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Schnelle Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus der menschlichen Muttermilch

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DOI:

10.3791/67954

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14. November 2025

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1Department of Pediatrics/Division of Neonatology and Center of Glial Biology in Medicine, University of Alabama at Birmingham School of Medicine, 2School of Health Professions/Department of Clinical and Diagnostic Sciences, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Biological Sciences, Alabama State University, 4Department of Pediatric Surgery, Washington University-St. Louis

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die effektive Isolierung extrazellulärer Vesikel aus der menschlichen Muttermilch mit hoher Reinheit zu beschleunigen und zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel (EVs), nanokleine Partikel mit einer Größe von etwa 20-1000 nm, erregen aufgrund ihres therapeutischen Potenzials schnell Aufmerksamkeit. Insbesondere wurde gezeigt, dass aus der Muttermilch gewonnene extrazelluläre Vesikel (HBMDEVs) in experimentellen Modellen Schutz vor nekrotisierender Enterokolitis bieten, einer Darmerkrankung, die hauptsächlich Frühgeborene betrifft und zu einer Mortalität von bis zu 50 % führt. Herkömmliche extrazelluläre Vesikelisolationstechniken wie differentielle Ultrazentrifugation, Größenausschlusschromatographie usw. sind jedoch entweder zeitaufwändig oder erfordern spezielle Instrumente, die im klinischen Umfeld nicht praktikabel sind. Daher besteht ein Bedarf an einer einfachen Isolationsmethode, die eine schnelle reaktive Verabreichung von HBMDEVs an Patienten ermöglicht. Vorgeschlagen wird hier eine Kombination aus Zentrifugation menschlicher Muttermilch zur Entfernung von Fett und Zelltrümmern, gekoppelt mit einer schnellen Ultrafiltration der verbleibenden Magermilch, die hochleistungsfähige und funktionelle extrazelluläre Vesikel erzeugt. Die Verwendung dieser Technik kann den Einsatz von HBMDEVs als praktische therapeutische Option im klinischen Umfeld ermöglichen.

Einleitung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind ubiquitäre Nanopartikel mit einer Größe von etwa 20-1000 nm, entweder über endosomale Wege (wenn mikrovesikuläre Körper mit der Plasmamembran verschmelzen, was die Freisetzung von zellulärer Fracht in den extrazellulären Raum erleichtert) oder über Plasmamembranwege (d. h. Knospung). EVs enthalten zelluläre Fracht des Wirts wie Lipide, Proteine, Nukleinsäuren, verschiedene Metaboliten und andere Inhalte, abhängig von ihrer Quelle. Darüber hinaus sind EVs wichtig für die interzelluläre Kommunikation, die Angiogenese, die Immunsuppression, den Umbau der Tumormikroumgebung, die Krebsprogression usw.1,2,3,4. Bemerkenswert ist, dass die Muttermilch (HBM) reich an EV ist und von stillenden Müttern leicht zugänglich ist5. In jüngster Zeit haben aus der Muttermilch gewonnene EVs (HBMDEVs) als therapeutische Vektoren zur Behandlung von Krankheiten Aufmerksamkeit erregt 1,2. Neugeborene mit frühem oder niedrigem Geburtsgewicht sind anfällig für verschiedene Infektionen, einschließlich nekrotisierender Enterokolitis. Die nekrotisierende Enterokolitis, die durch eine ileale oder Dickdarmnekrose gekennzeichnet ist, reicht von einer leichten Darmentzündung bis hin zu Multisystemorganversagen mit einer Säuglingssterblichkeitsrate von bis zu 50 %6. Die Vorbehandlung mit aus der Muttermilch gewonnenen EV ist ausreichend, um in experimentellen Modellen von NEC in vitro und in vivo vor Darmentzündungen zu schützen 2,7. Daher kann die Verwendung von HBMDEVs eine praktikable Option für die Behandlung von NEC im klinischen Umfeld sein.

Trotz des therapeutischen Versprechens von HBMDEVs gibt es bekannte Einschränkungen bei der Verwendung aktueller Isolationstechniken, da sie entweder zeitaufwändig sind oder spezielle Geräte erfordern, von denen keines für das klinische Umfeld universell praktikabel ist. Der "Goldstandard" der EV-Isolierung beinhaltet mehrere Runden differentieller Ultrazentrifugation, die zwar eine zufriedenstellende Ausbeute an EVs erzeugt, aber deren strukturelle Integrität und Funktionalität beeinträchtigen kann 8,9. Darüber hinaus können die Ultrazentrifugationszeiten mindestens 2 Stunden betragen, was im klinischen Umfeld eine kostspielige Ressourcedarstellt 9. Isolationskits haben sich sowohl als zeitsparend als auch als etwas kostengünstig erwiesen. Die Isolation mit solchen Methoden führt jedoch auch zu geringen Erträgen und damit zu einer geringen Skalierbarkeit. Daher besteht ein Bedarf an HBMDEV-Isolationstechniken, die sowohl zeitsparend als auch kostengünstig sind, ohne die EV-Ausbeute zu beeinträchtigen.

