Methodenartikel

Ein stromlinienförmiger, etikettenfreier, Echtzeit-50%-Gewebekultur-Infektionsdosen-Assay (TCID50) unter Verwendung von Impedanz zur automatisierten Quantifizierung viraler Titer-Quantifizierung

1.4K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/67956

⸱

9. Januar 2026

 ,  ,  ,  , 
1Agilent Technologies, Inc.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der hier berichtete TCID50-Test nutzt beschriftungsfreie Echtzeitimpedanzmessungen und das Virologiemodul des Systems, um virusinduzierte zytopathische Effekte (CPE) objektiv in Echtzeit zu überwachen. Dieser optimierte Assay reduziert die praktische Erfahrung erheblich, unterstützt gleichzeitig hochdurchgängige, quantitative kinetische CPE-Messungen und ermöglicht automatisierte, Echtzeit-TCID50-Berechnungen.

Zusammenfassung

Die Messung des viralen Titers, also der Konzentration eines Virus in einer Probe, ist ein grundlegendes Verfahren in der virologischen Forschung. Obwohl sie unerlässlich sind, können traditionelle Methoden wie der Plaque-Test und der TCID50-Test zeitaufwendig sein, eine Färbung oder Markierung der Reagenzien erfordern und oft eine subjektive Interpretation beinhalten, insbesondere wenn zytopathische Effekte (CPE) subtil oder schwer durch Bildgebung zu quantifizieren sind. Beispielsweise können TCID50-Assays Viability-Farbstoffe wie MTT oder MTS verwenden, während Plaque-Assays auf Bildgebung und Färbung setzen, um virale Plaques sichtbar zu machen, was beide Variabilität verursachen kann. Darüber hinaus bieten diese traditionellen Methoden nur eine statische Momentaufnahme der viralen Infektivität, was die Fähigkeit einschränkt, die dynamischen Interaktionen zwischen Viren und permissiven Zellen zu erfassen. Um die derzeitigen Einschränkungen bei der Messung des Virentiters zu überwinden, wurde ein optimierter TCID50-Test entwickelt, der impedanzbasierte Technologie verwendet, um CPE objektiv, nicht-invasiv und in Echtzeit zu messen und so die Notwendigkeit von Etiketten zu eliminieren. In dieser Studie wurden zwei virus-permissive Zellmodelle zur Validierung des Impedanz-TCID50-Tests verwendet: das GFP-markierte Adenovirus (Adv-GFP) in HEK293A Zellen und das Influenza-A-Virus (IAV) in MDCK-Zellen. Der Arbeitsablauf ist einfach und umfasst Zell-Seeding, Virenimpfung, Echtzeitüberwachung und automatische Analyse von TCID50 durch die Software. Während der gesamten Infektion wurden TCID50-Werte automatisch von der Systemsoftware unter Verwendung der Reed-Muench-Formel zu allen aufgezeichneten Zeitpunkten berechnet. TCID50-Werte der IAV, die durch Impedanzanzeigen erhalten wurden, waren vergleichbar mit denen des konventionellen kristallviolettfärbenden TCID50-Tests. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Quantifizierung von Viren präzise und effizient mittels Impedanzmessung in Kombination mit dem Virologiemodul der Systemsoftware erreicht werden kann. Der neue Assay vereinfacht traditionelle Methoden und bietet gleichzeitig verbesserte Einblicke in die virale Dynamik, unterstützt so fortschrittliche virologische Forschung und erweitert potenzielle klinische Anwendungen.

Einleitung

Da sich die virologische Forschung rasant weiterentwickelt, bleibt eine genaue Quantifizierung der viralen Infektivität entscheidend, um virale Mechanismen zu verstehen, antivirale Therapien zu entwickeln und die Impfstoffwirksamkeit zu bewerten. Eines der wichtigsten Verfahren ist die Messung des viralen Titers, also der Konzentration von Viralpartikeln in einer Probe. Der TCID50-Test, der die Anzahl der infektiösen Viruspartikel quantifiziert, die für die Produktion von CPE in 50 % der geimpften Zellen erforderlich sind, ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Bestimmung des funktionellen viralen Titers. Dieser weit verbreitete Endpunkt-Test ist besonders wertvoll für Viren, die keine Plaques bilden, und kann als Alternative zum Plaque-Test1 dienen.

Im Allgemeinen dauert der TCID50-Test je nach Virus und permissiven Zellen 2–14 Tage. CPE, einschließlich Veränderungen in Zellproliferation, Morphologie und Lebensfähigkeit, wird entweder durch (1) kolorimetrische Messungen nach Zugabe von Reagenzien wie MTT-Test (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid) und MTS (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-Carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) Test mit einem Plattenleser2 bewertet, oder (2) visuelle Bewertung morphologischer oder kulturbezogener Veränderungen mittels optischer Bildgebungsplattformen – zum Beispiel die Beurteilung von CPE durch Messung der prozentualen Konfluenz3, oder (3) visueller Nachweis von CPE durch kristallviolette Färbung nach der Fixierung von virusbehandelten Brunnen mit Formalin oder Paraformaldehyd (PFA). Die positive Rate der viralen Infektionen, die sich aus der Anzahl der CPE-positiven Replikate bei jeder viralen Verdünnung ergibt, bildet die Grundlage für die Berechnung von TCID50. Die Verdünnung, bei der 50 % der Kulturen CPE aufweisen, wird statistisch mit den etablierten Formeln4 berechnet, wie Reed-Muench, Spearman-Karber und Improved-Karber, und das Ergebnis wird als TCID50 pro Milliliter (TCID50/mL) angegeben.

Traditionelle TCID50- und Plaque-Tests gelten weithin als Goldstandard für funktionelle virale Quantifizierung und können wertvolle Einblicke liefern. Diese Assays sind jedoch oft mühsam, zeitaufwendig und erfordern eine manuelle Färbung, um CPE sichtbar zu machen, was zu geringem Durchsatz, erhöhtem Risiko menschlichen Fehlers und Subjektivität führt. Bei hochinfektiösen oder tödlichen Viren sind die Minimierung der Expositionszeit gegenüber Viren und die Reduzierung von virushaltigen Abfällen durch zusätzliche Schritte wie Färbungen wichtige Überlegungen zur Verbesserung der Biosicherheit. Mit Ausnahme des labelfreien, bildgebenden TCID50-Tests sind die meisten TCID50- und Plaque-Tests ebenfalls Endpunkt-Tests, was zu einem suboptimalen Zeitpunkt für die Titerbewertung führen und die Fähigkeit einschränken kann, die dynamischen Interaktionen zwischen Viren und Wirtszellen zu beobachten. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein stromlinienförmiger, labelfreier und Echtzeit-TCID50-Test entwickelt und etabliert. Konzeptionell ähnelt sie dem herkömmlichen TCID50-Test, nutzt die neue Methode zelluläre Impedanzmessungen, die vom RTCA MP-System erfasst und analysiert werden, um die Infektion objektiv und kontinuierlich über die Zeit zu überwachen.

