Methodenartikel

Isolierung und Identifizierung von Bakterienstämmen aus der Haut von terrestrischen Amphibien

DOI:

10.3791/67862

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17. Juni 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life, Health, and Environmental Sciences (MeSVA), University of L'Aquila

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dabei handelt es sich um eine Methode zur Probenahme und Isolierung kultivierbarer Bakterien aus der kutanen Mikrobiota des Europäischen Plethodontidensalamanders (Gattung Speleomantes). Hier stellen wir ein Protokoll vor, nach dem Salamanderhaut mit Tupfern entnommen und mit kultivierbaren Ansätzen verarbeitet werden kann. Wir beschreiben die Probenahme, Isolierung und Etablierung axenischer Kulturen mit bakterieller Stammcharakterisierung.

Zusammenfassung

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Die Mikrobiota ist ein lebenswichtiges Element höherer Organismen, wobei die Hautmikrobiota wesentlich zur Abwehr des Organismus gegen äußere Einflüsse beiträgt. Es gibt keine Standardmethode zur Beprobung von Speleomantes (Amphibia: Plethodontidae) hautmikrobiellen Gemeinschaften für den mikrobiellen Kultivierungsansatz. Um dies zu beheben, haben wir ein praktisches Protokoll für die Isolierung von Bakterien aus der Haut von Personen und eine Best Practice für den Umgang und die Lagerung von Proben entwickelt. Die Schritte sind einfach: Die Tupfer werden nach der Probenahme in einer physiologischen Kochsalzlösung aufbewahrt, die mit Glycerin versetzt wird. Nach dem Transfer im Labor können die Tupfer maximal 10 Tage lang bei +4 °C gelagert werden, um die Integrität der mikrobiellen Gemeinschaft zu gewährleisten. Diese Studie bietet interessante Einblicke in die Untersuchung der kutanen Mikrobiota von terrestrischen Amphibienarten, wie z.B. solchen, die zur Gattung Speleomantes gehören. Dieser Ansatz trägt zur Durchführung, Überwachung und Erhaltung von Maßnahmen für gefährdete Arten bei und könnte das Wissen über die Funktion der Mikrobiota für die Gesundheit und Ökologie von Amphibien verbessern. Dieses Protokoll könnte auch eine breitere Bedeutung für die Mikrobiomforschung in vielen Szenarien des Artenschutzes haben.

Einleitung

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Alle Organismen beherbergen eine Vielzahl von mikrobiellen Symbionten auf ihren Epitheloberflächen, Geweben und Organen1. Die Haut ist die primäre Schnittstelle zwischen dem Wirt und seiner Umwelt und bietet Lebensraum für verschiedene Mikroorganismen2. Die Haut ist das größte Organ der Wirbeltiere und fungiert als Barriere gegen mechanische, chemische und mikrobielle Angriffe3. Diese breite Exposition der Haut gegenüber Umweltbedingungen macht sie jedoch wahrscheinlich zur kritischsten ökologischen Grenze, die die Interaktion des Organismus mit externen biotischen und abiotischen Faktoren vermittelt4.

Die Hautmikrobiota von Amphibien wurde in den letzten zehn Jahren intensiv untersucht, und die Beziehung zwischen dieser mikrobiellen Gemeinschaft und ihrem Wirt wurde eingehend erforscht 5,6,7,8,9,10. Die Artenvielfalt der Hautmikrobiota wird maßgeblich durch die Art des Wirts (d.h. artspezifische Gemeinschaft) bestimmt, aber weitere Umweltfaktoren können eine höhere interspezifische Diversität fördern11. Die Hautmikrobiota von Amphibien hat eine andere Zusammensetzung als bei anderen Tieren. Es ist bekannt, dass Amphibien nachweislich eine wechselseitige Beziehung zu ihren Hautmikroben haben, da sie in der Lage sind, antimikrobielle Verbindungen zu biosynthetisieren oder ihren Wirt vor neu auftretenden Infektionskrankheiten zu schützen12.

