Methodenartikel

Nachweis der mitochondrienassoziierten endoplasmatischen Retikulummembrandichtigkeit mittels induzierbarer FRET-Biosensoren

DOI:

10.3791/67914

⸱

7. August 2026

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School,

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben eine Methode zur Messung von FET-Werten induzierbarer FRET-Biosensoren, die in vitro auf das ER (CFP-tagged) oder Mitochondrien (YFP-tagged) zielen, um die mitochondrienassoziierte ER-Membranen (MAMs) Tightness zu beurteilen, die die Aβ-Generierung beeinflusst, und diese Methode kann für die Erstscreening synthetischer oder natürlicher MAM-modulierender Mittel als potenzielle AD-Therapeutika verwendet werden.

Zusammenfassung

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Mehrere Studien haben gezeigt, dass Anzahl, Länge und Lückenbreite (Dicke) von ER-Mitochondrienkontakten oder mitochondrienassoziierten Membranen (MAMs) ihre biologische Rolle beeinflussen. Unsere früheren Arbeiten zeigten, dass die Stabilisierung enger MAMs, die durch eine Lückenbreite von etwa 7 nm gekennzeichnet sind, zu einer Erhöhung der Amyloid-β (Aβ)-Spiegel führt, während das Vorhandensein von lockeren MAMs mit einer Lückenbreite von etwa 40 nm die Aβ-Produktion in einem dreidimensionalen (3D) neuronalen Modell der Alzheimer-Krankheit (AD) reduziert. Um die Effekte von MAMs mit unterschiedlichen Lückenbreiten zu untersuchen, wurden ER- und Mitochondrien-orientierte FRET (Förster Resonance Energy Transfer)-Biosensoren – ER-CFP (cyanes fluoreszierendes Protein) bzw. Mito-YFP (gelbes fluoreszierendes Protein) – entwickelt, um enge MAMs (<10 nm Spaltbreite) im Vergleich zu lockeren oder nicht-MAMAs zu quantifizieren. FRET tritt auf, wenn sich das Donor-Fluorophor (CFP) und das Akzeptor-Fluorophor (YFP) innerhalb von 10 nm voneinander befinden, was dieses System zur Beurteilung der MAM-Nähe geeignet macht. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des spektral-ratiometrischen FRET zur Messung des Ausmaßes enger MAM-Bildung.

Einleitung

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Mitochondrien-assoziierte endoplasmatische Retikulumkontakte (MERCs), die biochemisch als mitochondrienassoziierte ER-Membranen (MAMs) isoliert werden, werden mit mehreren neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter die Alzheimer-Krankheit (AD)1. Die kürzlich vorgeschlagene "MAM-Hypothese" legt nahe, dass MAMs eine zentrale Rolle bei der Bildung von Amyloid-β (Aβ) spielen und damit die pathogene Kaskade von AD einleiten. Diese Kaskade umfasst die Bildung von neurofibrillären Tangles (NFTs), Kalziumdyshomeostase und Neuroinflammation2. MAMs bestehen aus cholesterinreichen, lipidähnlichen Mikrodomänen im endoplasmatischen Retikulum und der äußeren mitochondrialen Membran (OMM), die durch spezifische Tethering-Proteine verbunden sind, die sowohl zu ihrer strukturellen als auch zu ihrer funktionellen Vielfalt beitragen3. Die Stabilisierung der ER-Mitochondrienkontakte beeinflusst verschiedene zelluläre Prozesse, darunter die ER-Kalziumsignalübertragung und Apoptose 4,5. Es wird geschätzt, dass 5 % bis 20 % der Mitochondrien physische Kontakte mit dem ER bilden, umMAMs 6 zu bilden. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Anzahl, Länge und Lückenbreite (Dicke) zwischen ER und Mitochondrien an MAM-Standorten wichtige Determinanten ihrer funktionellen Rolle sind. Kryo-Elektronenmikroskopie und in-vivo-Analysen der Mausleber haben gezeigt, dass der Stoffwechselzustand der Hepatozyten sowohl die Dicke (von 14 nm bis 20 nm) als auch die Länge (von 145 nm bis 270 nm) von MAMs7 moduliert.

