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Isolierung und Kultivierung von primären murinen Adipozyten aus mageren und adipösen Mäusen

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DOI:

10.3791/67846

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24. Januar 2025

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Größe und Zerbrechlichkeit reifer Adipozyten haben die Techniken und Werkzeuge, die für ihre Untersuchung und Isolierung zur Verfügung stehen, eingeschränkt. Hier wird ein Protokoll für die Isolierung reifer muriner Adipozyten beschrieben, das leicht an verschiedene Fettdepots und Mausdiäten angepasst werden kann.

Zusammenfassung

Fettgewebe besteht hauptsächlich aus reifen, lipidbeladenen Adipozyten nach Volumen. Diese postmitotischen Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Energiespeicherung und -mobilisierung, der Thermoregulation und der Sekretion endokriner Faktoren. Die Ausdehnung des weißen Fettgewebes aufgrund eines kalorischen Ungleichgewichts führt sowohl zur Vergrößerung der vorhandenen Adipozyten als auch zur Bildung zusätzlicher Adipozyten aus Adipozyten-Vorläuferzellen. Durch Fettleibigkeit verursachte Veränderungen des weißen Fettgewebes, einschließlich solcher, die Adipozyten betreffen, sind mit zahlreichen Komorbiditäten wie Typ-2-Diabetes und 13 Krebsarten verbunden. Ein wesentliches Hindernis für die Untersuchung, wie Adipozyten zur Krankheit beitragen, ist die Unfähigkeit, reife Adipozyten ohne weiteres zu isolieren und zu kultivieren. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von mageren und adipösen Adipozyten von Mäusen aus den subkutanen und viszeralen Fettdepots von männlichen und weiblichen C57BL/6-Mäusen. Das Protokoll beschreibt, wie isolierte primäre Adipozyten bis zu 2 Wochen lang in einem Membran-Adipozyten-Aggregatsystem kultiviert werden können, was ihre funktionelle Analyse in Co-Kulturexperimenten, Lipolyse-Assays oder durch die Entnahme von konditionierten Medien, die Adipozyten-sezernierte Faktoren enthalten, erleichtert. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll Methoden zur Kultivierung von Fettgewebexplantaten in Basalmembran-Matrixkuppeln und zur Bildgebung primär isolierter Adipozyten. Wichtig ist, dass dieser Ansatz in bestehende Protokolle für die Isolierung von im Fettgewebe residenten Adipozyten-Vorläuferzellen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) integriert werden kann. Zusammen bieten diese Protokolle den Forschern Werkzeuge zur funktionellen Untersuchung von Adipozyten, Adipozyten-Vorläuferzellen und ganzem Fettgewebe von mageren und fettleibigen, männlichen und weiblichen Mäusen.

Einleitung

Es wird erwartet, dass die Prävalenz von Fettleibigkeit bei Erwachsenen in den Vereinigten Staaten bis 2030 50 % erreichen wird1, was es unerlässlich macht, die zellulären und physiologischen Auswirkungen von Fettleibigkeit besser zu verstehen. Fettleibigkeit ist durch ein kalorienreiches Ungleichgewicht gekennzeichnet, das aufgrund einer erhöhten Speicherung von Energie als Fett zu einer Ausdehnung des weißen Fettgewebes führt. Die Expansion des Fettgewebes kann sowohl durch die Bildung neuer Adipozyten (Hyperplasie) als auch durch eine Vergrößerung bestehender Adipozyten (Hypertrophie) erfolgen. Obwohl beide Prozesse zu einer Ausdehnung des Fettgewebes führen, geht die hypertrophe Expansion mit einer verminderten Stoffwechselgesundheit und einer höheren Inzidenz von Stoffwechselstörungen einher 2,3. Ein besseres Verständnis der Komplexität des Fettgewebes wird Einblicke in die molekularen Mechanismen geben, die Stoffwechselstörungen und andere mit Fettleibigkeit verbundene Komorbiditäten, einschließlich Typ-2-Diabetes und Krebs, regulieren.

Fettgewebe wird seit langem für seine Rolle bei der Energiespeicherung und Thermoregulation geschätzt. In jüngerer Zeit hat sich das Fettgewebe jedoch zu einem wichtigen metabolischen Signalgewebe entwickelt, das für die Sekretion von Metaboliten, Lipiden und Peptiden verantwortlich ist 4,5. Diese aus Fettgewebe gewonnenen Moleküle, die als Adipokine bezeichnet werden, signalisieren lokal und systemisch und können die Energiehomöostase, die Immunfunktion, die Gefäßdynamik und vieles mehr regulieren 5,6,7. Reife Adipozyten machen etwa 50 % der Zellen im Fettgewebe aus und stellen die große Mehrheit des Fettgewebevolumensdar 8. Wichtig ist, dass Studien gezeigt haben, dass Adipozyten aus vielen Subpopulationen bestehen 9,10. Als solche erzeugen Adipozyten-Vorläuferzellen unterschiedliche Populationen reifer Adipozyten, die auf Faktoren wie Geschlecht und Fettgewebedepot basieren. Diese reifen Adipozyten können durch Ernährungsumstellungen und Fettleibigkeit weiter moduliert werden, wodurch Subpopulationen von Adipozyten entstehen, die transkriptionell unterschiedlich sind und unterschiedliche parakrine Signaturen exprimieren 9,11,12,13,14,15,16 . Trotz ihrer Komplexität und physiologischen Bedeutung bleibt die Fähigkeit, reife Adipozyten zu isolieren und zu kultivieren, ein deutliches Hindernis für die Untersuchung dieser Zellen.