Die Isolierung von Bakterien aus der Haut ist in der Regel nach verschiedenen Schritten erreicht. Der erste Schritt besteht darin, eine repräsentative Probenentnahme durch Abstrich zu erhalten und eine externe Kontamination zu vermeiden. Die mikrobiellen Proben werden in steriler Kochsalzlösung oder Puffer suspendiert. Die Ergänzung von Suspensionsflüssigkeiten mit Schutzmitteln (z. B. Glycerin) könnte die Integrität der Bakteriengemeinschaft während des Labortransfers verbessern13,14. Nach der Übergabe an das Labor können die Proben sofort oder nach kurzer Zeit verarbeitet werden, um die Integrität der mikrobiellen Gemeinschaft zu erhalten. Der klassische mikrobielle Ansatz beinhaltet die Probenverarbeitung durch serielle Verdünnung, um die mikrobielle Dichte zu reduzieren und eine bessere Kolonietrennung auf den Petriplatten zu gewährleisten. Proben- und Serienverdünnungen werden dann auf unspezifische, nicht-selektive Medien wie Agar Luria-Bertani (LBA)15, Tryptisches Soja (TSA)16, Trypton-Hefeextrakt-Agar (TYEA)17,18,19 oder Nährstoff (NA)20 gestreift, die das Wachstum einer Vielzahl von Bakterien unterstützen. Es werden nicht-selektive Anreicherungen während der Probenahme und Verarbeitung verwendet, da es notwendig ist, ein breites Spektrum von Mikroben zu kultivieren. Das Streifen- oder Spreizplattenverfahren verteilt die mikrobielle Suspension gleichmäßig auf der Agaroberfläche21. Die gleichmäßige Verteilung ermöglicht es den verschiedenen in der Probe vorhandenen mikrobiellen Spezies, unterschiedliche Kolonien zu bilden. Nach einer Inkubation bei 20-37 °C für 2-7 Tage werden die mikrobiellen Kolonien gezählt und morphologisch unterschieden. Die morphologische Charakterisierung der Bakterienkolonie erfolgte auf der Grundlage von Pigmentierung, Form, Erhebung, Rand, Opazität und Oberfläche. Gut isolierte Kolonien mit den höchsten Verdünnungen werden auf frische Agarplatten subkultiviert, um mikrobielle Kulturen zu reinigen. Die Reinheit der Kolonien wird durch die Einheitlichkeit der Zellen und die Affinität zur Gram-Färbung gewährleistet. Es können auch mehrere biochemische oder molekulare Tests durchgeführt werden, um die Reinheit der Völkerzu überprüfen 22. Die Reinkulturen isolierter Stämme können entweder auf Agar-Schrägen bei 4 °C für den kurzfristigen Gebrauch gelagert oder langfristig bei -80 °C in Kryoprotektiva aufbewahrt werden (z. B. ein Glycerin-zu-Medium-Verhältnis von 20:80 oder 50:50)23.

In diesem Protokoll berichten wir über den Best-Practice-Ansatz zur Isolierung von Bakterien aus der Hautmikrobiota von Speleomantes-Höhlensalamandern , streng terrestrischen Amphibien, die sowohl in oberirdischen als auch unterirdischen Umgebungen leben können24. Angesichts des Mangels an universell anwendbaren Protokollen in der Literatur zielte diese Studie darauf ab, eine Best Practice für die Probenahme und Konservierung von kutanen Mikrobiota-Proben dieser terrestrischen Amphibien zu entwickeln. Um dieses Protokoll zu testen, haben wir den italienischen Höhlensalamander (Speleomantes italicus) als Modell verwendet und 12 Individuen aus einer Höhlenpopulation in den Abruzzen (Italien) beprobt. Die Individuen wurden von Hand entnommen und wiederholt (mindestens 5 Mal) an den dorsalen, ventralen Seiten und Flanken abgetupft. Die verwendeten Tupfer wurden in sterilem destilliertem Wasser eingeweicht. Die Tupfer wurden dann in physiologische 0,9%ige Kochsalzlösung mit und ohne Glycerin-Supplementierung getaucht. Nach dem Transfer ins Labor wurde die Probenkonservierung unter verschiedenen Bedingungen getestet: unkontrollierte Raumtemperatur, 4 °C und -20 °C für 10 Tage. Kultivierbare mikrobielle Gemeinschaften wurden mit kulturbasierten Methoden auf generischen und semiselektiven Medien (LBA, TSYEA, TSA, NA) verglichen.