MAMs treten auch als potenzielle therapeutische Ziele für verschiedene Erkrankungen auf, darunter Krebs und Stoffwechselerkrankungen. MAM-Dicke oder Spaltbreite reguliert das Überleben der Zelle. Die konstitutiven MAM-Stabilisatoren, MAM 1X und MAM 9X, die dazu entwickelt wurden, enge (6 nm ± 1 nm Spaltbreite) bzw. lockere MAMs (24 nm ± 3 nm Spaltbreite) zu stabilisieren, zeigten, dass die Stabilisierung enger MAMs die Aβ-Erzeugung in einem neuartigen 3D-Neuralkulturmodell von AD dramatisch erhöhte. Im Gegensatz dazu hatte die Stabilisierung der lockeren MAMs keine Wirkung8. Daher kann die Umwandlung der Stabilisierung enger MAMs in lose MAMs vorteilhaft sein, um die Amyloidpathologie zu senken. Die strukturellen und funktionalen Komplexitäten sowie das Fehlen einer präzisen quantitativen Analyse des Grads der MAM-Stabilisierung machen es schwierig, MAMs für die Wirkstoffforschung gezielt anzuvisieren. Eine neuartige Live-Cell-Bildgebung und kymographiebasierte Analyse der axonalen Geschwindigkeit der ER-gebundenen Mitochondrien zeigte, dass die axonale Geschwindigkeit der Mitochondrien als Maßstab zur quantitativen Messung der MAM-Stabilisierung verwendet werden kann, da engerer Kontakt mit dem ER die mitochondriale axonale Geschwindigkeit signifikant reduzierte im Vergleich zu freien Mitochondrien 8,9. Mit einem induzierbaren Stabilisator von MAMs in hAPP-exprimierenden Neuro 2A (N2AAPP)-Zellen8 fanden wir heraus, dass die Verschärfung der MAM-Lückenbreiten die Aβ-Erzeugung dosisabhängig erhöht8. Die induzierbaren MAM-Stabilisatoren sind Expressionsplasmide, die die CFP-(cyan-fluoreszenzprotein)-epitope-markierten ER-targeting- und YFP-(yellow fluorescence protein)-epitope-tagged mitochondrien-targetierte Biosensoren codieren, die mit den rapamycininduzierbaren FK506-rapamycinbindenden (FRB) oder 12-kDa FK506-bindenden Proteindomänen (FKBP) fusionieren. Die Biosensoren wurden als ER-CFP bzw. Mito-YFP bezeichnet. Das CFP ist ein Donor-Fluorophor, das Energie an den Akzeptor-Fluorophor YFP überträgt, wenn sie um >10 nm getrennt sind. Zellen (N2AAPP), die die induzierbaren Biosensoren exprimieren, erhöhten die Aβ-Erzeugung während der Rapamycin-Behandlung8, was darauf hindeutet, dass zunehmende enge MAMs die Aβ-Erzeugung erhöht. Diese Methoden sind vorteilhaft, um kleine Molekülmodulatoren von MAMs und deren effektive Konzentration zu screenen, die zur Stabilisierung eines optimalen Niveaus kompakter MAMs erforderlich sind, die pathogene ("Aβ-zunehmende") in therapeutische ("Aβ-Senkung") umwandeln, ohne die ER- und Mitochondrienkontakte, die für das Zellüberleben wichtig sind, vollständig zu destabilisieren.

Experimentelles Modell
Diese Studie verwendete Neuro2A(N2A)-Zellen, die konstitutiv APP751 (N2AAPP) exprimierten. Diese Zellen geben nachweisbare Aβ-Werte in das konditionierte Medium (CM) ab, verglichen mit naiven N2A-Zellen. N2AAPP-Zellen wurden in DMEM erhalten, ergänzt mit 10 % FBS, 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin und 2 mM L-Glutamat ergänzt mit 200 μg/mL G418, wie zuvorbeschrieben 10.

