Untersuchung des durch Kupfer-Nanopartikel induzierten programmierten Zelltods in Bakterien

Zusammenfassung

Kupfer-Nanopartikel wirken als antimikrobielle Wirkstoffe, indem sie reaktive Sauerstoffspezies erzeugen. Hier werden Verfahren vorgestellt, die zeigen, dass Kupfer-Nanopartikel gegen drei klinisch relevante Krankheitserreger wirksam sind und dass bestimmte programmierte Zelltodwege an diesem bakteriziden Prozess beteiligt sind.

Zusammenfassung

In jüngster Zeit hat die Besorgnis über multiresistente Erreger und unheilbare Infektionen aufgrund des übermäßigen und missbräuchlichen Einsatzes von Antibiotika zugenommen. Nanomaterialien wie Metall- und Metalloxid-Nanopartikel haben im biomedizinischen Bereich als potenzielle neue Strategien zur Bekämpfung multiresistenter Krankheitserreger an Popularität gewonnen. In dieser Studie wurde der Einsatz von Kupfer-Nanopartikeln (CuNPs) als Bakterizid gegen drei häufige im Krankenhaus erworbene opportunistische Krankheitserreger - Escherichia coli (E. coli), Acinetobacter baumannii (A. baumannii) und Staphylococcus aureus (S. aureus) - untersucht, die zunehmend Arzneimittelresistenzen entwickeln. Es werden detaillierte Protokolle für die Synthese von CuNPs in zwei Größen (20 nm und 60 nm) und die Bewertung ihrer bakteriziden Wirksamkeit durch Kolonieassays vorgestellt. Die Mechanismen der antimikrobiellen Wirkung, die CuNPs zugrunde liegen, wurden durch die Bewertung von Veränderungen in der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies untersucht. Darüber hinaus wurden vier Modulatoren, die die menschlichen Proteinfunktionen hemmen, eingesetzt, um die mögliche Beteiligung des programmierten Zelltods (PCD) an der bakteriellen Abtötung zu untersuchen. Durch diesen Ansatz wird das mögliche Auftreten kupferresistenter Stämme vorgeschlagen, aufbauend auf der Erforschung von Kupfer-Homöostaseproteinen, einschließlich kupferabhängiger Transkriptionsregulatoren. Diese Ergebnisse bieten eine umfassende Methodik zur Untersuchung der bakteriziden Wirkung von CuNPs und ihrer potenziellen Rolle bei der Bekämpfung von Antibiotikaresistenzen.

Einleitung

Arzneimittelresistente Bakterien sind in der Medizin ein ernstzunehmender Grund zur Sorge. Ihr schnelles Auftreten hat die Wirksamkeit herkömmlicher Antibiotika verringert, was zu mehr klinischen Komplikationen führt. Sie stellen eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar und schaffen einen dringenden Bedarf an neuen antimikrobiellen Wirkstoffen. Ein Forschungszweig sind Nanomaterialien. Nanomaterialien besitzen einzigartige physikalisch-chemische Eigenschaften, die es ihnen ermöglichen, mit Mikroben auf eine Weise zu interagieren, die ihre Lebensfähigkeit beeinträchtigt. Zum Beispiel induzieren Silbernanopartikel (AgNPs) oxidativen Stress in Bakterien, was zu Proteindysfunktion, Membranzerstörung, DNA-Schäden und schließlich zum Zelltod führt¹. Gold-Nanopartikel (AuNPs) hingegen sind für ihre antimykotischen Eigenschaften bekannt und können die bakterizide Wirkung von Antibiotika verstärken, indem sie als Träger dienen².

Darüber hinaus haben Kupfer-Nanopartikel (CuNPs) aufgrund ihrer starken antimikrobiellen Wirkung und niedrigen Produktionskosten große Aufmerksamkeit erregt. Studien deuten darauf hin, dass CuNPs durch Störung der enzymatischen Aktivität und die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) eine bakterizide Breitbandaktivität ^aufweisen3. Die positive Ladung von CuNPs erleichtert deren Eindringen in die Bakterien und verbessert deren zelluläre Aufnahme⁴. Dieser Mechanismus macht CuNP zu einer vielversprechenden Option für Oberflächenbeschichtungen, z. B. auf Implantaten, um Infektionen zu verhindern³. Eine interessante Erkenntnis ist jedoch, dass die bakterizide Wirkung von CuNPs größenabhängig zu sein scheint. Einige Studien haben ergeben, dass kleinere CuNPs eine höhere antibakterielle Aktivität aufweisen, wahrscheinlich aufgrund ihres überlegenen Verhältnisses von Oberfläche zu Volumen⁵.

