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Methodenartikel

Ein robustes und reproduzierbares Protokoll zur Erzeugung von Neuralröhrenorganoiden aus einzelnen embryonalen Mausstammzellen.

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DOI:

10.3791/67883

⸱

19. Dezember 2025

 , 
1Vienna BioCenter, Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA), 2Vienna BioCenter PhD Program, Doctoral School of the University of Vienna and Medical University of Vienna

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dreidimensionale Neuralröhrenorganoide (NTOs), die aus embryonalen Mausstammen gewonnen werden, sind wertvolle Werkzeuge zur Untersuchung des zentralen Nervensystems während der frühen Entwicklung. Hier wird eine Schritt-für-Schritt-Demonstration eines optimierten Protokolls zur Kultivierung von NTOs in vitro präsentiert, das stabile Kulturbedingungen und Fehlersuchstrategien für eine zuverlässige, reproduzierbare NTO-Generierung bietet.

Zusammenfassung

Die Entwicklung von Säugetieren ist ein äußerst komplexer Prozess, der durch die Notwendigkeit präziser konzentrations- und zeitabhängiger Signalübertragung für korrekte Musterbildung und Morphogenese gekennzeichnet ist. Trotz erheblicher technologischer Fortschritte und gesammelten Wissens bleiben zahlreiche Aspekte der Säugetierentwicklung schwer fassbar. Bei der Untersuchung des gesamten Organismus wird es schwierig, die Auswirkungen einzelner Bahnen oder den Mechanismus zu entschlüsseln, durch den äußere Reize die Interferenz umgebender Gewebe und Faktoren steuern. Um diese Komplexität zu bewältigen, haben sich dreidimensionale (3D) In-vitro-Modelle wie Organoide als wertvolle Werkzeuge herausgebildet. Organoide, abgeleitet aus embryonalen Stammzellen (ESCs) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), zeigen gewebeähnliche Merkmale, die ihren in vivo Pendants hinsichtlich Expressionsmuster und Funktionalität sehr ähneln. Wichtig ist, dass sie Zugang zur Manipulation und umfangreiche biologische Studien in einem kontrollierten experimentellen Umfeld bieten. Obwohl sie aus pluripotenten Kulturen stammen, zeigen organoide Systeme oft Heterogenität und erhebliche Variabilität, was ihren Nutzen bei der Untersuchung komplexer und komplexer biologischer Fragestellungen einschränkt. Daher besteht ein dringender Bedarf an detaillierten Protokollen, die darauf abzielen, Verfahren zu harmonisieren, die zu hochwertigen, reproduzierbaren Daten, einer Reduzierung des verwendeten Materials führen und vor allem die Untersuchung komplizierter Phänomene ermöglichen. In diesem Zusammenhang wird hier ein optimiertes Protokoll zur Kultivierung von Neuralröhrenorganoiden (NTOs) in vitro vorgestellt. Durch die Schaffung stabiler Kulturbedingungen und umfassende Methoden zur Fehlersuche ermöglicht dieses Protokoll die zuverlässige und reproduzierbare Erzeugung von NTOs, die als geeignetes Modell dienen, um relevante wissenschaftliche Fragestellungen zu untersuchen, einschließlich der Mechanismen der neuronalen Induktion, Musterbildung und der frühen Entwicklung des zentralen Nervensystems.

Einleitung

Die Entwicklung von Säugetieren, ausgehend von einer einzelnen totipotenten Stammzelle, ist ein komplexer Prozess, der die Induktion von Musterbildung und Morphogenese 1,2 beinhaltet. Diese Entwicklung erfordert streng regulierte zelluläre Programme, um dynamische Interaktionen zwischen Zellen und ihrer Umgebung zu steuern. Stammzellen besitzen die intrinsische Fähigkeit, systemische und lokale Signale zu erkennen, zu integrieren und darauf zu reagieren, darunter Morphogengradienten3, mechanische Grenzen4, zelluläre Proliferation und Umweltumgestaltung5. Externe raumzeitliche Hinweise treiben zudem mehrzellige Reaktionen an, zunächst in homogenen Geweben, um die präzise Bildung komplexer Strukturen sicherzustellen. Stammzellen, die sich durch ihre Selbsterneuerung 6,7 und Differenzierungsfähigkeit auszeichnen, spielen eine entscheidende Rolle bei der embryonalen Entwicklung und der Reparatur von adultem Gewebe, wobei die Haupttypen embryonale Stammzellen (ESCs), adulte Stammzellen (ASCs) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) umfassen.

ESCs werden aus der inneren Zellmasse (ICM) einer Blastozyste extrahiert und typischerweise in einer zweidimensionalen (2D) Umgebung auf Feederzellen oder extrazellulären Matrixen kultiviert, wobei spezielle Kulturmedien verwendet werden, um ihre Pluripotenz8 aufrechtzuerhalten. In den letzten Jahren ist der Bedarf an realistischeren Zellkulturbedingungen und -technologien drastisch gestiegen, weshalb dreidimensionale (3D) Zell- und Gewebemodelle entwickelt wurden, um grundlegende biomedizinischeProzesse zu untersuchen. Insbesondere in der Entwicklungsbiologie bieten diese 3D-Modelle wie Organoide eine robuste Methode zur Modellierung von Gewebemorphogenese und Organogenese ex vivo9. Organoide entstehen durch Selbstorganisation proliferierender Stammzellen, die sich spontan zu komplexen 3D-Strukturen durch Symmetriebruch und Musterbildung entwickeln. Dieser Prozess ist ähnlich, wenn auch nicht identisch mit dem, was in vivo beobachtet wird, und findet meist ohne externe Steuerung, sondern durch interne Dynamiken und Wechselwirkungen angetrieben10. Da Organoide die Struktur und Funktion tatsächlicher Organe stark nachahmen, können sie eine genauere Darstellung der Säugetierbiologie bieten als traditionelle 2D-Zellkulturen11. Darüber hinaus ist einer der Hauptvorteile der ethische Vorteil, da Organoide den Bedarf an Tiermodellen verringern und damit Bedenken im Zusammenhang mit Tierversuchenadressieren 12,13. Darüber hinaus bieten Organoide eine Plattform für Hochdurchsatz-Drogenscreenings und verbessern die Vorhersage der Wirksamkeit und Toxizität von Medikamenten. Es gibt jedoch auch mehrere Herausforderungen bei der Verwendung von Organoiden. Obwohl sie realistischer sind als 2D-Kulturen, reproduzieren sie nicht vollständig die Komplexität und Interaktionen ganzer Organe innerhalb eines lebenden Organismus14. Zusätzlich kann eine signifikante Variabilität zwischen Organoiden beobachtet werden, selbst wenn sie aus demselben Zelltyp stammen, was zu Inkonsistenzen in den experimentellen Ergebnissen führt15. Daher ist die robuste und reproduzierbare Kultivierung von Organoiden unerlässlich und erfordert fortgeschrittene technische Fähigkeiten, spezialisierte Ausrüstung und detaillierte Protokolle.

