Methodenartikel

Prion Safety Laboratory Wischtest

DOI:

10.3791/67889

⸱

14. Februar 2025

 ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, School of Medicine, Creighton University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Es fehlt eine Methode, um häufig genutzte Bereiche in Laborumgebungen auf Prionenkontamination und eine effektive Dekontamination zu untersuchen. Das hier beschriebene Protokoll bietet wichtige Grundlagen für die Implementierung eines Prionen-Sicherheits-Wischtests im Labor, der leicht an die individuellen Bedürfnisse bestimmter Labore angepasst werden kann.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Übertragung der iatrogenen Prionenkrankheit erfolgte durch kontaminierte neurochirurgische Instrumente, Transplantatmaterialien und die berufliche Exposition gegenüber Prionen-kontaminierten Laborwerkzeugen. Prionen verursachen Krankheiten durch die Fehlfaltung der normalen zellulären Form des Prionproteins PrPC in die fehlgefaltete und pathogene Form PrPSc und sind ausnahmslos tödlich. Die Reduzierung der iatrogenen und berufsbedingten Prionenübertragung ist eine Herausforderung. Erstens können Prionen über lange Zeiträume an Oberflächen binden und dort bestehen bleiben. Zweitens sind Prionen sehr resistent gegen Inaktivierung. Vor diesem Hintergrund können Oberflächen nach einer unwirksamen Dekontamination über lange Zeiträume infektiös bleiben. Dies kann nicht nur ein potenzielles Berufsrisiko für Prionenlabormitarbeiter darstellen, sondern auch Laborexperimente mit empfindlichen Prionenamplifikationstechniken möglicherweise kreuzkontaminieren. Das hier beschriebene Protokoll für einen Swipe-Test im Prionensicherheitslabor umfasst Schritte zur Identifizierung und Dokumentation von stark frequentierten Laborbereichen, empfohlene Abstrichkontrollen, um die Gültigkeit der Ergebnisse sicherzustellen, Schritte zur Identifizierung der richtigen Reaktionen auf positive Oberflächenabstriche, repräsentative Ergebnisse von Prionen-Swipe-Tests sowie potenzielle künstliche Ergebnisse. Insgesamt kann der Swipe-Test des Prionen-Sicherheitslabors als Teil eines umfassenderen Prionen-Sicherheitsprogramms implementiert werden, um die Dekontamination von Oberflächen zu bewerten, Gemeinschaftsräume auf Prionenkontamination zu überwachen und die Dokumentation des Prionen-Dekontaminationsstatus zu implementieren.

Einleitung

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Prionenkrankheiten sind ausnahmslos tödliche neurodegenerative Erkrankungen, für die keine Behandlung oder Heilung bekannt ist. Prionenerkrankungen werden durch PrPSc verursacht, die fehlgefaltete und pathogene Form der normalen zellulären Form des Prionproteins 1,2,3,4,5, PrP C. Es ist bekannt, dass Prionenkrankheiten den Menschen und mehrere andere Tierarten betreffen. Eine menschliche Prionenkrankheit, die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, CJK, hat drei bekannte Ätiologien: sporadisch, vererbt und erworben. Erworbene CJK kann als Folge einer versehentlichen Übertragung (iatrogen und beruflich) auftreten und gilt als Ursache für Kuru beim Fore-Volk in Papua-Neuguinea6.

Die Prionenübertragung wurde mit Prionen-kontaminierten Medizinprodukten und Transplantationsmaterialien in Verbindung gebracht 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Eine iatrogene Übertragung von CJK kann über Blut, Gewebe oder von Prionen-kontaminierten Oberflächen erfolgen 18,19,20. Zum Beispiel kann sich iatrogene CJK bei Patienten entwickeln, die nach einem Elektroenzephalogramm mit Elektroden verwendet wurden, die zuvor an einer Person im präklinischen Stadium der CJK verwendet wurden und später der CJK21 erlagen. In jüngerer Zeit kam es auch zu einer berufsbedingten Übertragung im Labor, bei der sich ein Laborarbeiter durch eine Hautpunktion mit einer Pinzette, mit der Hirnschnitte eines Tieres behandelt wurden, das mit der an Schafe angepassten BSE22,23 infiziert war, an die Prionenkrankheit erkrankte. Solche Übertragungsszenarien könnten in klinischen, Labor- und diagnostischen Laborumgebungen auftreten, in denen Prionenproben gehandhabt werden.

