Method Article

Identifizierung und Klassifizierung von positionsspezifischen GABAA Rezeptor Subunit Missense Varianten für ihre Rolle in hippokampalen Pyramidenneuronen

DOI:

10.3791/67833

⸱

June 6th, 2025

 , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Faculty of Engineering and Natural Sciences, Üsküdar University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie stellt ein Multiskalen-Framework vor, das von der DNA über die Proteinfunktion bis hin zum neuronalen Verhalten reicht. Es stellt einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung vorhergesagter pathogener Mutationen in der GABA-A-Rezeptor-Untereinheit vor und stellt die Hypothese auf, dass epileptogene Mutationen und proximale Mutationen, die als pathogen vorhergesagt werden, ähnliche Effekte auf das CA1-Pyramidenneuronenmodell hervorrufen können.

Abstract

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Das Verständnis der Auswirkungen funktionell unbekannter Varianten in Epilepsie-assoziierten Genen ist entscheidend für die Aufklärung der Pathophysiologie der Krankheit und die Entwicklung personalisierter Therapeutika. Mit einem Multiskalen-Rahmenwerk, das von der DNA-Sequenz über die Proteinfunktion bis hin zum neuronalen Verhalten reicht, beschreiben wir einen neuartigen Ansatz zur Vorhersage und Untersuchung pathogener Mutationen, wobei wir die Hypothese aufstellen, dass epileptogene Mutationen in der GABA-A-Rezeptor-Untereinheit und nahe gelegenen vorhergesagten Mutationen ähnliche Effekte auf das CA1-Pyramidenneuronenmodell haben könnten. Durch die Erforschung der charakteristischen Beziehungen zwischen vorhergesagten pathogenen Mutationen und proximalen epileptogenen Mutationen zielt die Studie darauf ab, die Auswirkungen vorhergesagter Mutationen auf der Grundlage der Auswirkungen epileptogener Mutationen auf hippokampale pyramidale Neuronensimulationen abzuschätzen.

Die Methodik beginnt mit der Erfassung genetischer Datendes GABA-A-Rezeptors γ2-Untereinheiten, gefolgt von der Datenbereinigung und -formatierung, die in R mit einem benutzerdefinierten Skript durchgeführt wird. Als nächstes werden Ensemble-Prädiktoren angewendet, um die pathogenen Missense-Varianten der γ2-Untereinheit zu identifizieren und zu priorisieren. Es wird die Kartierung einer spezifischen pathogenen Variante (vorhergesagt) auf die strukturellen Domänen der Untereinheiten veranschaulicht, die von epileptogenen Mutationen geteilt werden, begleitet von der molekularen Modellierung ihrer Auswirkungen und der Berücksichtigung der evolutionären Konservierung. Anschließend wird eine variantenspezifische Metaanalyse und Parameternormalisierung durchgeführt, gefolgt von einer Korrelationsanalyse, um signifikante Beziehungen zwischen vorhergesagten Mutationen und proximalen epileptogenen Mutationen zu identifizieren. Unter Verwendung eines Python-basierten neuronalen Simulators wird ein multikompartimentelles Leitfähigkeitsmodell beschrieben, das die Wirkung von Wildtyp- und epileptogenen Mutanten widerspiegelt. Die Simulation neuronaler Reaktionen, die durch den epileptogenen GABA-A-Rezeptor-Subtyp erzeugt werden, wird für die grobe Abschätzung der prognostizierten Wirkung pathogener Varianten auf die neuronale Reaktion berücksichtigt. Unseres Wissens ist dies das erste Protokoll, das ein Multiskalen-Framework zur Abschätzung der Auswirkungen von GABA-A-Rezeptorvarianten auf das neuronale Verhalten untersucht, das für die Epilepsieforschung von entscheidender Bedeutung ist. Dieses Protokoll kann als Grundlage für die Verbesserung der Vorhersage von zellulären Phänotypen dienen, die durch potenziell pathogene Varianten von GABA-A-Rezeptoren verursacht werden, die mit Epilepsie assoziiert sind.

Introduction

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Bei fast allen menschlichen Krankheiten spielt die genetische Variation eine bedeutende Rolle für die individuelle Anfälligkeit. Daher bietet das Verständnis, wie Sequenzvariationen mit dem Krankheitsrisiko zusammenhängen, eine wertvolle Möglichkeit, Schlüsselprozesse bei der Krankheitsentstehung aufzudecken und neue Ansätze für Prävention und Behandlung zu identifizieren1. Dies gilt auch für neurologische Entwicklungsstörungen, die zu den häufigsten chronischen Erkrankungen in der pädiatrischen Primärversorgung gehören2. Erkrankungen wie Autismus-Spektrum-Störung, geistige Behinderung und Epilepsie veranschaulichen, wie genetische Variation die individuelle Anfälligkeit während der Entwicklung signifikant beeinflusst3.