Es wurde nachgewiesen und bestätigt, dass impedanzbasierte Biosensing eine qualitative und quantitative zusammengesetzte Anzeige von Zellanzahl, Morphologie und Zell-Substrat-Anheftungsstärke auf etikettfreie, nicht-invasive Weise liefert 5,6. Frühere Studien haben gezeigt, dass virusinduzierte CPE in Echtzeit mit RTCA-Impedanzmessungen 7,8,9 genau quantifiziert werden kann. Anstatt die rohen Impedanzwerte zu melden, verwenden die Systeme einen einheitslosen Parameter namens Cell Index (CI), um Veränderungen der Impedanz durch zelluläre Ereignisse widerzuspiegeln. Zum Beispiel steigt der CI, wenn Zellen am Boden des Bohrlochs haften, sich ausbreiten und daran wachsen. Umgekehrt sinkt der CI, wenn Zellen absterben, schrumpfen oder sich ablösen, wie etwa während einer Virusinfektion.

Angesichts der vielversprechenden Berichte, die Impedanz zur Messung von CPE verwenden, zielte diese Studie darauf ab, zu zeigen, dass der impedanzbasierte TCID50-Test eine zuverlässige und genaue Alternative zur herkömmlichen viralen Quantifizierung ist. Das Virologiemodul der Systemsoftware ermöglicht automatisierte TCID50-Berechnung während der gesamten Echtzeit-CPE-Messung, vereinfacht und verkürzt den Assay-Prozess und liefert wertvolle Einblicke in die Kinetik der Virusreplikation und deren Interaktion mit permissiven Zellen.

Protokoll

Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Impedanzbasierte TCID50-Analyse

HINWEIS: Wie Abbildung 1 zeigt, besteht ein impedanzbasierter TCID50-Test aus vier Schritten, darunter permissive Zellbepflanzung auf einer Biosensorplatte, Virusverdünnungsvorbereitung und -impfung, CPE-Messung am System sowie schließlich Datenanalyse und TCID50-Berechnung mit dem Virologiemodul der Systemsoftware.

