Methodenartikel

Onkogen-Expressionsanalyse mit Veränderungen des pH-Werts in einer duktalen Pankreaszelllinie

DOI:

10.3791/67843

⸱

11. April 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Research Centre, Asian Healthcare Foundation, AIG Hospitals, 2Department of Biochemistry, Osmania University, 3Department of Medical Gastroenterology, Asian Institute of Gastroenterology (AIG) Hospitals

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur Untersuchung der Auswirkungen eines veränderten pH-Werts auf die Onkogenexpression mittels RNA-seq-Analyse einer duktalen Pankreaszelllinie.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die vierthäufigste krebsbedingte Todesursache, das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC), hat eine Fünf-Jahres-Überlebensrate von 12 %. Diese Krankheit hat eine schlechte Prognose und ist durch ein starres stromales Mikromilieu gekennzeichnet, was eine spürbare Herausforderung bei der Behandlung darstellt. Patienten mit chronischer Pankreatitis haben ein 10-fach höheres Risiko, an PDAC zu erkranken. Bei diesen Patienten sinkt der duktale pH-Wert von pH 8,0 auf pH 6,0 aufgrund einer Bikarbonatinsuffizienz und des entzündlichen Milieus. Unser Ziel war es, die Rolle des sauren Milieus bei chronischer Pankreatitis auf die Onkogenexpression in einer duktalen Pankreaszelllinie zu verstehen.

Daher wurden 80% konfluente humane duktale Epithelzellen der Bauchspeicheldrüse bei pH 6,0 bis pH 7,2 für 6 Stunden inkubiert. Die Gesamt-RNA aus den Zellen wurde verarbeitet, um die Gesamt-mRNA in den Proben anzureichern. Die Genexpression wurde mittels Next-Generation-Sequencing (NGS) von biologischen Replikaten untersucht. Die RNA-seq-Analyse wurde mit Hilfe eines Online-Tools durchgeführt und die differentiell exprimierten Gene (FCs < ± 2.0) identifiziert; es gab 90, 148 und 109 hochregulierte Gene und 20, 14 und 23 herunterregulierte Gene bei einem pH-Wert von 6,0, 6,5 bzw. 7,0. Vier Onkogene wurden bei pH 6,0 hochreguliert, sieben bei pH 6,5 und sieben bei pH 7,0. Die häufigsten Gene, die bei pH 6,0, pH 6,5 und pH 7,0 hochreguliert wurden, waren die lymphozytenzellspezifische Protein-Tyrosinkinase (LCK) [pH 6,0, FC: 2,93; pH 6,5, FC: 2,93; pH 7,0, FC: 3,32], das FGR-Proto-Onkogen, die Tyrosinkinase (FGR) der Src-Familie (FGR) [pH 6,0, FC: 4,17; pH 6,5, FC: 5,25; pH 7,0, FC: 5,09] und ArfGAP mit SH3-Domäne, Ankyrin-Wiederholung und PH-Domäne 3 (ASAP3) [pH 6,0, FC: 2,37; pH 6,5, FC: 3,84; pH 7,0, FC: 2,51]. Das saure Milieu löst die Aktivierung von Proto-Onkogenen aus, die bei chronischer Pankreatitis die Tumorinitiierung auslösen können.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) gehört zu den Hauptkrebsarten und steht in Bezug auf die Anzahl der damit verbundenen Todesfälle an vierter Stelle unter den Krebsarten1. Eine höhere Sterblichkeitsrate ist bei PDAC-Patienten offensichtlich, und nach neueren Studien liegt die Fünf-Jahres-Überlebensrate bei nur 12 %. Patienten mit dokumentierter chronischer Pankreatitis, einer Erkrankung, die zu einer Entzündung der Bauchspeicheldrüse2 führt, entwickeln mit größerer Wahrscheinlichkeit (etwa 15-16-fach) PDAC3. Es gibt verschiedene Arten von CP mit unterschiedlichen Ätiologien, wie z. B. alkoholbedingte, erbliche und idiopathische CP4. Es ist bekannt, dass die Bedingungen, die während der Zerspanungstherapie auftreten, zur Bildung von verkalkten Steinen, zur Entwicklung von Krebszellen und sogar zu Diabetes führen. Die Prävalenz von PDAC ist bei Patienten mit hereditärer chronischer Pankreatitis hoch5.

