Methodenartikel

Verhaltensassays zur optogenetischen Manipulation neuronaler Schaltkreise in Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/67964

⸱

7. Februar 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Neuroscience, Virginia Tech, 2Academy of Integrated Science, Virginia Tech, 3Fairfax County Public Schools, Westfield High School

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Arbeit werden Methoden zur optogenetischen Manipulation in Drosophila melanogaster vorgestellt, bei denen CsChrimson und GtACR2 verwendet werden, um spezifische Neuronen zu aktivieren und zum Schweigen zu bringen. Es werden vier Experimente beschrieben, die die Optogenetik nutzen, um thermotaktische und gustatorische Verhaltensweisen zu erforschen und Einblicke in die zugrunde liegenden neuronalen Mechanismen zu geben, die diese Prozesse steuern.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Optogenetik hat sich zu einer grundlegenden Technik in den Neurowissenschaften entwickelt, die eine präzise Steuerung der neuronalen Aktivität durch Lichtstimulation ermöglicht. In dieser Studie werden einfach zu implementierende Setups für die Anwendung optogenetischer Methoden bei Drosophila melanogaster vorgestellt. Zwei optogenetische Werkzeuge, CsChrimson, ein durch rotes Licht aktivierter Kationenkanal, und GtACR2, ein durch blaues Licht aktivierter Anionenkanal, wurden in vier experimentellen Ansätzen eingesetzt. Drei dieser Ansätze beinhalten Einzelfliegenexperimente: (1) ein optogenetischer thermotaktischer Blaulicht-Positionspräferenz-Assay, der auf temperaturempfindliche Heizzellen abzielt, (2) ein optogenetischer Rotlicht-Positionspräferenz-Assay, der bitterempfindliche Neuronen aktiviert, und (3) ein Rüssel-Extensions-Response-Assay, der die süßen Neuronen aktiviert. Der vierte Ansatz (4) ist ein Fliegenlabyrinth-Setup, um Vermeidungsverhalten mit mehreren Fliegen zu bewerten. Die Fähigkeit, neuronale Aktivität zeitlich und räumlich zu manipulieren, bietet aussagekräftige Einblicke in die sensorische Verarbeitung und Entscheidungsfindung und unterstreicht das Potenzial der Optogenetik, unser Wissen über neuronale Funktionen zu erweitern. Diese Methoden bieten einen zugänglichen und robusten Rahmen für zukünftige Forschung in den Neurowissenschaften, um das Verständnis spezifischer neuronaler Bahnen und ihrer Verhaltensergebnisse zu verbessern.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Optogenetik hat sich in den Neurowissenschaften zu einer leistungsfähigen Technik entwickelt, die Optik und Genetik kombiniert und eine präzise, nicht-invasive Kontrolle der neuronalen Aktivität durch Lichtstimulation ermöglicht1. In Drosophila melanogaster, einem weit verbreiteten Modellorganismus, ermöglichen optogenetische Werkzeuge die Aktivierung und Hemmung bestimmter Neuronen, wodurch Forscher neuronale Schaltkreise modulieren können. Unter den verwendeten Werkzeugen bieten CsChrimson und GtACR (Guillardia Theta Anion Channel Rhodopsine) komplementäre Ansätze für neuronales Targeting. CsChrimson-Kanalrhodopsin, ein rotlichtempfindlicher Kationenkanal aus Grünalgen, erleichtert die neuronale Aktivierung durch Depolarisation, wenn er rotem Licht ausgesetzt wird, mit einer maximalen Aktivierung bei etwa 590 nm2. CsChrimson bietet eine bessere Gewebepenetration als frühere Channelrhodopsine und reduziert lichtinduzierte Verhaltensartefakte in Drosophila-Studien 2. Im Gegensatz dazu ist GtACR, zu dem Varianten wie GtACR2 gehören, ein lichtgesteuerter Chloridkanal, der Neuronen durch Hyperpolarisation zum Schweigen bringt 3,4. GtACR2 leitet Anionen und wird durch blaues Licht aktiviert, wobei die Spitzenaktivierung bei etwa 470 nmliegt 4. CsChrimson und GtACR2 werden durch unterschiedliche Wellenlängen des Lichts aktiviert, was eine präzise und unabhängige Steuerung der neuronalen Aktivität ohne Kreuzaktivierung gewährleistet5.

