Superhochauflösende Bildgebung des Biofilms von Proteus mirabilis mittels Expansionsmikroskopie

Die Fluoreszenzmikroskopie ist ein weit verbreitetes Werkzeug zur Untersuchung der Architektur, Zusammensetzung und Funktion von Biofilmen¹. Die Fähigkeit der optischen Mikroskopie, die strukturellen, zellulären und subzellulären Merkmale von Biofilmen aufzulösen, ist jedoch durch die Beugungsbarriere begrenzt. Die Expansionsmikroskopie (ExM) ist eine innovative, zugängliche und einfach zu bedienende Superauflösungstechnik, die ein großes Potenzial für die Aufdeckung von Biofilmstrukturen jenseits der Beugungsgrenze ^2,3 hat. ExM erhöht die Auflösung, indem es biologische Proben isotrop erweitert, etwa um das Vierfache ihrer ursprünglichen Größe. Das Verfahren beinhaltet die in-situ-Polymerisation eines quellfähigen ionischen Hydrogels in der gesamten Probe und die Beibehaltung der relativen räumlichen Anordnung der molekularen Ziele, wenn es mit Vorsicht angewendet wird ^4,5.

Damit ExM richtig funktioniert, ist die Homogenisierung der mechanischen Eigenschaften des biologischen Materials ein entscheidender Schritt⁶. Standard-ExM-Varianten wurden an Säugetierzellkulturen und -geweben entwickelt, wo sie nur durch proteolytischen Proteinase-K-Verdau ^4,5 oder weiche Proteindenaturierung mit Detergenzien und Autoklavieren⁷ eine effiziente Homogenisierung erreichten, was zu einer isotropen 4-fachen Expansion führte. Im Falle von Bakterien und bakteriellen Biofilmen sind jedoch die Peptidoglykan-Zellwand und EPS-Matrixelemente, wie z. B. strukturelle Polysaccharide, Hindernisse gegen die Expansion 2,3,8,9.

Dieser Artikel beschreibt die Verfahren der Proteus mirabilis Biofilm-Expansionsmikroskopie (PmbExM), einer maßgeschneiderten ExM-Variante zur Expansion von Biofilmen von P. mirabilis, einem klinisch relevanten gramnegativen Bazillus, der mit hoher Antibiotikaresistenz und katheterassoziierten Harnwegsinfektionen assoziiert ist¹⁰. PmbExM verwendet eine Kombination aus enzymatischen Behandlungen mit Mutanolysin, α-Amylase, Cellulase, Lyticase und Proteinase K, um die Peptidoglykan-Zellwand, Polysaccharide bzw. Proteine zu hydrolysieren. Die Ergebnisse zeigen, dass mit dieser Methode eine 4,3-fache isotrope Expansion von 48 h-alten P. mirabilis-Biofilmen erreicht wird. Die Technik ermöglicht eine hochauflösende Visualisierung der Architektur des P . mirabilis-Biofilms , der Assemblierung und der intrazellulären Merkmale durch Doppelfärbung³. Darüber hinaus kann PmbExM an andere Biofilmmodelle angepasst werden, indem die Enzymbehandlungen so angepasst werden, dass sie auf speziesspezifische Biofilmkomponenten abzielen.

Das Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Beschreibung der Verfahren zu geben, die an der Gelierung, dem Verdau, der Expansion und dem Einbetten von Biofilmproben für PmbExM beteiligt sind. Darüber hinaus werden in dieser Arbeit die Bedingungen für das bakterielle Wachstum, die Probenformate und die von den Autoren verwendeten Fluoreszenzfärbetechniken sowie eine Datenverarbeitungs- und Analyseroutine beschrieben, die von Forschern mit begrenzter Erfahrung in der Bildverarbeitung leicht angewendet werden kann. Für einen umfassenderen und tiefergehenden Leitfaden zur Bildverarbeitung und -analyse verweisen wir auf Castagnini, D. et ^al.3.