Einige physiologische Zustände in der Bauchspeicheldrüse von CP-Patienten können für die Auslösung anderer Beschwerden von Vorteil sein; Dazu gehören das entzündliche Milieu, aktive Verdauungsenzyme und der saure pH-Wert des Pankreassaftes6. Auf dem Gebiet der Entzündung wird eine breite Palette von Studien durchgeführt, da Entzündungen Chaos in der normalen Funktion des Organs verursachen 7,8,9. Ein Ungleichgewicht in der pH-Regulation ist jedoch ein weiteres Phänomen, das die Einleitung des unkontrollierten Wachstums von Zellen auslösen kann10. Der Bauchspeicheldrüsensaft gesunder Menschen ist alkalisch, was dazu beiträgt, den vom Magen produzierten sauren Speisebrei zu neutralisieren. Im Gegensatz dazu bleibt der Pankreassaft bei CP-Patienten sauer, da die Bikarbonatsekretion unzureichend ist. Geringe Mengen an Bikarbonat können den Saft nicht vollständig neutralisieren, was zu einem leicht sauren Milieu im Kanal11 führt.

Frühere Studien deuten darauf hin, dass sich Krebszellen an saure Umgebungen anpassen und dort gedeihen12. In solchen Fällen deuten die Bedingungen, die während des Prozesses der chronischen Pankreatitis bestehen, auf ein günstiges Umfeld für die Proliferation und Metastasierung dieser Zellen hin13. Daher zielte unsere Studie darauf ab, die morphologischen Veränderungen in humanen Pankreasgangzellen zu beurteilen und die Onkogenexpression unter leicht sauren Bedingungen zu beurteilen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wiederbelebung der Zelllinie

  1. Beschaffen Sie die humane normale duktale Pankreaszelllinie (HPDEC/ H6C7) und beleben Sie die Zellen in frischem Medium.
    1. Tauen Sie die Zellen bei 37 °C in einem Wasserbad auf.
    2. Bereiten Sie das gesamte Medium frisch vor und filtern Sie es mit einem Spritzenfilter.
      HINWEIS: Das Komplettmedium enthält das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird.
    3. Geben Sie 6 ml des vollständigen Mediums in ein frisches konisches 15-ml-Röhrchen, fügen Sie die aufgetaute Zellsuspension hinzu und mischen Sie es gründlich.
    4. Die Suspension bei 1.800 × g 6 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, geben Sie 1 ml Nährmedium zum Pellet und mischen Sie es vorsichtig.
      HINWEIS: Kulturmedium enthält DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Pen/Streptokokken-Antibiotika.
    5. Die Zellen werden tropfenweise in einen T-25-Kolben mit 4 ml Kulturmedium gegeben und bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert.

2. Ändern des pH-Werts des Kulturmediums

  1. Bereiten Sie 100 ml 0,5 M Natriumphosphat-Pufferlösungen mit pH-Werten von 6,0, 6,5 und 7,0 vor, wie in Tabelle 1 angegeben.
  2. Überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät und stellen Sie ihn mit 1 N HCl/1 M NaOH ein.
  3. Sterilisieren Sie die Puffer in einer Laminar-Luftstromhaube mit einem 0,45 μm Spritzenvorsatzfilter.
    HINWEIS: Der Puffer kann bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert werden.
  4. Bereiten Sie Nährmedien mit pH-Werten von 6,0, 6,5 und 7,0 vor, indem Sie 20 mL sterilen 0,5 M Natriumphosphatpuffer mit dem entsprechenden pH-Wert zu 80 mL Kulturmedium hinzufügen.
  5. Geben Sie das Medium mit dem veränderten pH-Wert zu 85-90 % konfluenten menschlichen Pankreas-Gangzellen hinzu und überprüfen Sie die morphologischen Veränderungen unter einem Hellfeldmikroskop in 1-Stunden-Intervallen für 6 Stunden.

3. RNA-Isolierung

HINWEIS: Für die RNA-Isolierung aus Zellen müssen sterile Handschuhe verwendet werden und die Oberfläche muss mit 100 % Ethanol dekontaminiert werden.

