Wird zur Sterilisation von chirurgischen Instrumenten zwischen der Rattenoperation verwendet.
NanoFil Nadeln-NF35BV-2	World Precision Instrument	NC9708956	Wird verwendet, um ein Medikament - Farbstoffgemisch in den Vagusnerv zu injizieren.
Olsen-Hegar Nadelhalter mit Nahtschneidern	Fine Science Tools	12002-12	Wird bei der Wundnaht verwendet.
Parafilm M Labor-Verpackungsfolie, 4 Zoll x 125 Fuß, 1 Rolle pro Karton, 12 Stück	Honestmed	PM # 996	Wird verwendet, um die aliquotierten 5 μl des Arzneimittel-Farbstoff-Gemischs zu halten, so dass das Laden des Arzneimittel-Farbstoff-Gemischs in den intradermischen Schlauch BDTM genau ist.
PDI Alkohol Vorbereitungspads	Honestmed	NDC 10819-3914-2	Wird zur Desinfektion des Operationsbereichs verwendet.
Premium Care Sterile Typ VII Mullschwämme, 8-lagig, 2" x 2"	Dukal	Artikel C5119	Wird zum Zeitpunkt der Operation als Kuschel unter dem Hals einer Ratte verwendet.
Presse" n Seal Cling Film	Glad		Wird verwendet, um eine Ratte zum Zeitpunkt der Operation wie ein Tuch zu bedecken.
Ratten-Retraktor-Set	Kent Scientific Corporation	Surgi 5002	Wird verwendet, um den Schnitt offen zu halten, damit der Vagusnerv leicht von der Halsschlagader getrennt werden kann.
RechtsTemp Jr.	Kent Scientific Corporation		20,3 cm B x 25,4 cm L (8 Zoll B x 10 Zoll L), zum Warmhalten von Ratten.
S& T Pinzette - SuperGrip Tips	Fine Science Tools	00632-11	Wird zum Zeitpunkt des Nähens verwendet, um das Gewebe ohne Beschädigung zu halten.
S& T Nahtbindezange	Fine Science Tools	00272-13	Wird verwendet, um die Naht zu straffen.
Skalpellklinge #15	Fine Science Tools	10015-00	Wird verwendet, um einen Schnitt in die Haut an der Bauchseite des Halses zu machen.
Skalpellgriff-#7	Fine Science Tools	10007-12	Wird verwendet, um die Skalpellklinge zu halten.
Spritzen-Pumpe	KD Scientific	78-81-8052GL	Die Serienpumpe #D107034, Modell # LEGATO-180, ist eine programmierbare Pumpe, die ein kleines Gemischvolumen im Rahmen eines Programms pumpen kann.
TipOne Filter Tip Refill Starter Systems	USA Scientific	Artikel #1120-3510	Wird zum Pipettieren der Mischung aus Arzneimittel und Farbstoff verwendet.
Verdampfer für Isofluran, trichtergefüllt	Kent Scientific Corporation	Vetflow 1231	Wird zur Betäubung von Ratten verwendet.
Vetbond Tissue Adhesives	3M Science Applied to Life	ID B00016067	Wird verwendet, um Gewebe an der Stelle der Schnittwunde zu versiegeln, wenn die Naht nicht perfekt ist.
Wahl BravMini+ Professional Cordless Clipper Kit	Kent Scientific Corporation	CL7300-Kit	Wird zum Schneiden von Rattenhaaren verwendet.