Verabreichung von flüchtigen Anästhetika an Zebrafischlarven zur Verhaltensbeobachtung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine zugängliche Methode zur Schaffung einer gasdichten Umgebung dar, um Zebrafischlarven für Verhaltensexperimente flüchtige Anästhetika zu verabreichen.

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt eine einzigartige Methode zur Verabreichung von flüchtigen Anästhetika wie Isofluran und Sevofluran an Zebrafischlarven während Verhaltensexperimenten. Während Zebrafische als Modellorganismus für Wirbeltiere zahlreiche Vorteile bieten - darunter komplexe Verhaltensweisen, genetische Rückverfolgbarkeit, transparente Embryonen und schnelle Entwicklung -, war ihr Einsatz bei der Erforschung flüchtiger Anästhetika bisher begrenzt. Die Verabreichung von flüchtigen Anästhetika erfordert oft komplexe oder umständliche Apparaturen, die möglicherweise nicht allgemein zugänglich sind, was zu Hindernissen für die pharmakologische Untersuchung von flüchtigen Anästhetika in wässrigen Modellorganismen führt. Diese Methode stellt eine einfache Technik dar, bei der selbstklebende Silikonfolien verwendet werden, um eine gasdichte Versiegelung auf 96-Well-Glasplatten zu erzeugen. Die Validierung erfolgte durch die Bewertung der spontanen Bewegung, die über einen Zeitraum von 90 Minuten keine signifikanten Unterschiede zwischen versiegelten und offenen Vertiefungen zeigte. Darüber hinaus blieb die Anästhesiekonzentration über die Zeit stabil, gemessen durch HPLC. Zu den repräsentativen Ergebnissen gehört die experimentelle Bestimmung der medianen effektiven Konzentration (EC₅₀) für Sevofluran. Diese Studie bietet einen einfachen und zugänglichen Ansatz für pharmakologische Experimente mit flüchtigen Anästhetika, der leicht angepasst werden kann, um andere flüchtige Wirkstoffe und experimentelle Endpunkte zu untersuchen.

Einleitung

Nicht-Wassertiermodelle (Würmer, Fliegen, Nagetiere, Kaninchen, Primaten usw.) waren in der Vergangenheit die Modelle, die am häufigsten zur Untersuchung der Anästhesiepharmakologie verwendet wurden. Bei jeder dieser Spezies sind flüchtige Anästhetika (die durch Inhalation von Gas verabreicht werden) weitaus weniger schwierig als die Verabreichung von intravenösen Anästhetika (die entweder intravenös oder intraperitoneal verabreicht werden)¹. Neben der technischen Herausforderung der einfachen Verabreichung der intravenösen Medikamente ist das Erreichen eines stationären Narkosezustands mit flüchtigen Mitteln viel einfacher als mit intravenösen Mitteln².

Die Verabreichung von intravenösen Anästhetika an aquatische Larvenarten kann durch Diffusion aus ihrem umgebenden wässrigen Medium ^3,4 erreicht werden und ist daher eher mit der Verabreichung von flüchtigen Anästhetika für nichtwässrige Spezies vergleichbar. Viele Jahre lang waren Kaulquappen (Xenopus laevis) das Modell der Wahl für die Erforschung von Anästhetika, da die Verabreichung des Medikaments einfach zu verabreichen war und die Pharmakokinetik im stationären Zustand durch einfache Badzugabe des Anästhetikums zu ihrem künstlichen Teichwasser erreicht wurde ^5,6. Es gibt jedoch relativ wenige Beispiele für die Untersuchung flüchtiger Anästhetika in diesem Modell, da gasdichte Apparaturen erforderlich sind, die oft speziell angefertigt werden und umständlich zu verwenden sein können ^7,8.