Der Gesamtprozess von PmbExM ist in Abbildung 1 zusammengefasst. Bitte beziehen Sie sich auf die ergänzende Datei 1 , um die Zusammensetzung aller genannten Lösungen (d.h. Monomerlösung, Proteinase-K-Aufschlusslösung usw.) zu finden, die in dieser Arbeit verwendet werden. Ebenso finden Sie in den Ergänzungsdateien 2, 3 und 4 eine vereinfachte Datenverarbeitungs- und Analyseroutine, die von Forschern ohne große Erfahrung in der Bildverarbeitung verwendet werden kann. Das Protokoll kann bequem über einen Zeitraum von 2,5 bis 3 Wochen durchgeführt werden: die erste Woche ist der Reinigung und Sterilisation des Deckglases, dem Wachstum des Biofilms und der Probenfixierung gewidmet; die zweite Woche für die Probenfärbung und das PmbExM-Protokoll selbst, die dritte für die Probeneinfassung und die Bildaufnahme. Berücksichtigen Sie außerdem 1 Woche vorherige Vorbereitungen für die erforderlichen Materialien und Lösungen. Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien, Materialien, Geräten und Software sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Abbildung 1: Verankerung, Polymerisation, Verdau und Dialyse des PmbExM-Protokolls für die erfolgreiche Expansion, Beobachtung und Analyse des P . mirabilis-Biofilms . Die linke Spalte zeigt sechs Zustände der Probe bei ausgewählten Schritten während des Expansionsprotokolls. Es beginnt mit der fixierten, permeabilisierten und gefärbten Biofilmprobe, folgt vier Zwischenzuständen bis zum endgültigen gelifizierten und expandierten Zustand, bereit für die Mikroskopie und Bildanalyse mit Superauflösung. Die EPS-Matrix des Biofilms ist grün dargestellt, die bakterielle Zellwand ist durch violette Linien dargestellt, die allgemeine Proteinzellstruktur ist grau dargestellt und das Acrylamid-Acrylat-ExM-Polymer ist als wellenförmige blaue Linien dargestellt. Alle an dem Prozess beteiligten Enzyme werden durch Pac-Man-Symbole dargestellt: 3 Glykosid-Hydrolasen (grün) für die Exopolysaccharid-Hydrolyse: α-Amylase, Cellulase und Lyticase; Mutanolysin (violett) für den Abbau der Peptidoglykan-Zellwand; und Proteinase K (grau) für die allgemeine Proteinverdauung. Die Farben der Pac-Man-Symbole entsprechen den jeweiligen Zielstrukturen. Alle Objekte, die mit geringer Deckkraft oder gestrichelten Rändern dargestellt werden, stellen einen Zustand enzymatischer Degradation dar. Diese Abbildung ist eine Abwandlung von Castagnini, D. et ^al.3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Reinigung und Sterilisation von Glasdeckgläsern zur Biofilmbildung

1. 12 mm Glasdeckgläser in 1 M Natriumhydroxid 20 min bei Raumtemperatur mit Ultraschall beschallen und anschließend mit reichlich deionisiertem Wasser abspülen.
2. Beschallen Sie die Deckgläser 15 min lang bei Raumtemperatur mit 70 % (v/v) Ethanol und spülen Sie sie anschließend mit 95 % (v/v) Ethanol ab.
3. Lassen Sie die Deckgläser bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
4. Durch Autoklavieren sterilisieren.

2. Wachstum des Proteus mirabilis Biofilms

1. P. mirabilis in 10 ml Luria Bertani (LB) Brühe 24 h bei 37 °C ohne Schütteln anbauen.
   HINWEIS: In dieser Studie wurde ein kommerziell erhältlicher Stamm vom Typ P. mirabilis (siehe Materialtabelle) erworben und eingesetzt, aber die Verwendung eines beliebigen P . mirabilis-Stammes , der leicht verfügbar ist, wird empfohlen.
2. Nehmen Sie 1 ml aus der Kultur und fügen Sie es zu 9 ml frischer und steriler LB-Brühe hinzu, um eine Bakteriensuspension mit einer Verdünnung von 1:10 zu erzeugen.
3. Die optische Dichte (OD) bei 600 nm der 1:10-Bakteriensuspension ist auf 0,1 zu überprüfen. Bei Bedarf durch Zugabe kleiner Mengen frischer LB- oder P. mirabilis-Kultur anpassen, bis sie OD₆₀₀ = 0,1 erreicht.
4. 12 mm Glasdeckgläser (zuvor gereinigt und sterilisiert) in eine sterile 24-Well-Platte aus Polystyrol (ein Deckglas pro Vertiefung) einführen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die gesamte Deckglasoberfläche den Boden der Vertiefung berührt. Der Biofilm bildet sich an der Seite des Deckglases, die nach oben zeigt.
5. In den Vertiefungen der Platte werden 350 μl der Bakteriensuspension OD₆₀₀ = 0,1 besiedelt.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, nur die inneren Vertiefungen der Platte zu säen, während die äußeren Vertiefungen (d. h. die Vertiefungen in den Reihen A und D sowie in den Spalten 1 und 6) mit sterilem Wasser oder LB-Brühe gefüllt werden. Dies liegt daran, dass die äußeren Vertiefungen zu höheren Flüssigkeitsverdunstungsraten neigen als die inneren Vertiefungen, was sich auf das Wachstum des Biofilms auswirkt.
6. Legen Sie die Saatplatte in einen Inkubator und positionieren Sie sie mit einer Neigung von 45 Grad.
   HINWEIS: Verwenden Sie gängiges Labormaterial wie 50-ml-Zentrifugenröhrchen oder Mikropipettenspitzenboxen. Die gekippte Position ermöglicht die Bildung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche auf der Oberfläche der Deckgläser, an der sich der P . mirabilis-Biofilm an der dicksten Stelle bildet.
7. Lassen Sie die Biofilme 48 h lang bei 37 °C ohne Schütteln entstehen.
   HINWEIS: Dieser Biofilm-Wachstumsaufbau ist aufgrund der Biofilmaustrocknung aufgrund der Verdunstung des Mediums nicht für Inkubationszeiten von mehr als 48 h geeignet.