Die derzeit verfügbaren Methoden zur Isolierung reifer Adipozyten verwenden die Differenzierung von Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs), fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und zentrifugationsbasierte Techniken, obwohl alle ihre eigenen Nachteile haben. Die in vitro oder ex vivo Differenzierung von APCs in reife Adipozyten wird häufig verwendet, um reife Adipozyten zu entwickeln. Diese künstlich differenzierten Zellen sind jedoch multilokulär und enthalten viele kleine Lipidtröpfchen und nicht der unilokuläre Phänotyp reifer Adipozyten in vivo, die ein großes Lipidtröpfchen enthalten17. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass sich in vitro differenzierte Zellen transkriptionell von isolierten reifen Adipozyten unterscheiden, die in vivo gefunden wurden 17. Wichtig ist, dass die In-vitro-Differenzierung nicht in der Lage ist, den Unterschied zwischen mageren und adipösen Adipozyten zu erfassen. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) wird häufig verwendet, um bestimmte Zellpopulationen aus Gewebe zu isolieren. Reife Adipozyten können jedoch aufgrund ihrer Größe und zerbrechlichen Membranen unter FACS-Bedingungen leicht platzen, was dies zu einer ineffizienten Methode zur Isolierung reifer Adipozyten macht. Andere bestehende Protokolle führen zur Akkumulation großer Mengen freier Lipide, die für reife Adipozyten in Kultur im Laufe der Zeit toxisch sein können.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung von murinen reifen Adipozyten aus weißem Fettgewebe. Dieses Protokoll wurde von dem Protokoll für reife Adipozyten-Aggregatkulturen angepasst, das ursprünglich von Harms et al. erstellt wurde.17; Der hier beschriebene zentrifugationsbasierte Ansatz verwendet jedoch gängige Laborgeräte und ist in der Lage, Adipozyten effizient aus kleinen Mengen (~0,5 g) Fettgewebe zu isolieren. Dies ist ein leicht anpassbares System, und Modifikationen zur Isolierung reifer muriner Adipozyten von männlichen und weiblichen Mäusen, viszeralen und subkutanen Fettdepots und verschiedenen Ernährungsbedingungen sind enthalten.

Protokoll

Alle beschriebenen Tierversuche wurden vom Committee on the Use and Care of Animals der University of Utah genehmigt. Dieses Protokoll wurde für die Isolierung reifer Adipozyten von männlichen und weiblichen C57BL/6-Mäusen im Alter von 8 bis 16 Wochen mit einem Körpergewicht von 20 bis 45 g optimiert. Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle enthalten.

1. Vorbereitung der Lösung

  1. Bereiten Sie Kollagenasepuffer vor. Fügen Sie 100 mg Kollagenasepulver, 1 ml 1 M HEPES-Puffer, 500 μl 100x P188, 50 μl 1 M CaCl2, 0,05 g BSA und 48,45 ml Medium 199 hinzu. Die Lösung steril filtrieren, aliquotieren und bei -20 °C lagern.
  2. Stellen Sie Zellkulturmedien her. Kombinieren Sie 500 ml DMEM, 50 ml FBS, 5 ml Penicillin-Streptomycin und 5 ml L-Glutamin-Ergänzung.

2. Entnahme von weißen Fettgewebsdepots von Mäusen

  1. Bereiten Sie für jedes Depot eine 1 x 10 cm große Platte mit 200 μl HBSS vor und legen Sie sie auf Eis.
  2. Holen Sie die Tiere aus dem Tierstall und euthanasieren Sie die Mäuse gemäß den Richtlinien des Ausschusses für Tierpflege und -verwendung der Einrichtung. Hier wurden die Tiere durch Zervixluxation unter tiefer Narkose eingeschläfert.
  3. Wiegen und notieren Sie gegebenenfalls das Gewicht jeder Maus.
  4. Sterilisieren Sie die Maus, indem Sie 70% Ethanol sprühen, um das Äußere zu beschichten.
  5. Entnehmen Sie die entsprechenden Fettpolster aus der Maus 18,19.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die Lymphknoten aus dem subkutanen Depot zu entfernen, bevor Sie das Gewebe in die Schale legen.
  6. Wiegen Sie jedes Fett und notieren Sie das Gewicht.
  7. Lege das Fettpad in die vorbereitete 10 cm Platte auf Eis.

3. Vorbereitung von Explantaten aus weißem Fettgewebe

HINWEIS: Dieser Schritt ist optional.

  1. Mindestens 12 h vor Beginn der Dissektion die Basalmembranmatrix (Matrigel) bei 4 °C auf Eis auftauen und eine Schachtel mit sterilen 200 μL-Pipettenspitzen bei 4 °C kalt stellen.
  2. Pipettieren Sie mit gekühlten Pipettenspitzen 80 μl Basalmembranmatrix in die Mitte jeder Vertiefung einer 24-Well-Kulturplatte, um eine Kuppel zu erzeugen (Abbildung 1A). Legen Sie die Platte für 30 min in den Inkubator (37 °C, 5 % CO2), um die Matrix teilweise zu verfestigen.
  3. Gewebe vorbereiten: Wiegen Sie mit einer sterilen Präparierschere 0,1 g Gewebe von jeder Probe und legen Sie es in PBS auf Eis.
  4. Mit einer sterilen Pinzette das vorgewogene Gewebe in die teilverfestigte Matrixkuppel einbetten. Geben Sie 30 μl Basalmembranmatrix auf das eingebettete Gewebe. Stellen Sie die Platte für 30 Minuten wieder in den Inkubator, um das Gewebe in der Basalmembranmatrix zu fixieren.
    HINWEIS: Die Einbettung von Gewebe in die Basalmembranmatrix ist entscheidend, um sicherzustellen, dass das Gewebe in Kultur bleibt und nicht schwimmt. Dadurch bleiben die Gesundheit und Qualität des Gewebes erhalten (Abbildung 1B).
  5. Geben Sie 1 ml Wachstumsmedium (DMEM mit 10 % FBS) in jede Vertiefung und kehren Sie in den Inkubator zurück.