Prionen widerstehen gängigen Desinfektionstechniken und können über längere Zeiträume auf Oberflächen persistieren und infektiös bleiben 24,25,26,27,28,29. Gängige Desinfektionstechniken wie die Verwendung von Ethanol, phenolischen Reinigern, Wasserstoffperoxid, verschiedenen Formen von Strahlung und Formaldehyd sind für die Inaktivierung von Prionen ungeeignet, so dass die Oberflächen ihre Infektiosität beibehaltenkönnen 30,31,32,33,34,35,36,37 . Diese Eigenschaften tragen zur Übertragung von Prionen während iatrogener und beruflicher Exposition bei.

Methoden zum Nachweis von Prionen aus der Umwelt wurden erst vor kurzem entwickelt. Eine Abstrichmethode in der Umgebung in Verbindung mit einer Echtzeit-Beben-induzierten Umwandlung (RT-QuIC) kann die verbleibende Prioneninfektiösität von Umgebungsoberflächen sowie von gängigen Laboroberflächen nach unwirksamer Desinfektion beurteilen 38,39,40,41,42. Hier beschreiben wir, wie diese Technik in ein breiteres Prionen-Sicherheitsprogramm integriert werden kann. Insgesamt kann diese Methode die Überwachung laborabhängiger Desinfektionsprotokolle, die Untersuchung und ordnungsgemäße Dokumentation des Kontaminationsstatus ermöglichen, was dazu beitragen kann, die Gültigkeit von Experimenten zu gewährleisten, indem Kreuzkontaminationen minimiert werden, gemeinsam genutzte Räume auf Prionenkontamination bewertet werden und eine gezielte Umschulung des Personals auf der Grundlage häufig kontaminierter Bereiche ermöglicht wird.

Protokoll

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Alle Verfahren mit Tieren wurden vom Creighton University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

HINWEIS: Eine schematische Übersicht über den Swipe-Test des Prionensicherheitslabors ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Auswahl der Abstrichstellen und Vorbereitung für die Oberflächenabtupfung

  1. Identifizieren und kennzeichnen Sie geeignete Überwachungsbereiche für den Abstrich. Für Dokumentation und Referenz finden Sie in der bereitgestellten Vorlage (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 1).
  2. Bereiten Sie zwei 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für jeden der identifizierten Bereiche vor. Geben Sie 250 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung von Dulbecco in den ersten Satz Mikrozentrifugenröhrchen zur Verwendung in Schritt 3.2. Lassen Sie den zweiten Satz Mikrozentrifugenröhrchen für die Verwendung in Schritt 4.3 leer bleiben.
  3. Entnehmen Sie mit Schaumstoff bestückte Tupfer aus der Lagerung in einem Bereich, der frei von Prionenkontamination ist.
  4. Bereiten Sie eine Quetschflasche mit Milli-Q Wasser (MQ H2O) für die Verwendung in Schritt 2.1 vor.

