Im Folgenden beschreiben wir die Protokolle zur Gewinnung von Primärkulturen humaner tubulärer Epithelzellen (HRTEC) aus der Nierenrinde, um Monoschichten und dreidimensionale Kulturen auf einer extrazellulären Matrix (3D-HRTEC) zu entwickeln.
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Methodenartikel
Entwicklung von Primärkulturen humaner tubulärer Nierenepithelzellen in Monolayern und dreidimensionalen Bedingungen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Primärkulturen humaner tubulärer Epithelzellen (HRTEC) werden aus Nieren isoliert, die von pädiatrischen Patienten entnommen wurden, die sich einer Nephrektomie unterziehen, indiziert von der Abteilung für pädiatrische Nephrologie des Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde, Buenos Aires, Argentinien. Makroskopisch wird die normale Nierenrinde aus dem Nierenmark präpariert und in Fragmente geschnitten. Kortikale Fragmente werden dann in Hank-Lösung verdaut, die mit 0,1 % Kollagenase Typ 1 ergänzt wird, und durch ein 70 μm porengroßes Netz filtriert, um die Nierentubuli von den Glomeruli zu trennen. Die Nierentubuli werden einer zweiten Verdauung mit Kollagenase unterzogen, um Epithelzellen zu isolieren. Schließlich wird die Enzymverdauung gestoppt und die Epithelzellen werden in Kolben gezüchtet, die RPMI 1640 enthalten, mit Zusätzen unter 5 % CO2bei 37 °C bis zur Konfluenz. HRTEC-Zellen können als Monolayer auf 96-Well-Platten, Glasdeckgläsern zu 24-Well-Platten oder Zellkulturhaltern, die mit Kollagen beschichtet sind, gezüchtet werden. Außerdem werden dreidimensionale Kulturen humaner tubulärer Nierenepithelzellen (3D-HRTEC) aus HRTEC-Zellen gewonnen, die auf einer Basalmembran (BM)-Matrix ausgesät wurden. Die Zellaggregation und die Bildung von röhrenförmigen Strukturen werden überwacht. Wir verwenden seit vielen Jahren HRTEC-Primärkulturen, um die zytotoxische Wirkung von Shiga-Toxin in der pädiatrischen Niere zu untersuchen, die zu pathophysiologischen Veränderungen führt, die zum hämolytisch-urämischen Syndrom (HUS) führen. Sowohl HRTEC- als auch 3D-HRTEC-Kulturen können verwendet werden, um die Auswirkungen verschiedener Toxine, synthetischer Arzneimittel, biologischer Faktoren, Hormone usw. speziell auf das Epithel des proximalen Nierentubuli des Menschen zu bewerten.
Einleitung
In unserer Gruppe wurden Primärkulturen von humanen tubulären Nierenepithelzellen (HRTEC), die in Monolayern und unter dreidimensionalen Bedingungen (3D-HRTEC) entwickelt wurden, verwendet, um in der pädiatrischen Niere die zytotoxische Wirkung von Shiga-Toxin Typ 2 (Stx2) zu untersuchen, die nach einer gastrointestinalen Infektion mit Shiga-Toxin-produzierenden Escherichia coli (STEC) verursacht wurde.
Stx1 und Stx2 (Stxs) sind die Hauptvirulenzfaktoren von STEC, die das postdiarrheale hämolytisch-urämische Syndrom (HUS) verursachen können1. HUS ist eine systemische Komplikation, die etwa 5-10 % der STEC-infizierten Kinder betrifft und aus hämolytischer Anämie, Thrombozytopenie und pädiatrischem akutem Nierenversagen (AKI) besteht und eine unterstützende Behandlung erfordert2. In Argentinien ist STEC-HUS eine endemische Krankheit mit einer jährlichen Inzidenz von 6,52 Fällen pro 100.000 Kinder unter 5 Jahren (die höchste weltweit) und stellt eine der Hauptursachen für akutes Nierenversagendar 3. Obwohl die Mortalität weniger als 4 % beträgt3, entwickeln etwa 50 % der Patienten Nierenfolgen, was die zweithäufigste Ursache für Nierentransplantationen in unserem Land darstellt 4,5.
Vor der Internalisierung und der Ausübung seiner zytotoxischen Wirkung bindet Stx2 spezifisch an den Glykolipid-Globotriaosylceramid (Gb3)-Rezeptor, der auf der Zelloberfläche der Zielorgane exprimiertwird 6. Die Niere ist das wichtigste Organ, das durch Stxs geschädigt wird, da Stx-empfindliche Zellen vorhanden sind, die in Nierenepithel- und Endothelzellen große Mengen an biologisch aktiven Gb3-Rezeptoren exprimieren 7,8.
Frühere Arbeiten, die in HRTEC als Monolayer kultiviert wurden, zeigten, dass Stx2 die Proteinsynthese hemmte, die Zellviabilität und Zellproliferation verringerte und Apoptose und Nekrose induzierte 9,10,11,12. Darüber hinaus hemmte die Exposition von 3D-HRTEC gegenüber Stx2 die Zellmigration und die Entwicklung tubulärer Strukturen mit Merkmalen der proximalen Nierentubuli12,13.
