Analyse von Thrombozyten-Subpopulationen durch Mehrfarben-Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Die Mehrfarben-Durchflusszytometrie für Blutplättchen kann neue Thrombozyten-Subtypen innerhalb klassischer Thrombozyten-Subpopulationen identifizieren, wie z. B. ruhende, aggregierte, prokoagulanzielle und apoptotische Thrombozyten. Dies ermöglicht den Vergleich verschiedener Subpopulationsmuster, die durch verschiedene Thrombozytenagonisten induziert werden. Hier wird ein Verfahren zur Etablierung eines mehrfarbigen Durchflusszytometrie-Panels ausführlich beschrieben.

Zusammenfassung

Blutplättchen oder Thrombozyten sind kleine kernhaltige Blutzellen, die eine entscheidende Rolle bei Blutstillung und Thrombose spielen. Defekte in der Thrombozytenfunktion können bei Patienten mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu Blutungen oder thrombotischen Ereignissen führen. Daher ist es wichtig, Thrombozyten phänotypisch zu charakterisieren, um Thrombozytensubpopulationen der Thrombozytenfunktion zuordnen zu können. Die Stimulation menschlicher Blutplättchen mit Thrombozytenagonisten und -aktivatoren induziert morphologische und physiologische Veränderungen der Blutplättchen, begleitet von Veränderungen in der Oberflächenrezeptorpopulation. Dies führt zu funktionell vielfältigen Thrombozyten-Subpopulationen. Klassisch definierte Thrombozyten-Subpopulationen sind ruhende, aggregatorische, prokoagulante und apoptotische Thrombozyten. Um die Wirkung von Agonisten auf Thrombozyten-Subtypen zu charakterisieren, haben wir einen Assay mittels Mehrfarben-Durchflusszytometrie etabliert, der aus 10 verschiedenen Antikörpern und Farbstoffen besteht (anti-CD62P, anti-CD63, anti-CD61, anti-CD41, anti-CD42b, anti-Integrin_αIIbβ3 (Klon: PAC-1), anti-CXCR4, anti-ACKR3, Annexin V, Zombie NIR). Isolierte humane Blutplättchen wurden mit Thrombozytenagonisten inkubiert und mit spezifischen Fluorophor-konjugierten Antikörpern und Farbstoffen gefärbt. Anschließend wurden sie mittels Durchflusszytometrie vermessen. Dies ermöglicht es uns, agonistenspezifische Subtypen innerhalb der klassischen vier Subpopulationen zu definieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination von Aktivierungsmarkern (anti-CD62P, anti-CD63, anti-Integrin_αIIbβ3 (Klon: PAC-1)), Entzündungsmarkern (anti-CXCR4, anti-ACKR3) und apoptotischen Markern (Annexin V, Zombie NIR), aus denen sich das in diesem Manuskript beschriebene 10-Farben-Durchflusszytometrie-Panel zusammensetzt, die Möglichkeit eröffnet, weitere Thrombozytensubtypen zu definieren, die mit einer spezifischen Thrombozytenfunktion in Verbindung gebracht werden könnten. Diese Methode kann sowohl in der Grundlagenforschung zur Thrombozytenfunktion und -physiologie als auch bei der Definition neuer Thrombozyten-Subtypen in Krankheitsmodellen und Patientenstudien eingesetzt werden.

Einleitung

Thrombozyten, auch Blutplättchen genannt, sind kleine, kernfreie Blutzellen, die für die Blutstillung und die Entstehung von Thrombosen unerlässlich^{sind 1,2}. Sie können durch verschiedene Thrombozytenagonisten aktiviert werden. Klassische, physiologische Thrombozytenagonisten sind Adenosindiphosphat (ADP), das an die P2Y12- und P2Y1-Rezeptoren bindet, Thrombin, das Blutplättchen über die PAR1- und PAR4-Rezeptoren aktiviert, und Kollagen, das mit dem Glykoprotein VI interagiert. Kollagen kann in In-vitro-Experimenten durch das Kollagen-verwandte Peptid (CRP-XL) substituiert ^werden3,4. Kürzlich wurde gezeigt, dass Hemin durch die Interaktion von C-Typ-Lektin-ähnlichem Rezeptor (CLEC-2) und Glykoprotein VI (GPVI) eine Thrombozytenaktivierung induziert, wodurch Hämin als neuer endogener Thrombozytenaktivator/Agonist etabliert^{wird 5,6}. Mehrere pathologische Situationen können zu einer Hämolyse führen, die zur Freisetzung von freiem Eisen-haltigem Hämin führt. Alle diese Thrombozytenagonisten verändern die Oberflächenrezeptorexpression auf Blutplättchen. Die Veränderung der Oberflächenrezeptoren und der Plasmamembran hängt von der Stärke und Konzentration des Thrombozytenagonisten^{ab 7,8,9}. Daher ist es wichtig, Thrombozyten phänotypisch zu charakterisieren, um Thrombozytensubpopulationen der Thrombozytenfunktion zuordnen zu können.