4. Kollagenase-Behandlung

  1. Berechnen Sie die benötigte Menge an Kollagenaselösung. Siehe Tabelle 1.
  2. Bereiten Sie die Kollagenaselösung mit DNase vor. Fügen Sie 0,00017 g DNase pro 1 ml Kollagenaselösung hinzu. Vortex zum Mischen.
  3. Mit einer Rasierklinge das isolierte Fettgewebe so lange zerkleinern, bis das Gewebe homogen erscheint (Abbildung 2A). Übertragen Sie das gehackte Gewebe in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen.
    HINWEIS: Nicht zu viel zerkleinern. Das Zerkleinern ist abgeschlossen, wenn das Gewebe homogen und pastös erscheint. Unterhacktes Gewebe erscheint klobig und heterogen, und übermäßig zerkleinertes Gewebe führt zur Freisetzung von freien Lipiden (Abbildung 2B).
  4. Geben Sie vorbereitete Kollagenase und DNase-Lösung in das zerkleinerte Fettgewebe unter Verwendung der in Schritt 4.1 berechneten Volumina. Vortex bei maximaler Geschwindigkeit für 7-10 s, um sich gründlich zu kombinieren. Legen Sie die konischen 50-ml-Röhrchen horizontal in einen Schüttler, der auf 220 U/min und 37 °C eingestellt ist.
  5. Inkubieren Sie das Schütteln für 10 Minuten, dann 5 s lang vortexen und überprüfen Sie die Proben. Vollständig aufgeschlossene Proben erscheinen homogen ohne sichtbare Klumpen oder Gewebestücke. Wenn die Proben nicht vollständig aufgeschlossen sind, setzen Sie den Aufschluss im Schüttler fort und überprüfen Sie ihn alle 2 Minuten (Abbildung 2C).
    HINWEIS: Nicht zu viel verdauen. Übermäßige Zeit in der Kollagenaselösung kann zum Abbau von Adipozyten und zur Freisetzung von Lipiden führen.
  6. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um das verdaute Gewebe durch ein Sieb in ein neues konisches 50-ml-Gewebe zu leiten. Geben Sie ein Volumen FBS, das dem Volumen von Gewebe + Kollagenaselösung entspricht, durch das Sieb in ein konisches, um die Kollagenase zu neutralisieren.
    HINWEIS: Nach dem Filtern verbleibt eine kleine Menge Gewebe im Sieb.

5. Waschen des Taschentuchs

HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Schritte in einer sterilen Gewebekulturhaube aus.

  1. Bereiten Sie 1 x 15 ml-Röhrchen mit 10 ml warmem Nährmedium für jede Bedingung vor.
  2. Die Röhrchen aus Schritt 4.6 bei 300 x g 3 min bei der in Tabelle 1 angegebenen Temperatur schleudern.
    HINWEIS: Die Temperatur für die Zentrifugation muss je nach Geschlecht der Mäuse, von denen das Fettgewebe isoliert wurde, geändert werden. diese Temperaturen sind in Tabelle 1 angegeben.
  3. Stellen Sie sicher, dass sich das Gewebe nach dem Schleudern in vier Schichten trennt (Abbildung 3A).
    HINWEIS: Die oberste Schicht sind die freien Lipide, die zweite Schicht ist die reife Adipozytenschicht, die dritte Schicht ist die Kollagenase und FBS und die vierte Schicht ist die stromale Gefäßfraktion (SVF), die zu den unteren20,21 pelletiert.
  4. Entsorgen Sie die oberste Schicht der freien Lipide vorsichtig mit einer 200-μl-Pipette.
  5. Nachdem Sie die oberste Schicht entfernt haben, verwenden Sie eine p1000-Pipette mit abgeschnittener unterer Pipette, um die reifen Adipozyten in das vorbereitete 15-ml-Röhrchen mit 10 ml Wachstumsmedium zu übertragen (Abbildung 3B).
    1. Optional: Um die primären Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs) zu isolieren, drehen Sie die Röhrchen erneut bei 300 x g für 10 min. Fahren Sie dann mit der Isolierung der Adipozyten-Vorläuferzellen durch Liu et al.22, Cho et al.23 oder ähnliches fort.
  6. Drehen Sie die 15-ml-Röhrchen mit den reifen Adipozyten vorsichtig 3-5 Mal um, bis sich die weiße Schicht im Medium verteilt hat.
  7. Lassen Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei der in Tabelle 1 angegebenen Temperatur stehen, um eine Trennung der Adipozyten- und Medienschichten zu ermöglichen.
  8. Nach der 10-minütigen Pause die Röhrchen 1 Minute lang bei Raumtemperatur bei 100 x g drehen, um die Trennung der Schichten weiter zu fördern. Nach dem Spin werden die Proben wieder in vier Schichten aufgeteilt, wie in Abbildung 3A zu sehen ist.
  9. Entfernen und entsorgen Sie die oberste Schicht der freien Lipide mit einer Pipette.
  10. Schieben Sie die Nadel mit einer 21-G-Nadel, die an einer 5-ml-Spritze befestigt ist, am Rand des Röhrchens entlang, bis die Unterseite der Nadel frei von der reifen Adipozytenschicht ist (Abbildung 3C). Stellen Sie sicher, dass die Oberseite der Nadel und die Unterseite der Spritze die reife Adipozytenschicht nicht stören.
  11. Ziehen Sie die Spritze langsam nach oben, um das Nährmedium und alle Zelltrümmer zu entfernen.
    HINWEIS: Stellen Sie beim Entfernen des Mediums sicher, dass die Nadelspitze frei von der reifen Adipozytenschicht ist.
  12. Geben Sie vorsichtig 10 ml Nährmedium in jedes Röhrchen.
  13. Wiederholen Sie die Schritte 5.6-5.11. Fügen Sie keine weiteren Nährmedien hinzu.
  14. Schieben Sie die Pipettenspitze mit Gellade-Pipettenspitzen am Rand des Röhrchens nach unten, um das restliche Medium unter der reifen Adipozytenschicht zu entfernen.