Expressionsplasmid
Ein Expressionsplasmid wurde erzeugt, indem die YFP (gelbes fluoreszierendes Protein)-markierte mitochondriale Zielsequenz des säugetierartigen A-Kinase-Ankerproteins 1 [AKAP1(34-63)] und der CFP-(cyan-fluoreszierenden Protein)-markierten ER-Zielsequenz der phosphatidylinositol-3-phosphatase-Sac1-phosphatase [Sac1(521-587)] mit einer selbstspaltenden Tav2A-Sequenz, die die EGRGSLLTLTCGDVEENPGP-Peptidsequenz kodiert, kodiert als pYFP-AKAP1-Tav2A-Sac1-CFP8 kodiert wurde. Das mit Tav2A fusionierte Expressionsplasmid ist ebenfalls flankiert von Nukleotidsequenzen, die die FK506-Rapamycin-Bindungsdomäne (FRB) codieren [EMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPL HAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNV (K 2095P)DLTQAWDLYYHVFRRISKQ] oder der 12-kDa FK506-bindenden Protein-(FKBP)-Domäne (MGVEKQVIRPGNGPKPAPGQTVTVTVHCTGGGKD GDLSQKSQKFWSTDEGDEGQKPFSFQIGIGAVIKGWDEGVIGMQ IGEVARLRCSDYAYGAGGFPAWGIQPNSVLDFEIEVLSVQ). Das Fusionsplasmid FRB-YFP-AKAP1(34-63)-Tav2A-Sac1(521-587)-CFP-FKBP, hier als MAM-Tav2A bezeichnet, wurde erzeugt, um gleichmolare Expressionswerte von FRB-YFP-AKAP1(34-63) und Sac1(521-587)-CFP-FKBP für die ratiometrische FET-Analyse zu erhalten. Der Sac1(521-587)-CFP-FKBP, bezeichnet als ER-CFP, ist das Donor-Fluorophor, während Mito-YFP-FRB, bezeichnet als Mito-YFP, der Akzeptorfluorophor ist, der FRET erzeugt, wenn er um ~10 nm8 getrennt ist. Daher erkennen die FRET-basierten Biosensoren enge MAMs (6–10 nm, Spaltbreite). FRB und FKBP wurden eingeführt, um die Enge der MAM-Spaltbreiten bei der Zugabe von Rapamycin in einer dosisabhängigen Weise zu induzieren, die durch Messung des erhöhten FRET-Signals8 quantifiziert werden konnte.

Protokoll

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Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Transfektion

  1. Transfekt N2AAPP-Zellen mit MAM-Tav2A-Expressionsplasmid (14–18 H).
    1. Vor Beginn werden 1 × 10 6 N2A APP-Zellenpro Brunnen mit 6-Bohrloch-Platten mit Glasabdeckschichten aufbewahrt und die Zellen 12–16 Stunden im Wachstumsmedium gehalten.
    2. Transfekt 1-3 μg MAM-Tav2A-Plasmid (Supplementary File 1) mit dem Lipofectamin-Transfektionsreagenz gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    3. Nach 12–16 Stunden Transfektion führen Sie eine medikamentöse Behandlung durch.
      HINWEIS: Es sollten immer Zellen transfiziert werden, mit einem Expressionsplasmid, das nur den Spender (ER-CFP) oder den Akzeptor (Mito-YFP) kodiert, um als FRET-Hintergrund zu dienen.