Das Nervensystem ist ein komplexes Netzwerk, das für die Koordination von Handlungen und die Verarbeitung sensorischer Informationen verantwortlich ist, indem es Signale im ganzen Körper sendet und empfängt und so alle erforderlichen Funktionen steuert und koordiniert, einschließlich Bewegung, Empfindung, Denken und autonomen Funktionen wie Herzschlag und Verdauung. Der Vorläufer des zentralen Nervensystems, bestehend aus Gehirn und Rückenmark, ist das Neuralrohr. Es ist entscheidend zu verstehen, wie neuronale Strukturen sich in der frühen Neuralrohrentwicklung bilden und funktionieren, um Einblicke in verschiedene neurologische Störungen und Entwicklungsauffälligkeiten zu gewinnen. Neuroentwicklungsstörungen sind schwer in vivo zu untersuchen, insbesondere wenn sie aus ethischen Gründen von menschlichen Probanden stammen. Neuronale Organoide, wie Hirnorganoide16,17, haben das Verständnis der Entwicklung und Krankheit des Nervensystems erheblich verbessert, indem sie vielseitige, zugängliche Modelle bereitstellen, die menschliches Gehirngewebe eng nachahmen. Diese dreidimensionalen Strukturen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen (PSCs), replizieren verschiedene Aspekte der Gehirnentwicklung, darunter die Bildung unterschiedlicher Hirnregionen, zelluläre Vielfalt und komplexe neuronale Netzwerke 16,18,19. Indem sie Forschern ermöglichen, Entwicklungsstadien in Echtzeit zu beobachten und wichtige regulatorische Mechanismen zu untersuchen, bieten diese Organoide tiefgehende Einblicke in die normale Gehirnentwicklung. Hirnorganoide ermöglichen auch die Modellierung von neuroentwicklungsbedingten19- und neurodegenerativenErkrankungen 20, wie Mikrozephalie16,21, Zika-Virus-Infektion22, Autismus-Spektrum-Störungen23 und weitere, wobei Krankheitsmechanismen aufgeklärt und potenzielle therapeutische Ziele identifiziert werden. Darüber hinaus dienen Gehirnorganoide als wertvolle Plattformen für Arzneimitteltests und -entwicklungen, erleichtern die Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von Medikamenten in einer menschlichen hirnähnlichen Umgebung und beschleunigen personalisierte medizinische Ansätze. Darüber hinaus bieten sie einen kontrollierten Rahmen zur Untersuchung von Gen-Umwelt-Interaktionen und verbessern so das Verständnis komplexer Krankheiten, die aus dem Zusammenspiel genetischer und Umweltfaktoren entstehen. Da neuronale Organoide, ähnlich wie Gehirnorganoide, typischerweise aus Zellaggregaten gebildet werden, zeigen sie oft eine signifikante zelluläre Heterogenität und Variabilität in experimentellen Ergebnissen, was wiederum die Interpretierbarkeit der generierten Daten beeinflusst undfür Forscher eine erhebliche Herausforderung darstellt. Aus diesem Grund sind Protokolloptimierung und präzise Qualitätskontrollkriterien entscheidend für die Abschwächung wertvoller Daten, die den Zustand in vivo angemessen repräsentieren.

Meinhardt und Kollegen24 erzielten einen entscheidenden Einfluss, indem sie erstmals ein klonales neuronales Organoid-Protokoll berichteten, das die frühe Entwicklung von Neuralröhren nachahmt, gebildet aus einzelnen embryonalen Stammzellen (ESCs), das die Heterogenität zwischen den Organoiden drastisch minimiert. Diese Innovation ermöglicht es Forschern, Entwicklungsprozesse und -mechanismen sowie neuronale Musterbildung in einer präzisen und definierten Umgebung mit außergewöhnlicher Auflösung zu untersuchen. Bis jetzt haben viele Labore neuronale Organoide entwickelt, meist Maus- oder menschlichen Ursprungs, die verschiedene Teile des Neuralröhrchens und dessen Entwicklung nachahmen, wie in25 zusammengefasst. Basierend auf den verfügbaren Informationen ist das von Meinhardt et al.24 etablierte Protokoll jedoch die einzige Methode, bei der NTOs zuverlässig aus einer einzelnen Zelle entstehen, sich selbst organisieren und effizient in dorsoventrale Schicksale übergehen, nachdem ein einziger, globaler Puls von Retinsäure (RA) ohne zusätzliche ventralisierende Faktoren wie Sonic Hedgehog Agonist (SAG)26 hinzugefügt werden muss, oder die Verwendung von mikrofluidischen Kammern, die durch Gradientenbildung räumliche Informationen liefern. Das hier bereitgestellte Protokoll wurde von Meinhardt et al.24 übernommen, wie es in Krammer et al.26 dargelegt wurde. In diesem Protokoll werden einzelne Maus-ESCs in einer Zellkulturmatrix eingepflanzt und definierten neurodifferenzierbaren Bedingungen ausgesetzt. Innerhalb von zwei Tagen expandieren und epithelialisieren sich diese Zellen klonal, wodurch eine 3D-runde-zu-ellipsoide Struktur mit einem einzelnen Lumen und apikal-basal geschichteten Zellen entstehen. Am zweiten Tag verstärkt ein global angelegter 18-Stunden-Puls des Signalmoleküls RA die neuronale Differenzierung, posteriorisiert die NTOs vom Mittelhirn auf das Hinterhirn-/Halswirbelmarksniveau und induziert bis Tag 6 die Bildung einer einzigen, funktionalen Bodenplatte, die das NTO von ventral nach dorsal formt.