In den letzten Jahren hat sich der Zebrafisch zu einem bevorzugten Modell für die Untersuchung von intravenösen Anästhetika entwickelt, da die Verabreichung des Arzneimittels ebenso einfach ist und andere Vorteile wie ihre gut beschriebenen komplexen Verhaltensweisen und die Verfügbarkeit kommerzieller Einheiten zur Beobachtung^{dieser Verhaltensweisen 9}. Viele neuere Studien haben solche kommerziell erhältlichen Beobachtungseinheiten verwendet, um nach neuroaktiven Verbindungen, einschließlich Anästhetika, zu suchen, wobei 96-Well- und 24-Well-Plattenformate verwendet wurden, um das Verhalten der Zebrafischlarven^zu quantifizieren 4,10,11,12,13,14,15 . Die Larvenstadien eignen sich aufgrund ihrer Fähigkeit, viele Verhaltensreaktionen zu bewerten, ihrer geringen Größe, ihrer hohen Durchsatzkompatibilität und ihrer gut charakterisierten neuronalen Schaltkreise besonders gut für pharmakologische Studien ^9,16,17. Eine wesentliche Einschränkung in diesen Studien zu Anästhetika im Zebrafischmodell ist jedoch die relative Schwierigkeit bei der Verabreichung von flüchtigen Anästhetika. Diese Einschränkung hat zu wenigen Beispielen für einen Vergleich zwischen flüchtigen und intravenösen Wirkstoffen geführt ^4,15,18. Die Möglichkeit, beide Klassen von Anästhetika in einem einzigen Tiermodell einfach zu untersuchen und zu vergleichen, ist ein wichtiges Instrument, um die Untersuchung der Anästhesiepharmakologie über alle Klassen hinweg zu erleichtern.

Traditionell erforderte die Untersuchung von intravenösen Anästhetika bei einer aquatischen Spezies spezialisierte, oft kundenspezifische Geräte, die schwierig zu bedienen sein können oder möglicherweise nicht ausreichend gasdicht sind, um den Verlust des Anästhetikums für die Dauer des Experiments zu verhindern. Das hier beschriebene Verfahren stellt eine leicht zugängliche Alternative dar, um eine gasdichte Versiegelung in einer Glaskammer herzustellen, die für die Beobachtung des Verhaltens von Zebrafischlarven mit einer kommerziellen Beobachtungseinheit geeignet ist (siehe Materialtabelle).

Protokoll

Alle Zebrafischversuche wurden in Übereinstimmung mit den vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Tierverwendungsprotokollen durchgeführt. Erwachsene Zebrafische wurden in der Wasseranlage der University of Pennsylvania unter der Aufsicht des University Laboratory Animal Resources (ULAR) gehalten. Tübinger Langflossen-Wildtyp-Zebrafische wurden für alle Versuche im eigenen Haus gezüchtet und unter Standard-Haltungsbedingungen mit einem 13/11-h-Hell-Dunkel-Zyklus bis zum Erreichen der 5-Tage-Nachbefruchtung (dpf) gehalten. Die Experimente wurden mit biologischen Replikaten durchgeführt, wobei die Gelege von unterschiedlichen Paarungspaaren abgeleitet wurden, um eine angemessene biologische Vielfalt zu gewährleisten. Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von selbstklebenden Silikonplatten

HINWEIS: Äquivalente dieses Materials (Silikonfolie plus Klebstoff) können kommerziell bezogen werden, aber oft mit höheren Kosten und geringerer Verfügbarkeit.