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine Schritt-für-Schritt-Methode zur schnellen Isolierung von Elektrofahrzeugen aus HBM unter Verwendung vorhandener klinisch verfügbarer, von der FDA zugelassener Instrumente zu skizzieren. Um dies zu erreichen, wurden Standardzentrifugation und ein Filterverlängerungssystem in klinischer Qualität verwendet, um EVs von HBM zu isolieren. Diese Vesikel liegen innerhalb des erwarteten Größenbereichs, weisen eine Morphologie auf, die mit bekannten EVs übereinstimmt, sind für EV-Marker angereichert und funktionell ähnlich wie EVs, die mit herkömmlichen Ultrazentrifugationsisolationstechniken isoliert wurden. Auf diese Weise kann dieses HBM-EV-Isolationsprotokoll eine praktische, schnelle Isolierung und Anwendung von EVs, die von HBM isoliert wurden, im klinischen Umfeld ermöglichen.

Protokoll

Die Muttermilch wurde auf der regionalen Intensivstation der University of Alabama in Birmingham (UAB) gesammelt. Die entnommenen Proben wurden gesammelt, nachdem die Muttermilch für die Patientin aufgetaut worden war, und die Patientin war nicht in der Lage, die gesamte Fütterung zu nehmen. Diese Fütterungen werden normalerweise verworfen, wurden aber zu Forschungszwecken gesammelt. Die Proben wurden von de-identifizierten Individuen entnommen und bis zum Zeitpunkt der Experimente bei -80 °C gelagert. Die Sammlung wurde vom UAB Internal Review Board Protocol N160203002 genehmigt. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Isolierung extrazellulärer Vesikel (differentielle Ultrazentrifugation)

  1. Verdünnen Sie die Muttermilch in einer Biosicherheitswerkbank 1:10 in sterilem PBS in einem konischen 15-ml-Röhrchen.
  2. Die Muttermilch bei 300 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Nach der Zentrifugation sollten 3 verschiedene Schichten vorhanden sein: Milchfett (obere Schicht), Molken- oder Magermilch (mittlere wässrige Schicht) und die Zellen und andere Ablagerungen (unten pelletiert). In einer Biosicherheitswerkbank werden Milchfett- und Molkeschichten durch einen 70-μm-Filter gefiltert (ermöglicht eine leichtere Entfernung von Fett), während das Pellet ungestört bleibt. Übertragen Sie den Durchfluss in ein neues Rohr.
  3. Die Probe wird bei 2600 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. In diesem Schritt werden Milchfettreste, Zellen und Ablagerungen entfernt. In einer Biosicherheitswerkbank wird der Überstand durch einen 70-μm-Filter filtriert. Den Überstand in ein Ultrazentrifugenröhrchen umfüllen. Vergewissern Sie sich, dass sich vor der Ultrazentrifugation mindestens 10 ml Flüssigkeit im Röhrchen befindet.
  4. Die Probe wird bei 20.000 x g für 45 min bei 4 °C ultrazentrifugiert. Nach der Ultrazentrifugation können drei Schichten ähnlich wie in Schritt 1.2 vorhanden sein: Milchfett, Molken- oder Magermilch sowie Zellen und andere Ablagerungen. In einer Biosicherheitswerkbank filtrieren Sie Milchfett und Molkeschichten durch einen 70-μm-Filter, ohne das Pellet zu stören. Den Überstand in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführen.
  5. In einer Biosicherheitswerkbank spritzenfiltrieren Sie die Muttermilch mit einem 0,22 μm Filter. Den Überstand in ein neues Ultrazentrifugenröhrchen überführen. Vergewissern Sie sich, dass sich vor der Ultrazentrifugation mindestens 10 ml Flüssigkeit im Röhrchen befindet.
  6. Die Probe wird bei 110.000 x g für 70 min bei 4 °C ultrazentrifugiert. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml sterilem PBS.
  7. Die Probe erneut bei 110,00 x g für 70 min bei 4 °C ultrazentrifugieren.
  8. In einer Biosicherheitswerkbank wird das Pellet in 150-200 μl sterilem PBS resuspendiert.