Das optimierte Protokoll bietet mehrere wichtige Vorteile. Es ermöglicht eine robuste Epithelialisierung innerhalb der ersten drei Tage und erzeugt relativ kleine, kugelförmige Gewebe mit einem Durchmesser von etwa 200 μm, von denen jedes ein einziges Lumen enthält. Die Organoide entstehen klonal aus Einzelzellen und werden in einem serumfreien, chemisch definierten Kulturmedium erhalten. Innerhalb von sechs Tagen wird eine allmähliche neuronale Differenzierung von pluripotenten Kulturen erreicht, was zu Organoiden führt, die bis Tag 6 eine anteriore Mittelhirnidentität zeigen, sowie dorsoventral gemusterte hinterhirn- oder zervikale Rückenmarksähnliche Strukturen nach einem globalen RA-Puls26.

Mehrere Aspekte wurden angepasst und unterscheiden sich vom ursprünglichen Protokoll22,25, um die Reproduzierbarkeit und den Durchsatz zu verbessern. Dazu gehören modifizierte ESC-Kulturbedingungen, eine reduzierte Anzahl von Eingabezellen, ein verbessertes Differenzierungsmedium und ein angepasstes Differenzierungsprotokoll, das an den Tagen 0-2 (bereits in26 verwendet) auf die Noggin-Supplementierung verzichtet. Darüber hinaus wurde die Aussaatdichte für den Einsatz in 96-Brunnenplatten optimiert, was eine Analyse mit hoher Durchsatz ermöglicht. Zusammen haben diese Verbesserungen zu einer Steigerung der Effizienz bei NTO-Bildung und -Musterung um 40 % geführt, von ursprünglich ~40 % auf heute ~80 % in der aktualisierten Version.

Hier (Abbildung 1) wird eine detaillierte Beschreibung eines optimierten Protokolls bereitgestellt, das eine robuste und reproduzierbare Erzeugung von NTOs in einer Zellkulturmatrix ermöglicht. Das Protokoll umfasst alle Phasen der NTO-Handhabung, von der ersten Aussäung von ESCs für Differenzierungstests bis hin zur anschließenden Wartung, Fixierung und Analyse. Es enthält außerdem Richtlinien zur Qualitätskontrolle durch tägliche visuelle Bewertung der NTO-Morphologie sowie eine kritische Charakterisierung der Organoid-Identität mittels Antikörperfärbung, um korrekte Musterbildung und neuronale Differenzierung zu überprüfen. Darüber hinaus werden umfassende Fehlerbehebungsmethoden angeboten, die eine kritische Bewertung in jedem Schritt des Protokolls ermöglichen, was notwendig ist, um die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der experimentellen Protokolle sicherzustellen. Diese detaillierten Anweisungen helfen dabei, potenzielle Probleme zu identifizieren und zu lösen, Fehler zu minimieren und Ergebnisse zu optimieren. Dies ist entscheidend, um die Integrität wissenschaftlicher Experimente zu erhalten und anderen Wissenschaftlern zu ermöglichen, die Arbeit erfolgreich zu replizieren und umfassende Schlüsse aus den generierten Daten zu ziehen, wodurch das Fachgebiet vorangebracht wird.

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Abbildung 1: Überblick über das Protokoll. (A) Passaging von ESCs (siehe Schritt 1.1). (B) Aliquotierung der Zellkulturmatrix und Aussäen einzelner ESCs zur Differenzierung in NTOs (siehe Schritt 1.2). (C) Aliquotierung von RA und RA-Behandlung (siehe Schritt 2). (D) Entfernung der RA und Routine des täglichen Medium-Austauschs (siehe Schritt 3). Diese Figur wurde mit BioRender.com erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Protokoll

HINWEIS: Überprüfen Sie Zellen und NTO täglich auf Qualitätsbewertung vor weiteren Eingriffen (Mittelersatz, Behandlung, Fixierung usw.). Alle Verfahren, die eine direkte Exposition der Zellen mit Luft erfordern, müssen in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden, um die Sterilität zu gewährleisten und eine Kontamination der Kultur zu verhindern.