Drosophila ist aufgrund ihrer Kosteneffizienz, ihrer einfachen Aufzucht und ihrer robusten Verhaltensreaktionen auf Umweltreize, einschließlich Attraktivitäts- und Vermeidungsverhalten, ein effektives Modell für die neurowissenschaftliche Forschung6. Seine geringe Größe und die halbtransparente Kutikula verbessern das Eindringen von Licht, insbesondere von langwelligem rotem Licht, und ermöglichen eine effiziente optogenetische Manipulation 7,8. Während Drosophila-Zellen nicht genügend Retinal produzieren können, ein entscheidender Cofaktor für die Funktionalität von Channelrhodopsinen, gleicht die Zugabe von Retinal zu ihrer Ernährung diese Einschränkung aus und sorgt für eine effektive Aktivierung optogenetischer Werkzeuge9.

Um die Auswirkungen optogenetischer Manipulation bei Drosophila zu untersuchen, beschreiben wir vier Experimente, die auf verschiedene neuronale Schaltkreise und Verhaltensweisen abzielen und jeweils unterschiedliche Modalitäten verwenden, um entweder Vermeidung oder attraktive Reaktionen zu bewerten, die von Single-Fly-Assays bis hin zu gruppenbasierten Bewertungen reichen. Heizzellen (HC) in Drosophila sind thermosensorische Neuronen, die sich in der Arista befinden und auf Temperaturanstiege reagieren10. Diese Neuronen exprimieren wärmeempfindliche Ionenkanäle, die Vermeidungsverhalten auslösen und Fliegen von Wärmequellen wegleiten10,11. In Ansatz 1 verwendeten wir einen optogenetischen thermotaktischen Positionspräferenz-Assay mit einer einzigen Fliege, um HC-Neuronen zu manipulieren. Durch die Expression von GtACR2 in diesen Neuronen hemmten wir deren Aktivität bei Blaulicht-Exposition. Die Fliegen wurden zwei Temperaturoptionen ausgesetzt: 25 °C und 31 °C. Bei Raumlicht mieden die Fliegen die 31 °C heiße Seite und zeigten damit eine typische thermotaktische Reaktion. Die Aktivierung von GtACR2 durch blaues Licht brachte jedoch die HC-Neuronen zum Schweigen. Infolgedessen zeigten die Fliegen keine signifikante Temperaturpräferenz, was auf eine erfolgreiche optogenetische Hemmung hindeutet. Neben der Beurteilung der Funktion sensorischer Neuronen ermöglicht die Expression von GtACR2 in nachgeschalteten sensorischen Neuronen ähnliche optogenetische Manipulationen, um die neuronalen Schaltkreise zu untersuchen, die für bestimmte sensorische Modalitäten notwendig sind5.

Der gustatorische Rezeptor GR66a wird in Drosophila in den labialen Palpen am distalen Ende des Rüssels und in den Beinen exprimiert, was die Detektion von bitterem Geschmack vermittelt12,13. Diese Neuronen lösen als Reaktion auf Bitterstoffe Vermeidungsverhalten aus. In Ansatz 2 verwendeten wir einen optogenetischen Rotlicht-Positionspräferenz-Assay mit einer einzigen Fliege, um GR66a-exprimierende Neuronen zu manipulieren. Durch die Expression von CsChrimson in diesen Neuronen aktivierten wir sie bei Rotlichteinstrahlung. Die Fliegen wurden in einer Arena platziert, wobei die eine Hälfte rotem Licht ausgesetzt war und die andere Hälfte rotes Licht filterte. In Ermangelung von rotem Licht zeigten Fliegen keine Präferenz. Die Aktivierung von CsChrimson durch rotes Licht stimulierte jedoch die bitterempfindlichen Neuronen, was zu einer signifikanten Vermeidung des beleuchteten Bereichs führte, was die erfolgreiche optogenetische Aktivierung der GR66a-Neuronen bestätigt. Ähnliche Ansätze wurden verwendet, um die nachgeschalteten Kreisläufe von Heizzellen zu identifizieren, die für das Vermeidungsverhalten5 ausreichend sind.

