Einzelnukleotid-Polymorphismus-sensitiver FISH-Nachweis der lokusspezifischen ribosomalen RNA-Transkription in Drosophila melanogaster

Summary

Das Protokoll beschreibt die SNP-FISH-Methode (Single Nucleotide Polymorphisms) zur Unterscheidung ribosomaler RNA-Transkripte, die vom ribosomalen DNA-Locus des X- oder Y-Chromosoms in Drosophila melanogaster abgeleitet sind.

Abstract

Um sicherzustellen, dass ausreichend ribosomale RNA (rRNA) für die Ribosomenfunktion transkribiert wird, enthalten Genome Hunderte von Tandem-Duplikationen der Sequenzen, die für rRNAs kodieren und Regionen bilden, die als ribosomale DNA (rDNA)-Loci bezeichnet werden. Die Genome vieler Organismen enthalten mehr als einen rDNA-Locus, der über verschiedene Chromosomen verteilt ist, und rRNA kann von mehreren rDNA-Loci oder nur von einem einzigen Locus transkribiert werden. Veränderungen der rRNA-Transkriptionsquellen deuten häufig auf ribosomale Beschwerden hin. Die Homogenität der rRNA behindert jedoch die Unterscheidung, ob rRNA von mehreren oder einem einzelnen rDNA-Locus transkribiert wird. Hier beschreiben wir eine Methode, die die Einzelnukleotid-Polymorphismus-sensitive Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (SNP-FISH) verwendet, um die rRNA-Transkription zwischen Drosophila melanogaster rDNA-Loci auf dem X- und Y-Chromosom zu unterscheiden. Diese Methode nutzt Locus-spezifische rRNA-Varianten, um eine einfache Detektion der Quelle der rRNA-Transkription mit Einzelzellauflösung zu ermöglichen. Dieser Assay kann auf jeden Drosophila-Zelltyp angewendet werden und kann für die Verwendung in anderen Systemen angepasst werden.

Introduction

Die ribosomalen RNAs (rRNAs) 18S, 5,8S und 28S, die für die Ribosomenfunktion erforderlich sind, werden in einem einzigen Cistron namens 45S pre-rRNA mittranskribiert. Die drei rRNAs werden innerhalb der 45S-prä-rRNA durch zwei interne transkribierte Spacersequenzen (ITS) getrennt und von externen transkribierten Spacersequenzen (ETS) am 5'- und 3'-Ende flankiert. Alle diese Spacersequenzen werden von der 45S-prä-rRNA entfernt, damit die reifen rRNAs in Ribosomen eingebaut werden können (siehe¹). Um die hohe Nachfrage nach rRNA-Produktion zu befriedigen, die zur Unterstützung der Ribosomenaktivität erforderlich ist, enthalten alle eukaryotischen Genome Hunderte von Kopien der 45S-Sequenz. Diese Kopien werden in Tandem-Wiederholungen geclustert und bilden genomische Regionen, die als ribosomale DNA (rDNA)-Loci bezeichnet werden. Die meisten eukaryotischen Genome enthalten mehrere rDNA-Loci, die auf separate Chromosomen verteilt sind (siehe²). Die hohe Redundanz von 45S-Kopien bedeutet, dass es in der Regel viel mehr 45S-Kopien gibt, als für die Transkription erforderlich sind, und die Mehrheit der 45S-Kopien ist transkriptionell stumm und in Heterochromatin³ vergraben. Die transkriptionelle Aktivität ist bei allen rDNA-Loci nicht einheitlich, und eine Variation in der Transkription des rDNA-Locus ist bei^{allen Organismen} weit verbreitet ^4,5,6, was darauf hindeutet, dass die 45S-Transkription an einzelnen rDNA-Loci unterschiedlich reguliert ist. Bei Pflanzen, Wirbellosen und Wirbeltieren wurde ein lokusweites rDNA-Silencing beobachtet 7,8,9,10, was darauf hindeutet, dass das locusweite rDNA-Silencing ein wichtiger Mechanismus für die Regulierung der rRNA-Dosierung ist ¹¹. Die rRNA-Transkription ist ein wichtiger regulatorischer Schritt bei der Ribosomenproduktion, und Veränderungen der rRNA-Transkription, die die Translationsaktivität modulieren, sind ein wichtiges Merkmal sowohl der normalen Differenzierung als auch der Krankheitszustände¹². Veränderungen in der Transkription des rDNA-Locus sind auch mit einer Verringerung der Gesamtanzahl der rDNA-Kopien^{verbunden 13}. Daher kann eine veränderte Locus-spezifische rDNA-Transkription ein wichtiger Indikator für eine gestörte zelluläre Physiologie sein.

Während das locusspezifische Silencing eine Hauptquelle für die transkriptionelle Regulation von rRNA zu sein scheint, sind die Mechanismen, die dieses Silencing etablieren und bestimmen, welche rDNA-Loci transkriptionell aktiv sind, weitgehend unbekannt. Die Homogenität der rDNA-Sequenzen erschwert die Beurteilung der individuellen Transkription von rDNA-Locus und verhindert eine weit verbreitete Analyse der locusspezifischen rDNA-Transkriptionsaktivität. Diese Herausforderung kann möglicherweise überwunden werden, indem die strukturelle Variation und die Variation der Einzelnukleotidsequenz zwischen rDNA-Kopien innerhalb desselben Genoms^{genutzt werden} 4,5,6,13. Einige dieser Varianten können von den meisten oder allen Kopien in einem einzelnen Locus geteilt werden, wodurch einzigartige rDNA-Locus-Haplotypen mehrerer Varianten entstehen, die einen rDNA-Locus unterscheiden. Tatsächlich ergab die jüngste Kartierung von rDNA-Varianten auf spezifische Loci durch das Telomer-zu-Telomer-Konsortium Locus-spezifische gemeinsame rDNA-Varianten im menschlichen Genom¹⁴. Solche rDNA-Locus-Karten können die Identifizierung der locusspezifischen Transkription aus Sequenzierungsdatensätzen ermöglichen; Die Verfügbarkeit dieser Karten ist jedoch derzeit noch begrenzt und nicht einfach zu erstellen. Da sich rDNA-Loci nur bei Drosophila melanogaster auf den Geschlechtschromosomen befinden (ein Locus auf jedem X- und Y-Chromosom)¹⁵, fehlt der rDNA-Locus des Y-Chromosoms bei XX Weibchen. Diese natürliche Isolierung aus dem Y-Chromosomen-Locus bedeutet, dass Varianten des Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) zwischen den X- und Y-rDNA-Loci in der Short-Read-Sequenzierung leicht als alle Varianten identifiziert werden können, die bei Männern (XY) vorhanden sind, aber bei Frauen (XX) fehlen. Zuvor identifizierte SNPs können durch einfache PCR und Sanger-Sequenzierung von DNA von Männchen und Weibchen schnell in ungenotypisierten Drosophila-Stämmen getestet werden. Darüber hinaus bedeutet die Verfügbarkeit von Drosophila-Stämmen mit einem X-Chromosom, das keinen rDNA-Locus¹⁶ hat, dass einzelne X- und Y-rDNA-Loci individuell isoliert werden können, um eine noch präzisere rDNA-SNP-Charakterisierung zu ermöglichen. Diese einfache Identifizierung von SNP-Varianten zwischen den Drosophila rDNA-Loci ermöglicht die Bestimmung eindeutiger X- und Y-rDNA-Loci, SNP-Haplotypen¹³. X-Chromosomen-rDNA-Loci sind bei Drosophila-Männchen in der Regel ebenfalls völlig stumm, aber beide X-Chromosomen-Loci werden bei Weibchen transkribiert^10,17, was Drosophila zu einem nützlichen System macht, um das locusweite rDNA-Silencing zu untersuchen.

Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um das Vorhandensein spezifischer RNA- oder DNA-Sequenzen in den einzelnen Zellen eines Gewebes sichtbar zu machen. FISH-Markierungen zielen auf RNA- oder DNA-Sequenzen durch Antisense-Oligonukleotidsonden ab, die an Fluorophore konjugiert sind. FISH-Sonden müssen in der Regel ~20 Nukleotide lang sein, um eine ausreichend stabile Zielbindung für die Visualisierung zu gewährleisten, aber Sonden dieser Länge können auch leicht an Nicht-Zielsequenzen binden, die sich nur durch ein einziges Nukleotid unterscheiden (Abbildung 1A). Umgekehrt binden Sonden, die kurz genug sind, um Einzelnukleotidspezifität zu verleihen, nicht stabil genug für die Visualisierung. Um Spezifität und Stabilität auszugleichen, kombiniert SNP-sensitives FISH (SNP-FISH) eine ~26 Nukleotid lange Antisense-Fluoreszenzsonde mit einem nicht-fluoreszierenden Sense-Masken-Oligonukleotid, das an alle außer dem 5'-Ende der Sonde¹⁸ bindet. Diese Maske lässt nur die 10 meisten 5'-Nukleotide der Sonde einzelsträngig und steht für die Zielbindung zur Verfügung (Abbildung 1B). Dieser kurze einzelsträngige Teil der Sonde verleiht dem Ziel Spezifität, verhindert aber eine Kreuzreaktivität mit RNAs, die auch nur eine einzige Fehlanpassung mit diesen 10 Nukleotiden aufweisen (Abbildung 1B). Sobald das 5'-Ende der Sonde ihr Ziel bindet, wird die Maske durch passive Strangverschiebung von der Sonde entfernt, sodass der 3'-Bereich das Ziel binden kann und eine stabile Zielmarkierung entsteht (Abbildung 1B)¹⁸. Daher kann SNP-FISH RNAs, die sich durch einen einzigen SNP unterscheiden, differentiell visualisieren, indem ein Sondenpaar verwendet wird, die unterschiedliche Fluorophore haben, die jeweils einen anderen SNP ergänzen, aber eine gemeinsame Maske haben (Abbildung 1C). Obwohl bei dieser Methode nur eine einzige Fluorophor-konjugierte Sonde an den Ziel-SNP rekrutiert wird, kann das Poolen mehrerer Sondenmaskensätze zu mehreren SNPs innerhalb eines gemeinsamen rDNA-Haplotyps verwendet werden, um den SNP-sensitiven Nachweis einer einzelnen rRNA zu amplifizieren (Abbildung 1D). Da rRNA so reichlich transkribiert wird, können rRNA-Transkripte in FISH-Experimenten mit einer kleinen Anzahl von Fluoreszenzmarkierungen pro RNA leicht sichtbar gemacht werden. Dieser geringe Bedarf an Fluorophoren pro RNA bedeutet, dass SNP-FISH rRNAs aus einem spezifischen Locus mit nur wenigen eindeutigen SNPs visualisieren kann. Mit dieser Methode kann die Locus-spezifische rRNA-Transkription in einer Vielzahl von Drosophila-Geweben und Entwicklungsstadien leicht nachgewiesen^{werden 17}. Es ist besonders wirksam in männlichen Keimbahnstammzellen von Drosophila, die während des Alters zwischen exklusiver Y-rDNA-Transkription und Co-Expression von X- und Y-Chromosomen-rDNA-Loci wechseln¹³. Hier stellen wir ein SNP-FISH-Protokoll zur Verfügung, um unterschiedliche X- und Y-rRNA-Transkripte im Drosophila-Hoden zu visualisieren und so das übergeordnete Ziel zu erreichen, das Locus-spezifische rRNA-Silencing zu bewerten. Bei dieser Methode werden vier SNPs verwendet, die zuvor zwischen den rDNA-Loci auf den X- und Y-Chromosomen des gemeinsamen y¹w¹ Laborstamms Drosophila charakterisiert wurden (Abbildung 1D).

Protocol

1. Vorbereitung von Puffern und Reagenzien

HINWEIS: In den Schritten 1, 3 und 4 ist eine RNase-freie Technik zu verwenden, und es sollten zertifizierte RNase-freie Reagenzien verwendet werden.

