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Methodenartikel

Nachweis der mitochondrienassoziierten endoplasmatischen Retikulummembrandichtigkeit mittels induzierbarer FRET-Biosensoren

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DOI:

10.3791/67914

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7. August 2026

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School,

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Messung von FET-Werten induzierbarer FRET-Biosensoren, die in vitro auf das ER (CFP-tagged) oder Mitochondrien (YFP-tagged) zielen, um die mitochondrienassoziierte ER-Membranen (MAMs) Tightness zu beurteilen, die die Aβ-Generierung beeinflusst, und diese Methode kann für die Erstscreening synthetischer oder natürlicher MAM-modulierender Mittel als potenzielle AD-Therapeutika verwendet werden.

Zusammenfassung

Mehrere Studien haben gezeigt, dass Anzahl, Länge und Lückenbreite (Dicke) von ER-Mitochondrienkontakten oder mitochondrienassoziierten Membranen (MAMs) ihre biologische Rolle beeinflussen. Unsere früheren Arbeiten zeigten, dass die Stabilisierung enger MAMs, die durch eine Lückenbreite von etwa 7 nm gekennzeichnet sind, zu einer Erhöhung der Amyloid-β (Aβ)-Spiegel führt, während das Vorhandensein von lockeren MAMs mit einer Lückenbreite von etwa 40 nm die Aβ-Produktion in einem dreidimensionalen (3D) neuronalen Modell der Alzheimer-Krankheit (AD) reduziert. Um die Effekte von MAMs mit unterschiedlichen Lückenbreiten zu untersuchen, wurden ER- und Mitochondrien-orientierte FRET (Förster Resonance Energy Transfer)-Biosensoren – ER-CFP (cyanes fluoreszierendes Protein) bzw. Mito-YFP (gelbes fluoreszierendes Protein) – entwickelt, um enge MAMs (<10 nm Spaltbreite) im Vergleich zu lockeren oder nicht-MAMAs zu quantifizieren. FRET tritt auf, wenn sich das Donor-Fluorophor (CFP) und das Akzeptor-Fluorophor (YFP) innerhalb von 10 nm voneinander befinden, was dieses System zur Beurteilung der MAM-Nähe geeignet macht. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des spektral-ratiometrischen FRET zur Messung des Ausmaßes enger MAM-Bildung.

Einleitung

Mitochondrien-assoziierte endoplasmatische Retikulumkontakte (MERCs), die biochemisch als mitochondrienassoziierte ER-Membranen (MAMs) isoliert werden, werden mit mehreren neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter die Alzheimer-Krankheit (AD)1. Die kürzlich vorgeschlagene "MAM-Hypothese" legt nahe, dass MAMs eine zentrale Rolle bei der Bildung von Amyloid-β (Aβ) spielen und damit die pathogene Kaskade von AD einleiten. Diese Kaskade umfasst die Bildung von neurofibrillären Tangles (NFTs), Kalziumdyshomeostase und Neuroinflammation2. MAMs bestehen aus cholesterinreichen, lipidähnlichen Mikrodomänen im endoplasmatischen Retikulum und der äußeren mitochondrialen Membran (OMM), die durch spezifische Tethering-Proteine verbunden sind, die sowohl zu ihrer strukturellen als auch zu ihrer funktionellen Vielfalt beitragen3. Die Stabilisierung der ER-Mitochondrienkontakte beeinflusst verschiedene zelluläre Prozesse, darunter die ER-Kalziumsignalübertragung und Apoptose 4,5. Es wird geschätzt, dass 5 % bis 20 % der Mitochondrien physische Kontakte mit dem ER bilden, umMAMs 6 zu bilden. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Anzahl, Länge und Lückenbreite (Dicke) zwischen ER und Mitochondrien an MAM-Standorten wichtige Determinanten ihrer funktionellen Rolle sind. Kryo-Elektronenmikroskopie und in-vivo-Analysen der Mausleber haben gezeigt, dass der Stoffwechselzustand der Hepatozyten sowohl die Dicke (von 14 nm bis 20 nm) als auch die Länge (von 145 nm bis 270 nm) von MAMs7 moduliert.