3. Fixierung und Lagerung von Biofilmproben

1. Entfernen Sie das Nährmedium vorsichtig aus den Vertiefungen und waschen Sie die biofilmhaltigen Deckgläser vorsichtig zweimal mit 300 μl steriler Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) für 5 min bei Raumtemperatur unter sehr leichtem Rühren.
   HINWEIS: Vermeiden Sie die Zerstörung der Biofilme durch wiederholten Flüssigkeitsaustausch, indem Sie kleine Volumina für Inkubationen oder Waschen verwenden. 300-400 μl Flüssigkeit reichen aus, um die Biofilme in eine 24-Well-Platte zu tauchen. Es wird dringend empfohlen, langsam und methodisch zu pipettieren und zu vermeiden, dass die ausgetauschten Lösungen direkt auf die Biofilme treffen.
2. Entfernen Sie vorsichtig das PBS und ersetzen Sie es durch 400 μl 4 % (w/v) Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur zur Biofilmfixierung.
3. Entfernen Sie das PFA und ersetzen Sie es durch 300 μl 1 % PBST (1 % v/v Triton X-100 in PBS) für die Zellpermeabilisierung. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Ersetzen Sie die 1%ige PBST-Lösung durch 300 μl 0,3 % PBST (3 % v/v Triton X-100 in PBS). 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Entfernen Sie die 0,3 % PBST und ersetzen Sie sie durch 300 μl einer 50:50-Mischung aus Methanol und 0,3 % PBST zur Probendehydratisierung. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann die Mischung durch 1 ml absolutes Methanol ersetzen.
   HINWEIS: Fügen Sie langsam 1 ml Methanol hinzu und richten Sie es gegen die Wände der Vertiefung. Dieses höhere Volumen an Methanol wird verwendet, um eine vollständige Verdampfung während der Probenlagerung zu verhindern.
6. Lagern Sie die Proben mindestens 1 Tag und bis zu einem Monat bei -20 °C.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, die Platten mit einem flexiblen Wachsfilm zu versiegeln, um die Verdampfung und Austrocknung der Proben durch Methanol zu verzögern.
7. Nach Gebrauch rehydrieren Sie die Proben nacheinander, indem Sie das Methanol durch 300 μl einer 50:50-Mischung aus Methanol und 0,3 % PBST und dann bei Raumtemperatur durch 300 μl 0,3 % PBST ersetzen.

4. Fluoreszenzfärbung von Biofilmen

1. Inkubieren Sie die rehydrierten Biofilmproben mit 300 μl 50 μg/ml Weizenkeim-Agglutinin-Fluoreszenz-Lektin-Konjugat (im Folgenden nur als WGA-Konjugat bezeichnet; siehe Materialtabelle) in PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur für die Zellwand-/Kapsel-/Exopolysaccharid-Färbung.
   HINWEIS: Bitte lesen Sie die relevanten Themen zur Fluoreszenzfärbung im Abschnitt Diskussion. Schützen Sie die Proben von nun an vor Licht.
2. Entfernen Sie die WGA-Konjugatlösung und waschen Sie sie vorsichtig zweimal mit 300 μl PBS für 10 min bei Raumtemperatur.