2. Vorbereitung des Positiv- und Negativkontrollabstrichs

  1. Bereiten Sie Verdünnungen für Positiv- und Negativabstrichkontrollen unter Verwendung relevanter Kontrolltypen vor. Beispiel: Für die Positivkontrolle bereiten Sie eine 1%ige Verdünnung des Prionen-infizierten Gehirnhomogenats in Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) vor. Für die Negativkontrolle ist eine 0,1%ige Verdünnung von nicht infiziertem (UN) Gehirnhomogenat (BH) von derselben Spezies wie die Positivkontrolle bei DPBS herzustellen.
  2. Nehmen Sie mit sauberen Handschuhen die entsprechende Anzahl von Tupfern aus der sauberen Verpackung und legen Sie die Griffseite nach unten in ein Röhrchengestell, wobei Sie darauf achten, dass die Schaumstofftupfer so verteilt sind, dass die Spitzen nicht mit anderen Tupfern oder Oberflächen in Berührung kommen. Für jede Kontrollprobe sind drei Tupfer vorzubereiten. Wechseln Sie die Handschuhe zwischen jeder Probe.
  3. Halten Sie einen sauberen Schaumtupfer an den Griff und geben Sie 50 μl der jeweiligen Positiv- und Negativkontrollproben auf die Schaumtupferspitzen. Achten Sie darauf, dass Sie es auf beide Seiten der Tupferspitze auftragen, um eine vollständige Absorption zu gewährleisten.
    HINWEIS: Wechseln Sie immer die Handschuhe, bevor Sie einen sauberen Tupfer aus dem Röhrchengestell nehmen.
  4. Schneiden Sie mit einer Schere den überschüssigen Griff des Tupfers ab (ca. 1/2 der Länge) und legen Sie den Tupfer mit dem Schaumstoffspitzenteil nach unten in das vorgeladene Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie sicher, dass die Schaumstoffspitze in das DPBS eingetaucht ist und dass der Griff ausreichend geschnitten ist, um den Deckel des Mikrozentrifugenröhrchens vollständig zu schließen.
  5. Nach dem Handschuhwechsel mit der Anwendung von Kontrollproben fortfahren, bis alle Proben aufgetragen wurden.

3. Oberflächentupfen

  1. Halten Sie einen sauberen Schaumstofftupfer am Griff, befeuchten Sie die Schaumspitze mit MQ H2O und schütteln Sie den Überschuss ab. Legen Sie die angefeuchtete Schaumspitze des Tupfers auf den für die Überwachung ausgewählten Bereich und wischen Sie den Bereich etwa zehnmal hin und her, während Sie gleichzeitig die Spitze des Tupfers auf der Oberfläche drehen.
  2. Schneiden Sie mit einer Schere den überschüssigen Griff des Tupfers ab (ca. 1/2 der Länge) und legen Sie den Tupfer mit dem Schaumstoffspitzenteil nach unten in das vorgeladene Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie sicher, dass die Schaumstoffspitze in das DPBS eingetaucht ist und dass der Griff ausreichend geschnitten ist, um den Deckel des Mikrozentrifugenröhrchens vollständig zu schließen.
  3. Entsorgen Sie die Handschuhe und ziehen Sie vor der jeweiligen Abstrichstelle neue Handschuhe an, um die Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination zu minimieren.
  4. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle für die Überwachung ausgewählten Bereiche abgewischt wurden.

4. Tupferextraktion und Vakuumkonzentration

HINWEIS: Schalten Sie den Vakuumkonzentrator 30 Minuten vor dem Gebrauch ein, damit sich das Gerät aufwärmen kann.

  1. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in ein kreisförmiges Röhrchengestell. Platzieren Sie das Mikrofugenröhrchengestell in das Wasserbad des Becherhorn-Ultraschallgeräts. Stellen Sie sicher, dass sich die Schaumtupfer in DPBS in den Mikrozentrifugenröhrchen unter der Wasseroberfläche im Becherhorn befinden (der Griffteil muss nicht untergetaucht werden). Wenden Sie die folgenden Einstellungen an: 15 s Gesamtlaufzeit (5 s an, 5 s aus) bei ~75-85 Watt.
  2. Nach der Beschallung zentrifugieren Sie die Röhrchen etwa 15 s lang, um DPBS vor dem Transfer im Boden des Röhrchens zu sammeln.
  3. Mit einem P1000-Pipettenset auf 250 μl die gesamte Flüssigkeit (Tupferextrakt) vorsichtig vom Boden des Mikrozentrifugenröhrchens auffangen und aus dem zweiten, leeren, voretikettierten Set in das entsprechende Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um überschüssige Flüssigkeit aus der Schaumstoffspitze herauszudrücken. Entsorgen Sie leere Röhrchen mit Tupfern.
  4. Stellen Sie folgende Einstellungen am Vakuumkonzentrator ein: Temperatur: 45 °C, Heizzeit: 15 min, Laufzeit: 2 h, Vakuum: 5,1.
  5. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit den Tupferextrakten in den Vakuumkonzentrator und stellen Sie sicher, dass die Röhrchen ausbalanciert und alle Röhrchenkappen geöffnet sind.
  6. Stellen Sie nach Abschluss des Zyklus sicher, dass die Proben vollständig konzentriert sind (nur das Pellet bleibt übrig). Lagern Sie die Pellets bei -80 °C, bis sie für RT-QuIC verwendet werden.
    HINWEIS: In einigen Fällen kann eine zusätzliche Vakuumkonzentrationszeit erforderlich sein, um eine vollständige Konzentration zu gewährleisten. Entfernen Sie alle konzentrierten Proben und lassen Sie nur die Röhrchen übrig, die noch Flüssigkeit enthalten. Die verbleibenden Röhrchen im Konzentrator neu ausbalancieren und in zusätzlichen 1-Stunden-Schritten laufen lassen, bis die Proben vollständig konzentriert sind.