1. Pflege, Passaging und Auszaat von Maus-ESCs zur NTO-Differenzierung

  1. Passaging
    1. Halten Sie ESCs auf Zellkulturschalen oder Brunnen einer 6-Well-Platte, die mit 0,15 % Gelatine vorbeschichtet sind, 30 Minuten lang bei 37 °C.
    2. Lasse ESCs alle 2-3 Tage durch, mit täglichem mittlerem Austausch ab Tag 2.
    3. Alle Reagenzien (Medium, PBS, Enzymlösung) vor der Anwendung auf mindestens 21 °C und maximal 37 °C vorwärmen.
    4. Untersuchen Sie Zellen unter dem Phasenkontrastmikroskop (siehe repräsentative Bilder, Abbildung 2). Stellen Sie sicher, dass die Kolonien eine angemessene Größe und richtige Morphologie haben (Abbildung 2A), und stellen Sie gleichzeitig sicher, dass sie am Boden der Schale festhalten.
      HINWEIS: Entsorgen Sie die Kultur, wenn mehr als 10 % der Maus-ESCs differenziert sind (Abbildung 2B), und bereiten Sie eine frisch aufgetaute Kultur vor, die Sie mindestens zweimal durchlaufen sollten, bevor Sie ESCs für einen Differenzierungstest aussäen. Erfahrene Forscher können durch visuelle Beurteilung (siehe auch Mulas et al.28) oder mittels Antikörperfärbung für die Markerexpression (z. B. OCT4, siehe auch Ying et al.29) beurteilen.
    5. Öffne den Deckel der Kulturschale/Platte, neige ihn leicht und aspiriere vorsichtig das Medium. Haltet die Zellen so kurz wie möglich aus dem Inkubator fern. Bewahren Sie die Zellen so kurz wie möglich ohne Medium auf, um das Austrocknen der Kultur zu vermeiden.
    6. Waschen Sie die Kolonien mit 500 μL vorgewärmtem PBS (in einer einzigen Welle einer 6-Well-Platte zu den Zellen hinzufügen) und aspirieren Sie sofort erneut.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, weil: i) die Übertragung des ESC-Mediums (2iLIF) vor dem Differenzierungstest vermieden werden muss (oder die NTO-Bildung behindert wird), ii) FBS oder BSA im Kulturmedium die Dissoziation stoppen können. Dies gilt für ESCs, die in einem anderen ESC-Medium kultiviert werden und FBS oder BSA enthalten.
    7. Fügen Sie 500 μL vorgewärmte Enzymlösung hinzu und bringen Sie die Zellen zurück in den Inkubator.
    8. Zellen bei 37 °C 3 Minuten lang mit einem Timer inkubieren.
    9. Nach der Inkubationszeit nehmen Sie die Platte heraus und untersuchen Sie die Zellen unter dem Phasenkontrastmikroskop.
      HINWEIS: ESCs sollten sich von der Kulturplatte lösen lassen; Falls nicht, klopfen Sie fest, aber vorsichtig auf die Schale oder den Teller (Abbildung 2C).
    10. Fügen Sie 1 ml N2B27-Medium (Tabelle 1) hinzu, indem Sie es direkt auf die Zellen pipettieren.
      HINWEIS: Bei der Herstellung von Medium (N2B27) wird Glutamin maximal 5–10 Minuten bei 37 °C und vorzugsweise bei Zimmertemperatur aufbewahrt. ESCs sollten vom Teller abgewaschen werden, sodass 'leere' Bereiche in der Kulturschale bleiben.
    11. Verwenden Sie eine P1000-Pipette und kippen Sie die Platte leicht, sodass alle Kolonien, die an der Kulturschale kleben, abgewaschen werden können.
    12. Um Zellklumpen zu dissoziieren, kippen Sie die Platte leicht, legen Sie die Pipettenspitze (P1000) in die Mitte der Schale an, drücken Sie die Spitze gegen den Boden der Schale jedoch leicht außerhalb der senkrechten Achse und spülen Sie die Zellen aus. Wiederhole das fünf- bis zehnmal, um die Zellklumpen zu durchbrechen.
    13. Überprüfen Sie, ob die Zellen unter dem Phasenkontrastmikroskop richtig in einzelne Zellen dissoziiert sind (Abbildung 2D), und wiederholen Sie, ob noch Klumpen vorhanden sind.
    14. Nach vollständiger Dissoziation wird die Zellsuspension in ein sauberes, steriles 15-mL konisches Zentrifugenrohr überführt, das leere Bohrloch, in dem die Zellen kultiviert wurden, mit 1 mL N2B27-Medium gewaschen und mit der Zellsuspension in dasselbe konische Zentrifugenrohr übertragen.
    15. Spinne die Zellen für 5 Minuten bei 453 x g in einer Ultrazentrifuge.
    16. Atmen Sie vorsichtig das Überwassermittel ab.
    17. Die Zellen in einer angemessenen Menge N2B27-Medium (z. B. 1 mL) wieder suspendieren und die Zellen zählen (siehe Tabelle 2 für empfohlene Zellzahlen für den Differenzierungstest in NTOs).
  2. Differenzierung von ESCs in Neuralröhrenorganoide (NTOs)
    1. Aliquotierende Zellkulturmatrix
      1. Taue die Flasche mit der Zellkulturmatrix über Nacht auf Eis bei 4 °C auf (niemals bei Raumtemperatur oder Handauftauen). Lassen Sie die Zellkulturmatrix nicht länger als nötig bei 4 °C stehen; Aliquot und Freeze so schnell wie möglich, um seine Funktionalität zu erhalten.
      2. Im Biosicherheitsschrank stellen Sie 1,5–2 ml Mikrozentrifugenröhren auf Eis, um sie vorzukühlen, während die Zellkulturmatrixflasche auf frischem Eis bleibt.
      3. Mischen Sie die aufgetaute Zellkulturmatrix vorsichtig, um Blasenbildung zu vermeiden, da Blasen nach der Gelelatinierung eine Ablösung vom Brunnen oder der Schale verursachen können.
      4. Aliquot-Zellkulturmatrix im gewünschten Volumen (empfohlen 0,5–1 mL) und bei -20 °C einfrieren und bis zur weiteren Verwendung einfrieren. Vermeiden Sie es, die Spitze zwischen den Aliquots zu ersetzen, da Spitzen bei Raumtemperatur dazu führen können, dass die Zellkulturmatrix im Inneren erstarrt, was zu einem erheblichen Verlust führt. Stattdessen kühlen Sie die Pipettenspitzen auf 4 °C ab, indem Sie sie vor der Verwendung im Kühlschrank aufbewahren.
    2. Aussäen einzelner Zellen in einer Zellkulturmatrix
      1. Quantifizieren Sie die Anzahl der benötigten Zellen (100 Zellen/μL Zellkulturmatrix, siehe Tabelle 2).
      2. Übertragen Sie die entsprechende Zellnummer (Zellsuspension) in ein sauberes 15 mL konisches Zentrifugenrohr und füllen Sie es mit 1 mL N2B27 nach.
      3. Spinne die Zellen für 5 Minuten bei 453 x g in der Zentrifuge.
      4. Saugen Sie das Überstandsmittel ab und legen Sie das konische Zentrifugenrohr auf Eis.
      5. Lassen Sie das Zellpellet vorsichtig auf Eis in einer angemessenen Menge aufgetauter und flüssiger Zellkulturmatrix aufhängen, ohne die Bildung von Blasen zu vermeiden.
      6. Verteilen Sie die passende Menge an Zellkulturmatrix-Zellsuspension in einer dünnen Schicht auf eine Glasboden- oder Kunststoffbodenschale, die optimal für die Bildgebung geeignet ist (siehe Tabelle 2, Abbildung 3A-C), ohne die Wände von Mehrfachbrunnenplatten zu berühren. Aufgrund der hohen Oberflächenspannung kann der Tropfen der Zellkulturmatrix vom Zentrum des Lochs zu den Wänden wandern, wenn er zuvor berührt wurde, was zu einer unzureichenden Verteilung von Zellen/NTO führt.
        HINWEIS: Bei Verwendung von Mehrwellplatten: Zeichnen Sie zunächst einen Kreis der Zellkulturmatrix mit einer P20- (96-Well-Platte) oder einer P200-Pipettenspitze, bevor Sie sie mit der Zellkulturmatrix-Zellsuspension "füllen" (Abbildung 3B).
      7. Stellen Sie die Mehrfach-Brunnenplatte/-schüssel bei 37 °C in den Inkubator, damit die Zellkulturmatrix fest werden kann. Schätzung von 1 Minute pro μL Zellkulturmatrix für kleinere Mengen und maximal 15 Minuten für 40 μL oder mehr.
      8. Nach der Inkubationszeit nehmen Sie den Teller heraus und fügen Sie ein entsprechendes Volumen Medium hinzu (siehe Tabelle 2). ESCs in der Zellkulturmatrix dürfen während der Aussaat für den Differenzierungstest in NTO oder beim Austausch des Mediums nicht austrocknen. Nach der Jellifikation muss das Medium so schnell wie möglich aufgetragen werden. Die Jellifikation ist typischerweise in 1 Minute bei 37 °C pro 1 μL Zellkulturmatrix abgeschlossen und maximal 15 Minuten bei 40–100 μL Zellkulturmatrix, wenn sie als dünne Schicht aufgetragen wird.
        HINWEIS: Um das Austrocknen der ESCs in der Zellkulturmatrix zu vermeiden, sollten maximal 8 Brunnen einer 96-Bohrloch-Platte mit einer Mehrkanalpipette oder einer 35-mm-Glasboden-Schelle/-Brunne jeder anderen Mehrfach-Bohrlochplatte behandelt werden. Haltet die Zellen so kurz wie möglich aus dem Inkubator fern.
      9. Überprüfen Sie die Saatdichte und Zellverteilung innerhalb der Zellkulturmatrix unter dem Phasenkontrastmikroskop (Abbildung 3C, D). Die optimale Aussaatdichte wird empfohlen (Tabelle 2 und Abbildung 3). Für bestimmte Anwendungen, wie etwa frühe Analysen, kann eine bis zu zehnmal höhere Aussaatdichte jedoch vorteilhaft sein.
        HINWEIS: Mischen Sie die Zellkulturmatrix-Zellsuspension sorgfältig durch Resuspendierung mit einer P300- oder P1000-Pipettenspitze, bevor Sie für den Differenzierungstest aussäen, um die Zellzahlenvariabilität zwischen Brunnen/Schalen auszugleichen. Dieser Schritt wird nicht empfohlen, bevor jeder einzelne Brunnen ausgesaat wird, um den Verlust der Zellkulturmatrix zu verhindern, da dieser verfestigen und an der Pipettenspitze haften kann.