5. PmbExM-Schritte

1. MA-NHS-Verankerung und Acrylamid-Acrylat-Polymerisation
   1. Inkubieren Sie die gefärbten Biofilmproben mit 400 μl 1 mM Methacrylsäure-N-Hydroxysuccinimidylester (MA-NHS) in PBS für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren.
      HINWEIS: MA-NHS ist ein aktivierter Ester, der in einem wässrigen Medium zur Hydrolyse neigt, behandeln Sie die Proben daher sofort nach der Herstellung von 1 mM in PBS-Lösung.
   2. Führen Sie drei schonende Wäschen von 10 Minuten mit 300 μl PBS bei Raumtemperatur durch.
   3. Entfernen Sie das PBS und ersetzen Sie es durch 300 μl Monomerlösung. Über Nacht (O.N.) bei 4 °C inkubieren.
   4. Bauen Sie die Gelierungsvorkammern. Verwenden Sie einen Objektträger als Basis und legen Sie zwei Stücke umgeklapptes doppelseitiges Klebeband darauf, das als 400 μm Abstandshalter dient. Ordnen Sie die Abstandshalter 8-10 mm voneinander entfernt an.
      HINWEIS: Siehe Abbildung 2A für weitere Klarheit darüber, wie die Gelierungsvorkammer zu konstruieren ist. Das hier verwendete doppelseitige Klebeband war ca. 100 μm dick, daher wurde es zugeschnitten und auf sich selbst gefaltet, um Abstandshalter von 3 mm x 5 mm x 0,4 mm zu erhalten. Messen Sie die Dicke des verfügbaren doppelseitigen Klebebandes und ordnen Sie es entsprechend an. Die Aufnahme der Gelierlösung durch die Tape-Spacer ist vernachlässigbar. Alternativ zum doppelseitigen Klebeband können 12 mm Rundglas-Deckgläser mit Wassertropfen zusammengeklebt und bis zur gewünschten Höhe aufgestapelt werden.
   5. Ordnen Sie Nasskammern an, um die Proben während der Polymerisation vor Austrocknung zu schützen.
      HINWEIS: Eine herkömmliche Schachtel mit Mikropipettenspitzen kann leicht in eine Nasskammer umgewandelt werden, indem das Kunststoffgerüst der Spitzen entfernt und durch feuchte Papiertücher ersetzt wird.
   6. Bereiten Sie ein frisches Stoffvolumen der Gelierlösung vor, indem Sie die Volumina der Monomerlösung, 10 % (w/v) N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED), 0,5 % (w/v) 4-Hydroxy-TEMPO (4-HT) und 10 % (w/v) Ammoniumpersulfat (APS) in einem Verhältnis von 47:1:1:1 gründlich mischen. Mischen Sie das APS mit den restlichen Reagenzien der Gelierlösung erst, wenn die Schritte bis 5.1.5 abgeschlossen sind.
      HINWEIS: Das Gesamtvolumen der herzustellenden Stammgelierlösung hängt von der Menge der zu verarbeitenden Biofilmproben ab. Um beispielsweise drei Biofilmproben zu verarbeiten, stellen Sie 900 μl Gelierlösung her, indem Sie 846 μl Monomerlösung mit 18 μl 10 % (w/w) TEMED, 18 μl 0,5 % (w/w) 4-HT und 18 μl 10 % (w/w) APS mischen. Um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern, darf APS zuletzt und erst dann zur Mischung hinzugefügt werden, wenn Proben, Gelierungsvorkammern und Nasskammern zur Verwendung bereit sind. Bewahren Sie alle genannten Reagenzien und die kürzlich hergestellte Gelierlösung während dieses Schritts ab.
   7. Unmittelbar nach der Herstellung der Gelierlösung die Monomerlösung vorsichtig entfernen und durch 300 μl der ersteren ersetzen. Bei 4 °C 5 min inkubieren.
   8. Während des Schritts 5.1.7 wird die restliche Schutzabdeckung der doppelseitigen Klebebandstreifen, die auf den Objektträgern angeordnet sind, entfernt und in den Zwischenraum 40 μl Gelierlösung gegeben.
   9. Nachdem Schritt 5.1.7 abgeschlossen ist, entfernen Sie jedes biofilmhaltige Deckglas aus seiner Vertiefung und legen Sie es auf den zuvor auf einen Objektträger gelegten 40-μl-Tropfen Gelierlösung. Richten Sie das Deckglas so aus, dass der Biofilm auf seiner Oberfläche mit der Gelierlösung in Kontakt kommt.
   10. Beenden Sie den Bau der Gelierungskammer, indem Sie mit einer Pinzette vorsichtig auf das biofilmtragende Deckglas drücken, um sicherzustellen, dass es an den doppelseitigen Klebebandabstandshaltern haftet.
       HINWEIS: Dieser sandwichartige Aufbau besteht aus der sogenannten Gelierungskammer (Abbildung 2B).
   11. Die Proben werden in einer Nasskammer polymerisiert und 2 h bei 37 °C ohne Rühren inkubiert.
   12. Visualisieren Sie die Proben unter Fluoreszenzmikroskopie (siehe Schritt 6.2.1), ohne die Gelierungskammern für die Bildaufnahme vor der Expansion zu zerlegen.
       HINWEIS: Lassen Sie die gelierten Proben nicht länger als eine Stunde außerhalb der Nasskammer, da vorexpandierte Gele anfällig für Austrocknung sind, wodurch die Probe unbrauchbar wird. Bitte lesen Sie Schritt SF2.3 (Ergänzende Datei 2) für relevante Verfahren vor der Erweiterung.