6. Verpackung

  1. Die Zellen werden bei 100 x g für 1 min bei der in Tabelle 1 angegebenen Temperatur zentrifugiert. Entfernen Sie freie Lipide (klare Ölschicht auf den Zellen) mit einer Pipette. Entfernen Sie das Nährmedium unter den Adipozyten mit einer Gelladespitze. Achten Sie darauf, die Störung der Adipozytenschicht zu minimieren (Abbildung 4).
  2. Wiederholen Sie Schritt 6.1, bis alle Nährmedien und freien Lipide entfernt wurden (in der Regel 3-5 Mal). Das Zellpaket sollte eine weiße Farbe haben, ohne sichtbare freie Lipide über den Zellen oder Medien unter den Zellen (Abbildung 4).

7. Beschichtung und funktionelle Assays

  1. Plattierung der reifen Adipozyten für die Zellkultur
    1. Entnehmen Sie die Zellkultureinsätze von einer mit Gewebekulturen behandelten 24-Well-Platte und legen Sie sie mit der Membranseite nach oben auf die Oberfläche der Haube.
    2. Füllen Sie die abwechselnden Vertiefungen der Platte mit 1 mL warmem Nährmedium.
    3. Geben Sie mit einer abgeschnittenen p200-Pipettenspitze 30 μl gepackte reife Adipozyten aus Schritt 6.2 auf die Oberseite eines Transwell-Einsatzes (Abbildung 5A,B).
    4. Nehmen Sie den Transwell-Einsatz vorsichtig auf, drehen Sie ihn um und legen Sie ihn in eine vorgefüllte Vertiefung in der 24-Well-Platte (Abbildung 5A). Legen Sie die Platte vorsichtig in den auf 37 °C eingestellten Inkubator mit 5 % CO2.
      HINWEIS: Ordnungsgemäß verpackte Adipozyten sollten bei Betrachtung von oben eine undurchsichtige Schicht ohne sichtbare klare freie Lipidtröpfchen bilden (Abbildung 5C).
    5. Wechseln Sie das Medium an den reifen Adipozyten alle 2-7 Tage für bis zu 14 Tage.
      1. Um das Medium aus den Vertiefungen zu entfernen, halten Sie das Transwell an Ort und Stelle und verwenden Sie eine p200-Pipette, um das Medium vorsichtig durch die kleinen Öffnungen an der Seite des Transwell-Einsatzes zu entfernen (Abbildung 5D).
      2. Nachdem das Medium entfernt wurde, während der Transwell noch an Ort und Stelle bleibt, geben Sie sehr langsam 1 ml Medium an die Seitenwand des Wells.
        HINWEIS: Achten Sie darauf, Medien sehr langsam hinzuzufügen und zu entfernen. Adipozyten können sich leicht von der Membran lösen, wenn das Medium schnell gewechselt wird.
  2. Lipolyse-Assay
    1. Explantate aus Plattenfettgewebe, wie in Schritt 3.4 beschrieben, oder reife Adipozyten, wie in Schritt 7.1 beschrieben.
      HINWEIS: Zellen oder Gewebe müssen vor der Durchführung des Lipolyse-Assays mindestens 24 Stunden lang in phenolrotfreien Medien kultiviert werden.
    2. Lösungsvorbereitung: Bereiten Sie eine Lösung von 5 % BSA in DMEM (kein Phenolrot) vor, indem Sie 5 g BSA in 100 mL DMEM auflösen. Vorsichtig umdrehen, um sich zu verbinden, bis BSA vollständig aufgelöst ist.
      1. Bereiten Sie funktionierende Lösungen für Kontroll- und Stimulationsmedien vor. Kombinieren Sie als Steuermedien 5 % BSA DMEM-Medien mit dem Fahrzeug. Kombinieren Sie als Stimulationsmedium 5 % BSA-DMEM-Medium mit 5 μM CL-316,243. Erwärmen Sie das Steuer- und Stimulationsmedium vor der Anwendung auf 37 °C.
    3. Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen und waschen Sie es mit 1 mL warmem DPBS. Füllen Sie die Vertiefungen mit 500 μl Kontroll- oder Stimulationsmedium pro Vertiefung. Inkubieren bei 37 °C, 5 % CO2.
    4. Nach 1 h, 2 h, 4 h und 24 h nach Beginn des Lipolyse-Assays sammeln Sie 100 μl Medium aus jeder Vertiefung in ein Mikrozentrifugenröhrchen und ersetzen Sie es durch 100 μl des entsprechenden Kontroll- oder Stimulationsmediums.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Proben bei -20 °C gelagert werden.
    5. Führen Sie den kolorimetrischen Glycerin-Assay mit einem im Handel erhältlichen kostenlosen Glycerin-Kit (siehe Materialtabelle) oder ähnlichem durch.
      1. Bereiten Sie die Reagenzien wie im Kit angegeben vor.
      2. Tauen Sie die Proben auf und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren.
      3. Bereiten Sie eine Standardkurve mit einer siebenstufigen, 2-fachen seriellen Verdünnung unter Verwendung der Glycerin-Standardlösung vor.
      4. Übertragen Sie 25 μl Probe oder Standard in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit klarem Boden.
      5. Geben Sie 100 μl Reagenz für den freien Glycerin-Assay in jede Vertiefung, die die Probe oder Standardlösung enthält.
      6. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dann die Extinktion bei 540 nm ablesen (Abbildung 6A-D).
  3. Bildgebung
    1. Bereiten Sie die Objektträger vor. Um Dias vorzubereiten, entfernen Sie die Trägerpapierschicht von jedem Abstandshalter und legen Sie sie auf den Dia. Zwei Abstandshalter können nebeneinander auf jedem Objektträger platziert werden.
    2. Mit einer abgeschnittenen 200-μl-Pipettenspitze werden 30 μl gepackte Adipozyten aus Schritt 6.2 in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
    3. Bereiten Sie die Färbemischung vor. Bereiten Sie 200 μl Plasmamembran-Färbelösung mit 5 μg/ml und Hoechst mit 4,5 μg/ml in PBS vor. Fügen Sie den Proben eine Fleckenmischung hinzu und schütteln Sie sie vorsichtig.
    4. Färbeproben 30 min bei Raumtemperatur einfärben. Schützen Sie die Proben vor Licht.
    5. Nachdem die Färbung abgeschlossen ist, waschen Sie die Proben. Geben Sie 500 μl PBS zu jeder Probe und schütteln Sie sie vorsichtig, um sie zu kombinieren. 5 Min. ziehen lassen. 1 Minute lang bei 100 x g schleudern, dann das Medium mit einer Pipettenspitze mit Gelladefunktion unter den Zellen entfernen.
    6. Bereiten Sie die Folien vor. Entfernen Sie die durchsichtige Kunststofffolie von der Oberseite der Abstandshalter, um die klebrige Schicht freizulegen.
    7. 500 μl PBS in das Röhrchen mit den gefärbten Adipozyten geben und vorsichtig mischen.
    8. Um den reifen Adipozyten keine Zeit zu lassen, an die Oberfläche zu steigen, verwenden Sie eine abgeschnittene p200-Pipettenspitze, um 35 μl der Adipozyten in den Spacer auf dem Objektträger zu platzieren.
    9. Legen Sie einen Decklaschen auf den Abstandshalter.
    10. Fahren Sie sofort mit der Bildgebung fort (Abbildung 6C). Eine Verzögerung der Bildgebung kann zu einem Ausbluten des Membranmarkers führen.