1. Bereiten Sie in einer chemischen Haube 40 ml 4 % Formaldehyd in 1x PBS-Fixierlösung vor, indem Sie 10 ml 16 % Formaldehyd und 4 ml RNase-freies 10x PBS zu 26 ml RNase-freiem Wasser hinzufügen. In 1 ml Aliquot verteilen und innerhalb von 30 Minuten nach der Zubereitung bei -20 °C lagern. Die Fixierlösung kann bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.
   ACHTUNG: Die Lösung enthält Formaldehyd. Mit Handschuhen und geeigneter PSA anfassen und sicher entsorgen.
2. Bereiten Sie 10 ml Hybridisierungspuffer vor, indem Sie 1 ml 20x RNase-freies Kochsalz-Natriumcitrat (SSC), 1 g Dextransulfat, 100 μl 100 mg/ml Saccharomyces cerevisiae tRNA, 100 μl 200 mM Vanadyl-Ribonukleosid-Komplex, 1 ml 5 % RNase-freies BSA, 1 ml deionisiertes Formamid in Kombination mit 6 ml RNase-freiem Wasser mischen. In 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen in 1 ml-Aliquots verteilen und bis zu 1 Monat bei -20 °C lagern.
3. Bereiten Sie 50 ml Waschpuffer vor, indem Sie 5 ml 20x RNase-freies SSC, 5 ml deionisiertes Formamid und 50 μl Triton-X zu 40 ml RNase-freiem Wasser hinzufügen. Bei Raumtemperatur im Dunkeln bis zu 1 Monat lagern.
4. Bereiten Sie 10 ml DNA-Isolationspuffer vor, indem Sie 100 μl 1 M Tris-HCl pH 7,5-8,0, 20 μl 0,5 M EDTA und 50 μl 5 M NaCl zu 9,8 mL Wasser hinzufügen.

2. Probengenotypisierung für X- und Y-spezifische rRNA-SNPs

1. Sammeln Sie einzelne, unverpaarte homozygote X-Weibchen und -Männchen mit demselben X-Chromosom in 0,2-ml-Röhrchen und kühlen Sie sie auf Eis.
2. Kombinieren Sie 50 μl DNA-Isolationspuffer mit 0,5 μl 20 mg/ml Proteinase K pro Probe.
3. Geben Sie 50 μl DNA-Isolationspuffer / Proteinase K in die Drosophila-Probe und homogenisieren Sie die Probe mit einer Pipettenspitze.
4. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei 37 °C, gefolgt von 95 °C für 2 Minuten. Übertragen Sie 40 ml Probe (vermeiden Sie tierische Ablagerungen) in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen.
5. Amplifizieren Sie jede SNP-Zielregion aus jeder DNA-Probe separat durch PCR unter Verwendung einer Konzentration von 10 μM der folgenden Primerpaare: 18S SNP Vorwärts + Rückwärts; ITS1 SNP Vorwärts + Rückwärts; 28S SNP Vorwärts + Rückwärts. Die Primersequenz und die erwartete PCR-Amplikongröße sind in Tabelle 1 aufgeführt.
6. Verwenden Sie die Gelelektrophorese, um die gesamte PCR-Probe auf einem 1%igen Agarose-1x TAE-Gel zu trennen, um das erwartete PCR-Produkt zu bestätigen. Die erwarteten Produktgrößen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
7. Isolieren Sie das PCR-Produkt aus dem Gel mit einem handelsüblichen Gelextraktionskit.
8. Sequenzieren Sie PCR-Produkte durch Sanger-Sequenzierung. Sequenzieren Sie die Proben in beide Richtungen mit separaten Einzelreaktionen für den F- und R-Primer für jedes Ziel.
9. Bestimmen Sie die X-Chromosomen-SNP-Variante an den Positionen in Tabelle 2 in einer unverpaarten weiblichen DNA-Probe. Der erwartete X-Haplotyp ist in Tabelle 2 beschrieben.
10. Beobachten Sie die SNP-Positionen im Chromatogramm der Sequenzierung männlicher DNA-Proben. Ableitung der Y-Chromosomen-SNP-Variante basierend auf der bereits bestimmten X-SNP-Variante an jeder SNP-Position. Der erwartete Y-Haplotyp ist in Tabelle 2 beschrieben.

Name der Grundierung	Reihenfolge	Erwartete Amplikongröße
18S SNP F	GACTACCATGGTTGCAACGG	652 bp
18S SNP R	TTCACCTCTCGCGTCGTAAT
ITS1 SNP F	CTTGCGTGTTACGGTTGTTTC	955 bp
ITS1 SNP R	ACAGCATGGACTGCGATATG
28S SNP F	ATGCGTAGAAGTGTTTGGCG	598 bp
28S SNP R	GCCGACTTCCCTTACCTACA

Tabelle 1: Primersequenzen für die Sequenzierung von rDNA-SNPs. Primerpaare zur Amplifikation von rDNA-Regionen, die zuvor charakterisierte SNPs in den 18S-, ITS1- und 28S-rDNA-Regionen enthalten. Die Primer-Oligonukleotidsequenz und die erwartete PCR-Amplikongröße sind aufgeführt.

Haplotyp	SNP-Position	Reihenfolge
X rDNA	18ER	1603-ATACTTGTATTTTTTCATATG-1625
	ITS1-1	2873-CGTTAATAAATATTTGTAATT-2895
	ITS1-2	3115-GAAAATCGAAGAAACAAAATT-3137
	28ER JAHRE	5932-AACAAAAATGCCTAACTATAT-5954
Y rDNA	18ER	1603-ATACTTGTATCTTTTCATATG-1624
	ITS1-1	2873-CGTTAATAAACATTTGTAATT-2895
	ITS1-2	3115-GAAAATCGAAAAAACAAAATT-3137
	28ER JAHRE	5932-AACAAAAATGGCTAACTATAT-5954

Tabelle 2: Erwartete rDNA-Haplotypen. Erwartete SNPs an rDNA-Loci des X- und Y-Chromosoms im y¹w¹ Drosophila-Stamm. SNP fett und unterstrichen dargestellt. Die aufgeführte Position basiert auf der Konsensussequenz 45S rRNA (Ergänzungsdatei 1).