  1. Assay-Vorbereitung: Wiederbelebung und Subkultur permissive Zellen
    HINWEIS: Dieser Schritt muss eine Woche vor dem Assay durchgeführt werden. Um Unterschiede zwischen den Experimenten zu minimieren, wird dringend empfohlen, eine Zellbank von permissiven Zellen mit derselben Durchgangszahl für den Einsatz im Assay vorzubereiten. Verwenden Sie nach dem Kauf beim Zellanbieter keine Zellen, die älter als 15 sind.
    1. Kryopreservierte permissive Zellen auftauen
      1. Warmes Zellwachstumsmedium in einem 37 °C Wasserbad für mindestens 30 Minuten. Zum Beispiel wurde Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin, für HEK293A Kultur verwendet.
      2. Ein Fläschchen mit Zellen aus der für TCID50-Assays reservierten Zellbank auftauen, indem man es vorsichtig 1-2 Minuten in einem 37 °C Wasserbad schwenkt, bis einige Eiskristalle vorhanden sind; Tauchen Sie die Kappe nicht ab. Wische das Fläschchen mit 70 % Ethanol ab und lege es in eine laminare Haube.
      3. Übertragen Sie die Zellen vorsichtig in ein neues 50 ml konisches Rohr und fügen Sie 9 ml erwärmtes Wachstumsmedium zu den Zellen hinzu.
      4. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 4 Minuten bei Raumtemperatur.
      5. Entsorgen Sie das Supernatant und lassen Sie die Zellen in 15 mL erwärmtem Wachstumsmedium wieder suspendieren. Trage sie in eine neue T75-Flasche um.
      6. Wachsen Sie die Zellen in einem 37 °C Inkubator mit 5 %CO2 auf eine 80%-90%-Konfluenz.
    2. Subkultur von permissiven Zellen.
      1. Überwachen Sie die Zellen, bis sie eine 80%-90%ige Konfluenz erreichen.
      2. Entfernen Sie serumhaltige Medien aus dem Kolben und spülen Sie die Zellmonoschicht vorsichtig einmal mit Mg- und Ca-freiem Dulbecco-phosphatgepufferten Kochsalzlösungslösungslösung (DPBS).
      3. Trypsinisieren Sie die Zellen, indem Sie 2 ml 0,05%ige Trypsin/EDTA-Lösung pro T75-Kolben gleichmäßig verteilt und die Kolben 1-3 Minuten in einem 37 °C-Inkubator lassen.
        HINWEIS: Trippsinisieren Sie die Zellen nicht übermäßig, da dies schädlich für die Zellen sein kann.
      4. Stoppen Sie die Trypsinisierung, indem Sie 8 ml serumhaltiges Material hinzufügen, um das ursprüngliche Trypsinvolumen mindestens um das Fünffache zu verdünnen. Übertragen Sie 2,5 ml der Zellsuspension auf eine neue T75-Kolben und fügen Sie dann 8 ml Kulturmedium hinzu.
        HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung frisch aufgetauter permissiver Zellen für den TCID50-Test. Verwenden Sie stattdessen kultivierte Zellen mit 80%-90% Konfluenz. Um die interexperimentelle Variabilität zu verringern, sollten die wiederbelebten Stellen maximal zwei Wochen nach dem Auftauen erhalten bleiben. Um während der zweiwöchigen Kultur eine hohe Zelllebensfähigkeit und -proliferation zu gewährleisten: (1) Wachstum des Wachstumsmediums mindestens zweimal pro Woche wechseln; (2) Subkulturzellen, wenn sie eine 80%-90%ige Konfluenz erreichen. Für längere Wartungsarbeiten über zwei Wochen hinaus ist eine Validierung erforderlich.
  2. Viraler Titer
    HINWEIS: Dieser Schritt muss am ersten Tag durchgeführt werden.
    1. Messung des Biosensorplattenhintergrunds
      1. Übertragen Sie vorsichtig 50 μL vorgewärmtes Medium mit einer Mehrkanalpipette in jedes Bohrloch, wobei die Reverse-Pipetttechnik verwendet wird, um die Blasenbildung zu minimieren und eine gleichmäßige Volumendosierung sicherzustellen.
      2. Platzieren Sie den Teller in die Plattenstation; Öffnen Sie die Software des Systems und wählen Sie das Virologie-Modul aus, bevor Sie das Experiment starten. Geben Sie alle relevanten Notizen im Reiter Exp Notes ein und geben Sie nach Auswahl der entsprechenden Brunnen Zelleninformationen ein, einschließlich Zellnamen und Nummer, im Untertab Zelle des Layout-Tabs. Alternativ können Zellinformationen nach dem Seeding eingegeben werden.
        HINWEIS: Die Platten-Hintergrundmessung muss durchgeführt werden, bevor Zellen in die Bohrungen der Platte eingefügt werden. Hintergrundwerte für alle Brunnen sollten zwischen -0,063 und 0,063 liegen.
      3. Im Reiter Zeitplan klicken Sie auf die Schaltfläche "Schritt hinzufügen ", um Schritt 1 hinzuzufügen, der für die Schilder-Hintergrundmessung vorgesehen ist. Dann starten Sie die Aufnahme, indem Sie auf die Start-Schaltfläche klicken.
      4. Nimm die Platte von der Station und setze sie zurück in die Haube zur Zellinzaat.
    2. Permissive Zellaussaatung auf die 96-Well-Biosensorplatte
      1. Trypsinisiere die Erlaubniszellen aus dem T75-Kolben.
      2. Zählen Sie die Zellen und passen Sie die Zellsuspension auf die gewünschte Konzentration ein. In dieser Studie betrug die Konzentration von HEK293A 60.000 Zellen/mL.
      3. Fügen Sie 100 μL Zellsuspension zu jedem Brunnen der Platte hinzu.
        HINWEIS: Die richtige Zelldichte ist entscheidend. Eine suboptimale Aussaatdichte könnte zu einem experimentellen Artefakt führen. Daher muss die Aussaatdichte optimiert werden, bevor ein TCID50-Test durchgeführt wird.
      4. Lassen Sie die Platte nach der Zugabe der Zelle 30 Minuten in der Haube bei Raumtemperatur, damit sich die Zellen gleichmäßig am Boden des Brunnens verteilen können.
        HINWEIS: Das Nichtausführen dieses Schrittes kann zu großen Variationen von Brunnen zu Brunnen führen.
      5. Platziere die Platte in die Plattenstation in einem 37 °C Inkubator mit 5 %CO2.
      6. Navigiere zum Reiter Zeitplan der Software und füge Schritt 2 mit den Standardaufnahmeeinstellungen hinzu: 100 Sweeps und ein 15-minütiges Intervall. Dies initiiert alle 15 Minuten eine Impedanz-/CI-Überwachung und ermöglicht eine Echtzeitbewertung der Zellbindung und -proliferation als Zellqualitätskontrollschritt (QC) vor der Virusimpfung.
        HINWEIS: Tag 2 – Um die Reproduzierbarkeit und Konsistenz des Assays zwischen den Experimenten zu maximieren, ist es entscheidend, die Zellleistung im System zu bewerten, bevor der nächste Schritt übergeht. Da KI die Zellbindung und das Wachstum widerspiegelt, dienen KI-Werte während der 20–28-Stunden-Zeit nach der Aussaat als wichtiger Qualitätskontrollparameter. Sowohl der Wert als auch die Kinetik von CI sind zellspezifisch. In dieser Studie sollte für HEK293A Zellen, die mit 6.000 Zellen pro Bohrloch ausgesät und 20–28 Stunden kultiviert werden, das CI 2 überschreiten. Wenn der CI innerhalb von 20–28 Stunden nach der Aussaat nicht 2 erreicht, gilt die HEK293A Zellkultur als nicht bestanden, und der anschließende TCID50-Test wird nicht durchgeführt. Dieses Kriterium gewährleistet eine hohe Reproduzierbarkeit experimenteller Ergebnisse.
    3. Vorbereitung von Virusserialen Verdünnungen
      1. Berechnen Sie das Gesamtvolumen des Mediums (DMEM + 2 % FBS + 1 % Penicillin / Streptomycin), das zur Herstellung der Verdünnungen benötigt wird, und erwärmen Sie es in einem 37 °C Wasserbad für 30 Minuten. Das Medium wird für den Rest des Experiments verwendet.
      2. Tauen Sie ein Fläschchen mit aliquotiertem Virusbestand schnell in einem 37 °C Wasserbad für 1–2 Minuten auf, bis alle Eiskristalle geschmolzen sind.
      3. Bereiten Sie 10-fach seriell verdünnte Viren vor, indem Sie 20 μL des Viruslagers in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenrohr mit jeweils 180 μL vorgewärmtem Medium übergeben. Pipette auf und ab, um eine gründliche Vermischung von Medium und Virus sicherzustellen.
        HINWEIS: Tauchen Sie die Pipettenspitze nicht zu tief in die virale Lösung ein, um zu verhindern, dass überschüssige Viruspartikelrückstände außerhalb der Spitze transportiert werden, da dies zu ungenauen Verdünnungen führen kann.
      4. Um Schwankungen der Impedanzwerte durch die Zugabe von Erkältungsvirusproben zu vermeiden, gleichen Sie die Virusverdünnungen aus, indem Sie sie im Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2für 20 Minuten vor der Impfung inkubieren.
    4. Geben Sie Virusbehandlungsinformationen im Layout-Tab ein
      1. Auf dem Reiter "Platte Layout " der Software; Wählen Sie die Brunnen für die virale Titerbehandlung aus; Klicken Sie auf den Untertab Behandlung und geben Sie in diesem Experiment die anfängliche Verdünnung ein, zum Beispiel 0,001 (10-3); geben Sie 10 als "Verdünnungsfaktor" ein; wähle in diesem Fall die Verdünnungsrichtung von links nach rechts. Die virale Verdünnung wird automatisch basierend auf der Eingabe des Plattenlayouts berechnet und in jedem entsprechenden Brunnen angezeigt.
      2. Als Nächstes geben Sie das Virus-Impfvolumen ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Anwenden , um alle Behandlungsinformationen zu speichern. Dieser Schritt ist unerlässlich, um TCID50/mL während der Datenanalyse genau zu berechnen.
      3. Weisen Sie die Bohrungen, die nicht mit Viren behandelt werden, als Negativkontrolle zu, indem Sie die entsprechenden Brunnen auswählen und dann unter Brunnentyp im Reiter Behandlung Negativ Strg aktivieren.
        HINWEIS: Negativkontrollbrunnen müssen benannt und zur Layout-Seite hinzugefügt werden; Auslassung wird die Berechnung des TCID50 verhindern.
    5. Virus-Impfung
      1. Wenn Sie bereit sind, drücken Sie die Pause-Taste in der Software, um die Datenerfassung zu stoppen. Entfernen Sie die Platte von der Station und legen Sie sie in die laminare Haube.
      2. Entfernen Sie vorsichtig das Kulturmedium aus den Bohrlöchern der Platte mit einer Mehrkanalpipette.
      3. Fügen Sie vorsichtig 50 μL virale Verdünnung mit einer Mehrkanalpipette an die Oberseite der Zellmonoschicht hinzu, um eine Störung der Zellkultur zu vermeiden.
      4. Setze die Platte zurück in die Station und füge Schritt 3 mit den Standardaufnahmeeinstellungen (100 Sweeps und ein 15-minütiges Intervall) im Schedule-Tab hinzu, um die Aufnahmeimpedanz alle 15 Minuten für 2 Stunden fortzusetzen, sodass sich das Virus an die Zellen binden kann.
      5. Nach 2 Stunden Virusimpfung wird die Aufnahme pausiert und die Platte von der Station zur laminaren Haube entfernt.
      6. Fügen Sie langsam 150 μL vorgewärmtes Medium mit einer Mehrkanalpipette in die Bohrungen ein, um eine Störung der Zellmonoschicht zu vermeiden; Bring das Kennzeichen zurück zur Station.
      7. Setzen Sie Schritt 3 fort, indem Sie auf Start im Reiter "Planen" klicken. Die Impedanzsignale werden während der gesamten Impfzeit kontinuierlich alle 15 Minuten gemessen.
    6. Die Berechnung von TCID50 erfolgt entweder während oder nach Abschluss des TCID50-Tests
      1. Wählen Sie im Tab Datenanalyse alle im Assay verwendeten Brunnen aus und fügen sie dem Diagramm hinzu. Die y-Achse des Diagramms wird durch die im Y-Achse-Dropdown-Menü ausgewählte Option bestimmt.
      2. Navigiere zum Abschnitt Parameter . Wählen Sie TCID50 aus der Parameter-Dropdown-Liste, um die Berechnung von TCID50 zu starten.
      3. Wählen Sie das Balkendiagramm für die Berechnung des TCID50 zu einem bestimmten Zeitpunkt oder wählen Sie zeitabhängigen TCID50 , um den TCID50-Zeitverlauf über einen gewünschten Zeitraum während der Impfung zu erzeugen. Der TCID50/mL wird berechnet und nach dem Klick auf die Ausführungstaste angezeigt.