5. Vorbereitung der Abstrichsteuerungen für den Einsatz in RT-QuIC

HINWEIS: Die RT-QuIC-Kontrollen sollten vor dem Assay von Umgebungstupferextrakten durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass während des Abstrichs, der Extraktion oder der Konzentrationsverfahren keine Kontamination eingeführt wurde. Beispiele für Layouts finden Sie in Abbildung 3 und Abbildung 4.

  1. Bereiten Sie eine geeignete negative RT-QuIC-Plattenkontrolle vor (z. B. nicht infiziertes Gehirnhomogenat [UN BH]), indem Sie sie auf die entsprechende Konzentration in Gewebeverdünnungslösung (N2-0,1 %SDS/PBS) verdünnen. Bereiten Sie eine Positivplatten-Kontrollverdünnung vor, indem Sie mit Prionen infiziertes Gehirnhomogenat auf eine Verdünnung von 10-3 in Gewebeverdünnungslösung verdünnen.
  2. Zuvor gelagerte Kontrolltupfer-Extraktpellets aus -80 °C entfernen und mit jeweils 50 μl MQ H2O resuspendieren, indem ca. 10 Mal auf und ab pipettieren und anschließend kurz vortexen. Lassen Sie die Proben bei Raumtemperatur (RT) ruhen, während Sie die verbleibenden Schritte ausführen.
  3. Beladung von 2 μl spezifizierter Plattenkontrollen, einschließlich negativer Plattenkontrollen (Gewebeverdünnungslösung allein und nicht infiziertes Gehirnhomogenat) und einer positiven Plattenkontrolle (infiziertes Gehirnhomogenat).
  4. Laden Sie 2 μl jedes positiven und negativen Tupferextrakts in mindestens vier RT-QuIC-Plattenvertiefungen.
    HINWEIS: Wenn negative Abstrichkontrollen eine RT-QuIC-Aussaat aufweisen, die über dem Laborstandard für eine positive Bestimmung liegt, bedeutet dies, dass während des Abstrichs, der Extraktion und der Konzentration eine Kontamination eingebracht wurde und dass der Abstrichversuch erneut durchgeführt werden sollte

6. Vorbereitung der Proben für die Verwendung in RT-QuIC

  1. Bereiten Sie eine geeignete Negativplattenkontrolle vor (z. B. nicht infiziertes Hirnhomogenat, nicht infizierter Lymphknoten usw.), indem Sie auf die entsprechende Konzentration in Gewebeverdünnungslösung (N2-0,1 % SDS/PBS) verdünnen. Bereiten Sie Positivplattenkontrollen vor, indem Sie das infizierte Gehirnhomogenat auf eine Verdünnung von 10-3 in Gewebeverdünnungslösung verdünnen.
  2. Zuvor gelagerte Tupferextrakt-Pellets bei -80 °C entnehmen und mit 20-50 μl Gewebeverdünnungslösung (je nach vermuteter Kontaminationsmenge) resuspendieren, indem ca. zehnmal auf und ab pipettieren und anschließend kurz vortexiert wird. Lassen Sie die Proben bei RT sitzen, während Sie die verbleibenden Schritte ausführen.
  3. Laden Sie 2 μl spezifizierter Plattenkontrollen, einschließlich negativer Plattenkontrollen (Gewebeverdünnungslösung allein und nicht infiziertes Gehirnhomogenat) und einer positiven Plattenkontrolle (infiziertes Gehirnhomogenat) in die RT-QuIC-Plattenvertiefungen.
  4. Laden Sie 2 μl jedes Tupferextrakts in vier Replikatvertiefungen.

