Charakterisierung der pH-abhängigen reversiblen Selbstorganisation von Amyloid-beta-1-40-beschichteten Goldkolloiden

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir eine systematische Methode vor, die die quasi-reversible Selbstorganisation der Amyloid beta 1-40 (Aβ _1-40)-beschichteten 20 nm Goldaggregate beschreibt. Die nanogrößenabhängige, quasi-reversible Vernetzung zwischen Peptiden wurde mit spezifischen Aminosäuren oder Abschnitten des Aβ _{1-40-Monomers} korreliert.

Zusammenfassung

Die Charakterisierung von Aβ _1-40, das über die kolloidalen Nano-Gold-Partikeloberflächen beschichtet ist, wurde mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) durchgeführt. Die beobachtete pH-abhängige Verschiebung der SPR-Bande von Aβ _{1-40-beschichteten} 20-nm-Goldpartikeln korrelierte mit dem in den TEM-Bildern beobachteten Wechsel von Aggregation und Disaggregation. Ein pH-Wert von ~4 induzierte eine ungefaltete Konformation, und ein pH-Wert von ~10 induzierte eine gefaltete Konformation von Aβ _1-40 auf der Goldoberfläche. Dieser reversible Aggregationsprozess wurde durch Raman-Bildgebung beobachtet, indem der pH-Wert allmählich von pH 4 auf pH 10 geändert wurde. Wir beobachteten eine pH-abhängige Morphologieänderung von Aβ _1-40 auf der Goldoberfläche, wobei bei pH 4 klare Aggregate beobachtet wurden. Wir beobachteten jedoch sehr subtile Unterschiede im Spektrum der oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie (SERS) zwischen pH-4- und pH-10-Bedingungen, wobei der auffälligste Unterschied die spektrale Dichte im Bereich von 250 ^cm-1 und 1750 ^cm-1 ist. Insbesondere zeigte die Modenanalyse der reversiblen Aggregation, dass die Aggregate durch die ungefaltete Konformation von Aβ _1-40 gebildet wurden, die den Benzolringabschnitt von Tyrosin und Phenylalanin umfasste. Umgekehrt war der Abbau der Aggregate mit Konformationsänderungen in der Proteinfaltung von Aβ _1-40 verbunden, an denen Histidin, Glutamin, Methionin und Asparaginsäure beteiligt waren.

Einleitung

Die Fibrillogenese von Amyloid-beta-1-40 (Aβ _1-40) oder 1-42 (Aβ _1-42) Peptiden wurde als kritische Komponente bei der Bildung von Amyloid-Plaques, die eine Ursache der Alzheimer-Krankheit^sind, ausführlich untersucht 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ^,11. Der Schlüsselmechanismus bei der Fibrillogenese ist eine Oligomerisierung von Aβ _1-40 oder Aβ _1-42 Peptiden zur Bildung eines neurotoxischen Proteinaggregats, und es wurden umfangreiche Untersuchungen durchgeführt, um die Mechanismen zu verstehen, wie Monomere die Oligomere 12,13,14 bilden. Wir haben einen Ansatz verfolgt, bei dem amyloidogene Peptide, die Aggregate auf einer Nano-Gold-Oberfläche bilden, untersucht und Faktoren identifiziert werden, die für die Vernetzung zwischen Peptiden verantwortlich sind, die von der Goldoberfläche entfernt sind 15,16,17,18,19,20,21,22.

Aβ _1-40 nehmen unter sauren Bedingungen (pH ~4) eine ungefaltete Konformation (A) und unter basischen Bedingungen (pH ~10) eine gefaltete Konformation (B) an. Wir beobachteten dispergierte Aβ _{1-40-beschichtete} Goldkolloidpartikel bei pH ~10 und große Aβ _{1-40-beschichtete} Goldkolloidaggregate bei pH~4 (Abbildung 1)^23,24. Die entfaltete Konformation von Aβ _1-40 unter sauren Bedingungen begünstigt die Peptidvernetzung zwischen den Aβ _{1-40-Monomeren} über der Gold-Nanopartikel-Oberfläche, was zur Bildung von Goldkolloidaggregaten führt (siehe A in Abbildung 1). Wenn das Aβ _1-40-Monomer die gefaltete Konformation bei einem basischen oder neutralen pH-Wert (Aβ _1-40) hält, vernetzen sich die Monomere nicht zu Aggregaten, und die beschichteten Goldnanopartikel verbleiben als einzelne dispergierte Partikel (siehe B in Abbildung 1). Wir können daher den Prozess untersuchen, wie Aβ _1-40-Peptide Konformationsänderungen des Netzwerks durchlaufen und Aggregate bilden, indem wir die SPR-Bandenverschiebung über einen Bereich von pH-Bedingungen 25,26,27,28,29,30,31 messen.