   13. Zerlegen Sie die Gelierungskammern und schneiden Sie das überschüssige Gel mit einer chirurgischen Klinge um den interessierenden Bereich in der Biofilmprobe ab.
       HINWEIS: Das Trimmen der Gele wird dringend empfohlen, um die Handhabung und Einbettung von expandierten Proben zu erleichtern. Um die räumliche Orientierung des interessierenden Bereichs innerhalb der Proben zu verfolgen, schneiden Sie die Gele in eine asymmetrische Form oder lassen Sie einen charakteristischen Ausschnitt im Gel, um die korrekte Ausrichtung leicht zu erkennen.
   14. Legen Sie die Deckgläser mit den getrimmten Gelen mit dem Gel nach oben in eine neue 24-Well-Platte.
       HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt sollten die gelierten Proben auf ihrem ursprünglichen Glasdeckglas haften.
2. Enzymatischer Verdau I-III und DNA-Färbung
   HINWEIS: Die Homogenisierung der mechanischen Eigenschaften von P. mirabilis-Biofilmproben folgt einer Reihe von enzymatischen Aufschlüssen, die die Autoren in 3 Schritte kategorisiert haben, basierend auf der biologischen Struktur, die abgebaut werden soll: Polysaccharidhydrolyse (Aufschluss I), Peptidoglycanhydrolyse (Aufschluss II) und Proteinhydrolyse (Aufschluss III).
   1. Verdauung I
      1. Tauchen Sie die Proben in 1 ml α-Amylase-Aufschlusslösung. O.N. bei 50 °C inkubieren.
         HINWEIS: Große Volumina (d. h. 0,5-1 ml) enzymatischer Lösung werden verwendet, um ein Austrocknen der Probe aufgrund der hohen Inkubationstemperatur zu verhindern.
      2. Entfernen Sie die α-Amylase-Lösung und waschen Sie die Gele 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 300 μl Cellulade-Aufschlusspuffer.
      3. Entfernen Sie den Cellulade-Aufschlusspuffer und ersetzen Sie ihn durch 500 μl Cellulade-Aufschlusslösung. 2 h bei 45 °C inkubieren.
      4. Entfernen Sie die Cellulaseaufschlusslösung und waschen Sie die Gele 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 300 μl Lyticase-Aufschlusspuffer.
      5. Entfernen Sie den Lyticase-Aufschlusspuffer und ersetzen Sie ihn durch 500 μl Lyticase-Aufschlusslösung. 2 h bei 30 °C inkubieren.
   2. Verdauung II
      1. Entfernen Sie die Lyticase-Aufschlusslösung und waschen Sie die Gele 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 300 μl Mutanolysin-Aufschlusspuffer.
      2. Entfernen Sie den Mutanolysin-Aufschlusspuffer und ersetzen Sie ihn durch 1 ml Mutanolysin-Aufschlusslösung. O.N. bei 55 °C inkubieren.
   3. Verdauung III
      1. Entfernen Sie die Mutanolysin-Aufschlusslösung und waschen Sie die Gele 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 300 μl Proteinase-K-Aufschlusspuffer. Entfernen Sie den Proteinase-K-Verdauungspuffer und ersetzen Sie ihn durch 500 μl Proteinase-K-Aufschlusslösung. 2 h bei 37 °C inkubieren.
   4. (FAKULTATIV) DNA-Färbung
      1. Entfernen Sie die Proteinase-K-Lösung und waschen Sie die Gele mit 300 μL 10x PBS für 5 min bei Raumtemperatur.
      2. Entfernen Sie das 10x PBS und ersetzen Sie es durch 300 μl 5 μM rot fluoreszierende Nukleinsäurefärbung in 10x PBS für 30 min bei Raumtemperatur.
         HINWEIS: Im Abschnitt Diskussion finden Sie Kommentare zur DNA-Färbung für ExM-Verfahren.
3. Erweiterung
   1. Die Proteinase-K-Lösung (oder die DNA-Färbelösung, wenn der optionale Schritt 5.2.4 durchgeführt wurde) entfernen und die Gele in eine 60-mm-Petrischale geben. Geben Sie ein Gel pro Petrischale.
      HINWEIS: Verwenden Sie einen kleinen flachen Pinsel, um das Gel auf das Glasdeckglas zu drücken. Nehmen Sie mit einer Laborpinzette das Glasdeckglas und verwenden Sie es als Plattform für das Gel. Verhindern Sie, dass das Gel mit Hilfe der Bürste vom Deckglas fällt, wenn Sie es aus der Vertiefung der Platte heben. Vermeiden Sie, dass sich die Gele auf sich selbst falten.
   2. Füllen Sie die Petrischale mit überschüssigem deionisiertem Wasser, tauchen Sie das Gel vollständig ein und inkubieren Sie es unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Tauschen Sie das Wasser 4-5 Mal aus.
      HINWEIS: Beachten Sie, dass das expandierende Gel praktisch unsichtbar wird, wenn es in Wasser getaucht wird. Positionieren Sie die Petrischale gegen das Licht, um das Auffinden des Gels zu erleichtern und eine Beschädigung durch den Sog der Pasteurpipette oder Mikropipette während des Wasserwechsels zu vermeiden.