Das sich entwickelnde Gehirn ist anfälliger für epileptische Anfälle als das erwachsene Gehirn, was auf eine genetisch programmierte neurologische Entwicklungsdiskrepanz im kritischen Gleichgewicht zwischen Erregung und Hemmungzurückzuführen ist 4. Da GABA (Gamma-Aminobuttersäure), der primäre hemmende Neurotransmitter im erwachsenen Gehirn, während der embryonalen und frühen postnatalen Entwicklung exzitatorisch ist, ist dies nicht günstig für die Stabilität, die zur Vorbeugung von Anfällen in jungen Gehirnen erforderlich ist. Dieser vorübergehende Zustand, der durch den Mangel an ausreichender Expression von K-Cl-Co-Transportern5 verursacht wird, kann zu einem erhöhten Risiko für Anfallsaktivität in Gegenwart dysfunktionaler GABA-A-Rezeptoren beitragen. GABA-A-Rezeptoren vermitteln exzitatorische und inhibitorische Wirkungen von GABA, abhängig von der intrazellulären Konzentration des Cl-Ions 6. Wenn das Gehirn reift, verzerren Mutationen in den GABA-A-Rezeptor-kodierenden Genen sowie in anderen Ionenkanälen die Erregbarkeit, und Mutationen in Genen, die am neuronalen Stoffwechsel, der Zellsignalgebung und der Synapsenbildung beteiligt sind7, können Erkrankungen wie Absence-Epilepsie im Kindesalter verursachen8.

Klinische Interventionen nutzen zunehmend genetische Analysen, um die Präzision bei der Behandlung von neurologischen Entwicklungsstörungen zu verbessern2. Gentests bei pädiatrischer Epilepsie stellen potenzielle Ziele für Ansätze der Präzisionsmedizindar 9 und unterstreichen die Bedeutung genetischer Varianten für Behandlungsentscheidungen. Darüber hinaus erhalten ~25 % der Epilepsiepatienten mit De-novo-Mutationen genetische Diagnosen, die potenzielle Ziele für die Präzisionsmedizin identifizieren, was den erheblichen Wert genetischer Varianten bei der Orientierung von Behandlungsentscheidungen unterstreicht10. Dies wurde durch Fortschritte bei Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation vorangetrieben, wie z. B. gezielte Gen-Panels, die Sequenzierung des gesamten Exoms und die Sequenzierung des gesamten Genoms, die die genetischen Entdeckungen dramatisch beschleunigt haben11. Die zunehmende Zahl neuer Genentdeckungen bringt jedoch eine Herausforderung mit sich, wenn die Ergebnisse eine Variante von unbekannter Signifikanz (VUS) ergeben, eine Klassifikation, die widersprüchliche Beweise oder unzureichende Informationen über die molekulare Rolle der Variante bei der Pathogenese der Krankheit widerspiegelt. Varianten, die als VUS klassifiziert werden, entsprechen einer Kategorie innerhalb des fünfstufigen Variantenklassifikationssystems, das vom American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) und der Association for Molecular Pathology (AMP)12 vorgeschlagen wurde.

Um die Herausforderung funktionell unbekannter genetischer Varianten anzugehen, sind Anstrengungen in zwei Schlüsseldimensionen erforderlich: klinische Praxis und Forschung. Klinisch kann die Unsicherheit im Zusammenhang mit VUS das Patientenmanagement und die Entscheidungsfindung erschweren13. Aus Sicht der wissenschaftlichen Forschung ist es von entscheidender Bedeutung, pathogene Varianten in der zunehmenden Anzahl von Varianten mit ungewisser Signifikanz zu identifizieren und ihre Rolle in der Pathophysiologie der Krankheit und bei phänotypischen Effekten zu bestimmen1. Ein ideales Szenario wäre die genaue Vorhersage der molekularen, neuronalen und netzwerkbasierten Effekte aller funktionell nicht charakterisierten Varianten, um so die Ressourcen, den Zeit- und Arbeitsaufwand für laborbasierte Untersuchungen zu minimieren. Diese Aspekte unterstreichen die Bedeutung einer genauen Klassifizierung genetischer Varianten, um eine präzise Diagnose genetischer Epilepsien zu ermöglichen, eine personalisierte Behandlung zu unterstützen und die Entdeckung potenzieller pharmakologischer Ziele zu erleichtern. Die derzeitigen Vorhersagewerkzeuge 14,15,16,17 sind relativ genau, liefern aber in der Regel nur binäre Klassifikationen (pathogen vs. gutartig) und es fehlen krankheitsspezifische Einblicke in die molekulare Pathophysiologie, phänotypische Konsequenzen und zugrunde liegende Mechanismen. Dieser Artikel konzentriert sich auf die unbekannten Missense-Varianten ausgewählter GABA-A-Rezeptor-Untereinheiten-kodierender Gene und stellt einen Rahmen vor, der darauf abzielt, die Forschungsberatung zu verbessern, indem kontextuelle Faktoren von Varianten wie molekulare, evolutionäre und strukturelle Aspekte sowie Simulationen der neuronalen Pathologie einbezogen werden, die aus in vitro biophysikalischen Daten von Epilepsie-assoziierten Mutationen abgeleitet wurden. Unsere Methodik befasst sich mit der Identifizierung unbekannter pathogener Varianten der γ2-Untereinheit des GABA-A-Rezeptors, einer Schlüsseluntereinheit, die an der Pathophysiologie der Epilepsie beteiligt ist 18,19,20. Es folgt die Untersuchung des positionsspezifischen Matchings dieser vorhergesagten Varianten mit den epilepsieassoziierten Mutationen, die durch strukturelle und elektrophysiologische Daten charakterisiert sind. Diese Daten werden dann verwendet, um den Effekt der Variante auf ein Modell eines hippokampalen Pyramidenneurons abzuschätzen, das einen GABA-A-Rezeptor-Subtyp exprimiert, der aus γ2-, α1- und β3-Untereinheiten (γ2-GABA-A-Rezeptoren) besteht, die für die schnelle synaptische Hemmung verantwortlich sind6. Es ist wichtig zu beachten, dass sich GABA-A-Rezeptoren aus einem großen Pool von Untereinheiten (α1-α6, β1-β3, γ1-γ3, δ, Ε, θ, π und ρ1-ρ3) zusammensetzen und sich je nach Zusammensetzung der Untereinheiten die GABA-A-Rezeptoren in ihrer Modulation, ihren biophysikalischen Eigenschaften sowie in regionalen, zellulären und subzellulären Expressionsmustern unterscheiden, die mit spezifischen Funktionen gekoppelt sind 6,21,22,23, 24,25. Daher konzentriert sich die vorliegende Studie ausschließlich auf die γ2-GABAA-Rezeptoren bzw. γ2-haltigen GABAA Rezeptoren.