Tabelle 1: Mittlere Komponenten (N2B27 Basis, 2iLIF, N2B27 Differential). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Informationen zur Zellanzahl pro Schüssel, Menge der Zellkulturmatrix, Volumen des Mediums und Jellifikationszeit. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

2. RA-Behandlung von NTOs zur Verbesserung der neuronalen Differenzierung sowie zur Induzierung von Posteriorisation und Ventralisation

  1. Aliquotierende Retinsäure (RA)
    1. Bringen Sie All-Trans-RA-Pulver auf Raumtemperatur (bei -20 °C gelagert).
    2. Pulver wird in einem geeigneten Volumen DMSO rekonstituiert, um eine Endkonzentration von 100 mM zu erreichen.
    3. Aliquot 1 μL 100 mM RA in jeweils ein 1,5 mL Schraubdeckel-Fläschchen.
    4. Fügen Sie Argongas hinzu, bis das Rohr 'voll' ist.
      HINWEIS: Da Argongas schwerer als Sauerstoff ist, sinkt es an den Boden des Rohrs, um RA von der Luft abzudecken und zu bewahren. Das kann man an den Händen spüren, wenn es ausläuft, wenn das Rohr voll ist.
    5. Schließe das Fläschchen fest. RA ist sehr empfindlich gegenüber Licht und Luft.
    6. Lagere Aliquots im Dunkeln bei -80 °C bis zur weiteren Nutzung auf. Alternativ kann rekonstituiertes RA in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhren in flüssigerN2 gelagert werden.
      HINWEIS: Rekonstituiertes und verdünntes RA kann maximal 2 Tage im Kühlschrank aufbewahrt werden, wenn es mit Folie abgedeckt ist.
  2. RA-Behandlung von NTOs für 18 Stunden (Abbildung 4A)
    1. Entnehmen Sie 1 μL des Aliquot mit einer Konzentration von 100 mM aus -80 °C und lassen Sie es im Dunkeln aufbewahren, bis es bei Raumtemperatur aufgetaut ist (z. B. in der Handfläche oder in einem Röhrengestell in einem Biosicherheitsschrank ohne Licht).
      HINWEIS: Wenn RA-Aliquoten in Flüssigkeit N2 gelagert werden, öffnen Sie sofort den Deckel des Mikrozentrifugenrohrs, um eine Explosion des Röhrchens zu vermeiden, schließen Sie es erneut und fahren Sie mit Schritt 2.2.2 fort.
    2. Nach dem Auftauen geben Sie 400 μL vorgewärmtes N2B27diff-Medium für eine Konzentration von 250 μM mit einer P1000-Pipette hinzu. Gründlich mischen, um Homogenität zu erreichen.
      HINWEIS: Alternativ kann RA in reinem DMSO anstelle von N2B27diff-Medium rekonstituiert und verdünnt werden, wobei dies die Konzentration von DMSO in der Kultur erhöht. Bei der Herstellung eines Mediums (N2B27diff) wird Glutamin maximal 5–10 Minuten bei 37 °C und vorzugsweise bei Raumtemperatur aufbewahrt.
    3. Nehmen Sie Teller/Teller mit wachsenden NTOs aus dem Inkubator heraus und legen Sie sie in einen sterilen Biosicherheitsschrank.
    4. Untersuchen Sie die wachsenden NTOs unter dem Phasenkontrastmikroskop. Die Morphologie der NTOs ist entscheidend, um Informationen über die Lebensfähigkeit der Kultur und die Wirksamkeit des Experiments zu liefern (Abbildung 4B-D).
    5. Nehmen Sie den Deckel des Tellers/der Schüssel ab und kippen Sie den Teller leicht zur Seite. Aspirieren Sie das Medium sorgfältig, entweder mit einer P200-Pipette oder einem Aspirator, ohne die Zellkulturmatrix zu stören. Halte NTOs so kurz wie möglich ohne Medium, um ein Austrocknen der Kultur und/oder der Zellkulturmischung zu vermeiden.
    6. Fügen Sie ein geeignetes Volumen N2B27diff hinzu, ergänzt mit einer 250 nM RA-Lösung (siehe Tabelle 2), decken Sie mit dem Deckel ab und bringen Sie die NTOs zurück in den Inkubator.
      HINWEIS: Manchmal, besonders wenn die RA nicht vollständig gemischt wurde, können sich Niederschläge bilden, die sich im normalen N2B27diff schwerer auflösen lassen. In diesem Fall verwerfen Sie den Aliquot und erstellen Sie neue RA-Aliquots, da diese Niederschlage eine unbekannte und unkontrollierte RA-Konzentration haben.