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Protokoll

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Dieses Protokoll stellt die besten Praktiken für die Gewinnung und Handhabung von Speleomantes-Hautproben für einen mikrobiologisch kultivierbaren Ansatz zur Isolierung von Bakterienstämmen vor. Das Material, das in den folgenden Schritten nützlich ist, wird in der Materialtabelle aufgeführt. Das Protokoll folgt den Tierhaltungsrichtlinien von Artikel 11 des DPR 357/97 mit Genehmigung des italienischen Umweltministeriums (PNM 74554 vom 22.04.2024).

1. Vorbereitung der Medien

  1. Berechnen und wiegen Sie die Menge der Zutaten Pulver (siehe Herstelleranweisungen für die Menge des Pulvers, die für LBA, TSYEA, TSA, NA oder andere Medien verwendet wird).
  2. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um die Zutaten in destilliertem Wasser aufzulösen. Je nach Medium und gekauftem Produkt können Siedeschritte erforderlich sein.
  3. Bringen Sie das Medium auf das endgültige Volumen, wenn sich die Inhaltsstoffe vollständig aufgelöst haben, und kontrollieren Sie den pH-Wert. Wenn der Wert höher oder niedriger als erwartet ist, passen Sie ihn mit den in den Anweisungen des Herstellers empfohlenen Lösungen an. HCl- und NaOH-Lösungen werden häufig verwendet, um den pH-Wert zu senken bzw. zu erhöhen.
  4. Agar (2 % w/v) hinzufügen, auf 95 °C erhitzen und ca. 1 Minute kochen lassen, um den Agar vor der Autoklavation aufzulösen.
  5. Sterilisieren Sie das Medium durch Autoklavieren gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zu den üblichen Autoklavierverfahren gehören 121-134 °C für eine 15-30-minütige Behandlung.
  6. Nach dem Autoklavieren das Agarmedium auf ca. 45-50°C abkühlen und unter einer zuvor sterilisierten Laminar-Flow-Haube in sterile Petrischalen gießen
  7. Beschriften Sie die Platten nach dem Mediumstyp und dem Zubereitungsdatum.

2. Probenentnahme

  1. Spülen Sie die Haut des Salamananders (Gattung Speleomantes) in sterilem destilliertem Wasser ab, um die vorübergehenden mikrobiellen Gemeinschaften zu entfernen.
  2. Sammeln Sie Hauttupfer von Amphibien mit sterilen Wattestäbchen in einem Reagenzglas. Reiben Sie die Tupfer vorsichtig über die Hautoberfläche, um mikrobielle Proben zu sammeln, ohne die Person zu schädigen.
    1. Führen Sie einen in sterilem destilliertem Wasser getränkten Tupfer fünfmal auf jede Seite des ganzen Körpers, einschließlich aller Extremitäten, durch (fünf Hin- und Herbewegungen), um die Proben zu nehmen.
      HINWEIS: Eine Supplementierung mit Zusatzstoffen wird nicht empfohlen, da sie Einzelpersonen schaden kann.
    2. Legen Sie die Tupfer in Röhrchen mit physiologischer Kochsalzlösung (0,9 % NaCl), die mit Glycerin (20 %) ergänzt wird.
  3. Mischen Sie die Probe mit der Lösung, drücken Sie den Tupfer in Richtung der Röhrchenwände, während Sie das Röhrchen zusammendrücken und den Tupfer gründlich drehen (10 Mal im Uhrzeigersinn und 10 Mal gegen den Uhrzeigersinn).
  4. Nach dem Mischen verschließen Sie den Tupfer im Röhrchen und überführen Sie die mikrobiologischen Proben in das Labor, wobei Sie die Probe bis zur mikrobiellen Analyse bei 4 °C halten.
    HINWEIS: Alle Schritte werden mit neuem sterilem Material und Handschuhen für jede Person durchgeführt, um eine Kontamination und die Exposition des Bedieners gegenüber biologischen und chemischen Verunreinigungen zu vermeiden.