Die Primärkulturen von HRTEC- und 3D-HRTEC-Kulturen wurden auch verwendet, um die Wirkung von Östradiol auf die Zellproliferation zu bewerten, indem der Einbau von 5-Brom-2-Desoxyuridin (BrdU) in die DNA von Zellen in der S-Phase des Zellzyklus gemessenwurde 14.
Um die Epithelzellen zu isolieren, beginnen wir mit Nierenfragmenten, die aus pädiatrischen Nephrektomien gewonnen werden, die zur Korrektur urologischer Erkrankungen indiziert sind.
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Protokoll
Die Ethikkommission des Hospital General de Niños Pedro de Elizalde hat die Verwendung von menschlichem Nierengewebe für die Entwicklung von primären Zellkulturen zu Forschungszwecken genehmigt. Für die Verwendung von Nierenproben zu Forschungszwecken wurde eine schriftliche Einverständniserklärung der nächsten Angehörigen oder Erziehungsberechtigten im Namen der Kinder eingeholt.
HINWEIS: Die Primärkulturen humaner tubulärer Nierenepithelzellen (HRTEC) stammen von pädiatrischen Patienten, die sich im Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde in Buenos Aires, Argentinien, einer Nephrektomie unterziehen, die zur Korrektur urologischer Erkrankungen oder Tumorresektionen indiziert ist.
1. Entwicklung von Primärkulturen humaner tubulärer Nierenepithelzellen (HRTEC)
HINWEIS: Die kortikalen Nierenfragmente werden aus Nieren präpariert, die von pädiatrischen Patienten entnommen wurden, die sich im Krankenhaus einer Nephrektomie unterziehen. Die Primärkultur des HRTEC wird nach der zuvor beschriebenen Methode durchgeführt11.
Das Protokoll wird in den folgenden Schritten beschrieben:
- Bewahren Sie das Nierenfragment gekühlt in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder Hanks' Balanced Salt-Lösung (Hanks) auf, bis es im Labor verarbeitet wird.
- Präpariere die Nierenkapsel mit einer Pinzette. Trennen Sie die Nierenrinde von der Medulla und schneiden Sie sie in kleine Stücke von etwa 1 mm.
- Um die Verdauung durchzuführen, legen Sie die Nierenfragmente in sterile Hanks-Lösung ohne Ca2+ und Mg2+, ergänzt mit 0,1% Kollagenase Typ I.
- Inkubieren Sie die Nierenfragmente 30 Minuten lang bei 37 °C unter Schütteln.
- Um die Verdauung zu stoppen, wird ein Volumen PBS mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) zugegeben und die Probe dreimal durch Zentrifugation bei 160 × g für jeweils 10 Minuten in einer bei 4 °C gekühlten Zentrifuge gewaschen. Bei jeder Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das Pellet in derselben Lösung wieder suspendiert.
- Das Aufschlussprodukt wird durch ein 70 μm Porennetz geleitet, um die Tubuli zu filtrieren und die Glomeruli, die im Filter zurückgehalten werden, zu verwerfen.
- Die filtrierten Tubuli werden bei 160 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in steriler Hanks-Lösung ohne Ca2+ und Mg2+, ergänzt mit 0,2 % Kollagenase Typ I, resuspendiert.
- Die Probe wird 30 min lang bei 37 °C unter Schütteln inkubiert.
- Um die Verdauung zu stoppen, fügen Sie ein Volumen PBS hinzu, das 10 % fötales Rinderserum (FBS) enthält.
- Die Probe wird dreimal gewaschen, indem sie bei 160 × g à 10 min in einer bei 4 °C gekühlten Zentrifuge zentrifugiert. Bei jeder Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das Pellet in derselben Lösung wieder suspendiert.
- Nach der letzten Zentrifugation resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 ml vollständigem Kulturmedium (RPMI 1640 ergänzt mit 5 % FBS, L-Glutamin [2 mmol/l], Penicillin [100 μg/ml], Streptomycin [100 μg/ml] und Endothelzellwachstumsergänzung [EKGS, 1 %]).
- Die Zellsuspension wird in einen 25cm 2-Kulturkolben mit belüftetem Deckel ausgebracht.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in feuchter Atmosphäre und 5 % CO2.
- Waschen Sie die Zellkultur am nächsten Tag 3 Mal, verwerfen Sie die Flüssigkeit aus dem Kolben, fügen Sie jeweils 5 ml PBS hinzu und geben Sie 5 ml vollständiges Kulturmedium in den Kolben. Diese Waschungen eliminieren rote Blutkörperchen und röhrenförmige Fragmente, die nicht vollständig verdaut und nicht an den Kulturkolben gebunden wurden.
- Inkubieren Sie die Epithelzellen im Zellkultur-Inkubator bei 37 °C, damit sie in Monolayern zur Konfluenz wachsen können.
- Wechseln Sie das Medium alle 3 Tage durch ein frisches vollständiges Kulturmedium und beobachten Sie die Zellkultur täglich unter einem inversen Mikroskop.