3. Hodendissektion, Fixation und Permeabilisierung

1. Reinigen Sie das Stereomikroskop, den Arbeitsplatz, die Präparierschale und die Präparierzange mit 70 % Ethanol (oder einer anderen RNase-Behandlung).
2. Präparieren Sie Drosophila unter einem Stereomikroskop, um Hoden in 1x RNAse-freiem PBS zu isolieren. Fassen Sie mit einer Pinzette die Mitte des Bauches des Tieres und fassen Sie mit einer anderen Pinzette das Ende des Bauches, um das Tier vorsichtig auseinander zu ziehen. Die Hoden dissoziieren vom Tier und können mit einer Pinzette weiter getrennt werden. Sammeln Sie 30 - 40 Hoden pro Probe.
3. Nehmen Sie mit einer Pinzette Hoden auf und übertragen Sie sie aus der Präparierschale in ein 1,5-ml-Mikrofuge-Röhrchen, das 0,5 mL 1x RNase-freies PBS enthält.
4. Aspirieren Sie PBS und fügen Sie 1 ml Fixierlösung hinzu. Bei Raumtemperatur auf einem Nutenschüttler 30 Min. inkubieren. Fixiermittel aspirieren.
5. 2x mit 1 mL 1x RNase-freiem PBS für jeweils 5 min auf einem Nutating Shaker waschen. 1x PBS aspirieren und 1 ml RNase-freies 70%iges Ethanol (EtOH) hinzufügen. Über Nacht bei 4 °C auf einem Nutgießer inkubieren.

4. SNP-sensitive ribosomale RNA FISH

1. Aspirieren Sie Ethanol und fügen Sie 1 ml Waschpuffer hinzu. Inkubieren Sie 3 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Nutenschüttler, gefolgt von 2 Minuten aufrechter Röhre.
2. Mischen Sie Sonden und Masken mit Hybridisierungspuffer, wodurch ein Gesamtvolumen von 100 μl pro Probe entsteht. Sonde, Maskensequenzen und Fluorophormarkierungen sind in Tabelle 3 aufgeführt. Wenn Sie alle 4 SNPs verwenden, bereiten Sie 80 μl Hybridisierungspuffer, je 1 μl 10 μM Y-SNP-Sonde (insgesamt 4 μl), je 1 μl 10 μM X-SNP-Sonde (insgesamt 4 μl) und je 3 μl 10 μM gemeinsame Maske (insgesamt 12 μl) vor
3. Waschpuffer aspirieren und dann 100 μl Hybridisierungslösung hinzufügen. Die Ränder der Tube mit transparenter Folie bekleben, zum Schutz vor Licht in Alufolie einwickeln und mindestens 24 h in einem 37 °C warmen Wasserbad inkubieren.
4. Geben Sie 1 ml Waschpuffer in die Probe, ohne die Hybridisierungslösung zu aspirieren. In einem 37 °C warmen Wasserbad 30 min im Dunkeln inkubieren.
5. Aspirieren Sie den Waschpuffer und fügen Sie der Probe 1 ml Waschpuffer hinzu. In einem 37 °C warmen Wasserbad 30 min im Dunkeln inkubieren.
6. Aspirieren Sie den Waschpuffer und fügen Sie 50 μl Einbettmedium hinzu. Die Proben können sofort auf Objektträger montiert oder bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden, bevor sie montiert werden.

SNP-Position	Oligonucleotide	Reihenfolge		3' konjugiertes Fluorophor
18ER	X SNP-Sonde	AAAAAATACAAGTATTTAATCACATA		Alexa 488
	Y SNP-Sonde	AAAAGATACAAGTATTTAATCACATA		Alexa 647
	Maske	TATGTGATTAAATACT
ITS1-1	X SNP-Sonde	AAATATTTATTAACGGTAAGGATATT		Alexa 488
	Y SNP-Sonde	AAATGTTTATTAACGGTAAGGATATT		Alexa 647
	Maske	AATATCCTTACCGTTA
ITS1-2	X SNP-Sonde	GTTTCTTCGATTTTCATGTTCGAAAC		Alexa 488
	Y SNP-Sonde	GTTTTTTCGATTTTCATGTTCGAAAC		Alexa 647
	Maske	GTTTCGAACATGAAAA
28ER JAHRE	X SNP-Sonde	TTAGGCATTTTTGTTTTACTTGAAAA		Alexa 488
	Y SNP-Sonde	TTAGCCATTTTTGTTTTACTTGAAAA		Alexa 647
	Maske	TTTTCAAGTAAAACAA

Tabelle 3: Sonden- und Maskensequenzen für rDNA SNP-FISH. SNP-Positionen sind fett hervorgehoben. Der Sondenabschnitt, der an die Maske des Oligonukleotids bindet, ist unterstrichen. Beispiele für geeignete 3'-konjugierte Fluorophore sind aufgeführt, aber alle kompatiblen Fluorophore können verwendet werden.

5. Vorbereitung der Proben für die Bildgebung

1. Wenn Sie unter einem Präparier-Stereomikroskop arbeiten, verwenden Sie eine Pipette mit breiter Öffnung, um die Probe auf einen Objektträger zu übertragen.
2. Ordnen Sie die Hoden mit einer Pinzette in einer Linie an, um das Auffinden von Proben bei der Bildgebung zu erleichtern (keine bestimmte Ausrichtung erforderlich). Decken Sie das Muster mit einem Deckglas ab. Tupfen Sie die Ränder von Deckgläsern mit einem Taschentuch ab, um überschüssige Eindeckmedien zu entfernen.
3. Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit Nagellack. Lassen Sie den Nagellack 10 Minuten lang dunkel bei Raumtemperatur gleiten, damit er trocknen kann. Objektträger können sofort für die konfokale Bildgebung verwendet oder bis zu einem Monat bei 4 °C vor der Bildgebung gelagert werden^.

Results

Es wird erwartet, dass die Sequenzierungsergebnisse der SNP-Genotypisierung SNP-Unterschiede zwischen den X- und Y-rDNA-Loci aufdecken. Diese SNPs werden durch direkte Beurteilung der SNP-Positionen in Sequenzierungschromatogrammen nachgewiesen (Abbildung 2). Es wird erwartet, dass die Sequenzierung weiblicher Proben ein einzelnes Sequenzierungssignal an der SNP-Position aufweist, was auf eine SNP-Homozygotie zwischen den beiden X-Chromosomen hinweist (Abbildung 2A). Es wird erwartet, dass die Ergebnisse der Sequenzierung männlicher Proben einen doppelten Peak an der SNP-Position aufweisen (Abbildung 2B). Basierend auf dem X-Chromosomen-Genotyp, der durch die Sequenzierung weiblicher Proben bestimmt wurde, wird die Nicht-X-Variante als Y-Chromosomen-rDNA-SNP abgeleitet (d. h. X = T, Y = C für die 18S-SNP-Sequenzierung in Abbildung 2). Alternativ würde ein einzelner Sequenzierungspeak an einer SNP-Position in der männlichen Probe auf eine Homozygotie zwischen männlichen und weiblichen rDNA-Loci an dieser SNP-Position hinweisen, und diese Position wäre für rRNA SNP-FISH nicht verwendbar.