3. RA-Entfernung und Routine des täglichen Medium-Austauschs von NTO

  1. Übertragen Sie die Kulturplatte vom Inkubator in den sterilen Biosicherheitsschrank.
  2. Nimm den Deckel ab und kippe den Teller leicht zur Seite.
  3. Aspirieren Sie vorsichtig N2B27diff mit RA, entweder mit einer P200-Pipette oder einem Aspirator, ohne die Zellkulturmatrix zu berühren.
  4. Fügen Sie vorgewärmtes PBS hinzu (verwenden Sie genug Menge, um den Tropfen der Zellkulturmatrix zu bedecken oder wie in Tabelle 2 beschrieben), kippen Sie die Platte erneut und entfernen Sie sie vorsichtig, um die übrig gebliebene RA auszuwaschen.
  5. Fügen Sie ein geeignetes Volumen N2B27diff (wie in Tabelle 2 beschrieben) hinzu, indem Sie das Medium entlang der Wand des Brunnens/der Schale pipettieren, um eine Beschädigung des Tropfens der Zellkulturmatrix zu vermeiden.
  6. Ersetze das Medium täglich nach den Schritten 3.1-3.3 und gib dann vorsichtig frisches, vorgewärmtes N2B27Diff hinzu, indem du das Medium an die Wand des Brunnens/der Schale pipettierst, bevor du die NTO wieder in den Inkubator zurückgibst. Direktes und kräftiges Pipetieren oder das Hinzufügen von kaltem Medium/PBS auf den Tropfen der Zellkulturmatrix kann zu einem Brüch und Ablösen von der Platte/Schale führen.
    HINWEIS: Beim Stören von Signalwegen durch die Verwendung kleiner Moleküle oder rekombinanter Proteine ist es wichtig, das Medium täglich zu ersetzen. Wenn Medikamente länger als einen Tag angewendet werden sollen, müssen die Arzneimittellösungen täglich frisch oder mindestens alle zwei Tage hergestellt werden, um die Stabilität von Proteinen und Medikamenten sowie das anhaltende Vorhandensein der korrekten Konzentrationen zu gewährleisten.

4. Fixierung von NTOs

HINWEIS: NTOs sind wie von Krammer et al.26 beschrieben festgelegt. Je nach verwendetem Antikörper kann PFA aus verschiedenen Quellen (im Lagerhaus, intern usw.) benötigt werden.

  1. Tau PFA über Nacht bei 4 °C auf.
  2. Bringen Sie PFA vor der Anwendung auf Raumtemperatur.
  3. Bei Verwendung einer höheren PFA-Konzentration verdünnen Sie PFA auf 4 % in N2B27diff-Medium oder PBS in einer chemischen Haube.
  4. Nimm NTOs aus dem Inkubator und übertrage sie in eine chemische Haube.
  5. Öffnen Sie den Deckel und fügen Sie 4 % PFA im Verhältnis von 1:1 direkt zu den NTO hinzu, um eine Endkonzentration von 2 % zu erreichen (z. B. 100 μL 4 % PFA zu den 100 μL N2B27diff in der 96-Well-Platte).
  6. Den Deckel wieder aufsetzen und NTOs 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren. Stellen Sie einen Timer, da längere Fixierung die Wirkung bestimmter Antikörperbehandlungen beeinträchtigen kann.
    HINWEIS: PFA ist giftig und darf nicht eingeatmet werden. Arbeiten Sie sorgfältig und vorsichtig unter der chemischen Haube. Einige Antikörper erfordern die Verwendung eines bestimmten PFA oder eine kürzere/optimierte Fixierungszeit.
  7. Nach 30 Minuten den Deckel abnehmen und den Teller leicht zur Seite kippen, dann die Schritte 3.3-3.4 befolgen.
  8. Fügen Sie vorsichtig vorgewärmtes PBS hinzu (verwenden Sie genug Menge, um den Tropfen der Zellkulturmatrix oder wie in Tabelle 2 beschrieben zu bedecken) und inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur. Wiederhole diesen Schritt dreimal, um alle übrig gebliebenen PFA zu entfernen.
  9. Nach dem letzten Waschen werden eine angemessene Menge PBS hinzugefügt (siehe Tabelle 2), die Platte mit Parafilm abgedichtet und bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

5. Antikörperfärbung von NTOs

  1. Die Antikörperfärbung ist ein wertvolles Instrument zur Bewertung der korrekten Identität der NTO sowie des Erfolgs des Tests/Experiments. Die Antikörperfärbung kann wie in Meinhardt et al.24 und Krammer et al.26 beschrieben durchgeführt werden.
    HINWEIS: Wenn NTOs suboptimal erscheinen (Abbildung 4E-G) oder keinen korrekten raumzeitlichen Marker-Ausdruck zeigen (Abbildung 5 bis Abbildung 7), entsorgen Sie das Material, da es keine Qualitätsstandards erfüllt.
  2. Lasse die Block-/Permeabilisierungslösung (1x PBS mit 1 % BSA und 0,5 % Triton-X) bei 4 °C und passe sie vor der Anwendung an die Raumtemperatur an.
  3. Für eine vollständige 3D-Rekonstitution und Analyse sollten Sie Antikörper (1. und 2.Nd) mindestens 1, aber vorzugsweise 2-3 Nächte bei 4 °C halten, um eine gute Antikörperpenetration zu gewährleisten.
    HINWEIS: Der Alexa Fluor Anti-561 2. Antikörper könnte in den ersten drei Tagen des Differenzierungstests ein stärkeres Hintergrundsignal in der Zellkulturmatrix liefern.

6. Clearing von NTOs

  1. Bereite dich auf das Räumenvon 26 vor.
    1. Schließen Sie den Antikörperfärbungsprozess vor Beginn des Clearing-Verfahrens ab (stellen Sie sicher, dass sowohl der 1. als auch der 2. Antikörper inkubiert und gründlich ausgewaschen sind).
    2. Gib Propylgallat zur Klarlösung (2 mg Propylgallat pro mL Reinigungslösung), um die Photobleachung von NTOs zu minimieren.
      HINWEIS: Führen Sie das Reinigen 1–2 Stunden vor der Bildgebung durch, um eine Oxidation (die Flüssigkeit wechselt von hellem Gelb/Creme zu dunkel, hellgelb oder sogar braun) oder die Kristallisation der Reinigungslösung zu verhindern. Wenn eine Kristallisation auftritt, lösen Sie sich durch Zugabe von PBS zum Bohrloch.
  2. Lösungs-pH und Mischvorsichtsmaßnahmen
    1. Halten Sie den korrekten pH-Wert der Reinigungslösung aufrecht, um eine schnelle Oxidation oder das Auflösen der Zellkulturmatrix zu vermeiden.
    2. Vermeiden Sie starkes Schütteln oder starkes Mischen der Lösung, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern.