7. RT-QuIC-Analyse und Ergebnisse

  1. Führen Sie RT-QuIC gemäß den individuellen Laborprotokollen durch (optionale Protokolle38,40).
  2. Definieren Sie die Parameter, die für die Bestimmung der Positivität einer Stichprobe erforderlich sind (siehe repräsentative Ergebnisse, Abbildung 5).
    HINWEIS: Diese Parameter werden von jedem Lab definiert.
  3. Notieren Sie die Ergebnisse in der bereitgestellten Tabelle und ergreifen Sie geeignete Maßnahmen auf der Grundlage der Best Practices des Labors (Tabelle 1 und ergänzende Abbildung 2).

Ergebnisse

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Schriftliche Beschreibung der positiven und negativen Ergebnisse (einschließlich Positiv-/Negativplatten- und Tupferkontrollen)

Negativkontrolltupfer sind in den Überwachungsabstrich einbezogen, um eine mögliche Prionenkontamination zu überwachen, die während des Abstrichs, der Extraktion und des Konzentrationsprozesses eingebracht werden könnte. Die erste RT-QuIC-Platte, die für eine bestimmte monatliche Überwachung durchgeführt wird, sollte die Positiv- und Negativ-Abstrichkontrollen enthalten. Erfolgreiche Negativkontrollen überschreiten die positive Fluoreszenzschwelle nicht (Abbildung 6A). Dieses Ergebnis würde darauf hindeuten, dass während der experimentellen Verfahren keine Kontamination eingebracht wurde. Erfolgreiche Positivkontroll-Tupferextrakte zeigten eine positive Aussaat in allen Replikatvertiefungen für eine gegebene Probe (Positivkontrollabstriche waren mit dem hirnhomogenat des hamsteradaptierten transmissiblen Nerzenzephalopathiestamms Hyper (HY TME) kontaminiert. Die Einbeziehung einer Positivkontrollverdünnungsreihe ermöglicht die Bestimmung der Sensitivität der Prionendetektion für ein gegebenes Experiment (Abbildung 6A).

Bei der Untersuchung von Oberflächentupfer-Extraktproben können Oberflächen, die keine Aussaat über der vorgegebenen positiven Fluoreszenzschwelle aufweisen, als Prionen-negativ angesehen werden (Abbildung 6B). Umgekehrt zeigen Prionen-kontaminierte Oberflächentupferextrakte Seeding-Fähigkeiten oberhalb der positiven Fluoreszenzschwelle, obwohl das Maxpoint-Verhältnis (MPR) und die Zeit bis zur Fluoreszenz im Vergleich zur enthaltenen Positivplattenkontrolle variieren können (Abbildung 6B). Die Fähigkeit der Methode, eine angemessene Desinfektion zu beurteilen, wird durch die mit Bleiche behandelten Prionenkontaminierten Oberflächen unterstrichen, die RT-QuIC nun nicht mehr aussäen können (Abbildung 6B).

Wichtig ist, dass unser Labor zwar eine positive Probe als eine Probe definiert, die die eingestellte positive Fluoreszenzschwelle in mindestens der Hälfte der Replikatvertiefungen überschreitet, es jedoch notwendig ist, dass jedes Labor seine eigenen Standards festlegt. Die Rate der Amyloidbildung (RAF) und die Zeit bis zur Fluoreszenz können ebenfalls verwendet werden, um laborspezifische Schwellenwerte für die Positivität festzulegen.

Wir haben Ergebnisse von Oberflächenartefakten beobachtet, die die positive Fluoreszenzschwelle überschreiten, jedoch mit veränderten kinetischen Kurven und nach einer ungewöhnlich langen Zeit bis zur Fluoreszenz im Vergleich zu positiven Kontrollproben (Abbildung 6C). Diese Ergebnisse sollten mit Vorsicht interpretiert werden, da sie durch das Vorhandensein von Staub oder Chemikalienrückständen auf einer Oberfläche verursacht werden können. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit einer allgemeinen Laborsauberkeit sowie Kriterien zur Unterscheidung zwischen True-Positive- und False-Positive-Seeding.