Wir haben verschiedene Größen von Goldnanopartikeln getestet und festgestellt, dass das 20-nm-Goldkolloid den prominentesten reversiblen Selbstorganisationsprozess von Aβ _{1-40-Monomeren} als Reaktion auf eine externe Änderung des pH-Werts aufweist (Abbildung 2). Dies ist ein klarer Hinweis auf eine reversible Veränderung der Peptidkonformation, bei der saure Bedingungen (A) eine entfaltete Konformation induzieren, die die Vernetzung verstärkt und zur Aggregation von Goldkolloiden führt. Es wurde festgestellt, dass die Grundbedingung (B) eine gefaltete Konformation der Monomere 26,27,28,29,30,31 induziert.

Protokoll

1. Herstellung von Aβ _1-40 beschichteten Goldnanopartikeln

1. Mit einer Spritzennadel wird ein Volumen von 1 ml destilliertem deionisiertem Wasser zu 1 mg lyophilisiertem Aβ _1-40 (MW: 4,2 kDa, 98 % HPLC-Reinheit) hinzugefügt. Mischen Sie die Lösung mit einem Wirbelmischer für ca. 30 s und stellen Sie sicher, dass bei Raumtemperatur (RT; ~20 °C) keine festen Partikel in der Lösung beobachtet werden.
   1. Bereiten Sie alle Stammlösungen mit deionisiertem und destilliertem Wasser (~18 MΩ·cm) vor.
   2. Spektroskopische Bestimmung der Konzentration unter Verwendung der Tyrosinabsorption bei 275 nm³², die einen molekularen Extinktionskoeffizienten ε₂₇₅ von 1390 ^cm-1· ^M-1.
   3. Lagerlösungen von Aβ _1-40 bei -80 °C. (Siehe Materialtabelle für die Handelsprodukte von Aβ _1-40.)
2. Tauen Sie die Peptid-Stammlösung etwa 5 Minuten vor der Datenerfassung auf. Mischen Sie ein Volumen von 8 μl der Peptidlösung mit 800 μl kolloidalen Goldpartikeln in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie ein Volumen von 4,2 mL deionisiertem destilliertem Wasser hinzu und wirbeln Sie die Probe dann 10 s^lang 30,31,33,34 ein.
3. Legen Sie die Konzentration von Aβ _1-40 Peptiden auf 1,8 nmol fest und stellen Sie das Verhältnis von Aβ _1-40 Peptiden ein. Die Anzahl der Goldkolloide lag zwischen ~500:1 und ~2000:1²⁵.