7. Analyse von NTO

  1. Mikroskopievorbereitung
    1. Nach Abschluss der Antikörperfärbung und der Entfernung des ganzen Gewebes verwenden Sie ein Konfokalmikroskop mit 10-40-fachen Zielen für die Bildgebung.
  2. Visuelle Bewertung
    1. Verwenden Sie visuelle Diagnostik und manuelle Quantifizierung, um effizient festzustellen, ob NTOs eine angemessene neuronale Markerexpression und dorsoventrale Organisation aufweisen.
  3. 3D-Analyse-Software
    1. Für 3D-Analyse nutzen Sie Software wie CellProfiler28,29, Imaris (File Converter and Viewer) oder ein ähnliches Werkzeug, um räumliche Markierungen und strukturelle Details zu bewerten.
  4. Verifizierung der NTO-Identität
    1. Bestätigen Sie die korrekte Identität von NTOs durch Bewertung der zeitlichen Expression neuronaler Marker und der räumlich-zeitlichen Expression spezifischer dorsoventraler Mustermarker. Dieser Schritt ist unerlässlich, um sicherzustellen, dass der Differenzierungstest erfolgreich war, bevor weitere Forschung durchgeführt wird.
  5. Charakterisierungsaspekte: Siehe Abbildung 4 sowie Abbildung 6 und Abbildung 7 , um die folgenden kritischen Aspekte des Kulturerfolgs zu überprüfen:
    1. Siehe Abbildung 4 und die ZO-1-Färbung, die in Meinhardt et al.24 gezeigt wurde, um eine erfolgreiche Epithelalisierung und Lumenbildung zu überprüfen.
    2. Eine erfolgreiche neuronale Differenzierung ist gekennzeichnet durch die Absenkung von OCT4 und die Hochregulation von SOX1, gefolgt von der β3TUBULIN-Expression (detailliertin 24). Siehe Abbildung 6 und Abbildung 7 , um eine erfolgreiche neuronale Differenzierung zu überprüfen.
    3. Dorsoventrale Musterbildung wird durch das Vorhandensein einer ventralen FOXA2+/SHH+-Bodenplatte und eine PAX3+-Expression am entgegengesetzten dorsalen Pol bestätigt (detaillierte ventrale Musterung in26). Siehe Abbildung 6 und Abbildung 7, um eine erfolgreiche dorsoventrale Musterbildung zu überprüfen.

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Ergebnisse

R1-Maus-ESCs wurden für alle repräsentativen Beispiele in den in diesem Manuskript präsentierten Abbildungen verwendet. Andere erwähnte Maus-ESCs können leichte Unterschiede in der Epithelialisierungszeit, neuronaler Differenzierung oder Musterungseffizienz aufweisen, wenn sie für NTO ausgesat werden, jedoch sollten die Ergebnisse nicht signifikant von den hier gezeigten Daten abweichen.

Nur ESCs von guter Qualität (Abbildung 2A),...

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Diskussion

Hier werden mehrere optimierende Anpassungen und Verbesserungen des ursprünglichen Protokolls zur Erzeugung hochwertiger NOs vorgestellt, um die Standardisierung in verschiedenen Laboren zu erleichtern. Wichtige Modifikationen umfassen unterschiedliche ESC-Kulturbedingungen, reduzierte Anzahl der Eingangszellen, verbessertes Differenzierungsmedium, modifiziertes Differenzierungsprotokoll und Anpassungen der Saatdichte für Hochdurchsatzanalysen mit Mehrbohrungsplatten. Mehrere Aspekte des...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Wir möchten uns bei aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Tanaka-Labors für ihre Unterstützung und Diskussionen bei der Entwicklung dieses Protokolls bedanken. Insbesondere danken wir A. Pelzl für die kritische Lektüre des Manuskripts, die Beiträge und die Unterstützung bei den Schaltplänen sowie E. Chatzidaki für die kritische Lektüre, das Lektorat und die Unterstützung bei den Schaltplänen sowie die Beschaffung der PUD 25-Finanzierung zusammen mit Juergen A. Knoblich. Diese Veröffentlichung wurde vom Österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF) finanziert: "Stand Alone Publikation Projekt Nummer PUD 25". Zusätzlich wurde dieses Projekt vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union (Fördervereinbarung ERC AdG 742046) sowie vom Österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF) [10.55776/ F7803-B] (Stammzellmodulation) gefördert. Für den Zweck des Open Access haben die Autoren eine CC BY Public Copyright-Lizenz für jede Author Accepted Manuscript (AAM)-Version, die aus dieser Einreichung hervorgeht, angewendet.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
35 mm Schüssel | Nr. 1.5 Deckpapier | 14 mm Glasdurchmesser | UnbeschichtetMatTek CorporationKat# P35G-1.5-14-C
AccutaseInvitrogenKat# 00-4555-56
Albumin (BSA) Fraktion V (pH 7,0)Panreac AppliChemKat# A1391
All-Trans-RetinsäureMerckKat# R2625
B-27 Supplement (50X), serumfreiGibcoKatze# 17504044
Basementmembranmatrix (Matrigel)CorningKatze# BDL354234Proteinkonzentration: 10 mg/ml&nblöfl;
CellCarrier-96 Ultra-MikroplattenPerkinElmerKatze# 6055302
CellProfiler 4Stirling et al. 2021https://cellprofiler.org
CHIR 99021TocrisKat# 4423
KUBISCH-R+(N)Matsumoto et al., 2019N/A
DimethylsulfoxidSigma AldrichKat# D2650
DMEM/F-12, kein GlutaminGibcoKatze# 21331020
Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS, 1X)GibcoKatze# 14190144
Eppendorfer Zentrifuge 5810 REppendorfKatze# 5811000015
Eppendorf Microtube 3810XMerckKatze# EP0030125150
Falcon konische ZentrifugenröhrenCorningKatze# 352095
GelatineMerckKat# G2500
L-Glutamin (200 mM)GibcoKatze# A2916801
HeracellVIOS 160i CO2-Inkubator, 165 LThermoFisher ScientificKatze# 51033557
ImarisOxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com
Invertiertes LED-Phasenkontrastmikroskop (CKX53)Olympus
2-Mercaptoethanol (50 mM)GibcoKatze# 31350010
Monoklonale Maus anti-OCT-3/4Santa Cruz BiotechnologieKat# sc-5279; RRID:AB_628051Verwenden Sie 1:200
Monoklonale Maus Anti-PAX3DSHBCat# PAX3-C; RRID:AB_528426Verwenden Sie 1:100
Monoklonales Kaninchen Anti-SHHZell-SignalisierungstechnologienKat # 2207; RRID:AB_2188191Verwenden Sie 1:300
Monoklonales Kaninchen anti-β 3-TubulinZell-SignalisierungstechnologienCat# 5568; RRID:AB_10694505Verwenden Sie 1:500
Monoklonale Maus-Anti-ZO-1InvitrogenCat# 33-9100; RRID:AB_2533147Verwenden Sie 1:200
Maus-LIFQkineKat# Qk018-1000
N-2 Supplement (100X)GibcoKatze# 17502048
NeurobasalmediumGibcoKatze# 21103049
Paraformaldehyd, Reagenzqualität, kristallinMerckKat# P6148
PD 0325901TocrisKat# 4192
Penicillin-Streptomycin-LösungGibcoCat# 15140130
Phasenkontrastmikroskop
Polyklonale Ziege anti-FOXA2R& DKat# AF2400; RRID:AB_2294104Verwenden Sie 1:400
Polyklonale Ziege anti-SOX1R& D-SystemeKatze# AF3369; RRID:AB_2239879Verwenden Sie 1:200
RNA-Seq-Daten im Zusammenhang mit Abbildung 6Ishihara et al., 2022GEO: GSE214368
SafeFAST Premium Mikrobiologischer SicherheitsschrankDasit-Gruppe SCHNELLERKatze# F00025200000
Natriumpyruvat (100 mM)GibcoKatze# 11360070
Drehscheiben-konfokales invertiertes Mikroskop (IX3)Olympus
Triton X-100Sigma AldrichKat# 9036-19-5