Die ROS-Erzeugung verursacht weitreichende Schäden an Zellen und Bakterien, einschließlich Lipidperoxidation, Proteindysfunktion, DNA-Fragmentierung und Hemmung der Glukoneogenese/Glykogenolyse, und ist an Nekrose oder programmiertem Zelltod (PCD) ^{beteiligt6,7,8}. Jüngste Studien haben gezeigt, dass PCD-Systeme in Bakterien existieren, mit ähnlichen Wirkungsweisen und Effektoren wie in eukaryotischen Systemen⁹. Bakteriengemeinschaften können PCD als Reaktion auf Stress, einschließlich oxidativen Stress, durch ein Toxin-Antitoxin (TA)-System induzieren¹⁰. Vereinfacht ausgedrückt besteht das Toxin-Antitoxin-System aus Toxinen, die essentielle zelluläre Prozesse stören können, und Antitoxinen, die mit den Toxinen stabile Komplexe bilden können, um ihre Toxizität unter normalen Wachstumsbedingungen zu hemmen. Die meisten Bakterien und Archaeen enthalten TA-Loci in ihrem Genom, die oft in mehreren Kopien extrachromosomaler und chromosomaler DNA vorhanden sind. Es gibt verschiedene Arten von TA-Systemen, wobei das Typ II TA (bekannt als MazE/MazF-Modul) von besonderem Interesse ist. Unter Stressbedingungen werden Antitoxine abgebaut, so dass Toxine ihre zellulären Ziele hemmen können. In E. coli und S. aureus wird das Toxin MazF als Reaktion auf Stressbedingungen wie oxidativen Stress, hohe Temperaturen und Aminosäuremangel aktiviert. Infolgedessen wird die Expression des Antitoxins MazE reduziert, wodurch das Toxin MazF¹⁰ freigesetzt wird. Studien haben gezeigt, dass MazF die Synthese von Proteinen ermöglicht, die es einer kleinen Subpopulation ermöglichen, unter ungünstigen Bedingungen zu überleben, während der größte Teil der Population einen mazEF-vermittelten Zelltod erfährt. Dieser Zelltod kann entweder ROS-abhängig sein, wobei ROS eine transkriptionelle oder translationale Hemmung induziert, oder ROS-unabhängig, wobei DNA-Schäden die Todeswege auslösen¹¹.

Diese Studie untersucht die Mechanismen, durch die CuNPs den bakteriellen Tod induzieren. Anstatt sich nur auf das TA-System zu konzentrieren, wurden vier PCD-Modulatoren, die zuvor in unserer Forschung verwendet wurden ^7,12, eingesetzt, um potenzielle PCD-Signalwege in Bakterien zu untersuchen.

Durch die Untersuchung der bakteriziden Wirkungen von CuNPs in zwei verschiedenen Größen (20 und 60 nm) bei unterschiedlichen Konzentrationen und unter Verwendung von Methoden wie Kolonie-Assays, ROS-Nachweis und PCD-Modulatoren (SBI, Z-VAD, NSA und Wortmannin) unterstreicht diese Forschung, dass PCD nicht nur bei mehrzelligen Organismen auftritt, sondern auch in Bakteriengemeinschaften unter Stress auftritt. Durch die Bereitstellung detaillierter Protokolle soll diese Arbeit die Forscher in die Lage versetzen, die Wirksamkeit von CuNP und die bakteriziden Mechanismen in ihren eigenen Systemen zu bewerten. Darüber hinaus fördern diese Erkenntnisse das Verständnis der bakteriellen PCD und unterstützen die Entwicklung von CuNP-basierten Therapien zur Bekämpfung antibiotikaresistenter Bakterien.

Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von Kupfer-Nanopartikeln

1. Beziehen Sie kommerzielle Kupfer-Nanopulver (25 nm und 60-80 nm) aus einer kommerziellen Quelle.
2. Verwenden Sie 1,0 mM Natriumdodecylsulfat (SDS) als Dispergiermittel für zwei Größen von 1 mg/ml-Nanopartikeln.
3. Dispergieren Sie die Nanopartikel mit einem Ultraschallbad für mindestens 30 min bei Raumtemperatur. Die vollständig dispergierten Nanopartikel sind dann bereit für den Einsatz in nachfolgenden Experimenten.

2. Vorbereitung der Bakterien

1. Besorgen Sie sich E. coli (Migula) Castellani und Chalmers Stamm 25922 und A. baumannii Bouvet und Grimont Stamm aus der American Type Culture Collection. Beziehen Sie S. aureus vom Bioresource Collection and Research Center.
2. Die Bakterien werden in Luria-Bertani (LB)-Bouillon unter aeroben Bedingungen bei 37 °C kultiviert.
3. Die Bakterienkulturen werden in LB-Medium auf eine optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) von ca. 0,5 verdünnt.