GABA-A-Rezeptor-Untereinheiten bestehen aus charakteristischen strukturellen Merkmalen: einer langen N-terminalen extrazellulären Domäne (ECD), vier Transmembran-übergreifenden Domänen (TM1 bis TM4), einem intrazellulären Linker, der TM1 und TM2 verbindet, einem extrazellulären Linker, der TM2 und TM3 verbindet, einer großen intrazellulären Schleife zwischen TM3 und TM4 (TM3-TM4-Schleife) und einem kurzen extrazellulären C-Terminus 6,26, 27. Urheberrecht Es wird vermutet, dass der GABA-A-Rezeptor über einen komplexen "Lock-and-Pull"-Mechanismus funktioniert, bei dem die GABA-Bindung die β und α Untereinheiten sperrt, wodurch sie an den extrazellulären Domänen (ECDs) der Untereinheiten ziehen und sie gegen den Uhrzeigersinn drehen27. Durch diese Bewegung werden die Transmembrandomänen (TMDs) gekrümmt, wodurch der Ionenkanal27 geöffnet wird. Die Kanalaktivität scheint also zusammen mit strukturellen Kassetten innerhalb der GABA-A-Rezeptoren koordiniert zu sein. Es stellt sich heraus, dass Epilepsiemutationen durch Verzerrung dieser strukturellen Kassetten eine Dysfunktion der Kanalaktivität verursachen28. Folglich basiert unsere Studie auf der Idee, dass vorhergesagte pathogene Varianten in der Nähe von funktionell identifizierten epileptogenen Mutationen in den spezifischen Strukturkassetten der GABA-A-Rezeptor-Untereinheiten ähnliche Muster elektrophysiologischer oder biophysikalischer Verzerrungen in der Kanalfunktion aufweisen können, wie sie bei diesen epileptogenen Mutationen beobachtet wurden. Während das Vorhandensein epileptogener Strukturkassetten in den GABA-A-Rezeptor-Untereinheiten28 diese Annahme indirekt unterstützt, zeigt unsere Studie die Komplexität und Herausforderung der Korrelation biophysikalischer Parameter epileptogener Mutationen mit denen der vorhergesagten pathogenen Mutationen. Um diese komplexen Zusammenhänge zu entlarven, ist unser Rahmenwerk von Bedeutung, da es einen mehrskaligen Ansatz hervorhebt, der von der DNA über die Proteinfunktion bis hin zum neuronalen Verhalten reicht und für die Epilepsieforschung entscheidend ist. Dieser Ansatz integriert computergestützte Genetik mit molekularer Modellierung und neuronalen Simulationen und betont gleichzeitig die Bedeutung komplementärer Methoden, wie z. B. maschinelles Lernen, das auf großen Datensätzen trainiert wird und die Auswirkungen von Mutationen auf die Kanalstruktur, die Aktivität und die neuronale Erregbarkeit erfassen können. Darüber hinaus ermöglicht die Simulation der epileptogenen γ2-GABA-A-Rezeptoraktivität im hippokampalen pyramidalen Neuronenmodell die Replikation des in vitro zellulären Phänotyps, der mit der GABA-A-Rezeptorkanalopathie assoziiert ist, und den Nachweis veränderter Einzelneuronenantworten im Zentrum der Netzwerkdysfunktion.