3. Inokulation und Inkubation

  1. Mischen Sie die mikrobiologische Probe vor der Verarbeitung gründlich an.
  2. Bereiten Sie serielle Verdünnungen der kutanen Probe mit Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) im Bereich von 10-1 bis 10-6 vor.
  3. 100 μl der Ist-Probe und serielle Verdünnungen werden auf die vorbereiteten Agarplatten geimpft. Streichen Sie die Probe mit einer sterilen L-förmigen Schlaufe über die Oberfläche des Agarmediums und verteilen Sie sie gleichmäßig, ohne übermäßigen Druck auszuüben, um eine Beschädigung des Agars zu vermeiden.
  4. Die beimpften Platten in einem Inkubator bei 20-25 °C für 3-5 Tage umdrehen. Dieser Temperaturbereich ist günstig für die Züchtung vieler mesophiler und psychotroper Umweltbakterien, die die Haut von Amphibien bewohnen.
    HINWEIS: Alle Schritte werden mit sterilem Material unter einer zuvor sterilisierten Laminarhaube durchgeführt. Für jede Versuchseinheit werden fünf unabhängige Replikate erstellt. Da die Ausgangsdichte unbekannt und unvorhersehbar ist, ist es immer hilfreich, einen breiten Bereich von Verdünnungen einzubeziehen.

4. Stammreinigung und -identifizierung

  1. Wählen Sie Bakterienkolonien mit unterschiedlichen Morphologien für die weitere Analyse nach der Inkubation aus.
    1. Wählen Sie zunächst gut isolierte Völker, um Kontamination oder Überlappung zu vermeiden und überfüllte Bereiche zu vermeiden, in denen sich die Völker vermischen könnten. Wählen Sie außerdem Kolonien mit unterschiedlichem Aussehen (z. B. Farbe, Größe, Form, Rand, Oberfläche oder Textur), um die Beprobung potenziell unterschiedlicher Arten oder Stämme zu gewährleisten.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für die Auswahl der verschiedenen kultivierbaren Bakterienstämme der Hautmikrobiota.
  2. Subkultur der ausgewählten Kolonien.
    1. Eine gut isolierte Kolonie der ursprünglichen Agarplatte wird aseptisch mit einer Impfschlaufe auf eine frische Agarplatte übertragen. Streichen Sie die Kolonie, um sie zu isolieren, und brüten Sie sie dann entsprechend aus.
    2. Wiederholen Sie diesen Schritt mehrmals auf frischen Agarplatten, um von jedem Bakterienisolat Reinkulturen zu erhalten, bis die isolierten Kolonien ähnlich aussehen. Wiederholen Sie die Subkultivierung mit selektiven und generischen Medien.
      HINWEIS: Die Kombination von aseptischer Handhabung, visueller und mikroskopischer Untersuchung und molekularer Identifizierung gewährleistet einen kontaminationsfreien Stamm.
  3. Überprüfen Sie die Reinheit der mikrobiellen Kulturen durch mikroskopische Beobachtungen (von 5x- bis 100x-Objektiven), Gram-Färbeaffinität (Fixierung, Färbung und Beobachtung von Kolonien) und biochemische Tests (z. B. Katalase-, Oxidase-, Urease- und Zuckerfermentationstest)21,25.
    HINWEIS: Reinkulturen sollten eine einheitliche Koloniemorphologie, konsistente mikroskopische Eigenschaften und biochemische Merkmale aufweisen.
  4. Führen Sie eine molekulare Identifizierung durch.
    1. Extrahieren Sie DNA aus gereinigten Bakterienkolonien und führen Sie eine 16S rRNA-Gensequenzierung durch, um die Bakterienspezies zu identifizieren. Führen Sie eine PCR-Amplifikation des 16S rRNA-Gens mit bakteriellen universellen Primern durch, gefolgt von der Sequenzierung und dem Vergleich mit bekannten Sequenzen in Datenbanken wie GenBank26.
  5. Einrichtung von Biobankkulturen.
    1. Testen Sie axenische (oder reine) Kulturen auf Sterilität, indem Sie sie in ein nicht selektives Medium impfen und auf das Fehlen von Kontaminantenwachstum prüfen. Lagern Sie axenische Kulturen für den mittel- und langfristigen Gebrauch.
      HINWEIS: Zu den Standardmethoden gehören das Schlieren von Kolonien auf Agar-Schrägen des Selektivmediums und die Lagerung bei Raumtemperatur, das Suspendieren der Kultur in Stammlösungen, die mit einer Mischung aus dem Selektivmedium und Glycerin (20:80 oder 50:50) hergestellt wurden, oder die Lyophilisierung der Bouillonkultur (Gefriertrocknung) und das Einfrieren bei -80 °C.