Gemäß dem Protokoll für SNP FISH können die Proben visualisiert werden, indem sie auf Objektträger montiert und unter ein versiegeltes Deckglas gelegt werden, gefolgt von einer konfokalen Mikroskopie. Unter Verwendung der in Tabelle 3 aufgeführten Sonden wird das Y-abgeleitete rRNA-Signal durch Alexa Fluor 647-Emission und das X-abgeleitete rRNA-Signal durch Alexa Fluor 488-Emission nachgewiesen. Es wird erwartet, dass rRNA-Signale im Nukleolus beobachtet werden, der als das DAPI-arme Loch im Zellkern identifiziert werden kann (Abbildung 3A). Der Nukleolus ist in Keimzellen aufgrund seines großen Zellkerns und Nukleolus besonders leicht zu identifizieren (Abbildung 3A). Das schwache Signal ist typischerweise auch im Zytoplasma zu finden (Abbildung 3), aber es handelt sich um ein unspezifisches Signal, das auch in Proben ohne rRNA nachgewiesen werden kann, die eine komplementäre SNP enthalten (d. h. Y-Signal in Zellen ohne Y-rDNA oder X-Signal in Zellen ohne X-rDNA; Abbildung 3B-C). Darüber hinaus kann die künstliche Co-Markierung von X- und Y-rRNA manchmal im somatischen Zentrum nachgewiesen werden, selbst in Proben, denen entweder X- oder Y-rDNA-Loci fehlen (Abbildung 3B-C, gelbe Pfeile). Daher sollten nur nukleäre Signale verwendet werden, um die Locus-spezifische Transkription zu beurteilen. Es wird erwartet, dass die meisten Zellen, insbesondere somatische Zellen, nur ein Y-rRNA-Signal haben, was darauf hindeutet, dass rRNA ausschließlich aus dem Y-rDNA-Locus transkribiert wird (Abbildung 3A, gelber gestrichelter Kreis und roter Pfeil)^10,17. Die Koexpression von X- und Y-rRNA wird jedoch häufig in Keimzellen nachgewiesen, insbesondere in Keimbahnstammzellen¹³ (Abbildung 3A, weiß gestrichelte Kreise). X- und Y-rRNA-Signale in co-exprimierenden Zellen können benachbart sein und einen einzelnen Nukleolus bilden (Abbildung 3A obere Zelle) oder getrennt sein und zwei Nukleolen bilden (Abbildung 3A untere Zelle). Die Beispiele in Abbildung 3 sind von rDNA SNP-FISH unter Verwendung von Sondensätzen, die auf nur zwei SNPs (die beiden ITS1-SNPs) abzielen, und zeigen, dass nur zwei SNPs für rDNA SNP-FISH erforderlich sind. Robustere Signale werden jedoch beobachtet, wenn Sonden verwendet werden, die auf alle vier SNPs^{abzielen 13}.

Negativkontrollen sind eine wichtige Ergänzung für diesen Assay, um zu bestätigen, dass Sonden nicht mit dem falschen SNP-Ziel kreuzreagieren, insbesondere bei der ersten Fehlerbehebung der Methode. Zu den Negativkontrollen des X-Chromosoms gehören alle Erkrankungen, bei denen die rDNA des X-Chromosoms fehlt, wie z. B. Männer, die ein X-Chromosom mit einer rDNA-Deletion besitzen. Es wird erwartet, dass die X-Chromosomen-Negativkontrollen nur das Y-rRNA-Signal und keine X-rRNA nachweisen (Abbildung 3B). Zu den Negativkontrollen des Y-Chromosoms gehören alle Erkrankungen, bei denen die rDNA des Y-Chromosoms fehlt. Einige Beispiele für diese Erkrankungen sind XX weibliche Gewebe, Gewebe von Männern, denen ein Y-Chromosom fehlt, oder Männer, die ein Y-Chromosom mit einer rDNA-Deletion^{besitzen 15}. Es wird erwartet, dass die Y-Chromosomen-Negativkontrollen nur das X-rRNA-Signal und kein nachweisbares Y-rRNA-Signal nachweisen (Abbildung 3C). Beachten Sie, dass diese Kontrollen nicht nur wichtig sind, um die Sondenspezifität zu bestimmen, sondern auch um Signalhintergründe oder Artefakte zu bestimmen. Alle neuartigen Sonden oder Assay-Bedingungen, die Spezifität in solchen Kontrollen gewährleisten, können genau zum Nachweis der locusspezifischen rDNA-Transkription verwendet werden.

Unterschiedliche genetische, Entwicklungs- oder Umweltbedingungen können die Wahrscheinlichkeit verändern, dass rDNA ausschließlich aus dem Y-Chromosomen-rDNA-Locus^13,17 transkribiert wird. Die Häufigkeit der rDNA-Transkription von einem einzelnen Locus oder mehreren Loci kann quantifiziert und direkt zwischen den Proben verglichen werden. Um Unterschiede in der Transkription des rDNA-Locus quantitativ vergleichen zu können, muss jede Zelle individuell als Y-dominant, Co-dominant oder X-dominant kategorisiert werden. Zellen werden nur dann als Y- und X-dominant kategorisiert, wenn nur das jeweilige Signal detektiert wird. Jede Zelle, die sowohl Y- als auch X-rRNA-Signale aufweist, gilt als co-dominant, auch wenn ein Signal viel schwächer ist als das andere. So werden Zellen, die sehr starke X- und Y-Signale enthalten, qualitativ genauso angesehen wie Zellen mit starken Y- und schwachen X-Signalen oder starken X- und schwachen Y-Signalen. Der Gesamtprozentsatz aller Zellen über alle Stichproben in jeder Kategorie hinweg kann zwischen den Stichproben durch einen Chi-Quadrat-Test verglichen werden. Während dieser Assay gut funktioniert, um qualitativ zu bestimmen, ob ein bestimmter rDNA-Locus transkribiert wird oder nicht, haben wir bei der direkten Quantifizierung der Fluoreszenzintensität einzelner SNP-FISH-Signale keine konsistenten Auswertungen zwischen den Proben beobachtet. Daher empfehlen wir nicht, die Intensität des FISH-Signals zwischen den Proben oder die relative Intensität der X- und Y-rDNA-Signale innerhalb einer einzelnen Zelle quantitativ zu bewerten. Die Ursache für diese Inkonsistenz in der Fluoreszenzintensität ist unklar, obwohl sie auf die ineffiziente Bindung von maskierten Sonden zurückzuführen sein könnte, die nicht an alle Ziel-rRNAs binden.