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Protocol

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1. In-silico-Vorhersage pathogener Varianten

  1. Erhebung von Variantendaten
    1. Suchen Sie mit der ClinVar-Datenbank29 über die Website nach Varianten mit ungewisser Signifikanz (VUS) in der kodierenden Region des interessierenden Gens über die Website: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/. Geben Sie das Gensymbol (z. B. GABRG2) in die Suchleiste ein und filtern Sie die Ergebnisse so, dass nur die gewünschten Variantentypen enthalten sind, z. B. Einzelnukleotid, Missense-Varianten mit ungewisser Signifikanz. Laden Sie die Daten herunter und speichern Sie sie als data.xlxs (Ergänzungsdatei 4: Ergänzungstabelle S1). Notieren Sie sich das Datum der heruntergeladenen Daten.
      ANMERKUNG: Im vorliegenden Protokoll wird die humane γ2-Untereinheit des GABA-A-Rezeptors, insbesondere die Homo sapiens gamma-Aminobuttersäure Typ A-Rezeptor-Untereinheit gamma2 (GABRG2), Transkriptvariante 1, mRNA (NCBI Ref. seq.: NM_198904.4), auch bekannt als γ2L, analysiert. Es ist wichtig, das Referenztranskript des interessierenden Gens sowie andere entsprechende Identifikatoren in verschiedenen Datenbanken (UniProt, ENSEMBL, PDB) aufzuzeichnen, da unterschiedliche Berechnungsmethoden unterschiedliche Identifikatoren erfordern können (Ergänzungsdatei 4: Ergänzende Tabelle S2). Falls die Datenbank oder das Berechnungstool die Versionsnummern der Sequenzkennungen nicht erkennt, versuchen Sie es sowohl mit der ID mit der Versionsnummer (NM_198904.4) als auch ohne die Versionsnummer (NM_198904).
    2. Grundlegende Informationen zum Referenzprotein
      1. Wählen Sie in der NCBI-Datenbank https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ in den Suchoptionen Nukleotid aus und geben Sie die NCBI Ref. seq. ID des interessierenden Gens (NM_198904.4) ein. Wenn Sie dann in der rechten Spalte nach unten scrollen, klicken Sie auf das Protein unter der Kategorie Verwandte Informationen , um das Protein (NP_944494.1) zu finden, das vom Transkript NM_198904.4 kodiert wird. Unter Verwendung der für das Protein NP_944494.1 angegebenen Informationen werden die Sequenzpositionen der spezifischen Regionen in Form einer Tabelle festgehalten (Ergänzungsdatei 4: Ergänzungstabelle S3).
        HINWEIS: Es ist wichtig, die vorläufigen bekannten Informationen für die Sequenzposition von funktionell und strukturell kritischen Regionen, Motiven oder Resten wie Proteindomänen, Phosphorylierungsstellen, Ligandenbindungsstellen und molekularen Interaktionsgrenzflächen zu bestimmen. Dies kann durch die Kombination von Datenbank- (NCBI, ENSEMBL, UniProt...) und Literaturrecherchen erreicht werden.
  2. Organisation von Variantendaten
    1. Organisieren Sie die Daten so, dass sie die Eingabeanforderungen für die ausgewählten Prädiktoren erfüllen. Stellen Sie sicher, dass das Format der abgerufenen Daten so organisiert ist, dass es den Anforderungen des dbNSFP-Servers http://database.liulab.science/dbNSFP entspricht. Entfernen Sie dazu nicht benötigte Spalten aus der data.xlsx Datei (Zusatzdatei 4: Zusatztabelle S1 aus Schritt 1.1.1) und behalten Sie nur die folgenden Spalten in der angegebenen Reihenfolge bei:
      "GRCh38Chromosom", "GRCh38Location", "Name", "Proteinveränderung".
    2. Speichern Sie die Datei unter dem neuen Dateinamen: "data1.xlsx" (Zusatztabelle S4). Formatieren Sie die data1.xlsx Datei in R, indem Sie den Code ausführen (Ergänzende Datei 1: Data_GABAA. R), der die formatierten Daten als data1_output.xlsx (Ergänzungsdatei 4: Ergänzungstabelle S5) in dem für das R-Projekt relevanten Arbeitsverzeichnis speichert.
      HINWEIS: Unterschiedliche Berechnungsmethoden erfordern unterschiedliche Datentypen und Formate. Das Sammeln und Organisieren von Daten nach bestimmten Formatanforderungen, selbst für ein Dutzend Varianten, kann fehleranfällig und zeitaufwändig sein, daher ist dieser Schritt wichtig, es sei denn, der Variantenpool besteht nur aus wenigen Varianten. Dann ist möglicherweise eine manuelle Datenorganisation möglich.
  3. Vorhersage der Pathogenität
    1. Übertragen Sie den Inhalt der data1_output.xlsx Datei in die akademische Version des dbNSFP-Servers30,31, auf die über http://database.liulab.science/dbNSFP zugegriffen wird. Kopieren Sie dazu die Datei oder laden Sie sie direkt in .txt Format hoch.
    2. Stellen Sie sicher, dass die folgenden Optionen vor der Übermittlung vorausgewählt und auf dem Server bestätigt werden: HG38 (Genom-Build), ClinPred32 und BayesDEL33 . Innerhalb weniger Minuten generiert der Server die Ergebnisse.
      ANMERKUNG: In dem vorliegenden Protokoll wurden zwei Ensemble-Prädiktoren, nämlich BayesDEL33 und ClinPred32, für eine hohe Genauigkeit34 und Praktikabilität ausgewählt. Es können aber auch andere Prädiktoren, wie z.B. AlphaMissense, das in der dbNSFP-Datenbank30,31 verfügbar ist, ausgewählt werden. Die Auswahl von In-silico-Werkzeugen hängt von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Generierung ausreichender mehrerer Zeilen rechnerischer Beweise für eine aussagekräftige Vorhersage12. Ensemble-Prädiktoren, die die Analyse mehrerer Vorhersagealgorithmen integrieren, können diesem Zweck dienen.
    3. Laden Sie die Ausgabedatei (in einem .txt Format) herunter und speichern Sie sie als data2.xlsx (Ergänzungsdatei 4: Ergänzungstabelle S6).
    4. Setzen Sie die Filter in data2.xlsx (Ergänzungsdatei 4: Ergänzungstabelle S6), indem Sie auf die Filteroption im Menü klicken und ermitteln Sie die Konsensusvarianten in beiden Spalten durch Filtern nach D. Daraufhin wird die Liste der pathogensten Varianten angezeigt. Speichern Sie es (siehe Registerkarte Konsens in der Ergänzungstabelle S6 [ Ergänzungsdatei 4]).
  4. Variantenauswahl