  1. Entfernen Sie das Kulturmedium und spülen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  2. Legen Sie die Platte auf Eis, geben Sie PBS in die Vertiefung und kratzen Sie dann die Zellen mit einem Zellschaber ab.
    HINWEIS: Die Menge an zugegebenem PBS sollte ausreichen, um die Zellen zum Schaben zu bedecken. Es ist nicht erforderlich, eine große Menge an PBS hinzuzufügen.
  3. Die Suspension in einem frischen Röhrchen auffangen und bei 8.000 ×g 10 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand.
  4. Geben Sie Lysepuffer mit β-Mercaptoethanol in das Pellet und pipettieren Sie es 5-10 Minuten lang auf Eis auf und ab.
  5. Geben Sie das gleiche Volumen von 70 % Ethanol in das Lysat und mischen Sie es gründlich. Nicht wirbeln.
  6. Geben Sie die Lösung in die Kieselsäuremembransäule, zentrifugieren Sie sie 30 s lang bei >8.000 ×g und verwerfen Sie den Durchfluss.
  7. Geben Sie Waschpuffer in die Probe und zentrifugieren Sie sie 30 s lang bei >8.000 ×g . Zentrifugieren Sie das leere Röhrchen 1 Minute lang bei >8.000 ×g.
  8. Geben Sie 30-50 μL nukleasefreies Wasser in die Säule und lassen Sie sie 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Zentrifugieren Sie die Säule bei >8.000 ×g für 5 min.
    HINWEIS: RNA-Proben können bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert werden.

4. RNA-seq/Transkriptom

  1. Bewertung der RNA-Integrität
    1. Überprüfen Sie die Integrität der RNA in einem Bioanalysator, indem Sie 1 μl (25-500 ng) entnehmen und mit 5 μl Farbstoffpuffer mischen.
    2. Die Lösung bei 500 ×g 1 min zerkleinern und kurz schleudern.
    3. Führen Sie für jede Probe 3 Minuten lang eine einstufige Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bei 72 °C durch und inkubieren Sie sie dann 2 Minuten lang auf Eis, bevor Sie sie mit einem Bioanalysator analysieren.
  2. rRNA-depletierte Gesamt-RNA
    1. Geben Sie 5 μg Gesamt-RNA, 50 μl Hybridisierungspuffer und 1-3 μl Sondenmischung in ein frisches PCR-Röhrchen.
    2. Führen Sie die folgenden Schritte durch: erster Schritt, Denaturierung bei 70 °C für 10 min; zweiter Schritt, Hybridisierung bei 37 °C für 20 min; und Inkubation bei 37 °C bis zur Verwendung.
    3. In ein frisches Röhrchen 500 μl magnetische Kügelchen und die Probe geben; Legen Sie die Mischung 1 Minute lang auf einen Magnetständer, bis die Lösung klar wird.
    4. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig. Entfernen Sie das Röhrchen, waschen Sie die Kügelchen mit 500 μl nukleasefreiem Wasser und legen Sie die Mischung für 1 Minute wieder auf den Magnetständer. Entfernen Sie den Überstand, sobald die Lösung klar ist.
    5. Wiederholen Sie den Vorgang 5-7x. 200 μl Hybridisierungspuffer zugeben und gut mischen. Halten Sie die Röhrchen 5 Minuten lang bei 37 °C.
    6. Geben Sie 100 μl RNA-Sonde zu der obigen Mischung, mischen Sie vorsichtig und inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei 37 °C.
    7. Drehen Sie die Röhre kurz, bevor Sie sie 1 Minute lang auf den Magnetständer legen.