MAMs treten auch als potenzielle therapeutische Ziele für verschiedene Erkrankungen auf, darunter Krebs und Stoffwechselerkrankungen. MAM-Dicke oder Spaltbreite reguliert das Überleben der Zelle. Die konstitutiven MAM-Stabilisatoren, MAM 1X und MAM 9X, die dazu entwickelt wurden, enge (6 nm ± 1 nm Spaltbreite) bzw. lockere MAMs (24 nm ± 3 nm Spaltbreite) zu stabilisieren, zeigten, dass die Stabilisierung enger MAMs die Aβ-Erzeugung in einem neuartigen 3D-Neuralkulturmodell von AD dramatisch erhöhte. Im Gegensatz dazu hatte die Stabilisierung der lockeren MAMs keine Wirkung8. Daher kann die Umwandlung der Stabilisierung enger MAMs in lose MAMs vorteilhaft sein, um die Amyloidpathologie zu senken. Die strukturellen und funktionalen Komplexitäten sowie das Fehlen einer präzisen quantitativen Analyse des Grads der MAM-Stabilisierung machen es schwierig, MAMs für die Wirkstoffforschung gezielt anzuvisieren. Eine neuartige Live-Cell-Bildgebung und kymographiebasierte Analyse der axonalen Geschwindigkeit der ER-gebundenen Mitochondrien zeigte, dass die axonale Geschwindigkeit der Mitochondrien als Maßstab zur quantitativen Messung der MAM-Stabilisierung verwendet werden kann, da engerer Kontakt mit dem ER die mitochondriale axonale Geschwindigkeit signifikant reduzierte im Vergleich zu freien Mitochondrien 8,9. Mit einem induzierbaren Stabilisator von MAMs in hAPP-exprimierenden Neuro 2A (N2AAPP)-Zellen8 fanden wir heraus, dass die Verschärfung der MAM-Lückenbreiten die Aβ-Erzeugung dosisabhängig erhöht8. Die induzierbaren MAM-Stabilisatoren sind Expressionsplasmide, die die CFP-(cyan-fluoreszenzprotein)-epitope-markierten ER-targeting- und YFP-(yellow fluorescence protein)-epitope-tagged mitochondrien-targetierte Biosensoren codieren, die mit den rapamycininduzierbaren FK506-rapamycinbindenden (FRB) oder 12-kDa FK506-bindenden Proteindomänen (FKBP) fusionieren. Die Biosensoren wurden als ER-CFP bzw. Mito-YFP bezeichnet. Das CFP ist ein Donor-Fluorophor, das Energie an den Akzeptor-Fluorophor YFP überträgt, wenn sie um >10 nm getrennt sind. Zellen (N2AAPP), die die induzierbaren Biosensoren exprimieren, erhöhten die Aβ-Erzeugung während der Rapamycin-Behandlung8, was darauf hindeutet, dass zunehmende enge MAMs die Aβ-Erzeugung erhöht. Diese Methoden sind vorteilhaft, um kleine Molekülmodulatoren von MAMs und deren effektive Konzentration zu screenen, die zur Stabilisierung eines optimalen Niveaus kompakter MAMs erforderlich sind, die pathogene ("Aβ-zunehmende") in therapeutische ("Aβ-Senkung") umwandeln, ohne die ER- und Mitochondrienkontakte, die für das Zellüberleben wichtig sind, vollständig zu destabilisieren.

Experimentelles Modell
Diese Studie verwendete Neuro2A(N2A)-Zellen, die konstitutiv APP751 (N2AAPP) exprimierten. Diese Zellen geben nachweisbare Aβ-Werte in das konditionierte Medium (CM) ab, verglichen mit naiven N2A-Zellen. N2AAPP-Zellen wurden in DMEM erhalten, ergänzt mit 10 % FBS, 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin und 2 mM L-Glutamat ergänzt mit 200 μg/mL G418, wie zuvorbeschrieben 10.

Expressionsplasmid
Ein Expressionsplasmid wurde erzeugt, indem die YFP (gelbes fluoreszierendes Protein)-markierte mitochondriale Zielsequenz des säugetierartigen A-Kinase-Ankerproteins 1 [AKAP1(34-63)] und der CFP-(cyan-fluoreszierenden Protein)-markierten ER-Zielsequenz der phosphatidylinositol-3-phosphatase-Sac1-phosphatase [Sac1(521-587)] mit einer selbstspaltenden Tav2A-Sequenz, die die EGRGSLLTLTCGDVEENPGP-Peptidsequenz kodiert, kodiert als pYFP-AKAP1-Tav2A-Sac1-CFP8 kodiert wurde. Das mit Tav2A fusionierte Expressionsplasmid ist ebenfalls flankiert von Nukleotidsequenzen, die die FK506-Rapamycin-Bindungsdomäne (FRB) codieren [EMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPL HAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNV (K 2095P)DLTQAWDLYYHVFRRISKQ] oder der 12-kDa FK506-bindenden Protein-(FKBP)-Domäne (MGVEKQVIRPGNGPKPAPGQTVTVTVHCTGGGKD GDLSQKSQKFWSTDEGDEGQKPFSFQIGIGAVIKGWDEGVIGMQ IGEVARLRCSDYAYGAGGFPAWGIQPNSVLDFEIEVLSVQ). Das Fusionsplasmid FRB-YFP-AKAP1(34-63)-Tav2A-Sac1(521-587)-CFP-FKBP, hier als MAM-Tav2A bezeichnet, wurde erzeugt, um gleichmolare Expressionswerte von FRB-YFP-AKAP1(34-63) und Sac1(521-587)-CFP-FKBP für die ratiometrische FET-Analyse zu erhalten. Der Sac1(521-587)-CFP-FKBP, bezeichnet als ER-CFP, ist das Donor-Fluorophor, während Mito-YFP-FRB, bezeichnet als Mito-YFP, der Akzeptorfluorophor ist, der FRET erzeugt, wenn er um ~10 nm8 getrennt ist. Daher erkennen die FRET-basierten Biosensoren enge MAMs (6–10 nm, Spaltbreite). FRB und FKBP wurden eingeführt, um die Enge der MAM-Spaltbreiten bei der Zugabe von Rapamycin in einer dosisabhängigen Weise zu induzieren, die durch Messung des erhöhten FRET-Signals8 quantifiziert werden konnte.