Ergebnisse

Wie in Abbildung 2 gezeigt, sind das richtige Zerkleinern (Abbildung 2B) und der richtige Verdau (Abbildung 2C) wichtig für die Isolierung intakter reifer Adipozyten. Unterminierung und Unterverdauung können aufgrund einer unzureichenden Trennung vom Bindegewebe zu einer geringen Ausbeute an reifen Adipozyten führen. Visuell kann dies an fadenziehendem Gewebe beobachtet werden, das nach dem Zerkleinern übrig bleibt, und sichtbaren Klumpen in der Kollagenaselösung. Darüber hinaus führen übermäßiges Zerkleinern und Überverdauen aufgrund des Platzens der reifen Adipozyten zu einem geringen Ertrag. Visuell führt dies zum Verlust der weißen opaken Schicht und zu einer Ansammlung einer großen, klaren, freien Lipidschicht. Ein unangemessenes Maß an Zerkleinerung oder Verdauung führt zu einer schlechten Isolierung der Adipozyten.

Die richtige Vorbereitung und Verdauung des Fettgewebes führt zur Trennung des Gewebes in vier verschiedene Schichten, wie in Abbildung 3 zu sehen ist. Ein gewisses Platzen der Adipozyten, das zur Freisetzung von freien Lipiden führt, ist unvermeidlich; Das richtige Zerkleinern und Verdauen sorgt jedoch für einen minimalen Adipozytenruptur. Die verbleibende freie Lipidschicht und das Medium werden während der Packung der Adipozyten entfernt (Abbildung 4). Die richtige Packung der Adipozyten ist essentiell für die effiziente Isolierung reifer Adipozyten. Verbleibende freie Lipide oder Medien führen zu einer schlechten Isolierung und wirken sich negativ auf nachgelagerte funktionelle Assays wie Plating, Lipolyse und Zellbildgebung aus.

Dieses Protokoll erzeugt eine saubere Aufbereitung reifer Adipozyten. Zellbildgebung und Lipolyse-Assays können durchgeführt werden, um die zelluläre Funktion zu beurteilen und zu zeigen, dass die reifen Adipozyten nach der Isolierung und nach der Kultivierung bis zu zwei Wochen lang funktionieren. Der Lipolyse-Assay zeigt, dass die reifen Adipozyten die Fähigkeit behalten, auf zelluläre Signale durch die Freisetzung von freiem Glycerin nach Stimulation des β-3-adrenergen Rezeptors zu reagieren (Abbildung 6A,B). Diese Fähigkeit bleibt auch nach 2 Wochen in Kultur erhalten und ist sehr vergleichbar mit der Lipolyseaktivität von Fettgewebeexplantaten, die 24 h lang kultiviert wurden (Abbildung 6C,D). Adipozyten von schlechter Qualität zeigen eine abgeschwächte Lipolyse. Die Zellbildgebung von isolierten Adipozyten zeigt runde und intakte unilokuläre reife Adipozyten, die ein einzelnes großes Lipidtröpfchen enthalten. Adipozytenisolierungen von schlechter Qualität zeigen hauptsächlich große, extrazelluläre Öltröpfchen, die auf geplatzte Adipozyten hinweisen.