2. Entwicklung von dreidimensionalen HRTEC-Kulturen (3D-HRTEC)
HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Schritte zur Entwicklung dreidimensionaler Kulturen (3D-HRTEC) beschrieben. Die 3D-HRTEC-Kulturen werden nach der zuvor beschriebenen Methode durchgeführt12.
- Verwenden Sie eine BM-Matrix aus dem Engelbreth-Holm-Swarm-Maussarkom. Diese BM-Matrix wird gefroren geliefert und bleibt in diesem Zustand fest. Tauen Sie die BM-Matrixlösung über Nacht in einem Eisbad im Kühlschrank bei 4 °C auf, wie vom Hersteller angegeben.
- Kühlen Sie die Spitzen im Gefrierschrank ab, bevor Sie die BM-Matrix platzieren, und lassen Sie die Multi-Well-Platte auf Eis, um eine Verfestigung der Matrix während des Prozesses zu verhindern.
- Nehmen Sie ein Aliquot der flüssigen BM-Matrix (150 ml/cm2) und geben Sie es in jede Vertiefung der Platte, um den Boden der Vertiefung zu bedecken. Inkubieren Sie die Platte im Zellinkubator bei 37 °C für 1 h, um die BM-Matrix in einen Gelzustand zu versetzen.
- In der Zwischenzeit wird zum Ablösen konfluenter HRTEC-Primärkulturen das Nährmedium aus dem Kolben verworfen und 1 ml 0,25 % Trypsin und 0,02 % EDTA-Lösung hinzugefügt.
- Die Flüssigkeit über die gesamte Oberfläche des Kolbens verteilen und 5 min bei 37 °C im Zellkultur-Inkubator inkubieren.
- Beobachten Sie unter einem inversen Mikroskop, ob sich alle Zellen abgelöst haben.
- Die Zellen werden in 10 ml Kulturmedium oder PBS resuspendiert, in ein 15-ml-Röhrchen gegeben und 10 Minuten lang bei 4 °C bei 160 × g zentrifugiert.
- Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem vollständigen Kulturmedium, das die gleichen Zusätze enthält, die für HRTEC-Primärkulturen verwendet werden.
- Zählen Sie die Anzahl der Zellen in einer Neubauer-Kammer.
- 4 × 104 Zellen/150 μl pro Vertiefung auf die BM-Matrix ausstechen. Inkubieren Sie die Zellkultur mehrere Tage lang in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C, in feuchter Atmosphäre und 5 % CO2.
- Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage durch frisches Medium.
- Überwachen Sie die Zellaggregation und die Bildung von röhrenförmigen Strukturen unter einem inversen optischen Mikroskop.
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Ergebnisse
Konfluente HRTEC-Primärkulturen zeigten eine ähnliche Morphologie, die unter Lichtmikroskopie beobachtet wurde (Abbildung 1). Die Zellen wurden durch Immunfluoreszenz, wie in unseren früheren Publikationen beschrieben, unter Verwendung von Antikörpern gegen Aquaporin 1 (AQP1) und PECAM CD31charakterisiert 9,12,13. Immunfluoreszenzstudien zeigten, dass mehr als 90 % der HRTEC positiv für AQP1 waren, ...
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Diskussion
Primärkulturen sollten am selben Tag der Nephrektomie durchgeführt werden. HRTEC-Primärkulturen können zwischen 1-5 Passagen verwendet werden, um die morphogenetische Stabilität der Zellen zu gewährleisten. Nach der fünften Passage beginnen die Zellen, ihre Morphologie zu verändern, zeigen ein fibroblastenähnliches Aussehen oder eine Zunahme der Vakuolen und können ruhig werden.
Wenn ein größeres Nierenfragment verwendet wird, kann die DNA, die durch die Zelll...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
Wir danken dem Team der Kinderurologie der "Sección de Cirugía Pediátrica, Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde", Buenos Aires, Argentinien, für die Bereitstellung von Nierenproben. Diese Arbeit wurde durch Stipendien an C. Silberstein von der Universität Buenos Aires (UBACYT20020190100072BA) und an C. Ibarra und C. Silberstein vom Nationalen Rat für wissenschaftliche und technische Forschung (CONICET: PUE 0041) unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch das Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) (über Red STEC/SUH Nº 224RT0152).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Kollagenase Typ I | Sigma Merck, St. Louis, MO, USA | 637958 | |
| Nahrungsergänzungsmittel für das Wachstum von Endothelzellen | Sigma Merck, St. Louis, MO, USA | Nr. E2759 | |
| Matrigel Basalmembran-Matrix | BD Biosciences, USA; Sigma Merck, St. Louis, MO, USA | 356234 | |
| 70 μ M Pore Mesh Filter | BD Bioscience, MA, Vereinigte Staaten von Amerika | css010070 | |
| RPMI 1640 Medium mit L-Glutamin | Sigma Merck, St. Louis, MO, USA | R8758-500ml | |
| Hanks' Ausgewogene Salzlösung Ca2+ und Mg2+ frei | Gibco Invitrogen, NY, Vereinigte Staaten Von Amerika | 14175046 | |
| Trypsin-EDTA-Lösung | Sigma Merck, St. Louis, MO, USA | Nr. T4049 |
Referenzen
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