2. Iterative pH-Änderung und Überwachung der entsprechenden SPR-Bandenverschiebung

1. Stellen Sie die Lösungstemperatur mit dem Temperiergerät des Spektralphotometers Ultraviolett-sichtbar-Nahinfrarot (UV-Vis-NIR) auf einen bestimmten Wert (z. B. 25 °C) ein.
2. Überwachen Sie den anfänglichen pH-Wert der Probenlösung mit einem pH-Messgerät und stellen Sie ihn auf leicht unter pH 7 ein. Erfassen Sie das Absorptionsspektrum im Bereich zwischen 400 nm und 1000 nm.
3. Ändern Sie den pH-Wert der Probe auf ~pH 4 (d. h. pH 4,0 ± 0,3), indem Sie 10 μL-Volumina von 0,1 M HCl hinzufügen und das Absorptionsspektrum zwischen 400 nm und 1000 nm sammeln.
4. Ändern Sie den pH-Wert der Probe auf ~pH 10 (d. h. pH 10 ± 0,3), indem Sie 10 μl Volumen mit 0,1 M NaOH hinzufügen und das Absorptionsspektrum zwischen 400 nm und 1000 nm sammeln.
5. Ändern Sie den pH-Wert zwischen pH 4 und pH 10 mit HCl und NaOH 10-mal und erfassen Sie das Absorptionsspektrum kontinuierlich bei 25 ± 0,2 °C^29,30.
   HINWEIS: Bei allen Probenlösungen wurde die optische Dichte des Peaks des SPR-Bandes bei etwa 0,2 gehalten. Es wird eine Pufferwirkung durch die restliche Pufferlösung in einer Lösung erwartet. So wurde nach Bestätigung des Gleichgewichts der endgültige pH-Wert bestimmt. Der pH-Wert wurde direkt in einer Probenküvettenzelle mit einer Mikro-pH-Elektrode gemessen, die eine Genauigkeit von ±0,005 pH hat.
6. Ermitteln Sie den ASCII-Datensatz (American Standard Code for Information Interchange) von Wellenlängen als Funktion der Absorption. Extrahieren Sie die durchschnittliche Position der Bandpeaks mit dem Programm "Peak Fit ".
   1. Plotten Sie den Datensatz, um die optische Dichte als Funktion der Wellenlänge (nm) mit der Funktion Plotten anzuzeigen.
   2. Markieren Sie die anfänglichen Spitzenwellenlängen λ₁, λ₂ und λ₃ , indem Sie ihre ungefähren Positionen in den gezeichneten Daten auswählen, und passen Sie die Daten mit der RUN-Funktion an.
   3. Erhalten Sie das Diagramm, das den zentralen Peak jedes (λ_i), XC_i, mit der Fläche jedes Bandes (A_i) enthält.
7. Exportieren Sie die extrahierten Peakpositionen und -bereiche in ein Tabellenkalkulationsprogramm und berechnen Sie die durchschnittliche Peakposition bei einem bestimmten pH-Wert.
   1. Bestimmen Sie den Gewichtungsfaktor a_i jedes Peakzentrums λ_i , indem Sie die Fläche des Bandes (A_i) mit der Gesamtfläche der gesamten Bänder vergleichen als: .
   2. Extrahieren Sie die durchschnittliche Peakposition (pH) mit Gl. (1).
      (1)
8. Generieren Sie ein Reversibilitätsdiagramm mit dem folgenden Prozess:
   1. Tabellarische Darstellung der durchschnittlichen Peakpositionen als Funktion jeder "Operations"-Zahl, n als vs. n. Die Operationsnummer n für die Probe vor der Zugabe von Säure bei ~pH 7 auf 1 setzen. Erhöhen Sie die Arbeitsgangsnummer jedes Mal um 1, indem Sie den pH-Wert auf ~pH4 mit HCl oder den pH-Wert auf ~pH 10 mit NaOH ändern. Machen Sie n, um bei einem sauren Zustand (d.h. ~pH 4) gerade zu sein, und ungerade, um ein basischer Zustand (d.h. pH 10) zu sein.
   2. Analysieren Sie die Peakposition an jedem n, (n) = λ(n), mit der Formel³⁰
      (2)
      HINWEIS: Stellt eine anfängliche durchschnittliche Peakposition bei n = 1 durch A dar. Drücken Sie die Parameter B und C als n-abhängige Peakpositionsverschiebung aus. Legen Sie den Parameter D als Amplitude des Dämpfungsfaktors E der Wiederholung fest. Verwenden Sie die Sinusfunktion , um die Wellenförmigkeit der Peakposition als Funktion von n anzuzeigen.
   3. Transportieren Sie den Datensatz von (x, y) zur Origin-Software und plotten Sie.
   4. Bilden Sie die benutzerdefinierte Funktion, die in Gl. (2) unter Nichtlineare Kurvenanpassungsfunktion der Analyse angegeben ist. Geben Sie die Anfangswerte A, B, C, D und E ein, und klicken Sie auf RUN , um die Anpassung abzuschließen.
9. TEM-Bildgebung
   1. Stellen Sie die TEM-Proben der Aβ _{1-40-beschichteten} 20 nm Goldkolloide mit Formvar-beschichteten Kupfergittern her. Untersuchen Sie die Proben mit einem TEM, das bei 80 kV betrieben wird.
   2. Erfassen Sie Bilder mit einer nominalen Vergrößerung von 28.000x oder 71.000x mit einer 4-Megapixel-CCD-Digitalkamera (AMT) des Modells XR-40. Erfassen Sie die _TEM-Bilder für Aβ _{1-40-beschichtetes} 20-nm-Gold bei jeder Vorgangsnummer n = 1 (~pH 7), n = 2, 4, 6, 8 und 10 (pH 4) und n = 3, 5, 7 und 9 (pH 10).