Referenzen

  1. Hiiragi, T., Solter, D. First cleavage plane of the mouse egg is not predetermined but defined by the topology of the two apposing pronuclei. Nature. 430 (6997), 360-364 (2004).
  2. Louvet-Vallée, S., Vinot, S., Maro, B. Mitotic spindles and cleavage planes are oriented randomly in the two-cell mouse embryo. Curr Biol. 15 (5), 464-469 (2005).
  3. Sagner, A., Briscoe, J. Morphogen interpretation: concentration, time, competence, and signaling dynamics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 6 (4), e271(2017).
  4. Anlaş, A. A., Nelson, C. M. Tissue mechanics regulates form, function, and dysfunction. Curr Opin Cell Biol. 54, 98-105 (2018).
  5. Haupt, A., Minc, N. How cells sense their own shape: mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function. J Cell Sci. 131 (6), jcs214015(2018).
  6. Lajtha, L. G. Stem cell concepts. Differentiation. 14 (1-3), 23-33 (1979).
  7. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  8. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  9. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: modeling development and the stem cell niche in a dish. Dev Cell. 38 (6), 590-600 (2016).
  10. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
  11. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  12. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Park, G., Rim, Y. A., Sohn, Y., Nam, Y., Ju, J. H. Replacing animal testing with stem cell-organoids: advantages and limitations. Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1375-1386 (2024).
  14. Xu, Z., et al. Merits and challenges of iPSC-derived organoids for clinical applications. Front Cell Dev Biol. 11, 1188905(2023).
  15. Phipson, B., et al. Evaluation of variability in human kidney organoids. Nat Methods. 16 (1), 79-87 (2019).
  16. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  17. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  18. Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nat Biotechnol. 35 (7), 659-666 (2017).
  19. Eichmüller, O. L., et al. Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects. Science. 375 (6579), eabf5546(2022).
  20. Reumann, D., et al. In vitro modeling of the human dopaminergic system using spatially arranged ventral midbrain-striatum-cortex assembloids. Nat Methods. 20 (12), 2034-2047 (2023).
  21. Esk, C., et al. A human tissue screen identifies a regulator of ER secretion as a brain-size determinant. Science. 370 (6519), 935-941 (2020).
  22. Krenn, V., et al. Organoid modeling of Zika and herpes simplex virus 1 infections reveals virus-specific responses leading to microcephaly. Cell Stem Cell. 28 (8), 1362-1379.e7 (2021).
  23. Li, C., et al. Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism. Nature. 621 (7978), 373-380 (2023).
  24. Meinhardt, A., et al. 3D reconstitution of the patterned neural tube from embryonic stem cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 987-999 (2014).
  25. Wu, Y., Peng, S., Finnell, R. H., Zheng, Y. Organoids as a new model system to study neural tube defects. FASEB J. 35 (4), e21545(2021).
  26. Krammer, T., et al. Mouse neural tube organoids self-organize floorplate through BMP-mediated cluster competition. Dev Cell. 59 (15), 1940-1953.e10 (2024).
  27. Ishihara, K., Ranga, A., Lutolf, M. P., Tanaka, E. M., Meinhardt, A. Reconstitution of a patterned neural tube from single mouse embryonic stem cells. Organ Regen. 1597, 43-55 (2017).
  28. Mulas, C., et al. Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells. Development. 146 (6), dev173146(2019).
  29. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  30. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  31. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  32. Ishihara, K., et al. Topological morphogenesis of neuroepithelial organoids. Nat Phys. 19, 177-183 (2023).
  33. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).
  34. Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
  35. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).
  36. Robanus-Maandag, E., et al. p107 is a suppressor of retinoblastoma development in pRb-deficient mice. Genes Dev. 12 (11), 1599-1609 (1998).
  37. Smith, A. G., Hooper, M. L. Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity which inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem cells. Dev Biol. 121 (1), 1-9 (1987).
  38. Kuehn, M. R., Bradley, A., Robertson, E. J., Evans, M. J. A potential animal model for Lesch-Nyhan syndrome through introduction of HPRT mutations into mice. Nature. 326 (6110), 295-298 (1987).
  39. Doetschman, T., et al. Targeted correction of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells. Nature. 330 (6148), 576-578 (1987).
  40. Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).
  41. Ranga, A., et al. Neural tube morphogenesis in synthetic 3D microenvironments. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), (2016).

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