Die Entsorgung von festen und flüssigen Abfällen mit biologischer gefährlicher Gefahr sollte gemäß den aktuellen Richtlinien für die Entsorgung biologischer Gefahrstoffe einer bestimmten Institution erfolgen. Zu den gängigen Prionen-Desinfektionstechniken gehören die Behandlung mit Natriumhydroxid, Natriumhypochlorit (Bleichmittel) oder das Autoklavieren bei 134 °C für 18 min 43,44,45,46.

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Abbildung 1: Schematische Übersicht des Swipe-Tests des Prionen-Sicherheitslabors. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Beispiel für ein Layout der Abstrichstelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Das Probenversuchsdesign für Tupferkontrollen umfasste einen Swipe-Test des Prionensicherheitslabors. (A) Probenlayout für negative und positive Tupferextraktkontrollen. (B) Negative und positive Tupferextraktkontrollen sollten mit 50 μl H2O resuspendiert werden. Eine 10-fache Verdünnung des resuspendierten Tupferextrakts sollte durch Verdünnung in eine Gewebeverdünnungslösung erzeugt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Probenversuchsdesign für Oberflächentupferextrakte aus dem Swipe-Test des Prionensicherheitslabors. (A) Probenlayout für Oberflächentupferextrakte. (B) Oberflächentupfer-Extraktproben sollten mit 20 μl Gewebeverdünnungslösung resuspendiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Monatlicher Swipe-Test des Prionensicherheitslabors. Flussdiagramm, das zur Interpretation der Ergebnisse und zur Bestimmung der angemessenen Reaktion verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Repräsentatives Oberflächenabstrich-Experiment. (A) Oberflächentupfer-Kontrollplatte mit Negativ-Tupfer-Extrakt-Kontrollen in dreifacher Ausführung (DPBS, nicht infiziertes Hamstergehirn-Homogenat 10-4 und 10-10) und positiven Tupfer-Extrakt-Kontrollen in dreifacher Ausführung (HY-Gehirn-Homogenat 10-3). (B) Repräsentative Tupferextrakte für Tisch-, Glas- und Edelstahloberflächen, die vor der Kontamination, nach der Kontamination mit HY 10-3 und nach der Bleichbehandlung kontaminierter Oberflächen abgetupft wurden. (C) Vergleich des nicht infizierten Gehirnhomogenats 10-4, des HY-Gehirnhomogenats 10-3 und des mit einem feinen Staubfilm überzogenen Tupferextrakts aus dem Labortisch. Zu den Negativplattenkontrollen für die Panels A und B gehören ein Blindpräparat (Gewebeverdünnungslösung) und ein nicht infiziertes Hamsterhirnhomogenat 10-4. Panel B umfasst die Zugabe von nicht infiziertem Gehirnhomogenat 10-4 und die Positivplattenkontrolle von HY-Gehirnhomogenat 10-3. Eine positive Fluoreszenzschwelle (dargestellt durch eine rote gestrichelte Linie) wurde mit 2 bestimmt. Das angegebene Maxpoint-Verhältnis (MPR) ist die maximale Fluoreszenz geteilt durch den anfänglichen Fluoreszenzwert, der vom Plattenleser erhalten wurde. Jeder Punkt stellt eine technische Vertiefungsreplik für einen bestimmten Probentyp dar. Der Mittelwert und die Standardabweichung werden dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Monatliches Dokumentationsformular für den Probenabstrich vor Ort. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Layoutvorlage für die Abstrichstelle. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Monatliches Dokumentationsformular für die Abstrichstelle. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die beschriebene Methode des Prionen-Sicherheitsabstrichs kann verwendet werden, um bestehende Prionen-Sicherheitsmaßnahmen zu verbessern. Mit dieser Methode können Prionenlaborräume und -geräte sowie gemeinsam genutzte Laborräume auf mögliche Prionenkontamination überwacht werden. Wichtig ist, dass diese Methode angepasst werden kann, um laborspezifische Desinfektionstechniken zu testen, um die Dekontamination von Prionen-kontaminierten Oberflächen zu überprüfen. Da verschiedene Prionenstämme unterschiedliche Empfindlichkeiten gegenüber Desinfektionstechniken aufweisen, kann diese Methode bestätigen, dass diese Techniken für aktuelle Laborexperimente, wie z. B. die Behandlung mit Natriumhydroxid oder Natriumhypochlorit (Bleichmittel), wirksam sind43,44.