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Abbildung 1: Einbettung von Explantaten aus Fettgewebe. (A) Bild einer teilverfestigten Basalmembran-Matrixkuppel vor der Einbettung des Gewebes. (B) Repräsentative Bilder von unsachgemäßer und ordnungsgemäßer Gewebeeinbettung. Eine unsachgemäße Einbettung ist sichtbar, da das Gewebe teilweise oder vollständig über der Kuppel zu schweben scheint. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Schema der richtigen Zerkleinerung und Verdauung von Fettgewebe. (A) Schematische Darstellung der Gewebezerkleinerung und der Verdauungsschritte 4.2-4.6. (B) Repräsentative Bilder von unter-, optimalem und überminziertem Gewebe. Unterhacktes Gewebe hat große Stücke, die ihre ursprüngliche Form behalten. Übermäßig zerkleinertes Gewebe führt zu einer sichtbaren Zunahme der freien Lipide, die das Gewebe umgeben, die klar und ölig erscheinen. (C) Repräsentative Bilder von unter-, optimalem und überverdautem Gewebe. Unterverdautes Gewebe enthält Stücke des gesamten Gewebes, die in der Lösung verbleiben. Überverdautes Gewebe weist eine große freie Lipidschicht auf, die sich schnell von der Lösung trennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Trennung der Schichten des verdauten Fettgewebes. (A) Schematische und repräsentative Darstellung der Schichten, die nach Schritt 5.3 vorhanden sind. (B) Verwendung einer abgeschnittenen Pipettenspitze, um die reife Adipozytenschicht aus dem konischen 50-ml-Röhrchen zu entfernen. (C) Richtige Technik und Platzierung der Nadel und der Spritze, um das Nährmedium unterhalb der reifen Adipozytenschicht zu entfernen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Sequentielle Packung reifer Adipozyten. Sequenzielle Bilder von der Verpackung der reifen Adipozyten. Schichten aus freien Lipiden, Adipozyten und Medien werden markiert. Nach jedem Spin werden freie Lipide und Medien entfernt. Dies wird so lange wiederholt, bis sich nach einer Drehung kein Medium oder keine freien Lipide mehr von den Adipozyten trennen. Das endgültige Bild ist repräsentativ für gut gepackte reife Adipozyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Plattierung und Kultivierung reifer Adipozyten. (A) Schema der Plattierung reifer Adipozyten. Mit einer abgeschnittenen p200-Pipettenspitze werden gepackte Adipozyten auf die Membran eines Zellkultureinsatzes aufgebracht. Der Einsatz wird dann in vorgefüllte Vertiefungen mit Nährmedien invertiert. (B) Ein repräsentatives Bild der Beschichtung reifer Adipozyten, das eine abgeschnittene Pipettenspitze darstellt, die Adipozyten auf dem Transwell-Insert ablagert. (C) Schematische und repräsentative Bilder von ordnungsgemäß und schlecht gepackten Adipozyten, die mit Transwells beschichtet sind, von oben aus gesehen. Richtig gepackte Adipozyten erscheinen weiß und undurchsichtig, während schlecht gepackte Adipozyten zur Bildung klarer Lipidtröpfchen führen. (D) Schematische Darstellung der Technik zum Wechseln von Kulturmedien. Mit einer Pipettenspitze p200 wird das Medium vorsichtig durch die Öffnungen in der Seitenwand des Transwell-Einsatzes entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Bildgebung reifer Adipozyten und Lipolyse-Assay. (A,B) Glycerinfreisetzung aus subkutanen (A) und viszeralen (B) reifen Adipozyten. Adipozyten wurden von 16 Wochen alten männlichen C57BL/6-Mäusen isoliert, die mit normaler Futternahrung gefüttert wurden. 30 μl Adipozyten wurden wie in Schritt 7.1 beschrieben plattiert und 1 oder 10 Tage lang kultiviert. Die Adipozyten wurden mit 5 μM CL-316,243 für 1 h, 2 h und 4 h behandelt, und Überstände wurden gesammelt und auf freies Glycerin analysiert. (C,D) Glycerinfreisetzung aus subkutanen (C) und viszeralen (D) Fettgewebexplantaten. Fettgewebe wurde von 18 Wochen alten weiblichen Mäusen mit C57BL/6 isoliert, die mit normalem Futter gefüttert wurden. 0,1 g Fettgewebeexplantate wurden wie in den Schritten 3.1-3.4 beschrieben plattiert und 24 h lang kultiviert. Die Adipozyten wurden mit 5 μM CL-316,243 für 1 h, 2 h und 4 h behandelt, und Überstände wurden gesammelt und auf freies Glycerin analysiert. N = 3 technische Repliken für A-D. Alle Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung. (E) Repräsentative Bilder von isolierten subkutanen und viszeralen reifen Adipozyten. Adipozyten wurden von 16 Wochen alten männlichen C57BL/6J-Mäusen isoliert, die mit normaler Futternahrung gefüttert wurden. Die Adipozyten wurden mit der Plasmamembranfärbung (rot) und der Hoechst-Zellkernfärbung (blau) gefärbt. Maßstabsleisten: 50 μm; Vergrößerung: 60x. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