Hochdimensionale Methoden wie die Durchflusszytometrie haben gezeigt, dass Blutplättchen Subpopulationen mit unterschiedlichen Funktionen bilden. Die Subpopulationen können durch verschiedene Oberflächenmarker klassifiziert werden. In der Literatur ist bekannt, dass zwei unterschiedliche Thrombozyten-Subpopulationen vorhanden sind: das Prokoagulans, das durch Phosphatidylserin-Externalisierung gekennzeichnet ist, und der aggregatorische Phänotyp, der das Integrin aktiviert α_{IIIbβ 3.} Zusätzlich zu den klassischen Aktivierungsmarkern können Fluoreszenzfarbstoffe wie Glutathion-S-Arylloxid (GSAO), das die mitochondriale Funktion und oxidativen Stress nachweist, zur weiteren Kategorisierung verwendet werden, z. B. prokoagulanziöse Blutplättchen nach ihrem Stoffwechselzustand¹⁰. Dies ermöglicht eine Unterscheidung zwischen Ballonbildung und mitochondrialer Permeabilität, Übergangsporenbildung (MPTP), Prokoagulans Thrombozytenphänotyp¹¹.

Heemskerk et al. haben durch die Analyse der Exposition gegenüber Phosphatidylserin (PS) und der Aktivität von Integrin α_IIbβ₃ gezeigt, dass verschiedene Thrombozytenpopulationen unterschiedliche Gerinnungsschritte steuern können und dass starke Aktivatoren wie Thrombin und Kollagen für die Phosphatidylserin-Exposition erforderlich sind¹². Des Weiteren ist die Aktivierung der Blutplättchen durch GPVI mit Kollagen oder dem spezifischen GPVI-Agonisten Convulxin primär für die Bildung von adhärenten gerinnungsfördernden Blutplättchen verantwortlich. Ebenso induziert Arachidonsäure, die durch die Produktion von Thromboxan A2 durch Cyclooxygenase zur Aktivierung der Blutplättchen führt, die PS-Exposition¹³. Arachidonsäure ist jedoch im Vergleich zu Thrombin oder Kollagen ein schwacher Thrombozytenaktivator¹⁴. Van Velzen et al. untersuchten auch Thrombozytenoberflächenantigene (CD42a/b, CD36, CD41, CD61) und Aktivierungsmarker (PAC-1, CD63, CD62P) in zwei separaten Messungen¹⁵. Zusätzlich konnten van Velzen et al. Blut von Thrombasthenie-Patienten analysieren und die Subpopulationen zwischen gesunden und kranken Patienten vergleichen. Hindle et al. maßen den Einfluss von Prostacyclin auf Thrombozyten-Subpopulationen nach Thrombin- und CRP-XL-Behandlung mit zwei einzelnen Panels, die aus jeweils vier Markern bestanden (PAC-1, Annexin V, CD62P, CD42b oder CDCD154, CD62P, CD63, CD42b)¹⁶. In jüngster Zeit wurde die Mehrfarben-Durchflusszytometrie verwendet, um ruhende (CD42b⁺, PAC1^-, CD62P^-, Annexin V^-), aggregatorische (CD42b⁺, PAC1⁺, CD62P⁺, Annexin V^-), prokoagulanziöse (CD42b⁺, PAC1^-, CD62P⁺, Annexin V⁺) und apoptotische (Cd42b^-, PAC1^-, CD62P^-, Annexin V⁺) Thrombozyten-Subpopulationen^{zu definieren 7,17}. Laspa et al. erweiterten/verfeinerten den Ansatz der Mehrfarben-Durchflusszytometrie durch die Zugabe von Antikörpern gegen die Chemokinrezeptoren CXCR4 und ACKR3¹⁸. Basierend auf der verfügbaren Literatur ist dies das erste 10-Farben-Durchflusszytometer-Panel für isolierte humane Blutplättchen, das den Nachweis von 10 verschiedenen Antigenen auf einem einzelnen Blutplättchen (Einzelzellebene) innerhalb einer Population isolierter menschlicher Blutplättchen in einem Röhrchen ermöglicht. Daher ist es möglich, gleichzeitig das Aktivierungs-, Adhäsions- und Aggregationspotenzial, die Chemokinrezeptoren und das apoptotische Potenzial einer einzelnen Zelle zu messen, um die bestehende Subpopulation weiter zu unterscheiden. Damit ergänzt es Johnson et al., die die vier Hauptsubpopulationen mit vier Markern (ruhend, prokoagulans, aggregatorisch, apoptotisch) ^{definierten17}. Die Etablierung eines mehrfarbigen Durchflusszytometrie-Assays ermöglicht daher den Vergleich verschiedener Thrombozytenagonisten hinsichtlich ihres Aktivierungsmusters und der Bildung von Thrombozyten-Subtypen innerhalb klassischer Thrombozyten-Subpopulationen.