    8. Sammeln Sie den durchsichtigen Überstand, der die rRNA-depletierte RNA enthält, in einem frischen Röhrchen.
  3. RNA-Fragmentierung
    1. Geben Sie in ein frisches PCR-Röhrchen 8-10 μl rRNA-depletierte Gesamt-RNA (500 ng/g), 1 μl 10x Puffer und 1 μl RNase III.
    2. Die Lösung durch kurzes Klopfen und Schleudern mischen.
    3. Legen Sie die Röhrchen für 10 min bei 37 °C in einen Thermocycler.
    4. Geben Sie in ein frisches Röhrchen 5 μl Nukleinsäure-bindende Kügelchen und fügen Sie dann 90 μl Bindelösungskonzentrat hinzu.
    5. Geben Sie 30 μl der RNA-Fragmente und 150 μl 100 % Ethanol zu der obigen Mischung. Mischen Sie die Probe, indem Sie sie 10x pipettieren und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
    6. Legen Sie die Röhrchen auf den Magnetständer, bis die Lösung klar wird. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
    7. Waschen Sie die Kügelchen mit 150 μl Ethanol, während sich die Röhrchen auf einem Magnetständer befinden; Lassen Sie die Mischung 30 Sekunden ziehen und entfernen Sie dann den Überstand.
    8. Lassen Sie die Röhrchen 1-2 Minuten lang auf einem Magnetständer, damit das restliche Ethanol verdampfen kann.
    9. Geben Sie 12 μl vorgewärmtes nukleasefreies Wasser zu den Kügelchen und mischen Sie die Probe durch 10-maliges Pipettieren.
    10. Inkubieren Sie die Probe 1 Minute lang bei Raumtemperatur. Legen Sie die Röhrchen auf einen Magnetständer und sammeln Sie den Überstand ein, sobald er klar ist.
  4. Vorbereitung von Bibliotheken und cDNA-Präparation
    1. Geben Sie 3 μl der fragmentierten RNA-Probe in ein PCR-Röhrchen und fügen Sie dann 5 μl Hybridisierungsmischung hinzu. Mischen Sie die Probe, indem Sie sie einige Male pipettieren und dann kurz drehen.
    2. Bewahren Sie die Röhrchen 10 min bei 65 °C und anschließend 5 min bei 30 °C in einem Thermocycler auf.
    3. Geben Sie 10 μl Ligationspuffer und 2 μl Ligationsenzymmischung in die obige Lösung. Die Reaktion wird in einem Thermocycler 1 h lang bei 30 °C inkubiert.
    4. Geben Sie den Reverse-Transkriptase-Mastermix in die Ligationsmischung und inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang bei 70 °C, gefolgt von der Inkubation auf Eis.
  5. Amplifikation von cDNA
    1. Geben Sie 6 μl cDNA (500 ng) in ein frisches PCR-Röhrchen und fügen Sie dann 46 μl barcodierten PCR-Mix aus einem Röhrchen hinzu, das 46 μl High-Fidelity-Polymerase-Enzym und 1 μl 3'-Barcode-Primer enthält.
    2. Stellen Sie die PCR-Bedingungen wie folgt ein: erste Stufe, 2 Minuten lang bei 94 °C halten; zweite Stufe, Zyklen bei 94 °C für 30 s und 50 °C für 30 s; dritte Stufe, 16 Zyklen bei 94 °C für 30 s, 62 °C für 30 s und 68 °C für 30 s. Halten Sie die Reaktion 5 Minuten lang bei 68 °C.
    3. Die amplifizierte cDNA wird durch Wiederholung der Schritte 4.3.5 bis 4.3.10 aufgereinigt und die fragmentierte RNA-Probe durch das im vorherigen Schritt erhaltene PCR-Produkt ersetzt.
    4. Analysieren Sie die gereinigte RNA-Probe auf einem Sequenzierer (NGS), um Daten in Form von FASTq-Dateien zu generieren.