Abbildung 2: Gelierungskammer und Probenmontage. (A) Vorgelierungskammer. Positionieren Sie auf einer Folie 2 doppelseitige Klebebandabstandshalter (gelb). Auf dem befindet sich ein Deckglas ( = 12 mm) als Abstandsreferenz. (B) Gelierungskammer. Der bakterielle Biofilm (grün) bildet sich auf der unteren Deckglasoberfläche. 400 μm dicke Abstandhalter (orange) werden aus 100 μm dicken doppelseitigen Klebebandausschnitten hergestellt. Abstandshalter ermöglichen es dem Gel, die gesamte Probe einzubetten und verhindern ein Überlaufen der Gelierlösung von den Rändern der Kammer, wodurch verhindert wird, dass die Probe zwischen Objektträger und Deckglas gequetscht wird. (C) 3D-gedruckte Bildgebungskammern (besuchen Sie den folgenden Link, um auf die .stl-Dateien zuzugreifen https://github.com/scianlab/ExM). Eine Probe des expandierten Gels (links) und eine Probe des expandierten Gels, die in entionisiertes Wasser getaucht wurde (rechts). Expandierte Gele werden beim Eintauchen praktisch unsichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Beobachtung und Analyse

1. Einbetten von expandierten Proben
   1. Bereiten Sie die Bildgebungskammern mit einer Poly-Lysin-Beschichtung für die Immobilisierung der Probe während der Bildgebung vor¹¹: Tränken Sie die Glasoberfläche der Bildgebungskammer (siehe Materialtabelle) 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,1 % (w/v) Poly-L-Lysin.
   2. Entfernen Sie die Poly-L-Lysin-Lösung und führen Sie zwei Waschgänge mit überschüssigem deionisiertem Wasser durch. 1 h an der Luft trocknen lassen oder in einen Inkubator bei 37 °C stellen, um den Trocknungsprozess zu beschleunigen.
   3. Nach dem fünften Dialysezyklus aus Schritt 5.3.2 entfernen Sie das Wasser, das die Gele bedeckt, und schieben Sie die Probe mit einer kleinen flachen Bürste auf ein 24 mm x 50 mm großes Glasdeckglas. Verwenden Sie das rechteckige Deckglas als Plattform für das Gel und heben Sie es aus der Petrischale.
   4. Entfernen Sie das überschüssige Wasser mit Seidenpapier aus dem Gel, um zu verhindern, dass Wasser den direkten Kontakt zwischen der Oberfläche des Gels und der Polylysinbeschichtung auf der Glasoberfläche der Bildgebungskammer blockiert.
   5. Legen Sie das Gel vorsichtig auf die Glasoberfläche der Bildgebungskammer und vermeiden Sie die Ansammlung von Luftblasen zwischen dem Gel und dem Glas.
      HINWEIS: Die Glasoberfläche der Bildgebungskammer sollte vollständig trocken sein. Wenn Bilder vor der Expansion aufgenommen wurden, ist eine korrekte Ausrichtung des expandierten Gels zu berücksichtigen, um das Auffinden der zuvor erfassten Sichtfelder in der vorexpandierten Probe zu erleichtern.
   6. Fügen Sie deionisiertes Wasser hinzu, bis das Gel vollständig eingetaucht ist (siehe Abbildung 2C).
      HINWEIS: Die expandierten Gele müssen während des gesamten Bildgebungsprozesses hydratisiert bleiben, um ein Schrumpfen während der Aufnahme zu vermeiden.
2. Bilderfassung
   1. Visualisieren und erfassen Sie Bilder der Proben mit einem verfügbaren beugungsbegrenzten Fluoreszenzmikroskop.
      HINWEIS: Die Autoren verwendeten ein konfokales Spinning-Disk-Mikroskop mit einem 63-fachen Wasserimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur (NA) von 1,2. Für die Fluorophor-Anregung wurde eine Festkörperlaserlinie bei 488 und 647 nm verwendet. Die Aufnahmen wurden mit einer digitalen 16-Bit-CMOS-Kamera gemacht, die von einer proprietären Software gesteuert wurde (siehe Materialtabelle). Die Voxelgröße wurde auf 64,4 mm x 64,4 mm x 200 nm (XYZ-Achse ) eingestellt.
3. Bildverarbeitung
   1. In der Zusatzdatei 2 finden Sie eine digitale Bildverarbeitungsroutine für die Segmentierung von Bakterien (Abschnitt SF2.1), die Messung der Zellbreite (Abschnitt SF2.2), die EF-Bestimmung (Abschnitt SF2.3) und den Bildabgleich für vorexpandierte und expandierte Bedingungen (Abschnitt SF2.4).