    1. Unter den konsensusartigen pathogenen Vorhersagen bestimmen Sie die Varianten in der Nähe von epileptogenen Mutationen, die aus der Literatur gewonnen wurden. Stellen Sie sicher, dass letztere strukturelle und biophysikalische Parameter aufweisen, die für die Modellierung von Neuronen geeignet sind.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist explorativ und bezieht sich auch auf die Untersuchung des interessierenden Proteins in Bezug auf seine strukturellen, physikalisch-chemischen und biophysikalischen Parameter. In der vorliegenden Studie wurden diese Daten von Brünger et al.35 und Guo et al.36 zusätzlich zu einer Erhebung von Epilepsie-assoziierten Mutationen gewonnen. Zusätzlich wurde optional auf AlphaMissense37 Scores aus der dbNSFP-Datenbank 30,31 zugegriffen, die Schritt 1.3 wiederholt (Ergänzungsdatei 4: Ergänzungstabelle S7). Näheres dazu finden Sie in den Protokollabschnitten 2.1.1 und 2.1.2 sowie in den Ergebnissen (siehe "Clustering-Varianten für strukturelle und biophysikalische Parameter").
    2. Verwenden Sie für eine grundlegende Visualisierung die Server Protter38 ((https://wlab.ethz.ch/protter/start/) und HOPE39 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/), um die Varianten im vorherigen Schritt im Kontext ausgewählter GABRG2-Genmutationen zu untersuchen: P302L40 und K328M (oder K289M41, wenn das Signalpeptid mit 39 Resten ausgeschlossen wird).
      HINWEIS: Aufgrund der enormen Komplexität sollte die strukturelle Bewertung von Varianteneffekten auf mehreren Analyseebenen erfolgen. Werkzeuge wie Protter38 werden die klare Visualisierung der Varianten im Kontext topologischer Merkmale des Proteins ermöglichen und benutzerfreundliche Server wie HOPE39 werden durch molekulare Modellierung Einblick in den Varianteneffekt geben. Darüber hinaus ist eine umfassende Literaturrecherche des interessierenden Proteins von entscheidender Bedeutung, um die Informationen über Mutationen, die mit Epilepsie assoziiert sind, zu identifizieren und zu integrieren.
    3. Analyse von evolutionären Erhaltungs- und Strukturerkenntnissen
      1. Öffnen Sie Jalview 42,43,44, ein Open-Source-Programm zum Bearbeiten, Visualisieren und Analysieren von Proteinen.
      2. Importieren Sie Sequenzen für die Ausrichtung. Klicken Sie im oberen Menü auf Datei | Abrufen von Sequenzen; Wählen Sie die Datenbank im Dialogfeld aus (z. B. UniProt); Klicken Sie auf die Registerkarte IDs abrufen. und geben Sie, wie im Dialogfeld beschrieben, die UniProt-Zugangs-IDs des interessierenden Gens (GABRG2) von Menschen und anderen Wirbeltierarten ein: P18507, P22723, Q6PW52, A0A2I3TKX0, F1RR72, A0A8I3MDZ2 A0A8M1P4D6. Klicken Sie auf OK.
        HINWEIS: Die UniProt-Zugangsnummern der von GABRG2 kodierten Proteine lauten wie folgt: P18507 (P18507-2) für Homo sapiens, P22723 für Mus musculus, A0A2I3TKX0 für Pan troglodytes, F1RR72 für Sus scrofa, A0A8I3MDZ2 für Canis familiaris und A0A8M1P4D6 für Danio rerio.
      3. Abhängig vom interessierenden Gen können einige Sequenzen nicht annotiert werden. Führen Sie daher eine BLAST-Suche durch, um relevante Informationen und potenzielle Homologe für ein besseres kontextuelles Verständnis zu identifizieren. Laden Sie in diesem Fall das FASTA-Format von Proteinsequenzen über die Textfeldoption Sequenzen/Von hinzufügen im Menü Datei hoch, um mehrere Sequenzalignments der gewünschten Sequenzen zu erstellen.
      4. Nachdem die Achse geladen ist, beobachten Sie die angezeigten Sequenzen für den Vergleich mehrerer Sequenzen. Jede Zeile stellt eine Sequenz dar, und jede Spalte stellt eine Position in der Ausrichtung dar. Um die beste Ausrichtungsmethode zu bestimmen, verwenden Sie verschiedene Ansätze. Klicken Sie beispielsweise im Menü Sequenz auf die Webdienste und wählen Sie die Option T-Coffee mit Voreinstellung ausführen, die eine optimale Ausrichtung ermöglicht.
      5. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Sequenz P18507 Homo sapiens (die Referenzsequenz in der vorliegenden Studie) und legen Sie sie als Referenzsequenz fest. Wählen Sie im oberen Menü Format und klicken Sie auf Wrap , um die vollständige Ausrichtung im Bildschirm zu visualisieren. Klicken Sie im selben Formatmenü auf die obige Skala , um die Visualisierung bestimmter Restnummern zu verbessern. Um die Visualisierung weiter zu verbessern, passen Sie die Farbschemata an, indem Sie zu Farbe gehen und verschiedene Optionen auswählen (z. B. Farbfarbe, Chemische Eigenschaft); Ändern Sie bei Bedarf die Schriftgröße.
      6. Klicken Sie in der Menüleiste auf Berechnen und wählen Sie Konsens automatisch berechnen , um konservierte Regionen hervorzuheben.
      7. Konzentrieren Sie sich auf die Position der im In-silico-Vorhersageschritt identifizierten Varianten von Interesse und untersuchen Sie spezifische Variantenpositionen. Beschriften Sie bestimmte Rückstände, indem Sie mit der rechten Maustaste darauf klicken und Anmerkung hinzufügen auswählen. Schreiben Sie das Etikett (z.B. Varianten-ID) mit dem entsprechenden Farbcode und speichern Sie.
        HINWEIS: In der vorliegenden Analyse wurden P302L (violett) und A303T (rot) ausgewählt, um sie in der Mehrfachsequenzausrichtung zusammen mit den Strukturdaten zu visualisieren (siehe nächster Abschnitt).
    4. Dreidimensionale Rekonstruktion des Vollproteins mit den ausgewählten konservierten Resten
      1. Klicken Sie in der Datei aus dem vorherigen Schritt mit der rechten Maustaste auf die Referenzsequenz (GABRG2 human) und wählen Sie 3D-Strukturdaten.
      2. Identifizieren Sie die entsprechenden Strukturdaten (7QNE, Kette C)26 aus dem Dropdown-Menü und wählen Sie Neue Strukturansicht mit Jmol öffnen.
        HINWEIS: Dies ermöglicht die Einbeziehung der Reste, die in der Mehrfachsequenzausrichtung ausgewählt wurden, in die Strukturdaten durch Jmol, einen Open-Source-Java-basierten Viewer für chemische 3D-Strukturen.