SexDiätDepotSchwierigkeit beim HackenKollagenase: Verhältnis von GewebeEmpfohlene Aufschlusszeit (min)Schleudertemp.Waschtemperatur.
WeiblichNormales ChowSubkutanHart2:112RT37 °C
ViszeralMittel1:18RT37 °C
Fettreiche ErnährungSubkutanLeicht1:18RT37 °C
ViszeralLeicht1:18RT37 °C
MännlichNormales ChowSubkutanHart2:1144 °CRT
ViszeralMittel1:1104 °CRT
Fettreiche ErnährungSubkutanLeicht1:1104 °CRT
ViszeralLeicht1:1104 °CRT

Tabelle 1: Geschlechts-, Depot- und ernährungsspezifische Modifikationen. Die Zerkleinerungsschwierigkeit jedes Gewebes, die im Verhältnis zu anderen Depots als "leicht", "mittel" oder "hart" beschrieben wird. Beachten Sie, dass die tatsächliche Zerkleinerungszeit je nach Forscher und Gewebe variieren kann. Kollagenase: Gewebeverhältnis angegeben als Volumen (ml) der in Schritt 4.1 hergestellten Kollagenase + DNase-Lösung zum Gewicht des Gewebes (g). Die Verdauungszeit ist eine ungefähre Schätzung, aber die tatsächliche Verdauungszeit variiert je nach Zerkleinerung und Gewebe. Die Forscher sollten die Verdauung wie im Protokoll beschrieben beurteilen. Die Schleudertemperatur und die Waschtemperatur unterscheiden sich zwischen männlichen und weiblichen Mäusen. RT bezeichnet die Raumtemperatur.

Diskussion

Primäre Adipozyten sind bekanntermaßen schwer zu isolieren und zu kultivieren, da sie leicht aufbrechen, und ihre Größe schließt die Verwendung gängiger Instrumente zur Isolierung primärer Zellen wie der Durchflusszytometrie aus. Das hier beschriebene Protokoll liefert saubere und funktionsfähige reife Adipozyten, die für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen verwendet werden können. Wichtig ist, dass dieses Protokoll die Trennung der reifen Adipozyten von anderen Zelltrümmern und der freien Lipidschicht ermöglicht, was eine effektive Bildgebung, Kultivierung und Lipolyse-Assays ermöglicht. Das Protokoll kann ohne weiteres mit veröffentlichten Protokollen22, 23 für die Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion und der APCs kombiniert werden. Dieses Protokoll beschreibt auch ein Verfahren zur Präparation und Kultivierung von Ganzgewebe-Explantaten aus Fettgewebe, das für nachgelagerte Anwendungen wie Lipolyse-Assays und die Sammlung von sezernierten Faktoren aus ganzem Fettgewebe verwendet werden kann.

Zu den kritischen Aspekten gehören das richtige Zerkleinern, der Aufschluss und die Entfernung der freien Lipidschicht. Um ein ordnungsgemäßes Zerkleinern zu gewährleisten, ist es wichtig, das Erscheinungsbild des Gewebes während des gesamten Prozesses genau zu überwachen. Der Zeit- und Arbeitsaufwand, der erforderlich ist, um eine optimale Zerkleinerung des Gewebes zu erreichen, hängt vom Fettgewebedepot, diätetischen Interventionen (z. B. einer fettreichen Ernährung) und dem Forscher ab. Andere Werkzeuge zum Zerkleinern, wie z.B. eine Schere, können bei Bedarf eingebaut werden, was hier jedoch nicht untersucht wurde. Zu beachten ist, dass ein übermäßiges Zerkleinern vermieden werden sollte, da es die Adipozyten aufreißt, was nicht nur die unmittelbare Ausbeute verringert, sondern auch die Gesamtausbeute und die Adipozytenqualität aufgrund der schädlichen Wirkung der freien Lipidschicht auf die verbleibenden Adipozyten verringert. Die richtige Verdauung, ähnlich wie ein richtiges Hackfleisch, hängt vom Fettgewebedepot, den diätetischen Interventionen, dem Alter der Mäuse usw. ab. Die Zugabe von DNase zur Kollagenase hilft, die Aggregation der Adipozyten während der Verdauung zu verhindern, die durch Zelltrümmer entstehen kann. Die Verdauungszeit für Gewebe ist daher sehr variabel. Als Anhaltspunkt dienen die angegebenen Schätzungen für die Aufschlusszeiten, die in Tabelle 1 zu finden sind.Der beste Weg, um sicherzustellen, dass das Gewebe richtig verdaut wird, besteht jedoch darin, das Gewebe während des gesamten Prozesses und wie im Protokoll beschrieben visuell zu inspizieren. Die in Tabelle 1 aufgeführten unterschiedlichen Zentrifugations- und Waschtemperaturen, die auf der Grundlage des Geschlechts vorgeschlagen werden, sind wesentlich für die ordnungsgemäße Trennung der reifen Adipozyten sowohl von der freien Lipidschicht als auch von den anderen Zelltrümmern und SVF; Die Verwendung alternativer Temperaturen kann zum Verlust der reifen Adipozyten aufgrund von Aggregation und Adipozytenplatzen führen.