1. Legen Sie die 0,5 mm starke Silikonplatte auf eine saubere, ebene Fläche.
2. Untersuchen Sie die Blätter auf Falten und vermeiden Sie diese, wenn möglich.
   HINWEIS: Silikonfolien mit Falten haften möglicherweise nicht ausreichend auf dem Klebeband und können zu einer unzureichenden Abdichtung der Vertiefungen und/oder einer schlechten Sicht auf den Zebrafisch führen.
3. Reinigen Sie die Laken mit 70% Alkohol, um Öl oder Schmutz zu entfernen, und lassen Sie sie trocknen.
4. Tragen Sie mit einem Applikator, z. B. einem Pinsel, eine dünne, gleichmäßige Schicht Haftgrundierung auf die Silikonfolie auf. Um ein Überauftragen zu vermeiden, in kleineren Abschnitten arbeiten, da der Klebstoff schnell trocknet (in 1-5 s aushärtet).
   HINWEIS: Ohne diesen Haftungsverstärker haftet das Klebeband nicht ausreichend auf der Silikonfolie.
5. Sobald der Klebstoff aufgetragen ist, richten Sie das doppelseitige Klebeband mit der Silikonfolie aus, wobei die Papierunterlage nach oben zeigt.
6. Tragen Sie das Klebeband nach und nach mit einer Rolle auf das Silikon auf, um die Oberfläche zu glätten und Luftblasen zu entfernen (nach dem ersten Auftragen hilft das Arbeiten mit der Silikonseite nach oben bei der Visualisierung und Entfernung von Luftblasen).
7. Lassen Sie den Haftvermittler 24 h lang auf einer ebenen Fläche vollständig aushärten.
8. Schneiden Sie das selbstklebende Silikon in mindestens 10 mm breite Streifen (7,5 mm Vertiefungsdurchmesser plus Überlappung auf jeder Seite).
   HINWEIS: Wenn jede zweite Reihe der Well-Platte verwendet wird, wirkt sich eine größere Varianz der Streifen nicht negativ auf die Wells in benachbarten Reihen aus, was nicht nur die Anwendung erleichtern kann, sondern auch notwendig ist, um eine Abdichtung um den gesamten Umfang des Wells zu erreichen.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Streifen lang genug sind, um mindestens die Breite einer Reihe der Well-Platte abzudecken.
      HINWEIS: Wenn Sie eine Well-Platte verwenden, die nicht 96-Well-Platte ist, wie z. B. eine 24-Well- oder 48-Well-Platte, können die Streifengrößen an die spezifischen Abmessungen der Platte angepasst oder zugeschnitten werden, um eine ordnungsgemäße Abdeckung unabhängig von der Plattengröße zu gewährleisten.

2. Vorbereitung der Lösungen

HINWEIS: Alle Stamm- und Testlösungen von flüchtigen Anästhetika wurden unmittelbar vor dem Experiment hergestellt, um einen Verlust der Konzentration flüchtiger Verbindungen zu vermeiden.

1. Geben Sie für jede Lösung (Stamm- oder Arbeitslösung) ein Volumen nichtflüchtiges Lösungsmittel (E3-Embryowasser, DMSO usw.) in ein HPLC- oder Szintillationsfläschchen, das in Kombination mit der abschließenden Verdünnung des flüchtigen Anästhetikums das Gesamtvolumen ausreichend ausfüllt und nur minimalen Kopfraum verlässt (siehe Abbildung 1A).
2. Fügen Sie ein flüchtiges Anästhetikum mit einer gasdichten Hamilton-Spritze hinzu und verschließen Sie das Fläschchen schnell.
   HINWEIS: Stammlösungen in Fläschchen mit Septumdeckel können verwendet werden, um weitere Verdünnungen durch das Umfüllen der Lösung mit gasdichten Spritzen zu erleichtern.
3. Mischen Sie dann die Fläschchen (Vortex, Beschallung) nach Bedarf und lagern Sie sie zwischen, während Sie die Zebrafischplatten zubereiten.

3. Aufbau des Verhaltensexperiments

HINWEIS: Dieser Schritt des Protokolls kann etwas Übung erfordern. Es wird empfohlen, ohne Fisch oder Lösungen, die wertvolles Material enthalten, zu arbeiten, bis Sie sich mit der Technik vertraut gemacht haben.