2. Parameterauswahl und biophysikalische Modellierung

  1. Variantenspezifische Metaanalyse und Parameternormalisierung
    1. Überblick über die aktuelle Literatur, um identifizierte Untereinheitenvarianten mit elektrophysiologischer Datenkanalleitfähigkeit (gGABAA), Deaktivierungszeit (τ Deaktivierung), Anstiegszeit (τ Anstieg) und maximaler Stromamplitude (Imax) zu sammeln. Geben Sie die Zusammensetzung der Untereinheiten, den Zelltyp und die Wildtyp-Messungen für jeden Fall an. Kennzeichnen Sie die Varianten und ihre Kontrollen entsprechend (z. B. bekannt für Varianten mit identifizierten biophysikalischen Merkmalen und bekannte Kontrolle für die Wildtyp-Messungen für jede Variante).
    2. Erhalten Sie AlphaMissense-Pathogenitätsbewertungen für Varianten mit identifizierten biophysikalischen Merkmalen.
      HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie im Protokollabschnitt 1.3.
    3. Erstellen Sie einen Datenrahmen mit der Position der Untereinheit und der Aminosäure für jede Variante, den ursprünglichen und veränderten Aminosäuren, dem Pathogenitätswert und den biophysikalischen Parametern aus der Literatur. Um experimentelle Diskrepanzen zu vermeiden, normalisieren Sie die biophysikalischen Parameter für identifizierte Varianten als x-fache Veränderungen bei Wildtyp-Messungen.
  2. Vergleichende Variantenanalyse nach strukturellen und funktionalen Merkmalen
    1. Organisieren der vorhergesagten Varianten in einem Datenrahmen; entsprechend gekennzeichnet (z. B. für Varianten vorhergesagt, für die keine Literatur zu ihren biophysikalischen Eigenschaften verfügbar ist).
    2. Klassifizieren Sie die Varianten nach ihrer Position in der Aminosäuresequenz und der Tertiärstruktur. Fügen Sie dem Datenrahmen strukturelle Klassifikationsparameter hinzu (z. B. Lokalisation in Alpha-Helices, Spulen, Beta-Faltblättern, extrazellulären, intrazellulären oder Transmembrandomänen, Porenauskleidung, Agonistenbindung, Protein-Protein-Interaktionen) und geben Sie Informationen für jede Variante in Bezug auf ihre Aminosäureposition an.
    3. Klassifizieren Sie die Varianten nach ihrem Abstand zum Membranmittelpunkt und zur Porenachse. Fügen Sie den Abstand zur Porenachse und den Abstand zu den Parametern für den Membranmittelpunkt im Datenrahmen hinzu.
    4. Analysieren Sie die Korrelation zwischen strukturellen und biophysikalischen Parametern über bekannte Varianten. Wenn möglich, bewerten Sie die vorhergesagten Varianten in Bezug auf die erhaltenen Korrelationen.
  3. Aufbau von Synapsen- und Neuronenmodellen
    1. Verwenden Sie den Brian245, einen in Python entwickelten Open-Source-Neurosimulator zur Modellierung und Simulation von Spiking Neural Networks, um ein multikompartimentelles biophysikalisches Modell der GABAergen Synapse auf einem auf Multikompartimentellen Leitfähigkeit basierenden Hippocampus-Pyramidenneuron zu erstellen.
    2. Entwerfen Sie das leitfähigkeitsbasierte Modell, indem Sie die Kinetik des Ionenkanal-Gatings, passive und aktive Parameter sowie die postsynaptische Leitfähigkeit definieren. Definieren Sie das leitwertbasierte Modell wie in der Zusatzdatei 2 angegeben, in der die im Modell verwendeten Gleichungen beschrieben werden.
      1. Die Membrankapazität (Cm) auf 1 μF/cm2 und den intrazellulären Widerstand (Ra) auf 200 Ω cm einstellen.
      2. Verwenden Sie die modifizierten Leitwerte vom Hodgkin-Huxley-Typ für hippokampale Pyramidenneuronen39 mit gL = 0,0003 S/cm2, gK = 0,036 S/cm2, EL = -76,5 mV, ENa = 50 mV und EK = -90 mV.
      3. Passen Sie die Dichteverteilung der NaV-Kanäle über gNa auf 0,05 S/cm2 für Soma, 0,5 S/cm2 für das Axon-Anfangssegment (AIS) und den Knoten von Ranvier (NR) und 0,005 S/cm2 für Dendriten an. Legen Sie gK und gNa in myelinisierten Segmenten auf 0 fest.
      4. Aufbau einer Ionenkanal-Gating-Kinetik für NaV und KV , wie in der Zusatzdatei 2 beschrieben.