Die Methode kann für die Grundlagenforschung zur Analyse der Thrombozytenfunktion und -physiologie eingesetzt werden. Darüber hinaus kann der etablierte Mehrfarben-Durchflusszytometrie-Assay für humane Blutplättchen mit Blutplättchen durchgeführt werden, die im Rahmen von Patientenstudien, z.B. bei der Erforschung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und thrombotischen Ereignissen, gewonnen wurden, um die durch diese Krankheiten induzierten Thrombozyten-Subpopulationen und die Auswirkungen von Behandlungen auf diese induzierten Phänotypen zu entschlüsseln. So haben Mueller et al. gezeigt, dass sich die Thrombozyten-Subpopulationen bei Patienten mit Aortenstenose unterscheiden können¹⁹. Die gewonnenen Erkenntnisse könnten neue Möglichkeiten für pharmazeutische Interventionen bieten.

Protokoll

Die Blutentnahme und der Umgang mit Blut zu Forschungszwecken wurden von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Eberhard Karls Universität und des Universitätsklinikums Tübingen genehmigt (Ethikvotum 238/2018B02), und die Studienmethoden entsprachen den in der Deklaration von Helsinki festgelegten Standards. Gesunde Spender gaben eine schriftliche Einverständniserklärung zur Blutentnahme. Die Ausgangsmerkmale für gesunde Spender sind in Tabelle 1 aufgeführt. Abbildung 1 gibt einen Überblick über das Durchflusszytometrie-Protokoll.

1. Isolierung von menschlichen Blutplättchen aus Vollblut

HINWEIS: Die ISTH-Richtlinien wurden in Bezug auf die Probenentnahme, Tourniquets und die Wahl des Antikoagulans befolgt, um eine standardisierte Art und Weise zur Isolierung von Blutplättchen^{zu gewährleisten 20}.