3. Bewertung der Zellviabilität

1. Kolonie-Assay
   1. Verwenden Sie CuNP-Stammlösungen (1 mg/ml), um verschiedene Konzentrationen von CuNPs in zwei Größen herzustellen, darunter 0 μg/ml, 1 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml und 100 μg/ml.
   2. Die in Schritt 2.3 hergestellten Bakterienkulturen werden in Mikrozentrifugenröhrchen aufgeteilt und bei 3300 × g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
   3. Halten Sie die Bakterienpellets zurück und fügen Sie durch schonendes Pipettieren unterschiedliche Konzentrationen von CuNPs jeweils in zwei Größen hinzu.
   4. Behandeln Sie Bakterienpellets mit PBS und 70% Alkohol als Negativ- bzw. Positivkontrolle.
   5. Inkubieren Sie alle behandelten Bakterien durch Schütteln bei 200 U/min bei 37 °C für 24 h.
   6. Waschen Sie nach der Inkubation alle behandelten Bakterien mit PBS und verteilen Sie sie auf LB-Agarplatten. Legen Sie die Platten für 24 h in einen 37 °C heißen Inkubator.
   7. Zählen Sie die Koloniezahlen in jeder Behandlungsgruppe am nächsten Tag und führen Sie eine statistische Analyse durch. Es wird empfohlen, dies aus Gründen der statistischen Genauigkeit in dreifacher Ausfertigung durchzuführen.
2. Untersuchung des bakteriziden Mechanismus
   1. Bereiten Sie die Bakterien wie in Schritt 3.1.2 beschrieben vor und behandeln Sie sie entweder mit 5 μM SBI-0206965 (SBI) für 2 h, 0,5 μM Necrosulfonamid (NSA) für 1 h, 100 nM Wortmannin (Würze) für 30 min oder 100 nM Z-VAD-FMK (Z-VAD) für 30 min.
   2. Die Bakterien werden mit unterschiedlichen Konzentrationen von CuNP-Lösungen in zwei Größen, wie in Schritt 3.1.1 beschrieben, in Gegenwart oder Abwesenheit von 5 μM SBI, 0,5 μM NSA, 100 nM Würze und 100 nM Z-VAD gleichzeitig behandelt.
   3. Die Bakterien nach den Modulatorbehandlungen (Schritt 3.2.1) zentrifugieren und die Überstände entfernen.
   4. Die Bakterienpellets werden in den in Schritt 3.2.2 hergestellten Lösungen resuspendiert und unter Schütteln bei 200 U/min bei 37 °C 24 h lang inkubiert.
   5. Behandeln Sie die Bakterien mit 70 % Ethanol und PBS als Positiv- bzw. Negativkontrolle. Verwenden Sie eine Lösung ohne CuNPs als CuNP-Blindkontrolle (0 μg/ml; Mock) unter den gleichen Inhibitorbedingungen für jede Gruppe. Inkubieren Sie alle Proben für weitere 24 Stunden.
   6. Nach der Inkubation geben Sie das Reagenz für die Zellviabilität in einem Volumenverhältnis von 1:10 in die Kulturen. Inkubieren Sie die Kulturen für weitere 2 Stunden unter Schütteln bei 37 °C.
   7. Die Kulturen werden nach der 2-stündigen Inkubation zentrifugiert (Schritt 3.1.2). Übertragen Sie die fluoreszierenden Überstände auf 96-Well-Platten. Messen Sie die Fluoreszenz mit einer Anregungswellenlänge von 560 nm und einer Emissionswellenlänge von 590 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
   8. Den restlichen Überstand auf ^10-5 und ^10-4 verdünnen und zur Kultivierung auf LB-Agarplatten verteilen.
   9. Einzelne Völker am nächsten Tag zählen.

4. Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies

1. Bereiten Sie Bakterienkulturen wie in Schritt 2.3 beschrieben vor und teilen Sie sie in Mikrozentrifugenröhrchen auf.
2. Behandeln Sie die Bakterien mit verschiedenen Stressbedingungen als ROS-induzierende Positivkontrollgruppen (Daten in den Ergebnissen nicht gezeigt). Die Behandlungen sind in den Schritten 4.2.1-4.2.4 beschrieben.
   1. Setzen Sie die Bakterien 3 h lang 405 nm UV-Licht aus. Inkubieren Sie die Bakterien 2 Stunden lang bei 45 °C.
   2. Anschließend die Bakterien 2 h lang bei 4 °C inkubieren.
   3. Bakterien mit 3%_H2O₂ für 30 min behandeln.
   4. Halten Sie die Bakterien bei 37 °C in LB-Brühe als Negativkontrolle.
3. Bereiten Sie verschiedene Konzentrationen von CuNP vor, wie in Schritt 3.1.1 beschrieben, und behandeln Sie die Bakterien mit 20 nm oder 60 nm CuNP in Konzentrationen von 1 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml und 100 μg/ml für 24 h.
4. Waschen Sie die inkubierten Bakterien zweimal mit PBS, um alle verbleibenden Nanopartikel zu entfernen.
5. Bereiten Sie den Farbstoff 2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (H₂DCFDA) in PBS in einer Endkonzentration von 5 μM vor.
6. Resuspendieren Sie die Bakterienpellets in 5 μM H₂DCFDA und messen Sie die Fluoreszenzintensität bei 520/30 nm Emission mit einem Durchflusszytometer.
   HINWEIS: Die Intensität der grünen Fluoreszenz von FL1 korreliert mit dem ROS-Spiegel in der behandelten Kultur. Es wird empfohlen, dies aus Gründen der statistischen Genauigkeit in dreifacher Ausfertigung durchzuführen.

Ergebnisse

Antimikrobielle Aktivitäten von CuNPs der zweiten Größe in drei Krankheitserregern
Drei opportunistische Krankheitserreger (E. coli, S. aureus und A. baumannii) wurden verwendet, um die bakterizide Aktivität von CuNPs zu testen. Die Bakterien wurden mit 0 μg/ml, 1 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml und 100 μg/ml von 20 nm oder 60 nm CuNPs behandelt, und die bakteriziden Aktivitäten wurden unter Verwendung der minimalen bakteriziden Konzentration (MBC) bestimmt, die aus den K...

Diskussion

In dieser Studie wurden die antimikrobiellen Wirkungen und Mechanismen von CuNPs in zwei Größen und unterschiedlichen Konzentrationen gegen E. coli, S. aureus und A. baumannii untersucht. Unter Verwendung der etablierten Protokolle wurde beobachtet, dass CuNP-induzierte bakterizide Wirkungen oxidativen Stress und eine mögliche PCD-Aktivierung beinhalten. Das Zusammenspiel zwischen Metallhomöostase und bakteriellen Stressreaktionen ist jedoch noch weitgehend une...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Acinetobacter baumannii Bouvet und Grimont Stamm	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA	17978	Bakterien für das CuNP-Toxozitätsexperiment
Bio-Rad iMark Microplate Reader	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA	168-1130	Wird zur Messung der Absorption in bakteriellen Lebensfähigkeitsassays verwendet.
zellpermeiertes 2',7'-Dichlordihydrofluoresceindiacetat  (H2DCFDA)	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA	D6883	Wird zum Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in behandelten Bakterienzellen verwendet.
Kupfer-Nanopartikel (CuNPs) 25 nm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	774081	Zur Herstellung von CuNP-Stammlösung
Kupfer-Nanopartikel (CuNPs) 60-80 nm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	774103	Zur Herstellung von CuNP-Stammlösung
Escherichia coli (Migula) Castellani und Chalmers	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA	25922	Bakterien für das CuNP-Toxocity-Experiment
Gallios Durchflusszytometer	Beckman Coulter, Brea, CA, USA		Wird für die durchflusszytometrische Analyse in mehreren Experimenten verwendet, einschließlich der Detektion reaktiver Sauerstoffspezies.
LB-Agar	FocusBio, Miaoli, Taiwan	LBA500	Wird zur Kultivierung von Bakterien
verwendet Luria-Bertani (LB) Bouillon	Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA	244620	Wird zur Kultivierung von Bakterien
verwendet Necrosulfonamid (NSA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	480073	Wird als Modulator für die Vorbehandlung in Studien zum bakteriellen Todesweg verwendet.
PrestoBlue Reagenz für die Zellviabilität	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	P50200	Wird zur Beurteilung der Zellviabilität durch Fluoreszenz verwendet.
SBI-0206965 (SBI)	BioVision, Milpitas, CA, USA	9580	Wird als Modulator für die Vorbehandlung in Studien zum bakteriellen Todesweg verwendet.
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	L4509	Wird als Dispergiermittel für Kupfernanopartikel verwendet, um die Aggregation zu reduzieren.
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan	13567	Bakterien für das CuNP-Toxocity-Experiment
Varioskan LUX Multimode-Mikroplatten-Reader	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	VLBLATGD2	Wird zur Messung der Fluoreszenz in Zellviabilitätsassays
verwendet Wortmannin (Würze)	Abcam, MA, USA	ab120148	Wird als Modulator für die Vorbehandlung in Studien zum bakteriellen Todesweg verwendet.
Z-VAD-FMK (Z-VAD)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	V116	Wird als Modulator für die Vorbehandlung in Studien zum bakteriellen Todesweg verwendet.