2. Drogentherapie

  1. Behandeln Sie die MAM-Tav2A-exprimierenden N2A-APP-Zellen mit Rapamycin (Rapa) oder Rapalog (Log) (3–6 Stunden).
    1. Vor der Behandlung bereiten Sie Stocklösungen (10 mM) aus Rapa und Log vor.
    2. Wechseln Sie das Medium durch frische Medien mit 0 nM, 100 nM oder 250 nM Rapa oder Log.
    3. Nach 3 Stunden Behandlung werden 3,3 % Paraformaldehyd (PFA) hinzugefügt, um die Zellen zu fixieren.
    4. Bereiten Sie die Objektträger für die Fluoreszenz-Konfokalmikroskopie vor, indem Sie einen Tropfen Antifade-Reagenz aufgeben.
    5. Befestige die Deckfolien über den Tropfen und drücke sanft mit der Pinzette.
      HINWEIS: Die Glasdeckblätter sind zerbrechlich und erfordern Vorsicht. Als Alternative zu Glasdeckfolien verwenden Sie Glasbodenplatten. Der Hauptnachteil der Verwendung von Glasbodenplatten besteht darin, dass das Antifade-Reagenz nicht verwendet werden kann, was die Bildgebung aufgrund des Bleichens der Fluorophore erschwert. VERWENDEN Sie KEIN Antifade-Reagenz, das DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindol) enthält, da seine blaue Fluoreszenz das FRET zwischen CFP und YFP stören würde.

3. Konfokalmikroskopie für Fluoreszenzresonanzenergieübertragung (FRET)

  1. Legen Sie die Objektträger unter ein umgekehrtes Mikroskop und stellen Sie den Fokus des Mikroskops an, bis die Zellen sichtbar werden.
  2. Erzeugen Sie das Fluorophor mit einem 440-nm-Laser und nehmen Sie Bilder mit 468–503 nm Emission für den Donor-CFP (FKBP-CFP-ER) oder 525–565 nm für den Akzeptor-YFP (FRB-YFP-Mito) auf.
  3. Stellen Sie die Signalintensität mit dem eingebauten Leuchtstoffröhrenfilter ein, bis das Hintergrundsignal abgeklungen ist (sollte fast durchgehend schwarz sein).
    HINWEIS: Ein konfokales Mikroskop wurde verwendet, um fluoreszierende Bilder mit NIS Element AR-Software aufzunehmen. Es wurde eine 60-fache Vergrößerung mit einer Auflösung von 512 Pixeln verwendet.
  4. Speichere die Bilder als .nds-Dateien.
  5. Führen Sie eine spektral-ratiometrische FRET-Analyse durch.

4. Ratiometrische FRET-Analyse (6 - 12 Stunden)

HINWEIS: Die Fluoreszenzemission des Spenders ER-CFP (468–503 nm) und des Akzeptors Mito-YFP (525–565 nm) wurde mit einem konfokalen Mikroskop nachgewiesen. Die ImageJ-Software wurde verwendet, um die durchschnittliche Pixelfluoreszenzintensität nach Hintergrundsubtraktion zu quantifizieren. Das Verhältnis von YFP- zu CFP-Emissionsintensität wurde berechnet und als Anzeige für die spektrale RET-Analyse verwendet.

  1. Open Image J (Fidschi).
  2. Entweder zieht man die .nds-Datei auf Bild J oder drückt Datei -> Öffnen und wählt das Bild aus.
  3. Auf dem folgenden Bildschirm wählen Sie das Feld Split Channels aus.
  4. Klicken Sie auf das C = 0 Panel.
  5. Klicken Sie auf Analysieren > Messen.
    HINWEIS: Schreiben Sie den Mittelwert für die spätere Berechnung auf.
  6. Klicken Sie auf Prozess -> Mathematik -> subtrahieren.
  7. Hier kommt der Mittelwert ins Spiel.
  8. Wiederholen Sie Schritt 4 für das C = 1 Panel.
  9. Klicken Sie auf das Freihand-Auswahlwerkzeug .
  10. Umkreise eine Zelle von Interesse und drücke dann Strg+T, um sie auf die ROI zu speichern.
  11. Klicken Sie unten im ROI auf "Alles anzeigen ", um anzuzeigen, was Sie bereits ausgewählt haben.
  12. Wähle alle ausgewählten Zellen aus und klicke auf Messen, notiere diese Werte in Excel.
  13. Klicken Sie auf das Feld C = 1 und klicken Sie auf Alle anzeigen.
  14. Wähle alle Zellen aus, klicke erneut auf Messen und trage diese Werte in eine separate Spalte in Excel ein.
  15. Erstellen Sie in Excel eine Funktion, um die Werte des Spendersignals über den Empfänger zu legen (C0/C1). Das ist das FRET-Verhältnis.