1. Vorbereitung des Puffers
   1. Säure-Citrat-Dextrose (ACD) Antikoagulanzienpuffer: 12,50 g Na 3-Citrat (85 mM C₆H₅Na₃O₇ x 2 H₂O), 6,82 g Citratsäure (71 mM) und 10,00 g Glukose (111 mM) in 475 ml Aqua Destillata auflösen. Passen Sie den pH-Wert mit 1 M NaOH auf 4,69 an. Füllen Sie bis zu 500 mL mit Aqua Destillata. Anschließend den Puffer mit dem Filter sterilisieren und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Alle Lösungen werden mit einem vakuumbetriebenen Filtersystem filtersterilisiert, das eine Polyethersulfonmembran mit schneller Durchflussfähigkeit mit einer Porengröße von 0,22 μm verwendet.
   2. Tyrode-Puffer (10x): Wiegen Sie 80,00 g NaCl, 10,15 g NaHCO₃ und 1,95 g KCl und fügen Sie Aqua Destillata zu 1 l hinzu. Filtern Sie den Puffer und lagern Sie ihn bis zur Verwendung bei 4 °C.
   3. Tyrode-HEPES-Puffer (1x; 137 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 5 mM Glukose, 10 mM HEPES): Mischen Sie 10 mL 10x Tyrode-Puffer und 90 mL Aqua Destillata. 0,1 g Glukose und 0,1 g Rinderserumalbumin (BSA) auflösen. Stellen Sie den pH-Wert mit 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES) auf 7,4 ein. Setzen Sie 10 mL des Tyrode-Puffers auf pH 7,4 und passen Sie den pH-Wert der verbleibenden 90 mL des Tyrode-Puffers auf 7,4 mit 1 N HCl auf pH 6,5 an.
      HINWEIS: BSA kann einige Chemikalien, wie z. B. Hemin, auffangen. In diesem Fall ist es wichtig, den Puffer des 1x Tyrode ohne BSA vorzubereiten. Alle Puffer müssen vor der Verwendung auf Raumtemperatur oder 37 °C erwärmt werden.
2. Entnahme von Blutproben
   1. Bereiten Sie für jeden Spender eine 10-ml-Spritze mit 2 mL ACD-Antikoagulans vor und lassen Sie sie mit einem Inkubator auf Raumtemperatur oder 37 °C einstellen. Halten Sie den Verdünnungsfaktor von 1:5 (ACD: Blut) ein.
      HINWEIS: Verwenden Sie kleinere oder größere Spritzen, um Blutproben zu entnehmen. Kalter ACD-Puffer kann die Blutplättchen voraktivieren und Ihre Ergebnisse beeinträchtigen.
   2. Verwenden Sie eine Schmetterlingsnadel (21 G), um das Spenderblut langsam in den vorgewärmten ACD-Spritzen zu sammeln. Öffnen Sie den Tourniquet-Schlauch, bevor Sie die Spritze befüllen, um eine Voraktivierung zu vermeiden.
      HINWEIS: Spritzen mit einer größeren Nadel können die scherinduzierte Aktivierung von Blutplättchen minimieren.
   3. Übertragen Sie das ACD-Blut langsam in ein 15-ml-Reaktionsröhrchen. Verwenden Sie das Blut sofort, um eine Voraktivierung der Blutplättchen zu vermeiden.
3. Isolierung von Blutplättchen
   1. Zentrifugieren Sie das ACD-Blut 20 min lang bei 209 x g (Raumtemperatur, RT) ohne Bremsen. Bereiten Sie 25 mL Tyrode-HEPES-Puffer mit einem pH-Wert von 6,5 in einem 50-ml-Reaktionsröhrchen vor.
   2. Übertragen Sie das resultierende plättchenreiche Plasma (PRP, obere Schicht) vorsichtig in das 50-ml-Reaktionsröhrchen mit Tyrode-HEPES-Puffer, pH 6,5.
   3. Lassen Sie etwa 1 ml PRP über dem Buffy Coat und den Erythrozyten, um eine Kontamination mit anderen Blutzellen zu vermeiden.
   4. Die Suspension wird bei 430 x g 10 min lang bei RT zentrifugiert, um die Blutplättchen zu pelletieren. Das resultierende Pellet wird vorsichtig in 200-300 μl Tyrode-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 resuspendiert.
   5. Verwenden Sie einen Zellzähler, um die Thrombozytenzahl zu bestimmen. Passen Sie die Thrombozytenzahl mit Tyrode-HEPES-Puffer pH 7,4 auf 200 x 10³ Blutplättchen/μl an. Siehe Schritt 3 für die weitere Verarbeitung der Thrombozytenfärbung.