Abbildung 1: Diagramm der SNP-FISH-Methode. (A) Herkömmliche FISH-Antisense-Oligonukleotidsonden kreuzreagieren mit Nicht-Ziel-RNAs, die sich nur durch ein Nukleotid unterscheiden. (B) Bei der SNP-FISH-Methode wird ein komplementäres Masken-Oligonukleotid verwendet, das an die 3'-Region der Oligonukleotidsonde gebunden ist. Die Maske lässt nur 10 Nukleotide frei, die an die Zielsequenz binden können. Ein unmaskierter Sondenbereich bindet nicht stabil an Nicht-Zielsequenzen, die sich durch ein oder mehrere Nukleotide unterscheiden. Die Maske wird von der Sonde dissoziiert, nachdem die Sonde an das Ziel gebunden wurde, was eine stabile Bindung zwischen Sonde und Ziel ermöglicht. (C) Unterschiedlich markierte gepaarte SNP-Sonden in Kombination mit einer gemeinsamen Maske binden spezifisch Ziele, die sich durch ein einzelnes Nukleotid unterscheiden, ohne zu kreuzreagieren. (D) Mehrere Sonden können miteinander gepoolt werden, um spezifische rRNA-Haplotypen zu markieren. Vier SNP-Unterschiede wurden zwischen X- und Y-rDNA-Loci im y¹w¹ Drosophila melanogaster-Stamm charakterisiert. Ein SNP in der 18S rRNA, einer in der 28S rRNA und zwei im ITS1-Teil der prä-rRNA. X- und Y-spezifische rRNA-Haplotypen, die für SNP-FISH verwendet werden, werden angezeigt. Sonden, die auf die X-rDNA-Variante an den vier rRNA-SNPs abzielen, sind an ein gemeinsames Fluorophor (grün) konjugiert, und Sonden, die auf die Y-rDNA-Varianten abzielen, sind an ein anderes Fluorophor (magenta) konjugiert. Für jeden SNP wird eine gemeinsame Maske verwendet (insgesamt vier). Die SNP-spezifische Sondenbindung an jeder SNP-Position auf der rRNA kann rRNA aus den X- und Y-rDNA-Loci mit bis zu vier FISH-Oligonukleotidsonden spezifisch markieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Beispiele für homozygote und heterozygote rDNA-SNP-Sequenzierungsergebnisse. Beispiel: Sequenzierung von Chromatogrammen aus 18S SNP-Sequenzierung von DNA aus (A) weiblichen und (B) männlichen Proben. 18S SNP-Position, gekennzeichnet durch ein Sternchen (*). Das einzelne Thymin (T)-Signal für die SNP-Position in der weiblichen Probe deutet auf einen Thymin an der SNP-Position im rDNA-Locus des X-Chromosoms hin. Das Doppelsignal an der SNP-Position, aufgeteilt zwischen Thymin und Cytosin (C) in der männlichen Probe, deutet auf ein Cytosin an der SNP-Position im rDNA-Locus des Y-Chromosoms hin (abgeleitet aus dem Wissen, dass sich Thymin am X-Chromosomen-Locus befindet). Die Sequenzierungsergebnisse wurden mit ApE – einer Plasmid-Editor-Software¹⁹ – betrachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Beispiele für SNP-FISH-Ergebnisse im Drosophila-Hoden mit nur zwei SNP-FISH-Sondensets. SNP FISH-Beispiele in den Hoden von Tieren mit (A) sowohl X- als auch Y-rDNA, (B) nur Y-rDNA oder (C) nur X-rDNA. In diesen Beispielen wurden nur Sondensätze verwendet, die die beiden ITS1 rRNA-SNPs markierten, was zeigt, dass rRNA SNP FISH mit nur zwei Ziel-SNPs arbeitet. Keimzellen werden durch ihren großen runden Kern und somatische Zellen durch ihren kleineren und weniger runden Kern identifiziert. Keimbahnstammzellen sind an ihrer Position direkt neben der somatischen Nabe zu erkennen, die mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet ist. Keimzellen, die rDNA sowohl aus den X- als auch aus den Y-rDNA-Loci transkribieren, werden sowohl durch X- als auch durch Y-Kern-FISH-Signale identifiziert (weiße gepunktete Kreise, A-A''). Keimzellen, die DNA nur aus dem Y-rDNA-Locus transkribieren, haben nur ein Y-nukleäres FISH-Signal (gelber gestrichelter Kreis). Nur Y-exprimierende somatische Zellen sind mit einem roten Pfeil gekennzeichnet. Die künstliche Co-Markierung von X- und Y-rDNA-Loci ist in der somatischen Nabe (gelber Pfeil) zu beobachten. Der Maßstabsbalken beträgt 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: rRNA-Sequenz des X-Chromosomen-Locus. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Hier beschreiben wir eine Methode zur Verwendung von SNP-FISH zur Unterscheidung von 45S rRNA-Transkripten, die von den rDNA-Loci des X- und Y-Chromosoms in Drosophila melanogaster-Geweben abgeleitet sind. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die genaue Genotypisierung von 45S-SNPs, die als SNP-FISH-Ziele verwendet werden sollen. Wir stellen Primer und Protokolle für den Genotyp von vier bekannten Drosophila 45S-SNPs zur Verfügung, aber andere Sequenzierungsmethoden könnten neuartige SNPs aufdecken, die alternativ für den Assay verwendet werden könnten. SNP-Positionen, die sich zwischen den rDNA-Loci des X- und Y-Chromosoms als identisch erwiesen haben (d. h. es gibt einen einzigen Sequenzierungspeak in männlichen DNA-Proben), können nicht für SNP FISH verwendet werden. Einige SNP-Positionen können innerhalb eines einzelnen rDNA-Locus heterogen sein (d. h. die Sequenzierungsergebnisse geben keine einzige SNP-Variante für XX-Proben oder nur einen sehr geringen zweiten Sequenzierungspeak in XY-Proben an). SNPs, die innerhalb eines einzelnen rDNA-Locus heterogen sind, sind ebenfalls nicht für diesen Assay geeignet, da eine der Varianten von den beiden rDNA-Loci geteilt wird, wodurch die Transkription von einem einzelnen Locus oder mehreren Loci nicht unterscheidbar ist. Darüber hinaus kann aufgrund der Lagerung weiblicher Spermien²⁰ DNA, die von verpaarten Weibchen isoliert wurde, rDNA des Y-Chromosoms enthalten. Daher ist es wichtig, dass unverpaarte Weibchen für die XX-Sequenzierungsanalyse verwendet werden. Wichtig ist, dass diese Methode mindestens zwei chromosomenspezifische SNPs benötigt, um mindestens zwei locusspezifische Sonden in die Lage zu versetzen, jedes rRNA-Molekül für den Nachweis zu binden, wodurch ihre Anwendung auf rDNA-Loci mit mindestens zwei unterscheidenden SNPs zwischen ihnen beschränkt wird. Die Verfügbarkeit von mehr SNPs ermöglicht es, mehr Sonden an jede rRNA zu binden und kann eine höhere Signalwirksamkeit bieten. Interessanterweise markiert diese Methode nur rRNA im Nukleolus, obwohl zwei Sondenpaare auf SNPs in den 18S- und 28S-rRNAs abzielen, die in das Zytoplasma exportiert werden (rRNA, die die beiden ITS1-Zielstellen enthält, existiert nur im Nukleolus). Das Fehlen eines zytoplasmatischen FISH-Signals deutet auf zwei nicht-exklusive Möglichkeiten hin: 1) Die 18S- und 28S-Sonden allein reichen nicht aus, um zytoplasmatische rRNA nachzuweisen, möglicherweise weil die rRNA im Zytoplasma stärker verteilt ist als im Nukleolus, oder 2) es gibt eine geringere Bindungseffizienz der Sonde an rRNAs, die in die reifen ribosomalen Untereinheiten integriert sind, als an die unverarbeitete 45S-rRNA. Zusätzliche SNPs innerhalb der 18S- und 28S-rRNAs könnten den SNP-sensitiven FISH-Nachweis von zytoplasmatischen rRNAs ermöglichen.