2. Kristall-Violett-TCID50-Test

  1. Säe permissive Zellen in einer 96-Well-Mikroplatte mit der optimalen Saatdichte, wie im impedanzbasierten TCID50-Test beschrieben (Schritte 1–2).
  2. Führen Sie eine virenartige Verdünnungsvorbereitung und Inokulation wie im impedanzbasierten TCID50-Test vorgeschrieben durch.
  3. Fixierung und Verfärbung
    1. Nach Abschluss des Tests entsorgen Sie das Supernatant vorsichtig aus jedem Bohrloch und fügen Sie 100 μL 4 % Formaldehyd hinzu, um die Zellen zu fixieren.
    2. Inkubieren Sie bei 4 °C 1 Stunde lang und entfernen Sie dann das Fixativ.
    3. Färben Sie die fixierten Zellen mit 0,5 % Crystal Violet, das in PBS zubereitet wurde. 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
    4. Waschen Sie den Teller mit Leitungswasser, bis der Hintergrund frei ist. Lass den Teller vor dem Ritzen vollständig an der Luft trocknen.
      HINWEIS: Kristallviolett-Abfälle gelten sowohl nach RCRA als auch nach dem California Code of Regulations (CCR 66261.24) als gefährlich. Sammeln Sie alle verbrauchten Kristall-Violettlösungen, kontaminierte Materialien (z. B. Papiertücher, Handschuhe) und spülen Sie Abfälle in einem speziellen Behälter für gefährliche Abfälle. Entsorgen Sie den Abfall über den Umweltschutz- und Sicherheitsbeauftragten (EH&S) oder lizenzierten Entsorgungsunternehmen Ihrer Institution.
  4. Wertung und Berechnung des TCID50
    1. Inspizieren Sie jeden Brunnen visuell auf CPE. Ein positiver Brunnen zeigt teilweise oder vollständige Monoschichtzerstörung und leichtere Verfärbungen. Ein Negativbrunnen behält eine intakte Monoschicht mit dunkelvioletter Färbung.
    2. Zählen Sie die Anzahl der positiven und negativen Brunnen für jede Verdünnung.
    3. Berechnen Sie manuell TCID50/mL mit der Reed-Muench-Methode, basierend auf einem Impfvolumen von 150 μL.

Ergebnisse

Labelfreie, Echtzeit-, dynamische Überwachung von virusvermittelter CPE mittels Impedanz
Um zu bestätigen, dass virusinduzierte CPE zuverlässig und quantitativ durch Impedanz gemessen werden kann, haben wir zunächst zelluläre Veränderungen in HEK293A Zellen nach einer Adv-GFP-Infektion mit einem RTCA eSight-System erfasst, das gleichzeitig die Impedanz misst und Live-Zellbilder derselben Zellpopulation aufnimmt, was aufschlussreiche Informationen über das Zellverhalten liefert. HEK293A Zellen wurden auf einer 96-Well-Biosensorplatte mit einer Sädichte von 6.000 Zellen pro Bohrloch für 24 Stunden ausgesät und anschließend mit Adv-GFP bei 104 IFU/mL infiziert. Impedanz und Live-Zell-Bildgebung wurden 250 Stunden nach der Impekulation aufgezeichnet (Abbildung 2A). Um die Variabilität durch Unterschiede in der Zellbesetzung zu minimieren und relative Veränderungen nach der Behandlung zu zeigen, wurde der Normalized Cell Index (NCI) verwendet, um die kollektiven Veränderungen im Zellwachstum, der Bindung und der Lebensfähigkeit im Laufe der Zeit darzustellen. NCI wird berechnet, indem das CI zu einem bestimmten Zeitpunkt durch das CI am Normalisierungszeitpunkt (der Zeit vor der Impfung) geteilt wird. Die NCI-kinetische Spur der nicht infizierten Kontrolle (Abbildung 2A, schwarze Spur) zeigt einen allmählichen Anstieg über die ersten 48 Stunden, was auf eine kontinuierliche Zellproliferation hinweist. Am Ende des Tests folgt ein Plateau, das darauf hinweist, dass die Zellen zusammengeführt und die gesamte Oberfläche der Gold-Biosensoren bedeckt hatten. Im Gegensatz dazu fiel die Kinetik des NCI aus den virusinfizierten Bohrungen 50 Stunden nach der Impfung unter die Kontrollebene und sank allmählich, bis sie bei 100 Stunden Null erreichte.

Live-Zell-Bildgebung aus derselben Zellpopulation bestätigte visuell, dass das Impedanzsignal zuverlässig den physikalischen Zustand der permissiven Zellen widerspiegelt, während sie sich durch das gesamte CPE-Kontinuum bewegen. Wie in Abbildung 2A gezeigt, besteht eine umgekehrte Korrelation zwischen dem NCI und der Expression viraler GFP in infizierten HEK293A Zellen, die innerhalb der ersten 100 Stunden vor vollständiger Lyse der permissiven Zellen beobachtet werden. Darüber hinaus zeigen die zu den angegebenen Zeitpunkten aufgenommenen Lebendzellbilder (Abbildung 2B) einen permissiven Zellstatus während einer Virusinfektion weiter. Das Zellwachstum hielt während der ersten 48 Stunden nach der Infektion an, während Viruspartikel in den Zellen auf niedrigen Niveaus blieben. Mit Fortschreitung der Virusreplikation und Infektion begann jedoch der Zelltod, was sich durch eine verringerte Konfluenz und ein erhöhtes GFP-Signal in den Wirtszellen zeigte. Etwa 100 Stunden nach der Impfung begann die virale GFP-Expression aufgrund des erheblichen Verlusts lebensfähiger permissiver Zellen zurückzugehen. Dieser integrierte Ansatz stärkt die Zuverlässigkeit der Erkennung virusinduzierter CPE durch Impedanz und legt damit eine solide Grundlage für den impedanzbasierten TCID50-Test.