2. Auswahl und Titration von Antikörpern für die Durchflusszytometrie

1. Auswahl von Antikörpern und Farbstoffen
   1. Auswahl der Antikörper und Farbstoffe mit geeigneten Fluorophoren für das Durchflusszytometer²¹. Beachten Sie die vom Hersteller des Durchflusszytometers empfohlene Filterkonfiguration. Ein Beispiel für die Konfiguration von Thrombozytenmarkern und Fluorophoren ist in Tabelle 2 und Abbildung 2 für das folgende Zytometer angegeben: BD LSR Fortessa mit Laserkonfiguration: violett (402 nm), blau (488 nm), gelb/grün (561 nm), rot (640 nm).
      HINWEIS: Verwenden Sie hellere Fluorochrome für weniger exprimierte Antigene. Zum Beispiel wurden die hellen Fluorochrome BV412 und BV650 für die schwach exprimierten Chemokinrezeptoren (ACKR3 und CXCR4) verwendet22,23,24.
2. Titration von Antikörpern und Farbstoffen
   1. Titrieren Sie die Antikörper, um die richtige Arbeitskonzentration zu finden. Für die Titration verwenden Sie isolierte humane Blutplättchen aus Schritt 1 und eine Konzentrationsreihe des Antikörpers.
      HINWEIS: Die vom Hersteller angegebenen Arbeitskonzentrationen sind in der Regel ein guter Ausgangspunkt für die Konzentrationsreihen.
      1. Wenn Sie mit Antigenen arbeiten, die nur während der Behandlung exprimiert werden, aktivieren Sie die Blutplättchen vor der Färbung, um sicherzustellen, dass auch negative und positive Zellen nachgewiesen werden können. Zum Beispiel bindet PAC-1 nur an aktiviertes Integrin α_IIbβ₃. Aktivieren Sie daher die Blutplättchen stark, um ein helles, positives Signal zu erhalten, z. B. mit 10 μg/ml Kollagen-verwandtem Peptid (CRP; siehe Abbildung 3).
3. Titration von Proben
   1. Isolieren Sie die menschlichen Blutplättchen wie in Schritt 1 und stellen Sie die Thrombozytenzahl auf 1 x 10⁶ Blutplättchen pro Probe ein.
      1. Für Rezeptoren, die vor der Färbung nicht aktiviert werden müssen: CD61, CD42b, CD41, CXCR7, CXCR4 verwenden Sie eine ungefärbte und eine gefärbte Probe pro Antikörper. Für Rezeptoren/Marker, die vor der Färbung mit z. B. 10 μg/ml CRP-XL aktiviert werden müssen: PAC1, CD63, CD62P, Annexin V, Zombie NIR, verwenden Sie eine aktivierte und eine nicht aktivierte Probe 15,25,26.
   2. Aktivieren Sie die Thrombozyten (1 x 10,⁶ Thrombozyten pro Probe), ggf. für 30 min mit 10 μg/mL CRP-XL. Dann inkubieren Sie die isolierten Blutplättchen (1 x 10⁶ Blutplättchen pro Probe) 30 Minuten lang mit unterschiedlichen Konzentrationen des Fluorochrom-konjugierten Antikörpers oder Farbstoffs und fügen Sie 300 μl 1x Annexin-Bindungspuffer hinzu, um die Probe zu verdünnen (Beispiele für Konzentrationen sind in Tabelle 3 aufgeführt).
   3. Messen Sie 10.000 Ereignisse für jede Stichprobe.
   4. Berechnen Sie den Färbeindex, der die optimale Trennung der positiven und negativen Populationen für jeden Antikörper zeigt, wie in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt.
   5. Plotten Sie den Färbeindex für jede Antikörperkonzentration auf, um die optimale Konzentration zu ermitteln.

3. Färbung für die Durchflusszytometrie

HINWEIS: In Tabelle 4 finden Sie ein Färbebeispiel mit vier verschiedenen Thrombozytenaktivatoren (CRP-XL, ADP, Thrombin, Hemin).

1. Hemin muss frisch zubereitet werden. Das Pulver wird in 1,4 M NaOH zu einer 3 M Lösung aufgelöst und 5 min lang bei 450 U/min auf 96 °C erhitzt. Dann wird es mit destilliertem H₂O zu einer 3 mM Stammlösung verdünnt.
2. Nach Einstellung der Thrombozytenzahl (pro Probe: 1 x 10⁶ Thrombozyten) werden die Thrombozyten in einem Röhrchen mit den Thrombozytenaktivatoren für 30 min bei RT aktiviert, wie in Tabelle 4 angegeben.
3. Geben Sie 43,3 μl Antikörpercocktail zu den Proben und inkubieren Sie die Blutplättchen 30 Minuten lang bei RT im Dunkeln.
4. Nach der Inkubation verdünnen Sie die Proben mit 300 μL 1x Annexin Binding Buffer (10 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂), so dass das Annexin V Protein an das Phosphatidylserin an der Außenseite der Zellmembran binden kann. Messen Sie die Proben sofort.
   HINWEIS: Messen Sie die Proben sofort nach der Vorbereitung. Da die Proben nicht fixiert sind, kann eine Verzögerung der Probenvorbereitung und -messung die Variabilität der Ergebnisse erhöhen. Die Fixierung beeinträchtigt die Bindung von Annexin V.