Andere Methoden zur Beurteilung der locusspezifischen rRNA-Transkription umfassen rRNA-Sequenzierungsansätze, die die Expression von rRNA-Varianten differenzieren, die spezifischen Loci^{zugeordnet sind 6}. In ähnlicher Weise kann die qPCR die Expression von rRNA-Varianten, die eindeutig genug sind, um einen eindeutigen Nachweis zu ermöglichen, differenziell beurteilen ^5,21, obwohl unklar ist, ob das Silencing dieser Varianten das Silencing eines gesamten rDNA-Locus darstellt. Diese Methoden können zwar bei der Quantifizierung der Expression spezifischer rRNA-Varianten wirksam sein, aber nicht mit Einzelzellauflösung. Die Heterogenität des X-Chromosomen-rDNA-Silencings in Drosophila-Geweben deutet darauf hin, dass es eine starke Zell-zu-Zell-Variation in der rDNA-Locus-Transkription gibt¹⁷ und unterstreicht den Bedarf an Techniken, die diese Variabilität erklären können. Bildgebungsmerkmale, die mit der aktiven Transkription an rDNA-Loci assoziiert sind, wie die H3.3-Histonvariante¹⁰ oder der Pol-I-Transkriptionsfaktor UBF²², wurden verwendet, um die locusspezifische rRNA-Transkription mit Einzelzellauflösung zu identifizieren. Beide Methoden benötigen jedoch die kondensierten Chromosomen von mitotischen Zellen, um die Transkription an einem bestimmten rDNA-Locus zu unterscheiden. In Drosophila-Zellen können rDNA-Loci an den X- und Y-Chromosomen anhand der Chromosomenform¹⁰ identifiziert werden, aber die Identifizierung von transkriptionell aktiven rDNA-Loci in menschlichen Zellen erfordert auch eine Co-Färbung mit chromosomenspezifischen Markierungen²². Die SNP-FISH-Methode erfordert weder eine chromosomenspezifische Co-Markierung noch die Markierung von transkriptionellen Markern und kann in jedem Zellzyklusstadium oder in postmitotischen Zellen bewertet werden, was Flexibilität für den Einsatz in verschiedenen Geweben und experimentellen Bedingungen bietet.