PmbExM erweiterte den P. mirabilis-Biofilm um das 4,3-fache und bewahrte Morphologie und Topologie
Abbildung 3A-D zeigt die physikalische Vergrößerung von P. mirabilis-Biofilmzellen und die erhöhte Auflösung, die durch die Technik erreicht wurde. Darüber hinaus wurde dies nicht nur in dünnen Biofilmregionen beobachtet, in denen sich Zellen in einem monolagenartigen Layout organisieren, sondern auch in dickeren Regionen mit dicht besiedelten Anordnungen von 2- oder sogar 3-stufigen Bakterienschichten (Abbildung 3G,H). Die quantitative morphologische Analyse zeigte, dass PmbExM die maximale Breite von Bakterien von 0,7 μm ± 0,07 μm auf 3,0 μm ± 0,22 μm (mittlere ± SD) erhöhte (Abbildung 3E), was einem Expansionsfaktor (EF) von etwa 4,3 entspricht. Darüber hinaus zeigte die Kolokalisation von Bildern vor und nach der Expansion eine hohe Flächenüberlappung zwischen segmentierten Bakterien (Abbildung 3F). In Übereinstimmung mit der weiteren morphologischen Analyse ergab die weitere morphologische Analyse keine signifikanten Unterschiede zwischen den Bedingungen vor und nach der Expansion von Formdeskriptoren wie Fläche, Umfang2/Fläche, Exzentrizität der Hauptachse und Exzentrizität des Begrenzungskastens3. Gleichzeitig ergab die topologische Analyse, dass sich nur 7 von 318 Zentren des nächsten Nachbarn während des Expansionsprozesses änderten. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass PmbExM eine 4-fache Expansion erreichte, die die zelluläre Morphologie und die räumliche Organisation des Biofilms in drei Dimensionen beibehielt.

Abbildung 3: Die 4-fache isotrope Expansion durch PmbExM ermöglicht eine verbesserte laterale und axiale Auflösung von P. mirabilis-Biofilmen . (A) Prä-PmbExM P. mirabilis Biofilm, gefärbt für die Zellwand mit WGA-Konjugat (grün). Das weiße Rechteck wird vergrößert (B) und an die Erweiterungsbilder (C) und (D) angepasst. Beachten Sie die höhere Auflösung und die Details in (C) im Vergleich zu (B). (D) Bild des WGA-Konjugats und der DNA-Färbekanäle (magenta) von (C). (E) Boxdiagramm mit maximaler Breite vor PmbExM (weiß) und nach PmbExM (grau). Mittellinien sind Mittelwerte. PmbExM erreichte einen Expansionsfaktor (EF) von 4,3 ± 0,44. p-Wert < 0,0001, ungepaarter t-Test mit Welch-Korrektur. (F) Kolokalisation von segmentierten Bakterien, die ein Überlagerungsbild von vorexpandierten (rot), PmbExM (grün) und Überlappungen von vor- und nachexpandierten Bakterien (gelb) zeigen. Das PmbExM-Image wurde herunterskaliert, um es an das Image vor der Erweiterung anzupassen. Der weiße Pfeil zeigt ein Bakterium an, das während der Expansion rotiert wurde. (G) Laterale und orthogonale Ansichten eines P . mirabilis-Biofilms . Die Schichtorganisation von Zellen ist in der XZ- und YZ-Ebene kaum aufgelöst. (H) Post-PmbExM laterale und orthogonale Ansichten eines P. mirabilis-Biofilms . Die bakteriellen Zellschichten des Biofilms (gelbe Pfeilspitzen) und ein isoliertes Bakterium darüber (cyanfarbene Pfeilspitze) können leicht aufgelöst werden. Weiße Balken stellen die physikalische Skala (10 μm) dar, und graue Balken stellen die durch EF normierte Skala dar. Diese Abbildung ist eine Abwandlung von Castagnini, D. et al.3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