4. Kompensationsaufbau und Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontroll-Messung (FMO)

HINWEIS: Führen Sie vor dem Aufzeichnen von Daten ein Kompensations-Setup durch. Ein Durchflusszytometer berechnet automatisch die Kompensationseinstellungen; Beziehen Sie sich für das jeweilige Kompensationsverfahren in die üblichen Handbücher des Durchflusszytometers. Verwenden Sie jedoch Kompensationssteuerungen entweder mit Zellen oder mit Kügelchen.

1. Einrichtung der Vergütung
   1. Für die Kompensation mit Kügelchen bereiten Sie 150 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) für jedes Fluorophor mit einem Tropfen Kügelchen und 1 μl des fluoreszenzkonjugierten Antikörpers vor.
   2. Überwachen Sie die Reaktivität der Kügelchen der Spezies. Verwenden Sie Anti-Maus-IgGκ und die Negativkontrolle von Polystyrol-Mikropartikeln. Um Annexin V zu kompensieren, markieren Sie PE/Cy7-Kügelchen mit dem Antikörper PE/Cy7 Anti-Human-CD62L, der das gleiche Fluorophor wie Annexin V konjugiert.
   3. Verwenden Sie aminreaktive Kompensationskügelchen für den aminreaktiven Farbstoff. Verwenden Sie zwei Tropfen positive und einen Tropfen negative Kügelchen in 150 μl PBS mit 1 μl des Farbstoffs. Prüfen Sie, ob die aminreaktiven Kompensationskügelchen mit dem Farbstoff reagieren und ein positives Signal zeigen. Vergewissern Sie sich, dass die negativen Kügelchen nicht mit dem aminreaktiven Farbstoff reagieren und ein negatives Signal darstellen.
      HINWEIS: Verwenden Sie für Zombie NIR APC-Cy7 negative und positive aminreaktive Kügelchen.
   4. Inkubieren Sie die Kompensationsproben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
   5. Führen Sie jedes Kompensationsrohr separat und anbringen Sie die Singulett-Bead-Population auf Basis von FSC und SSC. Die Kügelchenpopulation erscheint als eine kleine konzentrierte Population. Zeichnen Sie ein Tor um diese Bevölkerung.
   6. Zeigen Sie die Histogramme für jedes Kompensationsröhrchen an und passen Sie die Kompensationswerte an, bis sich die positiven Peaks der verschiedenen Antikörper und Farbstoffe nicht überlappen. Messen Sie dann jedes einzelne Kompensationsröhrchen und lassen Sie den Spillover der Fluorophore gemäß der SOP des Herstellers berechnen.
   7. Fahren Sie mit der Aufnahme des eigentlichen Färbeexperiments mit den isolierten menschlichen Blutplättchen fort (siehe Schritt 3 und Tabelle 4). Passen Sie die SSC/FSC-Spannung vor der Messung an, um die Thrombozytenpopulation zu ermitteln. Da CD61 ubiquitär auf Blutplättchen exprimiert wird, überprüfen Sie mit dieser Fluoreszenzschwelle, ob jede Größe der Blutplättchen nachgewiesen werden kann.
   8. Messen Sie dann 20.000 Ereignisse pro Stichprobe.
2. FMO-Messung
   1. Bereiten Sie für jeden Marker eine FMO-Kontrolle gemäß Tabelle 5 vor. Um die Überlappungen aller Marker bestimmen zu können, bereiten Sie sowohl unstimulierte als auch stimulierte Proben vor.