2. Isolierung extrazellulärer Vesikel (Schnellfiltrationsmethode)

  1. In einer Biosicherheitswerkbank die Muttermilch (1:10) in sterilem PBS verdünnen.
  2. Die Muttermilch bei 300 x g für 10 min bei 4°C zentrifugieren. Nach der Zentrifugation sollte es drei verschiedene Schichten geben: Milchfett (obere Schicht), Molken- oder Magermilch (mittlere wässrige Schicht) und die Zellen und andere Ablagerungen (pelletiert in der unteren). In einer Biosicherheitswerkbank werden Milchfett- und Molkeschichten durch einen 70-μm-Filter gefiltert (ermöglicht eine leichtere Entfernung von Fett), während das Pellet ungestört bleibt. Übertragen Sie den Durchfluss in ein neues Rohr.
  3. Die Probe wird bei 2600 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. In diesem Schritt werden Milchfettreste, Zellen und Ablagerungen entfernt. In einer Biosicherheitswerkbank wird der Überstand durch einen 70-μm-Filter gefiltert. Überstand in ein 15-ml-Röhrchen überführen.
  4. Entlüften Sie in einer Biosicherheitswerkbank ein 0,22 μm großes 16-Zoll-Filterverlängerungsset mit 5,4 mL PBS.
    1. Nehmen Sie 5,4 ml steriles PBS in eine Spritze und spülen Sie das System, bis PBS aus dem anderen Ende des Schlauchs ausläuft.
  5. Spritzenfiltert die Muttermilch durch ein 0,22 μm großes 16-Zoll-Filterverlängerungsset. In diesem Schritt werden Milchfettreste, Zellen und Ablagerungen entfernt.
    HINWEIS: Je nach Menge an Schmutz in der Probe kann mehr als ein Filterverlängerungssatz erforderlich sein.
  6. Sammeln Sie den Durchfluss in einem konischen 15-ml-Röhrchen.

3. Nanosight-Tracking-Analyse

  1. Verdünnen Sie die Probe (1:1000) in sterilem PBS. Schnellfiltrierte Proben können unverdünnt verwendet werden.
  2. Wirbeln Sie die Probe kurz ein. Geben Sie 1 ml der Probe in eine Tuberkulinspritze.
  3. Befestigen Sie die Spritze am Injektionsgerät und befestigen Sie die Spritze.
  4. Stellen Sie die Einspritzpumpe auf 50. Schalten Sie die Kamera ein, um sicherzustellen, dass nicht zu viele oder zu wenige Partikel angezeigt werden. Stellen Sie sicher, dass der Partikelfluss konstant ist und es zu keinem Überspringen oder plötzlichen Sprung im Probenfluss kommt.
  5. Stellen Sie die Einspritzpumpe auf 100. Führen Sie das Protokoll aus.
    HINWEIS: Die Software wurde so eingestellt, dass sie einmal pro Minute gelesen wird, also insgesamt 5 Lesevorgänge.
  6. Lesen Sie das Beispiel.
  7. Spülen Sie Nanosight zwischen den Proben mit PBS.
    HINWEIS: Zur Bestimmung der Partikelgröße und der Partikelkonzentration pro Milliliter wurde ein Nanopartikel-Tracking-Analysesystem verwendet. Die durchschnittliche Konzentration der ultrazentrifugierten Probe betrug 3,30 e+08 +/- 4,08 e+06 Partikel/ml, während die Schnellfiltrationsmethode 5,50e+08 +/- 1,16e+08 Partikel/ml betrug.

4. Negative Färbung extrazellulärer Vesikel und Transmissionselektronenmikroskopie

HINWEIS: Für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurden Proben mit einer Exosomenkonzentration im Bereich von 108 verwendet.

  1. Glimmentladung Formvar/kohlenstofffilmbeschichtete Gitter aus Kupfer EM für 25 s bei 20 mA mit dem Entladegerät.
  2. Laden Sie 7 μl der EV-Suspensionslösung auf das Gitter und inkubieren Sie 1 Minute lang.
  3. Absorbieren Sie überschüssiges Papier mit Whatman-Filterpapier, indem Sie es von unterhalb des Gitters ableiten, um die Probe in Richtung des Gitters zu "ziehen" und nicht von ihm weg.
  4. Die Probe wird sofort mit einer Pipette mit 7 μl filtrierter 1%iger Uranylacetat (UA)-Lösung auf der Oberfläche des EM-Gitters gefärbt.
  5. Nach 15 s wurde überschüssige UA-Lösung aus dem Gitter entfernt, indem die Gitterkante mit Filterpapier berührt wurde. Betrachten Sie die Probe sofort (innerhalb von 24 Stunden) auf dem TEM bei 80 kV.