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Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Transfektion

  1. Transfekt N2AAPP-Zellen mit MAM-Tav2A-Expressionsplasmid (14–18 H).
    1. Vor Beginn werden 1 × 10 6 N2A APP-Zellenpro Brunnen mit 6-Bohrloch-Platten mit Glasabdeckschichten aufbewahrt und die Zellen 12–16 Stunden im Wachstumsmedium gehalten.
    2. Transfekt 1-3 μg MAM-Tav2A-Plasmid (Supplementary File 1) mit dem Lipofectamin-Transfektionsreagenz gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    3. Nach 12–16 Stunden Transfektion führen Sie eine medikamentöse Behandlung durch.
      HINWEIS: Es sollten immer Zellen transfiziert werden, mit einem Expressionsplasmid, das nur den Spender (ER-CFP) oder den Akzeptor (Mito-YFP) kodiert, um als FRET-Hintergrund zu dienen.

2. Drogentherapie

  1. Behandeln Sie die MAM-Tav2A-exprimierenden N2A-APP-Zellen mit Rapamycin (Rapa) oder Rapalog (Log) (3–6 Stunden).
    1. Vor der Behandlung bereiten Sie Stocklösungen (10 mM) aus Rapa und Log vor.
    2. Wechseln Sie das Medium durch frische Medien mit 0 nM, 100 nM oder 250 nM Rapa oder Log.
    3. Nach 3 Stunden Behandlung werden 3,3 % Paraformaldehyd (PFA) hinzugefügt, um die Zellen zu fixieren.
    4. Bereiten Sie die Objektträger für die Fluoreszenz-Konfokalmikroskopie vor, indem Sie einen Tropfen Antifade-Reagenz aufgeben.
    5. Befestige die Deckfolien über den Tropfen und drücke sanft mit der Pinzette.
      HINWEIS: Die Glasdeckblätter sind zerbrechlich und erfordern Vorsicht. Als Alternative zu Glasdeckfolien verwenden Sie Glasbodenplatten. Der Hauptnachteil der Verwendung von Glasbodenplatten besteht darin, dass das Antifade-Reagenz nicht verwendet werden kann, was die Bildgebung aufgrund des Bleichens der Fluorophore erschwert. VERWENDEN Sie KEIN Antifade-Reagenz, das DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindol) enthält, da seine blaue Fluoreszenz das FRET zwischen CFP und YFP stören würde.

3. Konfokalmikroskopie für Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET)

  1. Legen Sie die Objektträger unter ein umgekehrtes Mikroskop und stellen Sie den Fokus des Mikroskops an, bis die Zellen sichtbar werden.
  2. Erzeugen Sie das Fluorophor mit einem 440-nm-Laser und nehmen Sie Bilder mit 468–503 nm Emission für den Donor-CFP (FKBP-CFP-ER) oder 525–565 nm für den Akzeptor-YFP (FRB-YFP-Mito) auf.
  3. Stellen Sie die Signalintensität mit dem eingebauten Leuchtstoffröhrenfilter ein, bis das Hintergrundsignal abgeklungen ist (sollte fast durchgehend schwarz sein).
    HINWEIS: Ein konfokales Mikroskop wurde verwendet, um fluoreszierende Bilder mit NIS Element AR-Software aufzunehmen. Es wurde eine 60-fache Vergrößerung mit einer Auflösung von 512 Pixeln verwendet.
  4. Speichere die Bilder als .nds-Dateien.
  5. Führen Sie eine spektral-ratiometrische FRET-Analyse durch.

4. Ratiometrische FRET-Analyse (6 - 12 Stunden)

HINWEIS: Die Fluoreszenzemission des Spenders ER-CFP (468–503 nm) und des Akzeptors Mito-YFP (525–565 nm) wurde mit einem konfokalen Mikroskop nachgewiesen. Die ImageJ-Software wurde verwendet, um die durchschnittliche Pixelfluoreszenzintensität nach Hintergrundsubtraktion zu quantifizieren. Das Verhältnis von YFP- zu CFP-Emissionsintensität wurde berechnet und als Anzeige für die spektrale RET-Analyse verwendet.