Automatisierte Berechnung von TCID50 abgeleitet aus der Impedanzanzeige
Die genaue Identifizierung der positiven CPE-Bohrungen ist entscheidend für eine zuverlässige TCID50-Berechnung. Um zu bewerten, ob der impedanzbasierte TCID50-Test mit Unterstützung des Virologie-Moduls der Systemsoftware präzise und objektiv zwischen positivem und negativem CPE unterscheiden kann, wurden die HEK293A Zellen 24 Stunden vor der Impfung mit 6.000 Zellen/Brunnen ausgesät und mit einer Serie von zehnfachen Verdünnungen von Adv-GFP behandelt, wobei für jede Verdünnung acht Replikate (Brunnen) verwendet wurden. Das Adv-induzierte CPE wurde in Echtzeit im RTCA-System aufgezeichnet. In Abbildung 3A wurden impedanzkinetische Leiterbahnen, präsentiert als NCI, aufgezeichnet und automatisch während des gesamten Experiments dargestellt. Der Rückgang des NCI nach der Impfung zeigt eine klare dosisabhängige CPE, was sich an der starken Korrelation zwischen der zugesetzten Virusmenge und der Geschwindigkeit, mit der das Impedanzsignal abnimmt, zeigt. Die Zellen, die hohen Viruslasten zwischen 10-3 bis 10-7 Verdünnung ausgesetzt waren, zeigten starke und konstante Rückgänge des NCI, was eine robuste und einheitliche CPE über replizierte Brunnen hinweg widerspiegelt. Im Gegensatz dazu zeigte die kinetische Spur bei einer 10-8-Virusverdünnung von Beginn an große Variabilität, was zu deutlich größeren NCI-Standardabweichungen führte, insbesondere jenseits von 100 Stunden nach der Impfung. Wenn die Viruslast weiter unter die für eine Infektion erforderliche Schwelle gesenkt wurde – in diesem Fall eine Verdünnung von 10–10 –, wurde der NCI von den negativen Kontrollen nicht mehr zu unterscheiden. Diese Daten deuten darauf hin, dass bei einer Verdünnung von 10-8 das Virus 1) nicht in allen wiederholten Wells bei ähnlicher Kinetik CPE induzieren konnte; 2) diese Verdünnung wäre eine Trennlinie zwischen Konzentrationen, die CPE in allen Wiederholungen verursachen, und solchen, die CPE nur in einigen oder keiner der Replikate induzieren; Dieses binäre Ergebnis, infiziert (angezeigt durch CPE-induzierte KI-Veränderungen) oder nicht infiziert (keine KI-Veränderung), bildet die Grundlage für die Berechnung von TCID50 mit statistischen Methoden in der Systemsoftware. Daher ist die tiefgreifende Variation des NCI, die bei bestimmten Virenkonzentrationen beobachtet wird, ein entscheidender Indikator für das Auftreten einer teilweisen Infektion und könnte entscheidend für die Extrapolation sein, die zur Berechnung des TCID50 erforderlich ist.

Wie beim klassischen TCID50-Test muss der Schwellenwert für positive CPE definiert werden, bevor die integrierte Software die CPE-positiven Bohrungen automatisch identifizieren kann. Da verschiedene Viren und permissive Zellmodelle unterschiedliche Schwellenwerte erfordern können, ermöglicht die Software den Nutzern, diese Kriterien im Virologie-Modul zu konfigurieren und zu verfeinern. Basierend auf empirischen Daten wurde der Standardschwellenwert der Software für positive CPE angewandt, definiert als der NCI-Wert des virusbehandelten Guts, der mehr als drei Standardabweichungen unter dem durchschnittlichen NCI der negativen (nicht geimpften) Kontrollgruppen liegt, alsoNCI-virenbehandelte < (NCI-3 X SD)-negative Kontrolle. Die einzelnen Brunnen wurden dann entweder positiv (+) oder negativ (-) bewertet (Abbildung 3B). In diesem Fall wurde der TCID50/mL von Adv-GFP anschließend mit der Reed-Muench-Formel berechnet, einer der in der Software enthaltenen Formeln. Abgesehen von der Auswahl oder Definition von Kriterien für positive CPE waren für die Berechnung des TCID50 keine manuellen Maßnahmen erforderlich, da die Software den Prozess vollständig automatisierte.

Dynamisches Tracking von TCID50 während einer Virusinfektion
Um die angemessene Dauer des TCID50-Tests zu bestimmen, wurden Adv-GFP TCID50-Werte zu den gewünschten Zeitpunkten nach der Infektion extrahiert, beginnend bei 30 Stunden und in 30-Stunden-Schritten bis zu 240 Stunden. Ein 30-Stunden-Intervall wurde bewusst ausgewählt, da die Adenovirus-Replikation etwa 30 Stundenund 10 Stunden dauert. Die Adv-GFP TCID50-Werte wurden als Funktion der Zeit dargestellt (Abbildung 4). Eine bemerkenswerte Beobachtung ist die allmähliche Erhöhung der TCID50-Werte, die bis etwa 150 Stunden nach der Impfung anhält. Jenseits dieses Punktes entsteht ein Plateau, das auf ein Gleichgewicht hinweist, in dem die zytopathischen Effekte wahrscheinlich die Sättigung erreicht haben. Der zeitabhängige Anstieg, gefolgt von der Stabilisierung, deutet auf eine typische virale Replikationskurve hin. Die Anfangsphase ist durch aktive virale Ausbreitung gekennzeichnet, die in einem Höhepunkt gipfelt, der den maximalen zytopathischen Einfluss unter den gegebenen experimentellen Bedingungen widerspiegelt. Die Plateauphase des TCID50 könnte eine biologische Grenze widerspiegeln, bei der der Virusinfektionsprozess die Mehrheit der permissiven Zellen berührt hat, was zu erheblichem Zelltod führt und die weitere Virusreplikation stoppt. Der kinetische Zeitverlauf TCID50 legt nahe, dass der Test sechs bis sieben Tage nach der Impfung für das Adenovirus-HEK293A-Modell abgebrochen werden kann, da bereits ab 150 Stunden ein stabiler TCID50-Wert von 8,9 ×109 TCID50/mL beobachtet wurde.

Quantifizierung des Influenza-A-Virus-Titers mittels impedanzbasiertem TCID50-Test
Um zu untersuchen, ob der impedanzbasierte TCID50-Test auf andere Virus-Wirt-Modelle ausgeweitet werden kann, wurde ein TCID50-Test in mit IAV infizierten MDCK-Zellen durchgeführt. Obwohl kleinere Variationen des Infektionsmediums speziell für IAV berücksichtigt wurden, blieb das Kern-Assay-Verfahren mit dem für Adenovirus festgelegten Verfahren konsistent. Abbildung 5A zeigt den NCI der MDCK-Zellen über die Zeit nach der Impfung mit IAV-Verdünnungen von 1 x 10-2 bis 5 x 10-9. Ähnlich wie bei den Adv-infizierten HEK293 A-Zellen zeigten die uninfizierten/negativen Kontrollbrunnen eine stabile und konsistente NCI über Replikate hinweg. Die virusinfizierten Brunnen zeigten jedoch eine dosisabhängige NCI-Veränderung. Bei den niedrigen Dosen, 6,4 und 1,3 x 10-7 Verdünnungen, wurde eine große Standardabweichung beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass bei diesen Verdünnungen die Konzentration des Virus sich TCID50 näherte.