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Ergebnisse

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Der Arbeitsablauf des experimentellen Ansatzes ist in Abbildung 1 dargestellt.

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Abbildung 1: Arbeitsablauf bei der Probenahme, Handhabung und Verarbeitung der Amphibienhautproben. Bitte klicken Sie hier,...

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Diskussion

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Wir haben ein Best-Practice-Protokoll entwickelt, um eine kultivierbare Bakteriengemeinschaft aus der Mikrobiota der Amphibienhaut zu gewinnen und dies an Speleomantes italicus zu demonstrieren. Wie in der obigen Anwendung gezeigt, müssen mehrere Schritte unternommen werden, um eine erfolgreiche mikrobielle Isolierung aus der Amphibienhaut zu gewährleisten. Die Entnahme mit einer schonenden Tupfertechnik und sterilen Materialien ist sehr wichtig, um ausreichend mikrobie...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken für die finanzielle Unterstützung der Universität L'Aquila im Rahmen der Projekte "Progetti di Ateneo per la Ricerca di base 2024 UNIVAQ: Ecotoxicology of the endangered European cave salamanders" und "Analisi delle divergenze inter- e intraspecifiche del microbiota dei pletodontidi europei - FFORIC24.35" von Biodiversa+, der Europäischen Partnerschaft für biologische Vielfalt, im Rahmen des Projekts Sub-BioMon - Entwicklung und Erprobung von Ansätzen zur Überwachung der unterirdischen Biodiversität im Karst im Rahmen des Projekts 2022–2023 Gemeinsame Ausschreibung BiodivMon und der Nationale Aufbau- und Resilienzplan (NRRP), Mission 4, Komponente 2, Investition 1.1, Ausschreibung Nr. 1409, veröffentlicht am 14.9.2022 durch das italienische Ministerium für Universität und Forschung (MUR), gefördert von der Europäischen Union - NextGenerationEU - Projektcode: P2022CYF9L, Projekttitel Sind fakultative Höhlenarten Treiber von Metallverunreinigungen in die unterirdische Umgebung? (METALCAVE) - BECHER E53D23015380001.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Lauria-Bertani AgarMerk MilliporeL3027
Tryptische Soja AgarMerk Millipore22091
Trypton Soja Hefeextrakt AgarMerk Millipore17221
Nährstoff AgarMerk Millipore70148
GlycerinlösungMerk Millipore49781

Referenzen

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