Ergebnisse

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Die ratiometrische RET-Analyse von FACS-angereicherten N2A-APP-Zellen, die MAM-Tav2A exprimieren, zeigte einen dosisabhängigen Anstieg der Aβ40-Spiegel nach der Rapamycin-Behandlung8. Rapamycin wirkt, indem es den Säugetierziel des Rapamycin-(mTOR)-Signalwegs hemmt, was wiederum die Expression von TREM2 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 2) in Mikroglia herunterreguliert, was zu einer verminderten Aβ-Plaque-Entfernung in 5XFAD-Mausmodellen der Alzheimer-Krankheit11 führt. Das Rapamycin-Analog AP21967, allgemein als Rapalog (Log) bezeichnet, weist eine geringe Affinität für mTOR auf und ist daher relativ ungiftig für Zellen. Es behält jedoch die Fähigkeit, die FRB-Domäne mit derselben Affinität wie Rapamycin zu binden, aufgrund einer kompensatorischen, höhlenbildenden Mutation (K2095P), die in die FRB-Domäne12 eingeführt wurde.

Rapa- und Log-Behandlung erhöhte das FRET-Verhältnis (Abbildung 1). Die Behandlung zeigte kaum oder keine Wirkung auf die Spiegel von APP oder anderen MAM-Proteinen wie IP3R3 oder VDAC1. Daher erhöhte zunehmende enge (<10 nm) MAMs die Aβ-Erzeugung in vitro8. Bemerkenswert ist, dass auch die in naiven N2A-Zellen durchgeführten FRET-Assays ähnliche Ergebnisse lieferten.