CPE-positive Bohrlöcher wurden mit denselben Kriterien und Schwellenwerten identifiziert, die im Adv-HEK293A-Modell angewandt wurden, nämlich eine dreifache Standardabweichung unter dem Mittelwert der negativen Kontrollbohrungen. Die impedanzbasierten TCID50-Werte für IAV wurden ebenfalls zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Impfung bestimmt. Abbildung 5B zeigt die durchschnittlichen TCID50-Werte aus zwei unabhängigen Experimenten. Mit Ausnahme des frühen Zeitpunkts bei 60 Stunden zeigten die TCID50-Werte von 90 bis 150 Stunden nach der Infektion gute Stabilität und Konsistenz, was darauf hindeutet, dass der impedanzbasierte TCID50-Test für IAV zuverlässig in vier statt fünf Tagen abgeschlossen werden kann. Diese Konsistenz unterstreicht die Robustheit der impedanzbasierten Methode und bestätigt ihre Anpassungsfähigkeit und Zuverlässigkeit bei verschiedenen viralen Krankheitserregern.

Validierung des impedanzbasierten TCID50-Tests mit der herkömmlichen TCID50-Methode
Um das impedanzabhängige TCID50 für die IAV-Konzentrationsmessung zu verifizieren, wurden TCID50-Tests parallel mit zwei alternativen Ansätzen durchgeführt: labelfreie Bildgebung und kristallviolette Färbung. Kurz gesagt wurden MDCK-Zellen vorbereitet und in 96-Well-Mikrotiterplatten eingesät. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit einer Reihe von IAV-Verdünnungen für 5 Tage impft. Für den bildgebenden TCID50-Test wurde die Live-Zell-Bildgebung alle 4 Stunden aufgenommen. Die Konzentrationen von zehn IAV-Proben wurden in der Validierungsstudie bewertet. Die Zellkonfluenz der virusbehandelten Wells wurde mit der negativen, nicht infizierten Wells mit der Software des Systems verglichen. Die bildgebende Analyse für MDCK-Zellen war jedoch besonders herausfordernd, wie in Abbildung 6A dargestellt. Eine genaue Unterscheidung zwischen Zellen und leeren Räumen war aufgrund der flachen Morphologie und schlecht definierten Kanten der MDCK-Zellen schwierig, was die zuverlässige Identifizierung von CPE-positiven Wells durch bildgebende Analyse erschwerte. Der Einsatz fortschrittlicherer und ausgefeilterer Bildanalysesoftware kann die Genauigkeit der TCID50-Berechnungen in solchen Fällen verbessern11. In diesem Fall war die labelfreie, bildgebende TCID50-Bewertung mit der aktuellen Systemsoftware erfolglos. Für den Kristallviolettfärbungs-TCID50-Test wurden die Zellen am Tag 5 nach der Impfung fixiert und gefärbt, wie im Protokollabschnitt beschrieben. Abbildung 6B zeigt eine starke lineare Korrelation zwischen den impedanzbasierten und kristallviolett-färbungsbasierten TCID50-Werten, mit einer Regressionsgleichung von y = 0,9582x und R² = 0,9979. Diese vergleichende Analyse unterstreicht die Zuverlässigkeit der impedanzbasierten Methode zur Messung des viralen Titers und deren Eignung für TCID50-Analysen.

figure-results-1
Abbildung 1: Impedanzbasierter TCID50-Assay-Workflow. Schritt 1: Erlaubte Zellaussaatung auf der Biosensorplatte. Säe die permissiven Zellen auf einer Platte mit optimaler Aussaatdichte. Das Zellwachstum wird dann im Rahmen des Zellqualitätskontrollverfahrens (QC) im System überwacht. Schritt 2: Virusvorbereitung und Impfung. Bereiten Sie seriell verdünnte Virenbestände mit einem benutzerdefinierten Verdünnungsfaktor vor. Entfernen Sie die Platte aus dem System und geben Sie die Viren in die Brunnen der Platte in einer laminaren Haube. Schritt 3: CPE-Messung und Bewertung von CPE-positiven Bohrlöchern mit der Virologie-Modulsoftware. Bringen Sie die Platte ins System zurück und setzen Sie die Echtzeitaufnahme der virusinduzierten CPE fort. Die Software identifiziert CPE-positive Bohrlöcher automatisch basierend auf dem benutzerdefinierten Schwellenwert für die CPE-Erkennung. Schritt 4: Berechnung des TCID50. Durch die Echtzeitbewertung von CPE-positiven Brunnen über Virusinokulation kann die Virologie-Modul-Software TCID50-Werte zu jedem Zeitpunkt während des gesamten Tests berechnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-2
Abbildung 2: Adenovirus-induzierte CPE wurde sowohl impedanzbasierte als auch bildgebende Methoden untersucht (A) Dynamische Profilierung der Impedanz (linke y-Achse) und grüne Fluoreszenz (rechte y-Achse) in HEK293A Zellen über die Zeit nach einer Infektion mit Adv-GFP. Der normalisierte Zellindex für adenovirus-infizierte Zellen (NCI Adv-infiziert, rote Linie), negative Kontrollzellen (NCI NC, schwarze Linie) und GFP total integrierte Intensität (GFP Adv-infiziert, grüne Linie) werden als Funktion der Zeit dargestellt. Die insgesamt integrierte GFP-Intensität spiegelt die GFP-Expression in permissiven Zellen wider und dient als Indikator für eine Virusinfektion. Die Zahlen (1–6) entlang des normalisierten Zellindex entsprechen bestimmten Zeitpunkten während des Infektionsprozesses. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (N = 8) dargestellt. (B) Fortlaufende Bilder HEK293A Zellen vor und nach der Infektion mit Adenovirus-GFP. (1) Das Ausgangsbild (0 st.) wird von Schnappschüssen bei 48 Stunden (2), 72 Stunden (3), 96 Stunden (4), 120 Stunden (5) und 200 Stunden (6) nach der Infektion gefolgt, die die Veränderung des Zellwachstums, der Lebensfähigkeit und der Adenovirus-GFP-Fluoreszenz im Laufe der Zeit veranschaulichen. Maßstabsbalken = 160 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