1. Übertragen Sie eine Zebrafischlarve (5 dpf) in jede zweite Reihe der 96-Well-Glasplatte.
   HINWEIS: Wenn Sie jede zweite Reihe leer lassen, kann das Kontaminationspotenzial benachbarter Bohrlöcher durch Überlaufen verringert werden, da die Bohrlöcher in Schritt 3.4 versiegelt werden.
2. Entferne die E3-Lösung vorsichtig aus jeder Vertiefung. Dies kann eine Reihe nach der anderen oder auf der gesamten Platte erfolgen, wenn es schnell gehen kann.
   HINWEIS: Die Zeit, für die sich die Larven außerhalb der Lösung aufhielten, wurde minimiert, um potenziellen Stress zu reduzieren. Alternative Verfahren können auf der Grundlage unterschiedlicher experimenteller Anforderungen verwendet werden, einschließlich einer nur teilweisen Entfernung der Lösung vor der Zugabe der arzneimittelhaltigen Lösung, um den Stress zu minimieren. Das Protokoll sollte an die Erfordernisse des Versuchs angepasst werden, einschließlich der den Tieren eingeräumten Äquilibrierungszeit zum Ausgleich von potenziellem Stress, der Effizienz des Mischens der Lösung und der Genauigkeit der Konzentrationen einer arzneimittelhaltigen Lösung, wenn nicht das gesamte E3 vor der Zugabe der Arbeitslösung entfernt wird.
3. Verwenden Sie als Nächstes eine Transferpipette, um jede Vertiefung in der Reihe mit der experimentellen Lösung zu füllen. Achten Sie darauf, keine Blasen einzuführen. Überfüllen Sie jede Vertiefung (Abbildung 1B).
4. Drücken Sie den Streifen mit den in Schritt 1 hergestellten Silikonklebestreifen schnell nach unten (Abbildung 1C). Dies hilft, Blasenbildung zu verhindern und verhindert, dass Fische in benachbarte Brunnen überlaufen.
5. Drücken Sie fest auf die Oberseite der Platte, um sicherzustellen, dass jede Vertiefung versiegelt ist.
6. Wiederholen Sie die Schritte 2 bis 5, bis die Lösung ausgetauscht und die Vertiefungen für jede zweite Reihe der Vertiefungsplatte versiegelt sind (Abbildung 1D).
7. Drehen Sie die Platte vorsichtig um und untersuchen Sie sie auf Luftblasen.
   HINWEIS: Das Vorhandensein von Luftblasen verdeckt die Visualisierung der Bewegung des Zebrafisches.
8. Setzen Sie die Platte in die Verhaltensbeobachtungseinheit ein (Silikonkleber mit der Klebeseite nach unten) und führen Sie das Verhaltensexperiment durch (siehe Abschnitt Ergebnisse für Details).

Ergebnisse

Vergleich mit traditioneller Open-Well-Beobachtung
Um zu beurteilen, ob die Klebeversiegelung einen Einfluss auf die spontane Bewegung hat, wurde ein Vergleich zwischen den Kontrollen in offenen und verschlossenen Vertiefungen durchgeführt. Wie in Abbildung 2A zu sehen ist, wurde kein statistisch signifikanter Unterschied in der Bewegung zwischen diesen Gruppen für die Standarddauer von ~30 Minuten beobachtet, die in den in diesem Artikel beschriebenen Experimenten verwen...