      5. Führen Sie synaptische Ströme (Isyn) als Summe aller glutamatergen und GABAergen Synapsen in einem Kompartiment ein. Beziehen Sie sowohl den schnellen AMPA-Rezeptor-vermittelten Strom (IAMPA) als auch den langsamen NMDA-Rezeptor-vermittelten Strom (INMDA) in den glutamatergen Strom (Iglu) ein. Beziehen Sie nur schnellen GABA-A-Rezeptor-vermittelten Strom in den GABAergen Strom (IGABA) ein. Nehmen wir an, dass für jeden präsynaptischen Spike eine konstante Menge an Glutamat an die Synapse abgegeben wird; Daher ist die Aktivierung der Rezeptoren spike-zeitabhängig (sAMPA und sNMDA) und die Gesamtrezeptorleitwerte (gAMPA und gNMDA) spiegeln die Menge an Glutamat wider, die bei jedem Ereignis freigesetzt wird.
      6. Verwenden Sie das synaptische Modell, wie in der Zusatzdatei 2 beschrieben.
        HINWEIS: Eine detaillierte Erläuterung der Gleichungen finden Sie in der Ergänzungsdatei 2 , in der die im Modell verwendeten Gleichungen beschrieben werden.
    3. Ermitteln Sie den experimentell gemessenen Durchmesser für Soma und Neuriten sowie die Länge jedes Neuritenkompartiments und der Verzweigungsmuster aus der früheren Literatur46,47. Reduzieren Sie die reale Neuronenmorphologie in ein Modell mit mehreren Kompartimenten, indem Sie die Zelle in mehrere Kompartimente aufteilen, das die Hauptverzweigungsstruktur genau beibehält und die bilaterale Symmetrie beibehält.
    4. Stellen Sie die Morphologie (Segmentlänge und -durchmesser; d. h. d_soma: 30 μm; l_AH: 5 μm; d_AH_i: 1,5 μm; d_AH_f: 1,3 μm; l_AIS: 40 μm; d_axon: 1 μm; l_myseg: 100 μm; l_NR: 2 μm; l_AxTer: 4 μm; d_AxTer: 2 μm; l_approx: 100 μm; l_apmed: 100 μm; l_apdis: 200 μm; d_approx_i: 4 μm; d_approx_f: 3 μm; d_apmed : 2 μm; d_apdis: 2 μm; l_apLM: 70 μm; d_apLM: 2 μm; l_nAcDbasal: 400 μm; d_nAcDbasal: 1,4 μm; l_nAcDbasal_stem: 20 μm; d_nAcDbasal_stem: 1,5 μm) und biophysikalische Parameter (wie in Abschnitt 2.3.2 angegeben) für jedes Kompartiment des pyramidalen Neuronenmodells46,47, wie auch im Python-Skript (Ergänzende Datei 3: GABAAvar.py) beschrieben.
    5. Bestimmen Sie die biophysikalischen Parameter für das GABAerge Synapsenmodell, indem Sie die in Schritt 2.1.1 erhaltenen Wildtyp-Kontrollmessungen auswerten.
  4. Entwerfen Sie die Topologie des Neuronenmodells und weisen Sie morphologische und biophysikalische Parameter zu, was die Spezifizierung der räumlichen Anordnung und der Verbindungen der Kompartimente auf der Grundlage der zuvor erhaltenen morphologischen und Verzweigungsinformationen umfasst. Weisen Sie jedem Kompartiment des Modells die entsprechenden morphologischen (z. B. Segmentlänge und -durchmesser) und biophysikalischen Parameter (Abschnitt 2.3.2) zu, wie in der Zusatzdatei 3: GABAAvar.py beschrieben.
  5. Aufbau von Synapsen und Strominjektion
    1. Erstellen Sie die präsynaptische Aktivität mit SpikeGeneratorGroup (einer Klasse aus der Brian2-Bibliothek), wie in "GABAAvar.py" (Ergänzende Datei 3) angegeben. Verbinden Sie den Spike-Generator mit dem Zielkompartiment des Modellneurons mithilfe der Synapsen-Klasse , um synaptische Verbindungen zu modellieren.
    2. Stellen Sie einen konstanten Dauerstrom (Iinj) auf 0,85 nA ein und platzieren Sie ihn am Soma, um die unterschwellige Aktivität nachzuahmen, die durch die Ionenstrombelastung zu einem bestimmten Zeitpunkt verursacht wird, wie in der Zusatzdatei 3: GABAAvar.py beschrieben.
  6. Um Aufzeichnungsmonitore zu erstellen, zeichnen Sie Spannungsspuren aus Zielabteilungen mit StateMonitor auf.
  7. Erstellen und betreiben Sie das Netzwerk.
    1. Erstellen Sie das Netzwerk mit dem Modellneuron, den Verbindungen und Monitoren mithilfe des Netzwerks.
    2. Legen Sie den Zeitschritt der Simulation mit defaultclock.dt fest (z. B. 0,01 ms).
    3. Führen Sie die Simulation im Netzwerk mit network.run(T*ms) aus, wobei T im Beispiel auf 1.000 ms festgelegt ist.
  8. Testen der Auswirkungen von GABA-A-Rezeptor-Missense-Mutationen
    1. Definieren Sie den Einfluss jeder Missense-Mutation auf die Kanalkinetik anhand der in Schritt 2.1.1 gesammelten biophysikalischen Parameter.
    2. Führen Sie die Stimulation aus, indem Sie diese Parameter ändern, und stellen Sie die Ergebnisse mit "matplotlib.pyplot" dar, wie in "GABAAvar.py" (Ergänzende Datei 3) angegeben.
  9. Testen Sie Parameterkombinationen, um die Änderungen der Zündmuster und -raten zu analysieren. Plotten Sie die Ergebnisse für Vergleiche.