figure-results-3
Abbildung 3: Dosisabhängige CPE von Adenovirus-GFP in HEK293A Zellen, gemessen nach Impedanz. (A) HEK293A Zellen wurden in einer Biosensorplatte mit einer Dichte von 6.000 Zellen/Brunnen ausgesät, und 24 Stunden später wurden sie mit einer Serie von 10-fach verdünnten Adenovirus-GFP infiziert. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (N = 8) dargestellt. Inset: Normalisierter Zellindex der mit Adenovirus-GFP infizierten Wellen bei Verdünnung von 10-8 . Die Daten der Verdünnungen 10-9, 10-11 und 10-12 sind der Klarheit halber weggelassen. (B) Die einzelnen Wells/Replikate bei jeder Virusverdünnung wurden entweder als CPE-positiv (+) oder CPE-negativ (-) bewertet. Jede Spalte der Platte wurde mit einer anderen Virusverdünnung behandelt, wobei der Verdünnungsgradient vom niedrigsten in Spalte 1 bis zum höchsten in Spalte 10 reichte. Die Säulen 11 und 12 waren Kontrollbrunnen ohne Virusbehandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-4
Abbildung 4: Der Zeitverlauf der TCID50-Werte, abgeleitet aus Impedanzmessungen von CPE in HEK293-Zellen nach einer Infektion mit Adenovirus-GFP. TCID50/mL Adenovirus-GFP wurde zu bestimmten Zeitpunkten mit dem Virologiemodul aus fünf Experimenten berechnet. Obwohl das Virologie-Modul drei TCID50-Berechnungsformeln bietet, wurde die Reed-Muench-Formel für die TCID50-Berechnung ausgewählt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (N = 5) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-5
Abbildung 5: Influenza-A-Virus-Titer-Bewertung mit dem impedanzbasierten TCID50-Test. (A) Dosisabhängiges CPE von IAV in MDCK-Zellen, gemessen über Impedanz. MDCK-Zellen wurden bei 8.000 Zellen pro Bohrloch in eine Biosensorplatte eingepflanzt und 24 Stunden später mit einer fünffachen seriellen Verdünnung des Influenzavirus infiziert. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (N = 8) dargestellt. Daten aus der 2,6 × 10⁻⁸ Verdünnung werden der Verständlichkeit halber weggelassen. (B) Zeitverlauf der TCID50-Werte, abgeleitet aus Impedanzmessungen in IAV-infizierten MDCK-Zellen. Die Reed-Muench-Methode wurde für die Berechnung von TCID50 verwendet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD (N = 2) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-6
Abbildung 6: Korrelation zwischen impedanzbasierten und kristallviolett-färbungsbasierten TCID50-Assays. (A) Bild von MDCK-Zellen, die mit IAV impkuliert wurden. Skala = 160 μm. (B) Ein Vergleich von TCID50/mL-Werten, die mit impedanzbasierten und kristallvioletten Färbungsmethoden gewonnen wurden, wurde mit zehn IAV-Proben durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-7
Abbildung 7: Die repräsentativen Schnittstellen der Virologie-Modulsoftware des Systems. Die Software optimiert den impedanzbasierten TCID50-Testprozess. (1) Plattenlayout zur Aufzeichnung des Versuchsdesigns; (2) Zellindex oder normalisierter Zellindex wurde während der Virusimpfung automatisch von der Software dargestellt; (3) die Software bietet Flexibilität bei der Bestimmung positiver CPE-Kriterien und der Auswahl der TCID50-Berechnungsformel; (4) TCID50/mL kann zu jedem Zeitpunkt während des Tests bestimmt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

In dieser Studie wurde die Anwendbarkeit der Impedanz für die Bestimmung des viralen Titers anhand von Adenovirus-HEK293A- und Influenza-A-Virus-MDCK-Modellen nachgewiesen. Andere haben außerdem den robusten und zuverlässigen Nachweis von virusinduziertem CPE mit RTCA-Systemen über eine Vielzahl von Viren hinweg bestätigt, darunter Orthopoxvirus12, West-Nil-Virus (WNV) und St. Louis-Enzephalitis-Virus (SLEV)13, Chikungunya-Virus14, infektiöses Bursalvirus8, chimerisches GelbfieberDengue 15, Hepatitis-A-Virus16, SARS-CoV-217 und das Dengue-Virus9.

Die Echtzeit-CPE-Aufzeichnung durch Impedanz ermöglicht die Entdeckung virusspezifischer, zeitabhängiger Abfälle des CI-Werts in bestimmten virus-permissiven Zellmodellen. Fang et al. zeigten zuerst, dass ein kinetischer Parameter, der flavivirus-induzierte CPE charakterisiert, CIT50 – definiert als die Zeit bis zu einer 50%igen Abnahme der Zellimpedanz – umgekehrt proportional zur viralen Infektionsdosis innerhalb eines bestimmten Bereichs ist. Sie zeigten außerdem, dass CIT50 proportional zum Reziproken des neutralisierenden Antikörpertiters13 ist. Seitdem haben Charretier et al. von Sanofi Pasteur diese impedanzbasierte Echtzeit-Zellanalysemethode (RTCA) zur Bestimmung viraler infektiöser Titer während der Entwicklung des chimerischen Gelbfieber-Dengue-(CYD)-Impfstoffprodukts und Prozesses15 untersucht. Charretier et al.15 validierten diese impedanzbasierte Zellkultur-Infektionsdosis 50 % (CCID50) zusätzlich mit einem immunfärbenden CCID50-Test. Sie zeigten, dass die impedanzbasierte RTCA-Methode etwa fünfmal weniger arbeitsintensiv und 3,5-mal kosteneffizienter ist als der Standard-CCID50-Test in einem industriellen Umfeld. In unserer Studie wurde die Validierung des impedanzbasierten TCID50 gegen den traditionellen Crystal Violet TCID50-Test für IAV-induzierte CPE nachgewiesen. Zusätzlich wurde das Virologie-Softwaremodul in der RTCA-Software verwendet. Die CPE-positiven Bohrlöcher wurden automatisch basierend auf benutzerdefinierten Kriterien für CPE-positive Bohrlöcher in der Software identifiziert; In unserem Fall sinkt der CI-Wert im Vergleich zu den negativen Kontrollen. Der TCID50 wurde dann von der Software entsprechend berechnet, was eine genaue Titerbestimmung ermöglichte, ohne auf CIT50 angewiesen zu sein oder das Risiko einzugehen, dass die Testprobe außerhalb des optimalen Bereichs fiel. Die Festlegung einer angemessenen Schwelle für CPE-positive Brunnen ist entscheidend, da dies direkt die Sensibilität und Spezifität des Tests beeinflusst. Es wird empfohlen, dass Nutzer virusspezifische Kriterien bestimmen, indem sie Veränderungen des Zellindex mit den Ergebnissen ihrer validierten konventionellen Methode vergleichen. Diese empirisch abgeleiteten Schwellenwerte können dann innerhalb des Virologie-Moduls der Software konfiguriert und verfeinert werden.

Wie bei anderen zellbasierten Tests ist der Zustand der in impedanzbasierten TCID50-Tests verwendeten permissiven Zellen entscheidend für den Erfolg des Tests und die Qualität der Ergebnisse. Um eine hohe Zellproliferation und Lebensfähigkeit zu gewährleisten, werden frische, wenig durchgängliche Zellen empfohlen. Darüber hinaus kann das Erstellen einer Zellbank mit permissiven Zellen an derselben Stelle die Reproduzierbarkeit in verschiedenen Experimenten verbessern. Wie in Abbildung 3A dargestellt, erzeugten die permissiven Zellen bei optimalen Bedingungen stabile und konsistente Impedanzsignale in den nicht infizierten Kontrollen während des gesamten Tests. Es lieferte eine zuverlässige Basisreferenz, um einen Schwellenwert für CPE-positive Bohrungen festzulegen, was zu einer präzisen Bestimmung des viralen Titers führte. Darüber hinaus ist der impedanzbasierte TCID50-Test einzigartig in der Lage, die Qualitätskontrolle an permissiven Zellen vor der viralen Titerbewertung durchzuführen. Das charakteristische kinetische KI-Profil gesunder permissiver Zellen dient als zuverlässige Qualitätskontrollkennzahl, die sicherstellt, dass für die virale Quantifizierung nur lebensfähige und konsistente Zellpopulationen verwendet werden, wodurch die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit des Tests verbessert werden.