  1. Open Image J (Fidschi).
  2. Entweder zieht man die .nds-Datei auf Bild J oder drückt Datei -> Öffnen und wählt das Bild aus.
  3. Auf dem folgenden Bildschirm wählen Sie das Feld Split Channels aus.
  4. Klicken Sie auf das C = 0 Panel.
  5. Klicken Sie auf Analysieren > Messen.
    HINWEIS: Schreiben Sie den Mittelwert für die spätere Berechnung auf.
  6. Klicken Sie auf Prozess -> Mathematik -> subtrahieren.
  7. Hier kommt der Mittelwert ins Spiel.
  8. Wiederholen Sie Schritt 4 für das C = 1 Panel.
  9. Klicken Sie auf das Freihand-Auswahlwerkzeug .
  10. Umkreise eine Zelle von Interesse und drücke dann Strg+T, um sie auf die ROI zu speichern.
  11. Klicken Sie unten im ROI auf "Alles anzeigen ", um anzuzeigen, was Sie bereits ausgewählt haben.
  12. Wähle alle ausgewählten Zellen aus und klicke auf Messen, notiere diese Werte in Excel.
  13. Klicken Sie auf das Feld C = 1 und klicken Sie auf Alle anzeigen.
  14. Wähle alle Zellen aus, klicke erneut auf Messen und trage diese Werte in eine separate Spalte in Excel ein.
  15. Erstellen Sie in Excel eine Funktion, um die Werte des Spendersignals über den Empfänger zu legen (C0/C1). Das ist das FRET-Verhältnis.

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Ergebnisse

Die ratiometrische RET-Analyse von FACS-angereicherten N2A-APP-Zellen, die MAM-Tav2A exprimieren, zeigte einen dosisabhängigen Anstieg der Aβ40-Spiegel nach der Rapamycin-Behandlung8. Rapamycin wirkt, indem es den Säugetierziel des Rapamycin-(mTOR)-Signalwegs hemmt, was wiederum die Expression von TREM2 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 2) in Mikroglia herunterreguliert, was zu einer verminderten Aβ-Plaque-...

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Diskussion

Die Modulation von MAMs ist ein aufstrebendes Forschungsfeld mit potenziellen Auswirkungen auf verschiedene Erkrankungen, darunter Krebs, Stoffwechselstörungen und neurodegenerative Erkrankungen13. Viele pharmakologische Wirkstoffe, darunter der Dynaein-Antagonist LDC-3/Dynarrestin, das Antidiabetikum Metformin und das Krebshemmer Sulforaphan, stören MAMs und befinden sich derzeit in präklinischen und klinischen Studien für Krebs und Stoffwechselerkrankungen. Dies...

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Danksagungen

Wir danken Dr. Rudolph E. Tanzi, Professor am Massachusetts General Hospital (MGH), aufrichtig für seine aufschlussreichen Kommentare zum Manuskript. Wir danken Dr. Masato Maesako, Assistenzprofessor am MGH, für seine Expertise in FLIM-Analysen. Wir danken Dr. Gyorgy Hajnoczky, Professor an der Thomas Jefferson University in Philadelphia, für die großzügige Bereitstellung von Expressionsplasmiden, die ER-CFP oder Mito-YFP codieren. Diese Studie wurde vom Cure Alzheimer's Fund to RB unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BSAFisher Scientific501781532
Konfokales Mikroskop Olympus FV3000RS (Tokio, Japan)N/A
DMEM mit GlutaMAX-ErgänzungGibco/Thermo Fisher Scientific10564011
EDTA  Life Technologies41116134
Falcon 6-Well-Platten VWR International41122107
GAPDH-Polyklonaler AntikörperThermo Fisher ScientificPA1-988
Gelatine VWR International9000-70-8
Geneticin (G418-Sulfat)Gibco/Thermo Fisher Scientific10131035
GFP-Monoklonaler AntikörperInvitrogenMA5-15256
Graphpad Prism N/APrism 9, Version 9.5.0N/A
HeparinSigma-Aldrich H0200000
ImageJ-Software ImageJ 1.53aN/A
Invertiertes Konfokalmikroskop Nikon (C2 Eclipse Ti2)N/A
Lipofectamine2000Invitrogen11668027
MS Excel  Microsoft Excel, Version 2302N/A
NaCl  Fisher Scientific7647145
NuPAGE 4–12% Bis-Tris-Gel  InvitrogenNP0321BOX
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Lonza 17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10 N/A
Tris-HCL, pH 7,6  Boston BioProducts42000000
Triton X-100  Sigma-AldrichT8787
Trypsin-EDTAGibco/Thermo Fisher Scientific25200056
Tween 20Fisher Scientific501657287

Referenzen

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