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Abbildung 1: Die Verschärfung der MAM-Lückenbreiten erhöhte die Aβ-Erzeugung in vitro. (A) Schaltplan des induzierbaren MAM-Stabilisators CFP-FRB-ER-Tav2A-Mito-FKBP-YFP (MAM-Tav2A), der sich selbst spaltet, äquimolare Werte des Spenders (CFP-FRB-ER oder ER-CFP) und des Akzeptors (Mito-FKBP-YFP oder Mito-YFP) erzeugt und FRET/FLIM fördert, wenn er an die endogenen, enge MAMs befestigt ist oder die enge MAM-Bildung durch Stimulation der FRB- und FKBP-Interaktion mit Rapamycin (Rapa) oder dessen Analog Rapalog (Log) verstärkt. (B) IB von Zellen, die MAM-Tav2A (Tav2A) exprimieren und eine äquimolare Expression von CFP-ER (blauer Kasten) und Mito-YFP (gelber Kasten) nach der Selbstspaltung von Tav2A zeigen. (C) Konfokale Bilder von DMSO (Veh) oder Rapa (250 nM) behandelten Zellen, die MAM-Tav2A überexprimieren. (D,E). Ratiometrische RET-Analyse von Zellen, die ohne (Veh) oder mit 100 nM Rapamycin (Rapa) (D) oder Rapalog (Log) (E) behandelt wurden. FRET-Werte werden als Intensitätsverhältnisse zwischen Kanal 2 (465–500 nm) und Kanal 1 (525–555 nm) dargestellt. Für jede FRET-Analyse wurden 40–50 Zellen zufällig ausgewählt, um Rendis zellweise zu generieren. Einweg-ANOVA. S. < 0,0001. (F) Repräsentatives Western-Blot-Bild von MAM-Tav2A-exprimierendenN2A-APP-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit Rivastigmin (Riv: 0 oder 50 μM). MAM-Tav2A erzeugte äquimolare Werte des Spenders (CFP-ER) und des Akzeptors (Mito-YFP). (G) Quantifizierung des FRET-Verhältnisses zwischen Spender und Akzeptor von vehicle-behandeltem (0 μM) oder Riv-behandeltem (50 μM). (H) Aβ ELISA (Wako) des konditionierten Mediums (CM) der vehikelbehandelten (0 μM) oder Riv-behandelten (50 μM) Zellen zeigte nach 50 μM Riv-Behandlung eine signifikante Reduktion der Aβ40 (pM)-Spiegel. n = 6, p < 0,001. (I) FRET (Verhältnis) und Aβ (pM) Werte werden tabelliert. Die Figur wurde von Zellmer et al.8 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Datei 1: MAM-Tav2A-Plasmid-Sequenzdatei. Die DNA-Sequenz des Expressionsplasmids, das die ER-zielorientierte Sac1-Sequenz kodiert (521FLALPIIMVVAFSMCIICLLMA GDTWTETLAYVLFWGVASIGTFFIILYNGYNGKDFVDAPRLVQ KEKID587), verknüpft mit FKBP- und CFP-Sequenzen, und die mitochondrienzielende AKAP1-Sequenz (34SSHDEQQVEAGAVQLRADPAIKEPLPVEDV63) verknüpft mit FRB- und YFP-Sequenzen, die mit der selbstspaltenden Tav2A-Sequenz verbunden sind (EGRGSLLTCTCGD VEENPGP). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Modulation von MAMs ist ein aufstrebendes Forschungsfeld mit potenziellen Auswirkungen auf verschiedene Erkrankungen, darunter Krebs, Stoffwechselstörungen und neurodegenerative Erkrankungen13. Viele pharmakologische Wirkstoffe, darunter der Dynaein-Antagonist LDC-3/Dynarrestin, das Antidiabetikum Metformin und das Krebshemmer Sulforaphan, stören MAMs und befinden sich derzeit in präklinischen und klinischen Studien für Krebs und Stoffwechselerkrankungen. Diese pharmakologischen Wirkstoffe modulieren die ER-Mitochondrienkontakte oder MAM-Kontaktbreiten, indem sie die Wechselwirkungen zwischen MAM-tethering-Proteinen wie PTPIP51, VAPB, VDAC1, PACS2, MFN2, VDAC1 und IP3R3 14,15,16,17,18,19,20 regulieren. Der Sigma-1-Rezeptor (S1R)-Antagonist (NE-100) senkte die MAMs und senkte die axonalen Aβ-Spiegel in einem 3D-Neuronalmodell von AD21 dramatisch. Ein aktueller Bericht zeigte, dass der Verlust von S1R lockere MAMs erhöhte und enge MAMs verringerte, was auf S1R als therapeutisches Ziel zur Modulation der MAM-Tightness 8,9 hindeutet.