5. Proteinkonzentration

  1. Aceton fällt 250 μl gereinigte EVs (1:4) für 1 h bei -20 °C aus.
    HINWEIS: Verwenden Sie 100 μl gereinigte Exosomen für die Ultrazentrifugationsmethode.
  2. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 30 min.
  3. Trocknen Sie das Pellet an der Luft und resuspension Sie anschließend in 100 μl RIPA-Puffer.
  4. Befolgen Sie das Protokoll des BCA-Protein-Assay-Kits, um die Proteinkonzentrationen zu bestimmen. Die Extinktion wurde bei 562 nm mit einem Mikroplatten-Reader gemessen.
    HINWEIS: 1 ml Muttermilch ergibt normalerweise ca. 1,3 μg/ml Protein durch Ultrazentrifugation und ca. 0,2-1 μg/ml Protein durch Schnellfiltration.

6. Westlicher Blot

  1. Inkubieren Sie eine 1-Volumen-Proteinprobe mit einem 4-Volumen-Lane-Marker, reduzieren Sie den Probenpuffer und kochen Sie ihn 7 Minuten lang bei 90 °C.
  2. Laden Sie 10 μg Protein und lassen Sie es 15 Minuten lang auf einem SDS 10% Gel bei 70 V laufen. Erhöhen Sie anschließend die Spannung auf 100 V und lassen Sie sie weitere 90 min laufen.
  3. Das Gel wird mit dem halbtrockenen Gerät 30 Minuten lang bei 15 V auf eine Nitrozellulosemembran übertragen.
  4. Waschen Sie die Membran 3 Mal mit TBS-0,1% Tween (TBS-T) für jeweils 10 min.
  5. Blockieren Sie die Membran für 30 Minuten mit Fast Blocking Buffer Lösung (verdünnt auf 1x).
  6. Inkubation des Primärantikörpers (Hsp70-1:1000; CD63-1:1000 und CD9-1:1000) in 1x Pufferlösung, über Nacht bei 4°C auf einer Wippe 10,11,12.
  7. Waschen Sie die Membran dreimal für jeweils 10 min mit TBS-T.
  8. (H+L) HRP-konjugierter Anti-Maus-Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:1000 für alle interrogierten Proteine (Hsp70, CD9 und CD63) in 2% Milch in TBS-T zugeben und 2 h bei Raumtemperatur auf einer Wippe inkubieren.
  9. Waschen Sie die Membran dreimal für jeweils 10 min mit TBS-T.
  10. Entwickeln Sie mit ECL (1:1) und filmen Sie mit dem Entwickler.

7. In-vitro-Kultur von IEC-6-Zellen

  1. 1,0 x 106 Zellen in einem T-25-Kolben in 5 ml vollständiges RPMI-Medium aussäen. Lassen Sie die Zellen über Nacht anhaften.
  2. Entfernen Sie das gesamte Medium und waschen Sie es mit 1-2 mL PBS.
  3. Aspirieren Sie PBS und fügen Sie 5 mL EV-freies vollständiges RPMI hinzu.
  4. Geben Sie über Nacht eine Endkonzentration von 400 μM H2O2 pro Vertiefung und 10 μg/ml EVs gleichzeitig in die Zellen.
  5. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 1-2 mL PBS.
  6. Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie 1 ml Trypsin hinzu.
    1. Legen Sie die Zellen für 5 Minuten bei 37°C in den Inkubator.
  7. Deaktivieren Sie Trypsin, indem Sie das doppelte Volumen des vollständigen RPMI hinzufügen. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 125 x g .
  8. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml PBS.
  9. Zählen Sie Zellen mit einem Zellzähler.

Ergebnisse

Isolierung von Elektrofahrzeugen durch Ultrazentrifugation und Schnellisolierung
Dogmatisch gesehen umfasst die EV-Isolierung von HBM eine Zentrifugation, um Milchfett und andere große Partikel zu entfernen, gefolgt von einer Filtration, mehreren Runden der Ultrazentrifugation und der Resuspension der mit EV angereicherten Probe in PBS. Bei der Schnellfiltrationsmethode wird eine Zentrifugation verwendet, um Milchfett und Zellablagerungen zu entfernen, gefolgt von einer Filtration über einen 0,22-μm-Filterverlängerungsfilter, wodurch weitere Rückstände entfernt werden, was zu einer mit EV angereicherten Probe führt, die mit herkömmlicher Ultrazentrifugation vergleichbar ist (Abbildung 1).