3. Raman-Bildgebung und Untersuchung der reversiblen Aggregation

1. 100 μl Lösung werden für jede Probe mit der Arbeitsgangsnummer n auf eine Glimmerscheibe (Durchmesser 1 cm) gegeben. Trocknen Sie die Proben über Nacht, bevor Sie sie messen.
2. Sammeln Sie Weißlichtbilder bei jeder Operation Nummer n. Bereiten Sie die separate Probe auf einer Glimmerscheibe vor, da der pH-Wert für jede Arbeitsgangnummer n kontinuierlich zwischen ~ pH 4 und ~ pH 10 geändert wurde (Abbildung 3).
3. Erfassen Sie das Raman-Bild bei jeder Operation Nummer n mit einem Laser mit einer Wellenlänge von λ = 633 nm bei einer Leistung von 0,5 ± 0,05 mW und einer räumlichen Auflösung von ~0,43 μm in einem Gitter bestehend aus 100 × 100 Pixeln mit einer Integrationszeit von 500 ms/Spektrum für den Bereich zwischen ~200 ^cm-1 und ~2.800 ^cm-1 (Abbildung 4).
4. Plotten Sie das repräsentative Spektrum für jedes n, ausgerichtet als Funktion von n und konstruieren Sie das dreidimensionale SERS-Spektrum als Funktion von n für Aβ_1-40 beschichtetes 20-nm-Gold (Abbildung 5A). Verwenden Sie die Draufsicht des dreidimensionalen SERS-Spektrums als Konturkarte (Abbildung 5B), um die spezifischen Moden zu extrahieren, die mit einer bestimmten pH-Bedingung verbunden sind (d. h. ~pH 4 und ~pH 10). Extrahiert alle spektralen Merkmale, die entweder nur bei n_gerade oder nur bei n_ungerade verbessert wurden.

Ergebnisse

Mit der Bindung von Aβ _1-40 an die Oberfläche der nanokolloidalen Goldpartikel verschob sich die _SPR-Bande um das Absorptionsmaximum von 530 nm signifikant auf die Peakposition von ~650 nm, wenn die Lösung saurer gemacht wurde (pH 4)³⁵. Zusammen mit TEM-Bildern haben wir festgestellt, dass spektroskopische Merkmale, die bei pH 4 beobachtet wurden, mit der Bildung der Goldkolloidaggregate mit plausibel entfalteter Konformation und Vernetzung mit den umgebenden ungefalteten Aβ _{1-40-Monomeren} übereinstimmen, die über die Goldoberfläche³⁰ adsorbiert sind. Wir beobachteten, dass die Aβ _{1-40-Monomere} unter basischen Bedingungen (pH 10) wieder in die gefaltete Konformation zurückkehrten, was zu einer quasi-reversiblen Verformung der Aggregate führte. Dieser quasi-reversible Prozess zeigte sich an der Abwechslung des durchschnittlichen Bandenpeaks ((n)), der zwischen einer kürzeren und einer längeren Wellenlänge wechselte, und der dispergierten vs. aggregierten Morphologie in TEM-Bildern zwischen basischen (pH = 10) und sauren (pH = 4) Bedingungen. Es wurde bereits beobachtet, dass ein Teil des Aβ _{1-40-Monomers} auch dann noch ungefaltet bleibt, wenn die Lösung auf die Ausgangsbedingungen³⁶ zurückgesetzt wurde. Video 1 zeigt die pH-abhängige Farbänderung von Aβ _1-40 und 20 nm blankem Goldkolloid.

Zum Vergleich wurde die pH-Hopfenuntersuchung von 20 nm blankem Goldkolloid durchgeführt (Abbildung 5C und D). Im Verlauf der pH-Änderungsoperation zeigte sich das Wachstum der Clusterisierung der Goldkolloide in SPR-Bandenshoft, TEM-Bildern sowie Weißlichtbildern. Interessanterweise gab es mehrere SERS-Spektrallinien, die entweder von n_ungerade und n_gerade abhingen. So wurde z.B. bei n_gerade (pH ~4) die Linie bei 275 ^cm-1, die als der mit Au_n assoziierte Modus (n = 5, 6, 12, 16, 20, 58)³⁷ oder der Modus des Au-Cl-Liganden³⁸ zugeordnet wurde, intensiv beobachtet. Andererseits wurde auch_{für n bei} 1008 ^cm-1 C-N str³⁹ und CH₂ wag³⁹, CH₂ Deformation⁴⁰ bei 1291 ^cm-1 extensiv beobachtet.