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Results

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Diese Studie verwendet einen multiskaligen Ansatz, um die pathogenen Varianten in der γ2-Untereinheit des GABA-A-Rezeptors, einer Schlüsselkomponente in der Pathophysiologie der Epilepsie, vorherzusagen und zu charakterisieren. Durch den Einsatz von Vorhersagemodellen, molekularer Modellierung, evolutionärer Konservierung, Strukturuntersuchung, Korrelationsanalyse und neuronalen Simulationen verbessert dieser Ansatz die Klassifizierung von Varianten, mit erheblicher Relevanz fü...

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Discussion

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Durch die Anwendung einer Kombination aus computergestützter Genetik, molekularer Modellierung und neuronalen Simulationen hat der in dieser Arbeit vorgestellte Ansatz das Potenzial, die Klassifizierung von GABA-A-Rezeptorvarianten zu verbessern und wertvolle Erkenntnisse sowohl für die Epilepsieforschung als auch für klinische Anwendungen zu liefern. Eine umfassende Analyse zur Identifizierung und Priorisierung von vorhergesagten pathogenen Mutationen wird vorgestellt und zu ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Arbeit haben.

Acknowledgements

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Wir danken Çağla Koca für ihre Unterstützung beim Aufbau des Modellneurons.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Brian2 Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, Frankreich; Imperial College London, Vereinigtes Königreich2.8.0.4Stimberg et al., 2019 (https://pypi.org/project/Brian2/ )
dbNSFP-Server   Genos Bioinformatics LLC, USAv3.0Liu et al., 2020 (http://database.liulab.science/dbNSFP) (https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP)
HOFFNUNG   Zentrum für molekulare und biomolekulare Informatik CMBI, Radboud Universität, Niederlande 1.1.1Venselaar et al., 2010 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/)
Jalview   Universität Dundee, GroßbritannienJV2Waterhouse et al., 2009 (https://www.jalview.org/)
Jupyter NotebookProjekt Jupyter, USAhttps://jupyter.org/install 
PhytonPython Software Foundation, USA3.13https://www.python.org/downloads/
Protter   ETH Zürich, SchweizVersion 1.0Omasits, et al., 2014 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/)
R Die R Foundation for Statistical Computing, USAR-Version 4.3.2   https://www.r-project.org/ 
RStudioPosit software, PBC, USARStudio 2023.12.1+402 "Ocean Storm" Versionhttps://posit.co/downloads/

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