Charakterisierung von HBMDEVs aus dem Schnellfiltrationssystem der Filtererweiterung
Die Nanosight-Tracking-Analyse ergab eine vergleichbare Partikelgröße zwischen ultrazentrifugierten (Abbildung 2A) und Schnellfilter-isolierten HBMDEVs (Abbildung 2B). Beide Methoden deuten darauf hin, dass isolierte EVs eine mittlere Größe von etwa 100 nm haben. EVs transportieren verschiedene Frachten (d. h. Proteine, Lipide, miRNAs usw.) für die Sekretion von Wirtszellen zu ihren verschiedenen Zielen. Das erste untersuchte Zielprotein war daher das Hitzeschockprotein 70 (Hsp70), ein Protein, von dem bekannt ist, dass es über EVstransportiert wird 13. Die Western-Blot-Analyse zeigt, dass EVs, die durch Schnellfiltration isoliert wurden, eine vergleichbare Expression von Hsp70 zeigten wie solche, die durch Ultrazentrifugation isoliert wurden (Abbildung 3A und ergänzende Abbildung 1A). Darüber hinaus können EVs über die Oberflächenexpression von Tetraspaninen wie CD9 und CD63 identifiziert werden14. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass EVs, die durch Schnellfiltration isoliert wurden, tatsächlich CD9 (Abbildung 3B und ergänzende Abbildung 2B) und CD63 exprimieren (Abbildung 3C und ergänzende Abbildung 3C). Schließlich ergab die morphologische Analyse von HBMDEVs mittels Transmissionselektronenmikroskopie eine ähnliche Vesikelmorphologie zwischen den beiden Isolationstechniken (Abbildung 4A-D).