Die Entfernung der freien Lipidschicht bei jedem Schritt ist von entscheidender Bedeutung, und wenn dies nicht der Fall ist, führt dies zu nachgelagerten Komplikationen bei der Beschichtung, der Bildgebung und dem Lipolyse-Assay. Darüber hinaus führt das anhaltende Vorhandensein der freien Lipidschicht während des gesamten Verfahrens zu einem zusätzlichen Absterben der Adipozyten aufgrund von Lipotoxizität, was sich dramatisch auf die Gesamtausbeute und -qualität auswirkt. Während die Maximierung der Effizienz der Isolierung reifer Adipozyten im Allgemeinen erwünscht ist, führt das Entfernen der freien Lipidschicht, selbst auf Kosten einiger reifer Adipozyten, zu einer Gesamtsteigerung der Ausbeute an reifen Adipozyten am Ende des Protokolls.

Zu den Einschränkungen des Verfahrens gehört die Anzahl der Proben. Aufgrund der Strenge und des Zeitaufwands für die Entfernung des Mediums und der freien Lipidschicht ist das Verfahren in der Regel auf sechs Proben gleichzeitig beschränkt. Die Verarbeitung von deutlich mehr Proben führt dazu, dass primäre Adipozyten zu lange freien Lipiden ausgesetzt sind und die Gesamtausbeute verringert wird. Zusätzliches Personal kann jedoch eine Erhöhung der Anzahl der Proben ermöglichen. Die Zeit vom Zerkleinern bis zum funktionellen Assay ist kritisch, da übermäßige Verzögerungen bei der Entfernung des Mediums und der freien Lipidschicht zu einem zusätzlichen Platzen der reifen Adipozyten führen. Das Protokoll ist weiter in der Fähigkeit eingeschränkt, Subpopulationen reifer Adipozyten zu trennen.

Derzeitige Methoden zur Untersuchung reifer Adipozyten beruhen in erster Linie auf der Isolierung von APCs und der anschließenden ex vivo-Differenzierung dieser Zellen. Zusätzliche Methoden, einschließlich Organ-on-a-Chip-Modell und Trans-Well-Co-Kulturen, wurden entwickelt18,24. Es wurde jedoch gezeigt, dass sich diese ex vivo differenzierten Adipozyten transkriptionell und morphologisch von den reifen Adipozyten im Fettgewebe unterscheiden17. Morphologisch sind ex vivo differenzierte Adipozyten multilokulär, während in vivo isolierte Adipozyten unilokulär sind. Dieses Protokoll wurde gegenüber früheren Berichten modifiziert und optimiert17,25 um reife Adipozyten aus nur 0,5 g Fettgewebe erfolgreich zu isolieren und zu kultivieren, verglichen mit anderen Protokollen, die mindestens 5 g Fettgewebe erfordern25 . Schließlich zielte diese Studie darauf ab, den erfolgreichen Abschluss der wichtigsten Schritte im Protokoll anstelle von konkreten Zeiten, Zentrifugationstemperaturen und Kollagenasemengen visuell zu veranschaulichen, obwohl Richtlinien in Tabelle 1 enthalten sind. Diese Parameter müssen entsprechend Faktoren wie dem Fettgewebedepot, dem Geschlecht und der Adipositas des Tieres angepasst werden, die sich alle auf die Effizienz der Verdauung und die saubere Trennung der reifen Adipozyten in diesem Protokoll auswirken können.

Insgesamt dauert der Eingriff 3-4 Stunden, abhängig von der Anzahl der gepoolten Mäuse und der Anzahl der einzelnen Fettgewebsproben. Es wird erwartet, dass die Fähigkeit, die funktionelle Rolle reifer Adipozyten zu kultivieren und zu bewerten, viele nachgelagerte Anwendungen für die Untersuchung der Adipozytenbiologie selbst (z. B. Metabolismus, Nährstoffverwertung und Rückverfolgung) und die Interaktion von Adipozyten mit anderen Zelltypen, wie APCs, Krebszellen und Zellen des Immunsystems, ermöglichen wird.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken den Zuschüssen von 5 For The Fight und Huntsman Cancer Institute (KIH), der V Foundation for Cancer Research (KIH) und DK133455 (KIH). Schematische Darstellung des mit Biorender erstellten Protokolls. Darüber hinaus danken die Autoren Stephanie Giagnocavo und dem Cell Imaging Core an der University of Utah für die Hilfe bei der Bildgebung sowie Mark Lee für das Feedback zum Manuskript.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100x Poloxamer 188 LösungSigmaP5556-100mL
15 mL konisch Cellstar188261
21 G NadelBD305165
5 mL SpritzeBD309646
50 mL konischCellstar227261
6,5 mm Transwell mit 0,4 & Mikro; m Poren-Polycarbonat-MembraneinsatzCorning3413
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
CaCl2SigmaC1016-500gm
CellMask Plasmamembran-FärbungenThermo Fisher ScientificC10045
CL 316243 DinatriumsalzTocris1499
Kollagenase PulverSigmaC6885
DMEMGibco11995-040
DMEM ohne Pheonol RotGibcoA14430-01
DNase ISigma-Aldrich10104159001
Fötales Rinderserum (FBS)GibcoA56708-01
Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus Gold ObjektträgerFisher scientific
Gel Loading PipettenspitzeFisher scientific02-707-181
GlutaMAX SupplementGibco35050061
Glycerol Assay KitAbcamAB133130
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14025-092
HEPES BufferSigma83264-100ml-F
Heraeus Megafuge 16R ZentrifugeThermo Scientific
Hoechst 33342 SolutionThermo Fisher Scientific62249
Inkubierender Mini-SchüttlerVWR12620-942
Medium 199Sigma-AldrichM4530
Mikroskop-DeckgläserVWR16004-302
PBSGibco10010023
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
SecureSeal Imaging SpacerGrace Biolabs654006
Seive (SteeL Feinmaschiges Cocktailsier)OXO3112000https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html
151884875004271

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