Im Gegensatz zu der eindeutigen pH-abhängigen und reversiblen Aggregationsmorphologie, die bei der Weißlichtbildgebung beobachtet wurde, gab es relativ subtile Unterschiede in den spektralen Merkmalen im SERS-Spektrum zwischen n_ungerade und n_gerade. In erster Näherung war die spektrale Liniendichte im Bereich zwischen 250 ^cm-1 und 1750 ^cm-1 für n_ungerade höher als für n_gerade. Die Spektrallinien im Fingerabdruckbereich, 1250 ^cm-1 und 1750 ^cm-1 (Amide I, II und III-Banden) für n_ungerade , zeigten weniger aufgelöste spektrale Merkmale, was entweder auf eine Verbreiterung oder Zunahme der spektralen Dichten hindeutet. In Abbildung 6 wurde eine Konturkarte in Abbildung 5B (Abbildung 6B) mit den SERS-Signalen bei 761 ^cm-1 (rot) und 1395 ^cm-1 (blau) organisiert, was die Betonungen bei n_ungerade bzw. n_gerade darstellt (Abbildung 6C). Als repräsentatives SERS-Spektrum für n_ungerade und n_gerade ist oben das SERS-Spektrum bei n = 7 (rot) und n = 4 (blau) dargestellt (Abbildung 6A). Um die Korrespondenz zur SPR-Bandenverschiebung für Aβ_1-40 beschichtetes 20 nm Gold zu verdeutlichen, ist das Bandverschiebungsdiagramm in Abbildung 3 auf der Seite dargestellt (Abbildung 6D).

Während wir vorläufige Daten über die vollständige Zuordnung des beobachteten SERS-Spektrums haben, stellen wir hier einige bemerkenswerte Raman-Verschiebungsmerkmale fest. Die in_{n ungeraden} Spektrallinien und (plausiblen Zuordnungen) verstärkten Spektrallinien liegen hauptsächlich im Bereich kleiner als 1000 ^cm-1: 394 ^cm-1 (Trp)^41,42,43, 761 ^cm-1 (His, Ala)39,44,45,46,47, 875 cm-1 (Indol-NH-Verschiebung, C-C-Dehnung von Met)³⁹, 974 ^cm-1 (Glu, C-COO^- Dehnung von Asp, Modus im Zusammenhang mit Citrat)39,48,49. Die Raman-Verschiebung, die bei n verstärkt wurde, zeigte_sogar signifikante spektroskopische Merkmale im Fingerabdruckbereich (Amide I, II und III): 1166 ^cm-1 (N-H⁺ Deformation von Tyr)^39,41, 1227 ^cm-1 (Ala-Pro-Gly, Amide III)39,50,51, 1395 ^cm-1 (COO^- symmetrische Dehnung oder CH₂- CH₃- Scherung von Glu)^39,48, 1585 ^{cm-1 (Ring-CC-Dehnung} von Phe, asymmetrische Dehnung von Carboxylat -Au, ^COO-Dehnung von Citrat, Verformung von Benzolring)39,41,45,46,47,49,52, 1592 ^cm-1 (Phe, Tyr, C=C Dehnung von Tyr, CC-Dehnung von Ring in Phe, Benzolringdehnung und COO^- Dehnung in Phe und Tyr und asymmetrische Dehnung von OH)39,41,48,50,51 und 1628 ^cm-1 (Amide I Subpeak, charakteristisch für intermolekulare β-Faltblattstrukturen ⁵³, C=O und die gekoppelten CN/NH-Schwingungsmoden des Proteinrückgrats, die aus parallelen β-Faltblatt-artigen Strukturen stammen, Akkumulation von aggregiertem Aβ⁵⁴, zufälligen Spulen β Windungen, β-Haarnadelkurven⁴⁸. Die Sequenzen, die für n_ungerade oder_{n gerade} erscheinen, sind in Abbildung 7 dargestellt. Insgesamt waren für n,_{die sogar} der reversiblen Aggregation bzw. der ungefalteten Konformation von Aβ _1-40, Phe/Tyr enthaltendem Benzolring, der symmetrische Dehnung des COO^-, CH₂- CH₃- Scherenmodus von Glu und -NH⁺ Deformation von Tyr signifikant an der Konformationsänderung des Peptids beteiligt. Während der Demontage der Aggregation, die beobachtet wurde, wenn die Peptide die gefaltete Konformation annahmen, die den bei n_{vorherrschenden} Modi entsprach, schienen Glu, Asp, Met, His und Ala beteiligt zu sein.