Mehrere Labore haben gezeigt, dass EVs schützende Eigenschaften verleihen, die das Überleben der Zellen bei zellulärem Stress fördern 2,3,7. Ähnlich wie in zuvor veröffentlichten Berichten sind EVs, die mit der Schnellfiltrationsmethode isoliert wurden, in der Lage, Darmepithelzellen (IEC-6) vor dem durch Wasserstoffperoxid induzierten Zelltod zu schützen2 (Abbildung 5A,B). Diese Daten deuten darauf hin, dass HBMDEVs, die mit der Schnellfiltrationsmethode isoliert wurden, nicht nur vergleichbare Eigenschaften mit denen aufweisen, die durch differentielle Ultrazentrifugation isoliert wurden, sondern auch funktionell ähnlich sind.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der Unterschiede zwischen Ultrazentrifugation und Schnellfiltrationsmethoden für die Isolierung von Elektrofahrzeugen aus der Muttermilch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Nanosight-Tracking-Analyse von EVs, die aus menschlicher Muttermilch mittels Ultrazentrifugation und Schnellfiltrationsmethode isoliert wurden. (A) NTA von EVs aus menschlicher Muttermilch (verdünnt 1:1000 in 1x PBS), isoliert durch Ultrazentrifugation. Die gezeigten Daten sind eine einzige Darstellung von 3-4 unabhängigen Studien. (B) NTA von EV aus menschlicher Muttermilch, die durch Schnellfiltration isoliert wurden. Die gezeigten Daten sind eine einzige Darstellung von 3-4 unabhängigen Studien. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Western-Blot-Analyse von EVs, die mittels Ultrazentrifugation und Schnellfiltration isoliert wurden. (A) Ein-Sekunden-Exposition von 10 μg Hitzeschockprotein 70 (Hsp70). "L" steht für Leiter, "U" für Ultrazentrifugation und "R" für Schnellfiltration. Proben, die durch Schnellfiltration gewonnen wurden, wurden durch Zentrifugation bei 110.000 × g für 70 Minuten weiter konzentriert, wobei sie zweimal durchgeführt wurde. Das gezeigte Bild stellt eine von vier unabhängigen Studien dar. (B) Zweiundzwanzigste Exposition von 10 μg CD9. "L" steht für Leiter, "U" für Ultrazentrifugation und "R" für Schnellfiltration. Die Schnellfiltrationsproben wurden durch Zentrifugation bei 110.000 × g für 70 Minuten konzentriert, wobei zweimal durchgeführt wurde. Das gezeigte Bild stellt eine von vier unabhängigen Studien dar. (C) Zweiundzwanzigste Exposition von 10 μg CD63. "L" steht für Leiter, "U" für Ultrazentrifugation und "R" für Schnellfiltration. Die Schnellfiltrationsproben wurden durch Zentrifugation bei 110.000 × g für 70 Minuten konzentriert, wobei zweimal durchgeführt wurde. Das gezeigte Bild stellt eine von vier unabhängigen Studien dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Transmissionselektronenmikroskopische Analyse von EVs, die mittels Ultrazentrifugation und Schnellfiltration isoliert wurden. (A) Elektronenmikroskopische Aufnahme von EVs, die mittels Ultrazentrifugation bei 8.000× Vergrößerung isoliert wurden. Maßstabsleiste = 800 nm. Das gezeigte Bild stellt eine von drei unabhängigen Studien dar. (B) Elektronenmikroskopische Aufnahme von EVs, die mittels Ultrazentrifugation bei 20.000× Vergrößerung isoliert wurden. Maßstabsleiste = 200 nm. Das gezeigte Bild stellt eine von drei unabhängigen Studien dar. (C) Elektronenmikroskopische Aufnahme von Elektrofahrzeugen, die durch Schnellfiltration bei 8.000× Vergrößerung isoliert wurden. Maßstabsleiste = 800 nm. Die EVs wurden durch Zentrifugation bei 110.000 × g für 70 Minuten konzentriert, wobei die Produktion zweimal durchgeführt wurde. Das gezeigte Bild stellt eine von drei unabhängigen Studien dar. (D) Elektronenmikroskopische Aufnahme von Elektrofahrzeugen, die durch Schnellfiltration bei 20.000× Vergrößerung isoliert wurden. Maßstabsleiste = 200 nm. Die EVs wurden durch Zentrifugation bei 110.000 × g für 70 Minuten konzentriert, wobei sie zweimal durchgeführt wurde. Das gezeigte Bild stellt eine von drei unabhängigen Studien dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Funktionsanalyse von EVs, die mittels Ultrazentrifugation und Schnellfiltration isoliert wurden. (A) Zellviabilität von IEC-6-Zellen, die in EV-freiem vollständigem RPMI-1640-Medium kultiviert wurden. Die Zellen wurden über Nacht mit 400 μMH2,O2 und 10 μg/ml EVs gleichzeitig behandelt. Die gezeigten Daten stellen eine von zwei unabhängigen Studien dar. (B) Zellzahlen von IEC-6-Zellen, die in EV-freiem vollständigem RPMI-1640-Medium kultiviert wurden. Die Zellen wurden über Nacht mit 400 μMH2,O2 und 10 μg/ml EVs gleichzeitig behandelt. Die gezeigten Daten stellen eine von zwei unabhängigen Studien dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Western-Blot-Charakterisierung von Hsp70 in EVs, die mittels Ultrazentrifugation und Schnellfiltration isoliert wurden. Eine Sekunde Exposition von 10 μg Hitzeschockprotein 70 (Hsp70). "L" steht für Leiter, "U" für Ultrazentrifugation und "R" für Schnellfiltration. Die Schnellfiltrationsproben wurden durch Zentrifugation bei 110.000 × g für 70 Minuten konzentriert, wobei zweimal durchgeführt wurde. Jede Probe stellt ein einzelnes biologisches Replikat dar. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Western-Blot-Charakterisierung von CD9 in EVs, die mittels Ultrazentrifugation und Schnellfiltration isoliert wurden. Fünfminütige Exposition von 10 μg CD9. "L" steht für Leiter, "U" für Ultrazentrifugation und "R" für Schnellfiltration. Die Schnellfiltrationsproben wurden durch Zentrifugation bei 110.000 × g für 70 Minuten konzentriert, wobei die Proben zweimal durchgeführt wurden. Jede Probe stellt ein einzelnes biologisches Replikat dar. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Western-Blot-Charakterisierung von CD63 in EVs, die mittels Ultrazentrifugation und Schnellfiltration isoliert wurden. Zehnminütige Exposition von 10 μg CD63. "L" steht für Leiter, "U" für Ultrazentrifugation und "R" für Schnellfiltration. Die Schnellfiltrationsproben wurden durch Zentrifugation bei 110.000 × g für 70 Minuten konzentriert, wobei die Proben zweimal durchgeführt wurden. Jede Probe stellt ein einzelnes biologisches Replikat dar. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Elektrofahrzeuge erregen Aufmerksamkeit, da die Literatur darauf hindeutet, dass sie verschiedene Entzündungsmechanismen regulieren und schützende Vorteile bieten können 2,7. Eine Einschränkung des praktischen Einsatzes von EVs im klinischen Umfeld ist jedoch die Zeit, die benötigt wird, um EVs zu isolieren und eine ausreichende Ausbeute zu erzielen 8,15. Hier wurde ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die schnelle und effiziente Isolierung von Elektrofahrzeugen von HBM mit einem von der FDA zugelassenen Filtersystem skizziert. Der Nutzen dieser Methode halbiert herkömmliche EV-Isolationsmethoden, ohne die Ausbeute zu beeinträchtigen. Daher kann dieses Protokoll eine praktische therapeutische Anwendung von aus menschlicher Muttermilch gewonnenen EV in einem klinischen Umfeld ermöglichen, sollte die EV-Therapie in absehbarer Zeit zugelassen werden.