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur einfachen Verabreichung von flüchtigen Anästhetika wie Sevofluran an Zebrafischlarven, die zur Quantifizierung der Wirksamkeit flüchtiger Anästhetika bei Wildtyp-Fischen verwendet wurde. Obwohl diese Technik konzeptionell einfach ist, kann es Übung erfordern, eine ausreichend abgedichtete, blasenfreie Reihe von Bohrlöchern in einem kurzen Zeitrahmen zu gewährleisten und den Verlust flüchtiger Wirkstoffe zu minimieren. Da diese Methode für flücht...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
96-Well-Mikrotiterplatten aus Glas	Zinsser Nordamerika	3600500	"Diese Glas-Mikrotiterplatten bestehen aus speziellem, hochreinem, temperaturbeständigem Borosilikatglas und die Oberflächen sind säurepoliert. Die Platten sind rechteckig in der Standard-SBS-Mikroplatten-Grundfläche (85 x 127 mm). Diese Glasreaktor-Mikrotiterplatten sind in erster Linie für den Einsatz in chemischen Anwendungen konzipiert und beständig gegen Temperaturen bis zu 530 Grad; C. Sie können autoklaviert werden. Sie werden aus einer homogenen Glasscheibe gefertigt und weisen eine einheitliche Geometrie und Form auf, um gleichbleibende Temperaturen von Bohrloch zu Bohrloch (innerhalb eines typischen Bereichs von 0,2 Grad C) zu gewährleisten."
2,0 mL klar, große Öffnung, 9 mm Gewindefläschchen	Chemglass Biowissenschaften	CV-1150-1232	"Mit einer um 40 % größeren Öffnung sind diese Fläschchen speziell für den Einsatz in Roboterarm-Autosamplern konzipiert. Sie verfügen außerdem über das einzigartige Design des Step-Fläschchens, das einen Einsatz mit begrenztem Volumen präzise im Hals des Fläschchens zentriert. "
3M Doppelseitiges Klebeband 9490LE	AbbVie Inc	24WG90	"3M Double Coated Tape 9490LE mit 3M Laminierkleber 300LSE bietet eine hohe Haftfestigkeit auf den meisten Oberflächen, einschließlich vieler Kunststoffe mit niedriger Oberflächenenergie wie Polypropylen und pulverbeschichtete Lacke. Der Acrylatkleber bietet auch eine hervorragende Haftung auf Oberflächen, die leicht mit Öl verunreinigt sind, das typischerweise bei Maschinenteilen verwendet wird. Das doppelseitige Klebeband 9490LE von 3M bietet auf einer Seite die zusätzliche Funktion des 3M-Laminierklebstoffs 300MP, um eine hervorragende Haftfestigkeit auf einer Vielzahl von Schaumstoff- und Gewebematerialien (6 Zoll x 5 yd) zu gewährleisten.
DanioVision Beobachtungskammer	Noldus	DVOC-0041	"DanioVision ist ein Komplettsystem, das für die Hochdurchsatzprüfung von Zebrafischlarven in Multi-Well-Platten entwickelt wurde. Es umfasst die Beobachtungskammer und die renommierte Video-Tracking-Software EthoVision XT."
DanioVision Temperiergerät	Noldus	DVTCU-0011	"Die DanioVision Temperiereinheit ist ein Durchflusssystem: Wasser fließt gleichmäßig mit der von Ihnen gewählten Temperatur unter die Brunnenplatte. Die Temperatur ist in der gesamten Well-Platte gleich."
Ethovision XT16 Software	Noldus	NSE-EV-BASIS	"EthoVision XT ist die am weitesten verbreitete Video-Tracking-Software, die das Verhalten, die Bewegung und die Aktivität jedes Tieres verfolgt und analysiert, markenrechtlich geschützt von Noldus"
Isofluran	Piramal Intensivpflege	NDC # 66794-017-10	Flüssigkeit zur Inhalation, ein nicht brennbares, nicht explosives Inhalationsanästhetikum, das 100 ml Isofluran enthält. Lagerung bei kontrollierter Raumtemperatur 20° bis 25º C
Scotch-Weld Sofortkleber Grundierung AC79 Klar	3M	"62-3916-0860-1 (Produkt-ID) C2103N (Los)"	"3M Scotch-Weld Instant Adhesive Primer AC79 wurde für den Einsatz auf schwer zu verklebenden Elastomeren mit niedriger Oberflächenenergie wie EPDM, Silikon und anderen Kautschuken entwickelt. Die Vorbereitung und das Auftragen der Oberfläche sind unkompliziert und die Haftgrundierung trocknet schnell, damit die Arbeiten schnell ausgeführt werden können."
Silikonplatten mit einer Dicke von 0,5 mm	verschiedene Lieferanten	N/A	Transluzente Silikonplatten wurden von mehreren Lieferanten gekauft
Speedball Pop-in Hartgummi Brayer mit Kunststoffrahmen, 4 Zoll"	Speedball	793728	"Der Speedball Pop-In Hard Brayer hat eine Walze, die zur einfachen Reinigung herausschnappt. Einteiliger Kunststoffrahmen mit abnehmbarer 4 Zoll breiter Rolle. Hergestellt aus reinem Naturkautschuk mit geschliffener Oberfläche. Der Hartgummi-Brayer ist 4 Zoll breit, hat einen stabilen Kunststoffrahmen und eignet sich hervorragend zum Auftragen von Klebstoff."
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Ultane Sevofluran	AbbVie Inc	NDC # 0074-4456-04	Flüchtige Flüssigkeit zur Inhalation, ist in bernsteinfarbenen Flaschen verpackt, die 250 ml Sevofluran enthalten. Lagerung bei kontrollierter Raumtemperatur 15° d/m; bis 30º C
Wheaton Flüssigszintillationsfläschchen, Kappen auf Fläschchen, Glas, Metallfolie / Zellstoff, 24-400, 20 mL	DWK Lebenswissenschaften	986561	20-ml-Szintillationsfläschchen, die aus Borosilikatglasröhren vom Typ I, PET oder HDPE umgebaut wurden. Erhältlich mit aufgesetzter Kappe.