Abbildung 1: Die pH-abhängige Absorption und Morphologie. Gezeigt werden das Absorptionsspektrum bei pH 4 (A) und pH 10 (B) für Aβ _1-40 beschichtete Goldnanopartikel (20 nm) sowie die entsprechenden TEM-Bilder, Skizzen von Aggregations-/dispergierten Partikeln und Bilder von Lösungen in Fläschchen. A ist die ungefaltete Konformation von Aβ _1-40 Monomeren unter sauren Bedingungen, und B ist die gefaltete Konformation unter basischen Bedingungen. Diagramme von Aβ _1-40 Monomeren in jeder Konformation und Aggregations-/dispersen Morphologien sind neben den TEM-Bildern dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Reversibilität der von Nanogröße abhängigen Selbstorganisation. Die Verschiebung der durchschnittlichen Peakposition des SPR-Bandes in Abhängigkeit von der Operationsnummer n, für alle getesteten Größen von Goldkolloidpartikeln. Die ungefähren pH-Werte und die entsprechende Stufe der in Abbildung 1 gezeigten Zuschlagstoffe sind ebenfalls angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: und TEM/Weißlicht-Bilder bei jeder Operationsnummer. Die als Funktion der Operationsnummer n wurde für Aβ _1-40 beschichtetes 20 nm Gold (geschlossene Kreise) und 20 nm Goldkolloid (offene Kreise) zusammen aufgetragen und ist mit repräsentativen TEM (A und C)/Weißlichtbildern (B und D) bei ausgewählten Operationsnummern (n = 1, 2, 3, 7 und 8 durch dekodierte Pfeile gekennzeichnet) für Aβ _1-40 beschichtetes 20 nm Gold (A und B) und 20 nm Gold Kolloid (C und D). Die schwarze Schrift zeigt den pH-Wert 7 an, die blaue Schrift den pH-Wert 4 und die rote Schrift den pH-Wert 10. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Repräsentatives weißes Licht und Raman-Bild. Das Weißlichtbild, das Raman-Bild und das SERS-Spektrum für (A) n = 2 und (B) n = 3; i) Weißlichtbild in einem weiten Sichtfeld, ii) Weißlichtbild in dem Bereich, in dem das Raman-Bild aufgenommen wurde (gekennzeichnet durch ein rotes Quadrat in i)), iii) das Raman-Bild von zwei kombinierten Komponenten, iv) Raman-Bild von Komponente 1 und sein v) SERS-Spektrum von iv), vi) Raman-Bild von Komponente 2, und vii) SERS-Spektrum von vi). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Konturkarte des SERS-Spektrums für n_ungerade, n_gerade und_{n all}. (A) Die dreidimensionale Karte des SERS-Spektrums im Bereich von 250 ^cm-1 und 1750 ^cm-1 als Funktion von n für Aβ_1-40 beschichtetes 20-nm-Gold mit einer in (B) gezeigten Konturkarte oben. (C) Die dreidimensionale Karte des SERS-Spektrums im Bereich von 250 ^cm-1 und 1750 ^cm-1 als Funktion von n für 20 nm Gold mit einer in (D) dargestellten Konturkarte oben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Konturkarte des SERS-Spektrums. Die Konturkarte des SERS-Spektrums als Funktion von n (1-10). (A) Extinktion bei 1395 ^cm-1 (blau) und 761 ^cm-1 (rot). (B-D) Das untere Feld zeigt das SERS-Spektrum und das rechte Feld zeigt die Amplitude der Änderung der Signalintensität von SERS-Signalen bei jedem n. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Bemerkenswerte Sequenzen von Aβ_1-40. Die Sequenzen, denen eine signifikante Beteiligung bei n_ungerade (entsprechend der Bildung der gefalteten Konformation) zugewiesen wurde, sind durch rote Pfeile nach unten gekennzeichnet, und diejenigen, denen eine signifikante Beteiligung bei n_gerade (entsprechend der Bildung der ungefalteten Konformation) zugewiesen wurde, sind durch blaue Pfeile gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: pH-abhängige Farbänderung von Aβ_1-40 und 20 nm Kolloid aus blankem Gold. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Diskussion