Zu den wichtigsten Schritten für diese Methodik gehört die Identifizierung geeigneter Abstrichstellen, die eine Stichprobe sowohl von stark frequentierten Bereichen als auch von zu überwachenden Bereichen liefern, die an einer nachgelagerten Kreuzkontamination von Experimenten beteiligt sein könnten. Darüber hinaus sollten Labore Positiv- und Negativkontrollen verwenden, die denen ähneln, die in einem bestimmten Labor oder einer bestimmten Klinik üblich sind. Wenn Sie beispielsweise mit Nagetier-Prionen arbeiten, sollten die Positiv- und Negativkontrollen mit der jeweiligen Spezies übereinstimmen. Schließlich sollten die Überwachungsdaten auf dem neuesten Stand gehalten und so organisiert werden, dass Trends in der Positivität leicht identifiziert werden können, um so eine Eindämmung und Umschulung des Laborpersonals im Falle konsistent positiver Ergebnisse für ein bestimmtes Gebiet zu ermöglichen.

Eine Einschränkung dieses Protokolls ist die mögliche Generierung fehlerhafter RT-QuIC-Ergebnisse. Angesichts der Empfindlichkeit von RT-QuIC kann das Vorhandensein von Reinigungsmittelrückständen, Salz und anderen Substanzen auf Laboroberflächen das Ergebnis der Reaktion beeinflussen39. Insgesamt ist es angesichts dieser Beobachtung von Vorteil, dass die Oberflächen frei von Substanzen bleiben, die RT-QuIC beeinträchtigen können, wie z. B. Salzreste, Reinigungsmittel und Staub. Sobald Verbesserungen an der RT-QuIC-Methodik verfügbar werden, gehen wir davon aus, dass viele der derzeitigen Einschränkungen von RT-QuIC behoben werden. Wir ermutigen daher den Endbenutzer, sich über die Literatur auf dem Laufenden zu halten, um von den neuesten Verbesserungen in RT-QuIC zu profitieren.

Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode für Labore, die Prionen erforschen, ist die Möglichkeit, Kontaminationen zu minimieren, die sich auf die Ergebnisse empfindlicher Amplifikationsassays auswirken können. Autopsiewerkzeuge werden in der Regel desinfiziert, bevor sie für zukünftige Autopsien wiederverwendet werden. Die beschriebene Abstrichmethode bietet eine Methode zur Beurteilung von Nekropsiewerkzeugen auf verbleibende Prioneninfektiösität, die die nachgelagerten Ergebnisse beeinflussen kann. Dies kann den Experimenten ein zusätzliches Maß an Strenge verleihen, um die Möglichkeit auszuschließen, dass der Prionennachweis in Geweben nicht auf eine Kontamination durch die Nekropsiewerkzeuge zurückzuführen ist.

Offenlegungen

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J.C.B. und Q.Y. sind Erfinder einer Patentanmeldung im Zusammenhang mit der Technologie zum Abtupfen von Prionenoberflächen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Arbeit wurde durch ein Stipendium der Creutzfeldt Jacob Disease Foundation unterstützt. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -interpretation oder der Entscheidung, die Arbeit zur Veröffentlichung einzureichen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Fisherbrand  PurSwab Foam TupferFisher MarkeKatalog #14-960-3E
Milli-Q IQ 7005 ReinstwassersystemMilliporeSigmaQ7005T0C
Mini-Zentrifuge, 6000 U/minSouthern LabwareMLX-306
Omega PlattenleserBMG LabtechFLUOstar Omega Plattenleser
Q700 UltraschallgerätQSonicaQ700-110
Rekombinanter Hamster Prion ProteinMNPROMNPROtein-HamsterSyrischer Hamster, Aminosäuren 90-231
Savant speedvac Thermo ScientificSPD1030-230
Siliziumdioxid-Nanokugeln (50 nm)Nano-ComposixSINS50-25M

Referenzen

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