5. Bioinformatik

  1. Öffnen Sie das online verfügbare Galaxie-Tool, indem Sie den Link: https://usegalaxy.org in die Suchregisterkarte des Browsers kopieren und einfügen.
  2. Registrieren Sie sich beim ersten Besuch dieser Website für ein Profil, indem Sie auf das Anmelden oder die Option "Registrieren " in der oberen rechten Ecke klicken.
  3. Nachdem Sie ein Konto erstellt haben, melden Sie sich bei dem Konto an, indem Sie den öffentlichen Namen/Benutzernamen und das Passwort eingeben.
  4. Laden Sie die FASTq-Dateien hoch, die Sie nach der RNA-seq-Analyse erhalten haben, indem Sie auf die Upload-Option auf der linken Seite klicken.
  5. Wählen Sie das cutadapt-Werkzeug aus dem Werkzeugbereich auf der linken Seitenleiste aus. Mit diesem Werkzeug werden Sequenzen von geringer Qualität gekürzt.
    HINWEIS: Diese Datei kann nun für das Mapping verwendet werden.
  6. Klicken Sie auf die Werkzeugschaltfläche auf der linken Seitenleiste und suchen Sie nach dem RNA-Stern-Werkzeug. Geben Sie die Details wie folgt ein: Verwenden Sie die Ausgabedatei von cutadapt, wählen Sie das Referenzgenom als humanes Referenzgenom (hg38) aus und ändern Sie die Länge der genomischen Sequenz um annotierte Verbindungen auf 36. Wählen Sie die Ausgabe als Genzahl aus und klicken Sie auf die Option Run Tool in der oberen rechten Ecke.
    HINWEIS: Dieses Tool generiert eine BAM-Datei.
  7. Wählen Sie in den Werkzeugoptionen das Werkzeug featurecounts aus, und laden Sie die BAM-Dateien hoch, die nach der RNA-Sternanalyse erhalten wurden. Legen Sie die Option für die minimale Zuordnungsqualität pro Lesevorgang in den Lesefilteroptionen auf 10 fest, und klicken Sie auf die Option Ausführen in der oberen rechten Ecke.
  8. Öffnen Sie die featurecount-Ausgabedatei im rechten Bereich und kopieren Sie die Daten in eine Tabelle. Berechnen Sie die Faltungsänderung relativ zum Steuerelement, indem Sie die Anzahl der im Test erhaltenen Lesezahlen durch die Anzahl der im Steuerelement mit dem Befehl =log (Faltenänderung, 2) erhaltenen Lesezahlen dividieren.
    HINWEIS: Eine Fold-Änderung <-2.0 gilt als Hinweis auf eine Herunterregulierung und eine Fold-Änderung > 2.0 als Hochregulierung.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Morphologische Veränderungen
Die Inkubation von humanen Pankreas-Gangzellen in einem sauren Medium veränderte die Morphologie der Zellen. Ein konfluentes und dicht gepacktes Zellmuster führte unter sauren Bedingungen zu dispergierten Zellen, und der Zelltod wird mit der Zeit prominent. Im Vergleich zu normalen mediumhaltigen Zellen schrumpften und verkleinerten sich duktale Zellen. Eine drastische Veränderung der Sterberate wurde nach 6 Stunden Inkubation beobachtet. Nach 24 Stunden nahm die Zellzahl ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Methode wurde entwickelt, um die Auswirkungen saurer Bedingungen auf nicht-krebsartige duktale Epithelzellen des menschlichen Pankreas in biologischen Wiederholungen zu bestimmen. Eine Veränderung des pH-Wertes des Mediums führte dazu, dass sich die Zellen in einem gestressten Zustand befanden, und es wurde eine Veränderung der Morphologie beobachtet. Die Zellen wurden bei einem pH-Wert von 6,0, 6,5 oder 7,0 für 24 Stunden kultiviert und stündlich überwacht, um die Inkubationszeit ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Renuka Goudshelwar ist DBT dankbar für die Bereitstellung des Stipendiums. Renuka Goudshelwar dankt der Abteilung für Biochemie der Osmania University (Hyderabad) und Dr. V. V. Ravikanth für seine Unterstützung bei der Analyse der NGS-Daten. Dr. M. Sasikala dankt für die finanzielle Unterstützung, die er vom ICMR, dem Gesundheitsministerium der indischen Regierung (Zuschuss Nr. 94/2020/5582/Proteomics-Adhoc/BMS) erhalten hat.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 mL graduierte Zentrifugenröhrchen (Falcon)  Tarsons 500031für die Probenvorbereitung verwendet 
50 mL Messzentrifugenröhrchen (Falcon)Tarsons 500041für die Probenvorbereitung verwendet 
Agilent 2100 BioanalysegerätAgilentAgilent G2938AInstrument zur Bewertung der RNA-Qualität 
Antibiotische Antimykotische Lösung 100x flüssigHimediaA002-100 mLZur Vermeidung von Kontaminationen 
Zellschaber mit drehbarer KlingeHimedia TCP223Schaben und Sammeln der Zellen
CO2 Inkubator New BrunswickGalaxy 170 SWird für die Inkubation der Kultur verwendet 
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), hoher Glukose-  HimediaAL007S-500 mLMedium für die Kultivierung der
Zellen Dulbecco's Phosphat gepufferte Kochsalzlösung 1xHimediaTL1006-500mLZellwäsche
Galaxy (https://usegalaxy.org)Online-Tool zur Verarbeitung von NSG-Daten 
HI FBS (Herkunft: Australien)Gibco10100-147Wird für das Wachstum von Zellen verwendet 
Humane duktale Epithelzelllinie der Bauchspeicheldrüse (HPDEC/ H6C7)Addex BioT0018001duktale Pankreaszelllinie
Ion Total RNA-Seq Kit v2Thermo Fisher Scientific4475936RNA Probenvorbereitungskit
Laminar Air Flow
Na2HPO4 DiabasicSigma AldrichS3264-250GNatriumphosphat Vorbereitung des Puffers 
NaH2PO4 MonobasicSigma AldrichS3139-250GNatriumphosphat-Puffer Vorbereitung 
NovaSeq 6000Illumina3376672Sequenzer 
Nunclon Delta Surface (6-Well-Platte)Thermo Scientific140675Kultivierung der Zellen 
Gekühlte TischzentrifugeThermo ScientificSorvall ST 8RWird für die Zentrifugation
verwendet RiboMinus Eukaryote System v2Thermo Fisher ScientificA15026rRNA Depletion Kit 
Rneasy Mini Bausatz Qiagen74104Kit zur Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellen
ThermocyclerEppendorfE950040025 PCR-Reaktion 
Wasserbad Equitron#8406MAuftauen der Probe