Bestehende EV-Isolationsprotokolle haben eine konsistente und effektive Ausbeute an EVs aus ihrer Ausgangsflüssigkeit gezeigt. Traditionelle Isolationsmethoden, sei es der Goldstandard, die differentielle Ultrazentrifugation oder die Verwendung kommerzieller Kits, sind jedoch nicht ohne Grenzen. Die Isolierung von EVs durch differentielle Ultrazentrifugation ist zwar effektiv, aber zeitaufwändig mit Protokollen mit kombinierten Schleuderzeiten von mindestens ~3 h 2,8,15. Die Isolationszeit in Kombination mit Protokollen zur korrekten Quantifizierung der EV-Zahlen würde ihren Einsatz unter Zeitdruck in einem klinischen Umfeld zu einer Herausforderung machen. Darüber hinaus sind kommerzielle Kits zwar effektiv, aber teuer. Darüber hinaus ist die Anzahl der Proben, die pro Kit verarbeitet werden können, angesichts der hohen Kosten dieser Kits gering 8,15.

Dieses Protokoll bietet eine Lösung für diese Einschränkungen, die Zeit und Geld spart, ohne die Ausbeute oder Reinheit von Elektrofahrzeugen zu beeinträchtigen. Damit dieses Protokoll wirksam ist, gibt es wichtige Schritte, die bei der Durchführung des Protokolls befolgt werden müssen. Eine Verdünnung und eine erste Zentrifugation der menschlichen Muttermilch sind notwendig, um extrazelluläre Ablagerungen und Milchfett aus der Milchprobe zu entfernen. Die Entfernung dieser Ablagerungen ist entscheidend, um ein Verstopfen des Filterverlängerungssystems zu verhindern und somit zu verhindern, dass mehrere Filter für eine Probe verwendet werden müssen. Darüber hinaus ist das Spülen des Filterverlängerungssystems mit PBS von entscheidender Bedeutung, da es den Filter zur Vorbereitung der Probe vorbereitet. Das Priming trägt dazu bei, dass die Probe während des Priming-Prozesses nicht verloren geht. Es ist zu beachten, dass je nach Inhalt der Muttermilchprobe mehr als ein Filterverlängerungsset erforderlich sein kann, unabhängig davon, ob die Probe vor der Filtration verdünnt und zentrifugiert wird. In diesem Fall kann mehr als ein Filter verwendet werden. Das neue Filterverlängerungsset muss jedoch vor der Filtration der Probe grundiert werden.

Dieses Protokoll ist effektiv und konsistent bei der Isolierung von Elektrofahrzeugen aus der menschlichen Muttermilch, es gibt jedoch einige Einschränkungen zu beachten. Die Zentrifugenschritte (~20 min Gesamtzeit zwischen beiden Umdrehungen) vor der Filtration der Probe sind notwendig. Versuche, die verdünnte Probe ohne Zentrifugation zu filtrieren, führen zu wiederholter Verstopfung des Filterverlängerungssystems, zum Verlust der Probe und verlängern die Zeit des EV-Isolationsprotokolls. Darüber hinaus war die Probe nicht rein, wie die NTA- und TEM-Analyse zeigte. Versuche, Proben zu verwenden, die vor der Filtration nicht zentrifugiert wurden, können unerwünschte Verunreinigungen in die Probe einbringen, was je nach zukünftiger nachgelagerter Anwendung isolierter Elektrofahrzeuge zu Off-Target-Effekten führen kann. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll nur in Bezug auf die Isolierung von EVs aus der menschlichen Muttermilch implementiert. Daher wurde die Wirksamkeit dieses Protokolls bei der Isolierung von EVs aus anderen Flüssigkeiten nicht untersucht. Angesichts der wässrigen Natur aller Körperflüssigkeiten ist nicht zu erwarten, dass es Unterschiede in der Reinheit und Ausbeute von Elektrofahrzeugen geben wird, wenn dieses Protokoll verwendet wird, um Elektrofahrzeuge aus anderen Quellen zu isolieren.