Ein kritischer Aspekt bei Studien zur Peptidkonformation ist die Wartung der Proben, da sich die Proben bei unsachgemäßer Lagerung verschlechtern. Die Peptidproben wurden in lyophilisierter Form erhalten und begannen zu denaturieren, sobald sie mit destilliertem deionisiertem Wasser rehydriert wurden, selbst wenn sie bei -80 °C gelagert wurden. Die Reinheit der Goldkolloide wurde durch Qualitätskontrollanalysen verifiziert. Um die Stabilität der Kolloide zu erhalten, wurden sie bei 4 °C gelagert und nicht eingefroren. Die Goldkolloidlösungen wurden für jedes Experiment frisch aufbereitet, da die Salzpufferlösung das Goldkolloid destabilisieren würde. HCl- und NaOH-Lösungen wurden für jedes Experiment frisch hergestellt.

Die technischen Herausforderungen des manuellen Ablesens und Aufzeichnens des pH-Werts der Lösung mit empfindlichen Instrumenten bei gleichzeitiger Änderung des pH-Werts zwischen 4 und 10 schränken die Genauigkeit unserer berichteten Ergebnisse ein. Daher konnten wir keine konsistenten Ergebnisse in der Intensität der SERS-Signale beobachten. Dies führte wahrscheinlich zu einem Fehler in der Amplitude, die für das Konturdiagramm verwendet wurde. Zukünftige Arbeiten zur Überprüfung der mit n_geraden oder_{n ungeraden} Moden assoziierten Moden könnten Mutationen einführen, um die Aminosäuren in der Aβ _1-40-Sequenz zu ersetzen, von denen wir berichten, dass sie an der Konformationsänderung des Proteins beteiligt sind, wie z.B. die einzelnen Tyrosin- oder Asparaginreste.

"Die Wechselwirkung zwischen dem Aβ_1-40-Monomer und der Goldoberfläche wird als Dipolwechselwirkung angesehen, und das Ausmaß der Wasserstoffbrückenbindung wurde in der Arbeit von H. Schmidbauer et ^al.55 hypothetisiert. In einer separaten Arbeit haben wir die SERS-Spektroskopie in Abhängigkeit von der Menge an Aβ_1-40 unter sauren Bedingungen untersucht, sie extrahierte die nanogrößenabhängige Adsorptionsbildung⁵⁶. Für 20 nm Gold wurde spekuliert, dass die C=C- oder -C-N-Bindung von Histidin (His) die Adsorption einleitet; Bei 80 nm Gold gelangte jedoch ein Benzolring-Atmungsmodus von Phenylalanin (Phe) oder Tyrosin (Tyr) an die Goldoberfläche, um die Adsorption einzuleiten. Der Adsorptionsprozess von Aβ_1-40 über die Goldoberfläche bei neutralen oder basischen Bedingungen (pH ~10) wurde so angesehen, dass das mit Aβ_1-40 beschichtete Goldkolloid hydrophil bleibt, da im wässrigen Zustand keine Ausfällungen gebildet wurden. Die Ausfällungen wurden jedoch bei pH 4 beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Zuschlagstoffe hydrophob waren.

Die TEM-Bilder und Weißlichtbilder zeigen nur indirekt Hinweise auf die Aggregation. Wir haben versucht, Zirkulardichroismus (CD)-Spektroskopie durchzuführen, um die in der reversiblen Aggregation beobachtete Morphologie mit den Sekundärstrukturen zu korrelieren. Die streuenden Basislinien verhinderten jedoch, dass wir reproduzierbare CD-Signale erhalten konnten. Stattdessen verwendeten wir daher die Raman-Spektroskopie und konzentrierten uns mehr auf die Moden, die entweder bei der Aggregation (entfaltete Konformation von Aβ_1-40) unter pH ~4 oder bei der Disaggregation (entfaltete Konformation von Aβ_1-40) unter pH ~10 verstärkt wurden. Daher beschränkte sich die beste Spekulation zur Identifizierung der Sekundärstruktur in dieser Arbeit auf die Überwachung der Knoten, die mit den Sekundärstrukturen verbunden sind. Dies wurde bei der Beobachtung des β-Faltblatts bei 1628 ^cm-1 gezeigt, insbesondere unter pH-4-Bedingungen.