Diese rRNA SNP-FISH-Methode kann für die Verwendung mit anderen SNPs, die zwischen Drosophila-rRNAs unterscheiden, modifiziert oder möglicherweise auf SNPs angewendet werden, die zwischen rDNA-Loci in anderen Organismen unterscheiden. Die Anwendung dieser Methode auf Organismen mit mehr als zwei rDNA-Loci erfordert, dass ein Locus einen einzigartigen rDNA-Varianten-Haplotyp aufweist, der mindestens zwei SNPs enthält, die auf keinem anderen rDNA-Locus vorhanden sind und die von allen 45S-Kopien an diesem Locus gemeinsam genutzt werden. Diese Anforderung bedeutet, dass die Methode nur in der Lage sein wird, die Transkription von einem spezifischen Locus im Vergleich zu allen anderen zu spezifizieren (d. h. rRNA-SNPs von Locus 1 im Vergleich zu SNPs, die von Loci 2 und 3 geteilt werden). Wenn jedoch jeder rDNA-Locus einen kompatiblen Haplotyp hat, könnten mehrere Experimente kombiniert werden, um die Transkription jedes Locus einzeln zu beurteilen. Die relativ geringe Stringenz der Hybridisierungstemperatur (37 °C), die in diesem Protokoll verwendet wird, ermöglicht eine starke Sondenbindung, insbesondere angesichts des kurzen, unmaskierten Teils der Sonde, obwohl gezeigt wurde, dass die Hybridisierung bei höheren Temperaturen (50-75 °C) das Signal einiger FISH-Sonden^{verstärkt 23}. Höhere Hybridisierungstemperaturen können die Verschiebung des Maskenstrangs verbessern und die Sondenbindung erhöhen, aber zu hohe Temperaturen können die Sonden-Masken-Bindung destabilisieren und die SNP-Spezifität verlieren. Aus diesem Grund erwarten wir nicht, dass SNP-FISH DNA spezifisch markiert, da die Temperaturen, die zum Schmelzen doppelsträngiger DNA-Ziele erforderlich sind, um die Sondenbindung zu ermöglichen, auch die Sonden-Masken-Bindung destabilisieren und die SNP-empfindliche Zielspezifität eliminieren würden. Dennoch kann die Optimierung der Hybridisierungstemperatur für neue rRNA-SNP-Sonden das Signal erhöhen, insbesondere wenn nur zwei SNP-Stellen verfügbar sind. Der Verlust des x-chromosomalen rDNA-Silencing ist mit einer Verringerung der rDNA-Kopienzahl in Drosophila¹³ verbunden, so dass die Entwicklung von SNP-FISH-Assays zur Charakterisierung der locus-spezifischen rRNA-Transkription in anderen Systemen als nützliches Werkzeug zur Bewertung der Integrität der rDNA und der Ribosomenfunktion dienen kann. Darüber hinaus wurde diese Methode für die Verwendung mit einer Deletionsvariante in Drosophila modifiziert, und diese einzelne strukturelle rRNA-Variante war für den Nachweis geeignet (möglicherweise aufgrund einer größeren Zielbindungsaffinität ohne Sondenmaske)¹⁷. Die Verwendung von strukturellen rRNA-Varianten, die möglicherweise mit SNP-Varianten kombiniert werden, erweitert das Potenzial für die Anwendung in anderen Systemen. Da die Mechanismen, die die Transkription des rDNA-Locus regulieren, weitgehend unklar sind, ist rRNA SNP-FISH aufgrund seiner Flexibilität und potenziellen Anpassungsfähigkeit an andere Systeme ein leistungsfähiges Werkzeug für zukünftige Studien zur Untersuchung der rRNA-Transkription.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PTC Tempo 96 Thermocycler	Bio Rad	12015382	Jeder Thermocycler kann verwendet werden
0,2 mL 8 Streifen Flatcap PCR-Röhrchen	VWR	89133-912	Alle kompatiblen Röhrchen können verwendet werden
1 kb DNA-Leiter	NEB	N3232S	Zur Verwendung bei der Überprüfung der Sequenzierung PCR-Amplikongröße durch Gelelektrophorese
1,5 mL graduierte Mikrozentrifugenröhrchen	USA Scientific	1615-5510	Jedes zertifizierte RNase-freie Röhrchen kann
2 mM dNTP Mix	ThermoFisher Scientific	R0241
50x TAE Buffer	Bio Rad	1610743	für die Gelelektrophorese verwenden. Es kann ein beliebiger TAE-Puffer verwendet werden.
5M NaCl			Jedes NaCl kann aus jeder Quelle verwendet oder hergestellt werden
Agarose	VWR	97064-250	Jedes Agarose kann verwendet werden
ApE - A plasmid Editor software	N/A	N/A
Klarer Nagellack			Jeder Nagellack von jedem Einzelhändler kann verwendet werden
Deckglas, Nr. 1 Dicke	Thomas Scientific	6672A38
Deionisiertes Formamid	Fisher Scientific	NC9569627
Dextransulfat Natrium	Sigma Aldrich	D8906-10G
DreamTaq Green PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	K1081
Dumont #5 Pinzette	Fine Science Tools	11252-20	Wird zum Präparieren von Proben
EDTA (0,5 M), Ph 8,0	verwendetThermoFisher Scientific	R1021	Jedes vergleichbare Produkt kann verwendet werden
Ethanol	VWR	89125-172	Jedes Ethanol mit 200 Proof kann verwendet werden. Wird zur Verdünnung auf 70 % Ethanol zur Permeabilisierung und Reinigung für Rnase-freie Bedingungen verwendet
Ethidiumbromid	ThermoFisher Scientific	15585011
Horizontales Mini-Gelelektrophoresesystem	Fisher Scientific	14-955-170	Jedes Gelelektrophoresesystem kann verwendet werden
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Mikrotest-Färbeschale	Electron Microscopy Sciences	71564	Wird zum Präparieren von Proben verwendet
Nutating Shaker	Sigma Aldrich	BMSB3D1020	Jeder Nutating Shaker kann verwendet werden
Parafilm	USA Scientific	3023-4526
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10X) pH 7,4, RNase-frei	Life Technologies	AM9624
Durchstechen 16% Formaldehyd (w/v), Methanolfrei	Life Technologies	28908
Präzisions-Allzweck-Wasserbad	Life Technologies	TSGP02	Jedes Wasserbad kann verwendet werden
QIAquick Gel-Extraktionskit	Qiagen	28704	Jedes Gel-Extraktionskit kann verwendet werden
Rekombinante Proteinase K-Lösung (20 mg/ml)	Invitrogen	AM2546	Jedes vergleichbare Produkt kann verwendet werden
Rnase-frei UltraPure BSA	ThermoFisher Scientific	AM2618
S. cerevisiae tRNA	Sigma Aldrich	R8759
SSC (20X), RNase-frei	Fisher Scientific	AM9763
Triton-X 100	Life Technologies	A16046.AE
UltaPure 1M Tris-HCl Puffer, pH 7,5	ThermoFisher Scientific	15567027	Jedes vergleichbare Produkt kann verwendet werden
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled	Water Life Technologies	10977023
Vanadyl-Ribonukleosid-Komplex	NEB	S1402S
VECTASHIELD Einbettmedien mit DAPI	Vector Laboratories	H-1200-10
VWR Superfrost Mikroskop Objektträger	VWR	48311-601
y[1]w[1] Drosophila melanogaster Linie	Bloomington Drosophila Stock Center	1495
Zeiss LSM 980 Konfokalmikroskop	Zeiss Mikroskopie		Jedes konfokale Mikroskop mit kompatibler Emission und Detektion kann verwendet werden
Zeiss Stemi 2000-C Stereomikroskop und Lichtquelle	Mikroskop Zentrales	455053	Jedes Stereomikroskop kann verwendet werden