Live FRET (Fluoreszenzresonanz Energietransfer) Bildgebung von Neuronen, die von transgenen Ratten der Alzheimer-Krankheit (AD) abgeleitet wurden, zeigten eine signifikante Störung in engen MAMs (<10 nm), ohne beobachtbare Veränderung der lockeren MAMs (~20 nm) im Vergleich zu denen in Wildtyp-Kontrollen1. Induzierbare FRET/FLIM-basierte MAM-Stabilisatoren, die Rapamycin (Rapa)/rapalog (Log)-induzierbare FRB- und FKBP-Dimerisationsdomänen enthalten und in N2A-APP-Zellen exprimiert werden, zeigten, dass die Rapa/Log-Behandlung die MAM-Dichtigkeit verbesserte und die Aβ40-Produktion dosisabhängig erhöhte 8,9. Dies lieferte den ersten Beweis dafür, dass die Verengung der MAM-Lückenbreite die amyloidogene Verarbeitung fördert. Das von der FDA zugelassene antiamnestische Medikament Rivastigmin, das derzeit präklinisch für milde bis moderate AD22,23 untersucht wird, reduzierte signifikant die Aβ40-Spiegel (p < 0,001), ohne die Expression von VDAC1 oder BACE1 zu verändern oder die Kolokalisationsfrequenz zwischen CFP-ER und Mito-YFP 8,9 zu beeinflussen. Rivastigmin scheint die MAM-Stabilisierung zu beeinflussen, indem es die Spiegel des MAM-ankernden Proteins mitofusin-2 (MFN2)24 moduliert. Dieses Ergebnis stimmt mit anderen Studien überein, die berichten, dass Rivastigmin die Aβ-Spiegel in kultivierten Neuronen und AD-Mausmodellen senkt (3xTg)25,26. Da die MAM-Lückenbreite verschiedene zelluläre Prozesse reguliert, die für das Zellüberleben27 essentiell sind, kann eine gezielte Modulation der MAM-Stabilität eine wirksamere therapeutische Strategie gegen die Aβ-Ansammlung bieten als eine vollständige Destabilisierung von MAMs, die zu unbeabsichtigten Nebenwirkungen führen könnte.

Eine wesentliche Einschränkung der Methode ist, dass die ratiometrische RET-Technik auf der äquimolaren Expression des Spenders und des Akzeptors beruht. Die Koexpression der Expressionsplasmide, die den Spender oder den Akzeptor codieren, liefert inkonsistente Ergebnisse. Die Verwendung eines selbstspaltenden Tav2A, der den Donor- und die Akzeptor-Biosensoren verbindet, gewährleistet die äquimolare Expression der Biosensoren. Allerdings wurden die Expressionsniveaus der Biosensoren vor der FRET-Analyse mittels Western-Blot-Analyse überprüft.

Rapamycin (Rapa) ist möglicherweise nicht ideal, um die Auswirkungen der MAM-Straffung auf die Aβ-Produktion zu beurteilen, da es den Säugetierziel des Rapamycin-(mTOR)-Signalwegs hemmt, was zu einer Downregulation von TREM2 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 2) in Mikroglia führt und folglich die Aβ-Plaque-Entfernung in Alzheimer-Krankheits-(AD)-Mausmodellen reduziert (5XFAD)11. Als Alternative kann das Rapamycin-Analog AP21967, allgemein als Rapalog (Log) bezeichnet, verwendet werden. Log zeigt eine geringe Bindungsaffinität für mTOR, was es für Zellen relativ untoxisch macht. Sie behält jedoch die Fähigkeit, die FRB-Domäne mit einer ähnlichen Affinität wie Rapamycin zu binden, aufgrund der Einführung einer kompensatorischen höhlenbildenden Mutation (K2095P) in der FRB-Domäne12.

Die beschriebene Methode hat eine hohe Bedeutung. Trotz der Belege mehrerer präklinischer Studien, die vielversprechende therapeutische Effekte synthetischer oder natürlicher Kleinmolekülmodulatoren von MAMs bei Krebs und Stoffwechselerkrankungen zeigen, wurden bisher keine klinischen Studien durchgeführt. Einer der Hauptgründe dafür ist das Fehlen einer zuverlässigen Methode, die die MAM-Stabilität quantitativ messen kann, eine Voraussetzung für die Entwicklung wirksamer Therapien. Die Quantifizierung der Struktur-Funktions-Beziehung von MAM erfordert eine vollständige Zellansicht, was für reife Neuronen mit traditionellem TEM oder anderen hochauflösenden Mikroskopien nicht erreicht werden kann, aber mit niedrigerVergrößerung 28 erreicht werden kann. Daher können traditionelle Techniken wie TEM, Kryo-TEM oder Rasterelektronenmikroskopie (SEM) zelluläre Strukturen auf nanoskaliger Ebene nachweisen, haben jedoch Einschränkungen bei der Messung des MAM-Stabilisierungsgrades, da die hochdynamische Natur von Mitochondrien29 und ER30,31 MAM-Strukturen transient 32,33,34 macht. Um die Strukturfunktionsbeziehung des MAM zu untersuchen, wurde die Messung der axonalen Geschwindigkeit von Mitochondrien, die mit dem ER verbunden sind, über enge oder lockere MAMs mittels lebender Zellbildgebung und kymografischer Analyse vorgeschlagen 8,9. Dies stimmt mit Berichten überein, die einen verminderten axonalen Transport von Mitochondrien in kortikalen Neuronen von AD-Gehirnen35 und differenzierten AD-Cybridzellen36 zeigen. Trotz der hohen quantitativen Genauigkeit ist die Lebendzellbildgebungstechnik möglicherweise nicht für das Hochdurchsatz-Medikamentenscreening nützlich. Im Gegensatz dazu kann die FRET/FLIM-Analyse als schnellere quantitative Technik als die bestehende Live-Zell- oder Hochauflösungsmikroskopie in Zukunft angewendet werden, um kleine Molekültherapien für AD zu identifizieren.