Es sollte auch beachtet werden, dass dieses Protokoll bei der Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel (sEV) effizient ist. Laut NTA waren HBM-abgeleitete EVs ~100 nm groß, was darauf hindeutet, dass größere EVs in der Stichprobe nicht vorhanden waren. Der Grund dafür ist, dass die Proben mit einem 0,22-μm-Filter gefiltert wurden, der hauptsächlich für die Isolierung von Exosomen und anderen kleineren EVs verwendet wird, was zum Zeitpunkt dieser Studie ein Hauptaugenmerk des Labors war. Theoretisch kann die Verwendung eines Filters mit größeren Poren die Isolierung größerer EVs ermöglichen. Diese Fragen gehen jedoch über den Rahmen der vorliegenden Studie hinaus.

Aus der Muttermilch gewonnene EVs stellen eine natürliche therapeutische Quelle dar, die für den klinischen Einsatz leicht zugänglich ist. Eine Einschränkung bei der Einführung von Elektrofahrzeugen in das klinische Umfeld ist die Isolierung von Elektrofahrzeugen in einer praktischen Methode, die potenziell von jeder Einrichtung verwendet werden könnte. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um diese Einschränkung zu überwinden und kann problemlos im Krankenhaus angewendet und mit einem vorhandenen, von der FDA zugelassenen Filtersystem in Krankenhausqualität implementiert werden, das im Handel erhältlich ist, oder für viel weniger als die Standard-Ultrazentrifuge erworben werden. Diese Methode ist kostengünstig und erzeugt eine EV-reiche und reine Probe aus einem Filtrationssystem, das bereits im klinischen Umfeld eingesetzt wird.

Offenlegungen

Der/die Autor(en) haben keine potenziellen Interessenkonflikte in Bezug auf die Forschung, die Autorenschaft und/oder die Veröffentlichung dieses Artikels erklärt.

Danksagungen

Bilder und Abbildungen wurden mit Hilfe von biorender.com generiert. Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde von der UAB High Resolution Imaging Facility unterstützt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIH/NICHD 5R21HD104481.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
(H+L) HRP-konjugierte AntimausBio-Rad1721011
(H+L) HRP-konjugierte AntikaninchenBio-Rad1706515
0,20 SpritzenfilterFisherbrand09-719C
0,70 μm Zell-SiebCorning431751
1,5 m Tris HCLIntern hergestellt
15-mL-RöhrenFalke352096
16-Zoll-FilterverlängerungssatzB-BRAUNFE2012F
1M Tris HCLTeknovaT1068
1x PBSGibco10010-031
50-mL-RöhrenFalke353070
5x reduzierender SamplepufferThermowissenschaftlich39000
AcylamidFisher Scientifc BP1410-1
Amphotericin BGibco15290-018
AMT NanoSprint43 Mark-II KameraAMT
Anti-AntiGibco15240-062
Anti-CD63NovusbioNBP2-32830
Anti-CD9Invitrogen10626D
APSThermowissenschaftlich17874
BCA-Protein-Assay-KitPierce23227
Beckman-RöhrenBeckman coulter 344059
BrightStar ECL ChemiluminescentAlkali ScientificXR92
Exosom erschöpftes FBSFisher ScientificNC0464480
Schneller BlockpufferPierce37575
Fetales RinderserumLebenstechnologien10082147
Hsp70InvitrogenMA3-006
Menschliches InsulinSigma-AldrichI9278-5ML
WasserstoffperoxidFisher ScientificH325-500
IEC-6 ATCCCRL-1592
JEOL 1400 FLASH TEMJEOL USA Inc
Lane-Marker-reduzierender ProbenpufferThermowissenschaftlich39000
MilchpulverBioworld30620074-1
Nanosight NS 300Malvern Instruments Ltd.
NitrocellulosemembranLebenstechnologien88018
PELCO easiGlow-EntladungsgerätTed Pella
Proteaseinhibitor-Mini-TablettenPierceA32955
RIPA-PufferPierce89901
RPMI 1640Fisher Scientifc 11875119
SDSFisher Scientifc BP2436-200
T-25-KolbenThermowissenschaftlich156367
TBSIntern hergestellt
TEMEDBio-Rad161-0801
Trypsin EDTAGibso25200-056
Tween 20ThermowissenschaftlichJ20605-AP

Referenzen

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