Für jeden neuen Virus sollte vor der Implementierung auch eine Impedanz-TCID50-Optimierung und Validierung durchgeführt werden. Schlüsselfaktoren wie Zellkulturbedingungen, einschließlich des Basalmediums und der FBS-Konzentration, sind entscheidend für reproduzierbare zelluläre Impedanzdaten und die Erhöhung der Empfindlichkeit der CPE-Erkennung, wie frühere Studien 6,16 hervorgehoben haben. In dieser Hinsicht hat sich die etikettfreie, auf Echtzeitimpedanz basierende Technologie als einfaches, effizientes und wertvolles Werkzeug zur Optimierung der Zellkulturbedingungen während der Assay-Entwicklungerwiesen 16.

Eine Einschränkung des Impedanz-TCID50-Tests tritt bei Viren auf, die kein CPE verursachen, da der Test auf CPE angewiesen ist, um Änderungen der Impedanzanzeige zu erzeugen, was die Grundlage für die Berechnung von TCID50 bildet. In solchen Fällen kann es notwendig sein, ein alternatives permissives Zellmodell zu identifizieren, das virusinduzierte CPE aufweisen kann, oder einen Immunfärbungsansatz zu verfolgen, sofern ein geeigneter Antikörper gegen das spezifische Virusantigen vorliegt. Dennoch demonstrierte diese Studie die Fähigkeit des RTCA-MP-Systems, dosisabhängige CPE zu erfassen und effektiv zwischen infizierten und nicht infizierten Zellpopulationen mittels einer objektiven und sensiblen Impedanzanzeige zu unterscheiden.

Die Einführung der TCID50-zeitabhängigen Analyse stellt einen bedeutenden Fortschritt gegenüber traditionellen Endpunktmessungen dar. Es vereinfacht den TCID50-Assay-Optimierungsprozess, da der optimale Zeitpunkt zur Berechnung und Meldung des viralen Titers leicht durch einen einzigen Echtzeit-Test erhalten werden kann. Während bildgebende bildgebende labelfreie TCID50-Assays ebenfalls zeitaufgelöste TCID50-Werte liefern können, ist ihre Anwendbarkeit auf Viruszellmodelle beschränkt, die CPE zeigen, das von den Bildgebungssoftware-Algorithmen erkannt werden kann, wie im IAV-MDCK-Modell (Abbildung 6A) demonstriert. Darüber hinaus eliminiert die Verwendung von labelfreier Impedanz zur CPE-Detektion die Komplikationen verschiedener Reagenzien und mehrstufiger Arbeitsabläufe, die das Risiko menschlicher Fehler erhöhen können. Neben der Vereinfachung des Arbeitsablaufs optimiert das Virologie-Modul der Systemsoftware auch den Assay. Zunächst beginnt er mit einer einfachen Einrichtung eines Experimentenplans für die automatische systemgesteuerte Aufnahme. Es folgt nach jeder Messung eine Echtzeit-spontane CPE-positive Bewertung und endet mit einer automatisierten TCID50-Berechnung für eine einfache Quantifizierung infektiöser Viruspartikel (Abbildung 7). Diese Automatisierung verringert die Hands-on-Zeit erheblich, eine entscheidende Verbesserung, insbesondere beim Umgang mit hochinfektiösen Viren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,05 % Trypsin 0,53 mM EDTA  (1x)Corning25-052-CI
12 Kanalreagenzien-ReservoirsVistaLab-Technologien3054-1011
Adenovirus-GFPVector Biolabs 1060
DMEM-MediumATCC30-2002
E-Plate VIEW 96Agilent300601020
Fetales RinderserumAvantor97068-085
Hek293A-ZelleThermo Fisher Scientific   R70507
Penicillin-Streptomycin-LösungHyCloneSV30010
Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (1x)HyCloneSH30256.01
Seaplaque agaroseLonza50101
xCELLigence RTCA eSight-SystemAgilentS2833AA
xCELLigence RTCA MP-SystemAgilent380601040

Referenzen

  1. Smither, S. J., et al. Comparison of the plaque assay and 50% tissue culture infectious dose assay as methods for measuring filovirus infectivity. J Virol Methods. 193 (2), 565-571 (2013).
  2. Pourianfar, H. R., Javadi, A., Grollo, L. A colorimetric-based accurate method for the determination of enterovirus 71 titer. Indian J Virol. 23 (3), 303-310 (2012).
  3. Hochdorfer, D., Businger, R., Hotter, D., Seifried, C., Solzin, J. Automated, label-free TCID50 assay to determine the infectious titer of virus-based therapeutics. J Virol Methods. 299, 114318(2022).
  4. Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the Calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virol Sin. 36 (1), 141-144 (2021).
  5. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (17), 7896-7900 (1991).
  6. Atienza, J. M., et al. Dynamic and label-free cell-based assays using the real-time cell electronic sensing system. Assay Drug Dev Technol. 4 (5), 597-607 (2006).
  7. Cheung, C. Y., Leung, C. K., Peiris, J. S. Potential of the real-time and label-free cell sensor impedance technology to transform cell-based infectivity assays for influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 5 (Suppl 1), 151-154 (2011).
  8. Ebersohn, K., Coetzee, P., Venter, E. H. An improved method for determining virucidal efficacy of a chemical disinfectant using an electrical impedance assay. J Virol Methods. 199, 25-28 (2014).
  9. Goh, V. S. L., et al. Evaluation of three alternative methods to the plaque reduction neutralizing assay for measuring neutralizing antibodies to dengue virus serotype 2. Virology J. 21 (1), (2024).
  10. Crisostomo, L., Soriano, A. M., Mendez, M., Graves, D., Pelka, P. Temporal dynamics of adenovirus 5 gene expression in normal human cells. PLOS One. 14 (1), e0211192(2019).
  11. Wang, T. E., et al. Differentiation of cytopathic effects (CPE) induced by influenza virus infection using deep convolutional neural networks (CNN). PLoS Comput Biol. 16 (5), e1007883(2020).
  12. Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochem Biophys Res Commun. 401 (1), 37-41 (2010).
  13. Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. J Virol Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
  14. Marlina, S., Shu, M. -H., Abubakar, S., Zandi, K. Development of a real-time cell analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8 (1), (2015).
  15. Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. J Virol Methods. 252, 57-64 (2018).
  16. Lebourgeois, S., et al. Development of a real-time cell analysis (RTCA) method as a fast and accurate method for detecting infectious particles of the adapted strain of Hepatitis A virus. Front Cell Infect Microbiol. 8, (2018).
  17. Suryadevara, N., et al. Real-time cell analysis: A high-throughput approach for testing SARS-CoV-2 antibody neutralization and escape. STAR Protoc. 3 (2), 101387(2022).

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

ImpedanzmessungEchtzeit Monitoringzytopathischer Effektmarkierungsfreier Assayserielle Virusverd nnungautomatisierte VirusquantifizierungHEK293A ZellenMDCK Zellen
Ein stromlinienförmiger, etikettenfreier, Echtzeit-50%-Gewebekultur-Infektionsdosen-Assay (TCID50) unter Verwendung von Impedanz zur automatisierten Quantifizierung viraler Titer-Quantifizierung
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.