In dieser Studie wurde nur die Veränderung der Peptidkonformation für die Goldkolloide mit einem Durchmesser von 20 nm beobachtet und nur n bis 10 untersucht. Die Konformations- und Aggregationseigenschaften des Aβ _1-40-Peptids könnten durch die Größe des Partikels verändert werden, das sie an⁵⁶ adsorbieren. Daher sind weitere Arbeiten erforderlich, um die Eigenschaften der Peptide zu verstehen, die auf der Vernetzung zwischen Monomeren beruhen, und solchen, die von den physikalischen Eigenschaften der Adsorptionsoberfläche beeinflusst werden. Unter den von uns getesteten Bedingungen zeigten nur die Goldkolloide mit einem Durchmesser von 20 nm eine Reversibilität der Aggregationsmorphologie, und die Mechanismen, wie der Kolloiddurchmesser die Reversibilität dieser Eigenschaft beeinflusst, sind nicht bekannt. Eine Erhöhung von n auf 20 könnte mehr Einblicke in den modenabhängigen Grad der Reversibilität der Aggregationsmorphologie liefern. Diese Untersuchungen, wie sich die Größe des Goldkolloids auf die Amyloid-Beta-Peptid-Aggregation auswirkt, werden wichtige Einblicke in die molekularen Mechanismen der Alzheimer-Pathologie liefern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Amyloid-Beta-Peptid 1-40 (Aβ 1– 40 Peptid)	r-Peptid (Bogart, GA, USA)	A-1156-2
CCD-Digitalkamera	AMT	XR-40 4-Megapixel CCD
Destilliertes deionisiertes Wasser aus dem Milli-Q- Wassersystem	Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)	Milli-Q IQ 7000
Gefrierschrank -86 oC	Thermo Scientific	Revco Chilly Willy  RLE-Serie Geräte-ID 187004 Build-Nummer 40.04
Goldkolloid (10 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornien, USA)	15703-20
Goldkolloid (100 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornien, USA)	15711-22
Goldkolloid (15 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornien, USA)	15704-20
Goldkolloid (20 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornien, USA)	15705-20
Goldkolloid (30 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornien, USA)	15706-21
Goldkolloid (40 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornien, USA)	15707-21
Goldkolloid (50 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornien, USA)	15708-21
Goldkolloid (60 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornien, USA)	15709-22
Gold Kolloid (80 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornien, USA)	15710-22
Hochwertigste V1AFM Glimmerscheiben 10 mm	Ted Pella Inc.	#50
Salzsäure-Standardlösung, 1,0 N	Fluka	Charge# SHBB4705V        318949-2L
Makroquarz Quvette Light Path 10 mm	Fire Fly Science	Typ1-MC-Path10mm
Mikro-pH-Elektrode	HORIBA	Modell 9618S (MFG Nr. 9Y8E0050)
Peak Fit Program	Origin (Northampton, MA, USA)	OriginPro2018b (64-bit) b9.5.5.409 (Akademisch)
pH 4.00 Pufferlösung	VWR	Kat.-Nr. 34170-127
pH 7,00 Pufferlösung	Fisher Chemical	SB107-4 Los 191041 pH-Messgerät
	HORIBA	Modell F-72G (MFG Nr. B27M0017)
Pipettenspitzen   Maxi-Tipps 1– 5 mL	Fisher	02-707-467
Pipettenspitzen 10 mL	Fisher	02-717-135
Pipettenspitzen 1000 mL	Fisher	02-717-156
Pipettenspitzen 1– 200 mL	Fisher	02-717-143
Pipettierer Fisher Brand Elite 0.5– 5 mL	Fisher	QU05317
Pipettierer Fisher Brand Elite 100 1000 mL	Fisher	QU01672
Pipettierer Fisher Brand Elite 10 100 mL	Fisher	MU10985
Pipette Fisher Brand Elite 1– 10 mL	Fisher	MU08178
Natriumhydroxidlösung 1,0 m	Fluka	Los#05096BPV    319511-2L
TEM	FEI Co	Morgagni Modell 268
TempAssure PCR-Röhrchen, flache Kappen, natur	USA Scientific		Polypropylen. 0,2 mL einzelne dünnwandige Röhrchen mit aufgesetzten mattierten Schieberkappen
UV-Vis-NIR Spektralphotometer	Varian	CARY 5000 UV1106M074
WI Tec alpha300R Konfokales Raman-Mikroskop	WITec-Oxford Instrument	XMB3000-3001