Das hier beschriebene FRET-Protokoll hat sich speziell im Kontext künstlich induzierter Verknüpfung zwischen ER und Mitochondrien bewährt. Seine Einfachheit ermöglicht eine effiziente Bewertung der Kontaktstabilität der ER-Mitochondrien und die Untersuchung der daraus resultierenden Effekte auf die Amyloidpathologie, was das Hauptziel dieses Ansatzes darstellt. Wir wollen diese Methode weiter nutzen, um eine Bibliothek potenzieller MAM-modulierender kleiner Moleküle innerhalb einer kürzlich entwickelten dreidimensionalen (3D) AD-Drogenscreening-Plattform37 zu screenen. Die Ergebnisse werden äußerst nützlich sein, um potenzielle Anti-Aβ-Kleinmolekül-MAM-Modulatoren13 in vitro auszuwählen, die künftig auf in vivo - oder klinische Studien ausgeweitet werden können.

Danksagungen

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Wir danken Dr. Rudolph E. Tanzi, Professor am Massachusetts General Hospital (MGH), aufrichtig für seine aufschlussreichen Kommentare zum Manuskript. Wir danken Dr. Masato Maesako, Assistenzprofessor am MGH, für seine Expertise in FLIM-Analysen. Wir danken Dr. Gyorgy Hajnoczky, Professor an der Thomas Jefferson University in Philadelphia, für die großzügige Bereitstellung von Expressionsplasmiden, die ER-CFP oder Mito-YFP codieren. Diese Studie wurde vom Cure Alzheimer's Fund to RB unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BSAFisher Scientific501781532
Konfokales Mikroskop Olympus FV3000RS (Tokio, Japan)N/A
DMEM mit GlutaMAX-ErgänzungGibco/Thermo Fisher Scientific10564011
EDTA  Life Technologies41116134
Falcon 6-Well-Platten VWR International41122107
GAPDH-Polyklonaler AntikörperThermo Fisher ScientificPA1-988
Gelatine VWR International9000-70-8
Geneticin (G418-Sulfat)Gibco/Thermo Fisher Scientific10131035
GFP-Monoklonaler AntikörperInvitrogenMA5-15256
Graphpad Prism N/APrism 9, Version 9.5.0N/A
HeparinSigma-Aldrich H0200000
ImageJ-Software ImageJ 1.53aN/A
Invertiertes Konfokalmikroskop Nikon (C2 Eclipse Ti2)N/A
Lipofectamine2000Invitrogen11668027
MS Excel  Microsoft Excel, Version 2302N/A
NaCl  Fisher Scientific7647145
NuPAGE 4–12% Bis-Tris-Gel  InvitrogenNP0321BOX
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Lonza 17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10 N/A
Tris-HCL, pH 7,6  Boston BioProducts42000000
Triton X-100  Sigma-AldrichT8787
Trypsin-EDTAGibco/Thermo Fisher Scientific25200056
Tween 20Fisher Scientific501657287

Referenzen

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