PmbExM enthüllte ausgeprägte intrazelluläre DNA-Organisationsmuster in P. mirabilis
PmbExM konnte auf die Biofilmstruktur auf zellulärer und suprazellulärer Ebene zugreifen und demonstrierte seinen Nutzen für die Untersuchung intrazellulärer Merkmale von Biofilmzellen. PmbExM zeigte in Kombination mit der Bildanalyse drei verschiedene Muster der intrazellulären DNA-Organisation: (1) ein haloartiges Muster an der Zellgrenze, begleitet von einem avocadokernartigen Muster in der Mitte (Abbildung 4C, D, gelbe Pfeilspitzen bzw. rote Sternchen); (2) ein bazillusförmiges, heterogenes Muster (Abbildung 4C,E, gelbes Sternchen); und (3) eine zentrische Agglomeration, die mit zwei kleinen kreisförmigen Flecken an den Zellpolen verbunden ist (Abbildung 4E, F, rote Pfeilspitzen). Keines dieser DNA-Organisationsmuster war unter konventioneller, beugungsbegrenzter konfokaler Mikroskopie beobachtbar (Abbildung 4A,B).

Abbildung 4: PmbExM zeigt subzelluläre Merkmale des Biofilms. (A) DNA-Färbung von nicht expandiertem P. mirabilis-Biofilm , erfasst durch beugungsbegrenzte konfokale Mikroskopie. Der grüne Pfeil zeigt die Richtung, Position und Entfernung des Intensitätsliniendiagramms in (B) an. (B) Intensitätsliniendiagramm der relativen Fluoreszenzintensität als Funktion des relativen Abstands entlang des grünen Pfeils. Beachten Sie die homogene Verteilung der bakteriellen DNA im gesamten Zellkörper. (C,E) DNA-Färbung eines durch PmbExM expandierten P . mirabilis-Biofilms und die entsprechenden Intensitätsprofildiagramme (D,F). Farbige Sternchen und Pfeilspitzen zeigen eine unterschiedliche räumliche Organisation der bakteriellen DNA, was sich in der erhöhten Auflösung durch PmbExM zeigt. Unterschiedliche DNA-Organisationsmuster können durch die Peakprofile der Liniendiagramme nachgewiesen werden. Weiße Maßstabsbalken in (A,C,E) stellen 2 μm dar. Graue Balken in (C,E) werden durch den Expansionsfaktor normalisiert. Diese Abbildung ist eine Abwandlung von Castagnini, D. et al.3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzungsdatei 1: Stamm- und Arbeitslösungen für den enzymatischen Aufschluss in der Expansionsmikroskopie. Tabelle 1: Stammlösungen. In dieser Tabelle sind die Standardlösungen aufgeführt, die zur Herstellung aller in dieser Studie beschriebenen Lösungen benötigt werden. Tabelle 2: Benannte Lösungen. In dieser Tabelle sind Name und Zusammensetzung der Arbeitslösungen und Enzymstammpufferlösungen aufgeführt, die im gesamten Protokoll verwendet werden. Verwenden Sie frisch aufbereitete Enzymstammpuffer, um die jeweiligen Enzymstammlösungen zu erzeugen (Tabelle 1). Alle enzymatischen Aufschlusslösungen werden nach Durchführung jedes Experiments hergestellt und verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Details zur Datenverarbeitung und Bildanalyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 3: WEKA-Klassifikator: Modell vor der Expansion. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 4: WEKA-Klassifikator: Modell nach der Expansion. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren erklären, dass keine finanziellen oder persönlichen Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Arbeit bestehen.