5. Datenanalyse

1. Analyse mit einer Datenanalysesoftware für Durchflusszytometrie (Abbildung 4)
   1. Ziehen Sie die FSC-Dateien per Drag & Drop in die Software. Definieren Sie mit dem FMO-Regler die positive Population für jeden Marker.
      1. Bestimmen Sie FMOs, indem Sie jedes FMO-Steuerelement gegen jeden Marker in einem Punktdiagramm darstellen. Dadurch wird das Übergreifen in andere Kanäle sichtbar. Verwenden Sie das FMO-Gate mit dem höchsten Fluoreszenz-Spillover als Grenze zur positiven Population für die behandelten 10-Farben-Proben.
2. Analyse mit einer Cloud-basierten Durchflusszytometrie-Analyse (Abbildung 5)
   1. Öffnen Sie die Software und erstellen Sie einen neuen Datensatz. Ziehen Sie die mit dem Durchflusszytometer erfassten FCS-Dateien per Drag & Drop.
   2. Starten Sie die Analyse, indem Sie einen Workflow erstellen. Die Vergütungsmatrix wird automatisch aus den Rohdatendateien erstellt.
   3. Führen Sie eine UMAP-Analyse mit den folgenden Einstellungen durch: Nachbarn: 15, Mindestabstand: 0,4; Komponenten: 2; Metrisch: Euklidisch; Lernrate: 1; Epochen: 200; Einbetten Initialisierung: spektral. Markieren Sie alle Dateien und alle 10 Marker (Features).
   4. Fügen Sie die Phenopraph-Analyse als neue Aufgabe hinzu und führen Sie die Analyse mit den folgenden Einstellungen aus: K Nächste Nachbarn: 20; Entfernungsmetrik: Euklidisch; Louvain Runs: 1; Anzahl der Ergebnisse: 1.
   5. Fügen Sie eine Gating-Aufgabe hinzu, um die generierten Cluster anzugeben. Nach dem Ausführen der Analyse ist es möglich, die Daten in verschiedenen Blots darzustellen, die exportiert werden können.

Ergebnisse

Eine deutliche Verschiebung der Thrombozytenpopulation ist in den Punktdiagrammen zu sehen (Abbildung 4A). Hemin bildet im Vergleich zu den anderen Aktivatoren mehr Blutplättchen mit niedrigem FSC. Etwa 40 % bis 60 % der behandelten Blutplättchen mit ADP, Thrombin und CRP-XL sind CD42b-positiv (Abbildung 4B). Nur Hämin verringert die CD42 b-positiven Blutplättchen signifikant (*p < 0,05; Abbildung 4B)...

Diskussion

Die Mehrfarben-Durchflusszytometrie ermöglicht die Definition unterschiedlicher Thrombozytencluster/Subpopulationen, die mit diskreten Funktionen assoziiert sind 12,17,18. Entscheidend für die Ergebnisse der Subpopulationen und der Expression der Rezeptoroberfläche ist die Qualität der isolierten humanen Blutplättchen. Daher ist ein wichtiger Schritt in dem vorgestellten Protokoll die Präparatio...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10x Bindungspuffer	Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA	88-8103-74	Puffer
Adenosindiphosphat (ADP)	Probe & go Labordiagnostica GmbH Lemgo, Deutschland	70212	Thrombozyten-Agonist
Annexin V PE-Cyanin7	Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA	88-8103-74	Farbstoff
anti-CD41 AF 700	BioLegend, San Diego, CA, USA	303728	Antikörper
anti-CD41 Alexa Fluor 700	BioLegend, San Diego, CA, USA	303727	Antikörper
Anti-CD42b PerCP/Cyanin5.5	BioLegend, San Diego, CA, USA	303918	Antikörper
anti-CD61 BV605	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, USA	744382	Antikörper
Anti-CD62P PE	Beckman Coulter, Brea, Kalifornien, USA	IM1759U	Antikörper
Anti-CD63 PE/Cy5	Abcam, Cambrigde, UK	ab 234251	Antikörper
anti-CXCR4 BV650	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, USA	740599	Antikörper
anti-CXCR7 BV421	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, USA	566234	Antikörper
anti-PAC-1 FITC	BD Bioscience Franklin Lakes, NJ, USA	340507	Antikörper
Rinderserumalbumin (BSA)	Applichem, Darmstadt, Deutschland	A1391-Citritesäure
	Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland	6490.1-CRP-XL
	CambCol Laboratories, Ely, Großbritannien	CRP-XL	Thrombozytenagonist
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, USA	G7528-Dubecco
" s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma Aldrich Co, St. Louis, Missouri, USA	D8537-Hemin
	Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, USA	H9039-10G	Thrombozytenagonist
HEPES	Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland	9105.3-Kaliumchlorid
	Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland	6781.3-Natriumchlorid
	Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland	3957.1-Natriumhydrogencarbonat
	Sigma Aldrich Co, St. Louis, Missouri, USA		401676-Thrombin
	Roche	10602400001	Thrombozytenagonist
Tri-Natriumcitrat-Dihydrat	Applichem, Darmstadt, Deutschland		1416551211-Zombie
NIR	BioLegend, San Diego, CA, USA	423105	aminreaktiver Farbstoff