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Franck, C., et al. Advanced pancreatic ductal adenocarcinoma: Moving forward. Cancers (Basel). 12 (7), 1955(2020).
  2. Kong, X., Sun, T., Kong, F., Du, Y., Li, Z. Chronic pancreatitis and pancreatic cancer. Gastrointest Tumors. 1 (3), 123-134 (2014).
  3. Jura, N., Archer, H., Bar-Sagi, D. Chronic pancreatitis, pancreatic adenocarcinoma and the black box in-between. Cell Res. 15 (1), 72-77 (2005).
  4. Kloppel, G. Chronic pancreatitis, pseudotumors and other tumor-like lesions. Mod Pathol. 20 (Suppl 1), S113-S131 (2007).
  5. Schneider, A., Whitcomb, D. C. Hereditary pancreatitis: a model for inflammatory diseases of the pancreas. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 16 (3), 347-363 (2002).
  6. Boedtkjer, E., Pedersen, S. F. The acidic tumor microenvironment as a driver of cancer. Annu Rev Physiol. 82, 103-126 (2020).
  7. Coussens, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420 (6917), 860-867 (2002).
  8. Balkwill, F., Mantovani, A. Inflammation and cancer: back to Virchow. Lancet. 357 (9255), 539-345 (2001).
  9. Clevers, H. At the crossroads of inflammation and cancer. Cell. 118 (6), 671-674 (2004).
  10. Kato,, et al. Acidic extracellular microenvironment and cancer. Cancer Cell Int. 13 (1), 89(2013).
  11. Hegyi, P., Maléth, J., Venglovecz, V., Rakonczay, Z. Jr Pancreatic ductal bicarbonate secretion: challenge of the acinar acid load. Front Physiol. 2, 36(2011).
  12. Ibrahim-Hashim, A., Estrella, V. Acidosis and cancer: from mechanism to neutralization. Cancer Metastasis Rev. 38 (1-2), 149-155 (2019).
  13. Vakkila, J., Lotze, M. T. Inflammation and necrosis promote tumour growth. Nat Rev Immunol. 4 (8), 641-648 (2004).
  14. Zepecki, J. P., et al. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38 (10), 1734-1750 (2019).
  15. Kim, R. K., et al. Role of lymphocyte-specific protein tyrosine kinase (LCK) in the expansion of glioma-initiating cells by fractionated radiation. Biochem Biophys Res Commun. 402 (4), 631-636 (2010).
  16. Hu, Y., et al. Requirement of Src kinases Lyn, Hck and Fgr for BCR-ABL1-induced B-lymphoblastic leukemia but not chronic myeloid leukemia. Nat Genet. 36 (5), 453-461 (2004).
  17. Sharp, N. A., Luscombe, M. J., Clemens, M. J. Regulation of c-fgr proto-oncogene expression in Burkitt's lymphoma cells: effect of interferon treatment and relationship to EBV status and c-myc mRNA levels. Oncogene. 4 (8), 1043-1046 (1989).
  18. Hui, A. B., Lo, K. W., Yin, X. L., Poon, W. S., Ng, H. K. Detection of multiple gene amplifications in glioblastoma multiforme using array-based comparative genomic hybridization. Lab Invest. 81 (5), 717-723 (2001).
  19. Fang, Z. Y., et al. Proteomic identification and functional characterization of a novel ARF6 GTPase-activating protein, ACAP4. Mol Cell Proteomics. 5 (8), 1437-1449 (2006).
  20. Okabe, H., et al. Isolation of development and differentiation enhancing factor-like 1 (DDEFL1) as a drug target for hepatocellular carcinomas. Int J Oncol. 24 (1), 43-48 (2004).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Pankreasgangzellensaures MikromilieupH Wert nderungchronische PankreatitisRNA SequenzierungGenexpressionsanalyseZellproliferationdifferenzielle GenexpressionZellkultur

Verwandte Artikel