In Ansatz 3 konzentrierten wir uns auf die optogenetische Aktivierung des appetitiven Verhaltens. GR5a-exprimierende Neuronen, die sich in den Geschmackssensillen an der Labellum und den Beinen befinden, erkennen Zucker und steuern das Fressverhalten. Die Aktivierung dieser Neuronen löst die Rüsselverlängerungsantwort (PER)14 aus. Wir verwendeten einen optogenetischen Rotlicht-Rüsselverlängerungs-Response-Assay, um GR5a-Neuronen zu aktivieren. Indem wir CsChrimson in diesen Neuronen exprimierten, stimulierten wir sie mit rotem Licht. Fliegen streckten ihren Rüssel unter Raumlichtbedingungen nicht aus. Die Aktivierung von CsChrimson durch rotes Licht führte jedoch zu einer Ausdehnung des Rüssels ohne süßen Stimulus, was eine erfolgreiche optogenetische Aktivierung von GR5a-Neuronen zeigt. Dieser Ansatz wurde verwendet, um den neuronalen Schaltkreis zu untersuchen, einschließlich gustatorischer sensorischer Neuronen, Geschmacksprojektionsneuronen und Rüssel-Motoneuronen15,16.

In Ansatz 4 untersuchten wir die optogenetische Aktivierung von Vermeidungsverhalten in Gruppen von Fliegen, indem wir einen optogenetischen Rotlicht-Fliegenlabyrinth-Assay verwendeten, der auf GR66a-Neuronen abzielte. Die Fliegen wurden an der Kreuzung zweier Röhren platziert: eine mit rotem Licht beleuchtet und die andere mit Schatten. Die CsChrimson-Expression in GR66a-Neuronen löste Vermeidung aus. In Abwesenheit von rotem Licht zeigten die Fliegen keine Präferenz, aber die Aktivierung von Rotlicht führte dazu, dass GR66a-exprimierende Fliegen rotes Licht mieden, was auf eine erfolgreiche Aktivierung des Signalwegs hindeutet. Fliegenlabyrinth-Assays werden häufig verwendet, um verschiedene sensorische Modalitäten zu untersuchen, einschließlich Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Geruchssinn. In Kombination mit der Optogenetik ist dieser Ansatz leistungsfähig, um sowohl attraktives als auch Vermeidungsverhalten zu untersuchen 17,18,19.

Diese Methoden bieten einen reproduzierbaren Rahmen für die Untersuchung der optogenetischen Aktivierung und Hemmung neuronaler Schaltkreise von Drosophila . Durch die Verwendung einer Kombination aus verschiedenen Kanalrhodopsinen und zugänglichen Verhaltensassays demonstriert diese Proof-of-Concept-Studie die Wirksamkeit optogenetischer Manipulation und bietet einfache Methoden zur Manipulation neuronaler Schaltkreisfunktionen mit potenziell breiteren Anwendungen in der neurowissenschaftlichen Forschung.

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Protokoll

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1. Stämme, Fliegenaufzucht und Fliegensauger

  1. Beanspruchung und Wartung
    1. Zu den in den Experimenten verwendeten Stämmen gehören HC-Gal410, Gr5a-Gal420 (Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592), Gr66a-Gal421 (BDSC: 57670), UAS-GtACR23, UAS-CsChrimson2 (BDSC: 55136). Das Heck fliegt bei 25 °C auf einem Standard-Maismehlmedium bei einem Dunkelzyklus von 12 h Licht: 12 Stunden.
      HINWEIS: 1 l Maismehlmedium enthält 1 l dH2O, 79 g Dextrose, 7,5 g Agar, 24 g Flockenhefe, 57 g Maismehl, 2,1 g Methyl-4-hydroxybenzoat (gelöst in 11,1 ml Ethanol), 6 g Natriumkaliumtartrattetrahydrat und 0,9 g Calciumchlorid.
  2. Fliegenaufzucht und Versuchsvorbereitung
    1. Sortieren Sie 0 bis 3 Tage alte Fliegen. Zum Zeitpunkt des Experiments sind die Fliegen 3 bis 6 Tage alt, um eine altersbedingte Konsistenz zu gewährleisten (Abbildung 1A).
    2. Teilen Sie jeden Genotyp 3 Tage vor der Durchführung der Experimente in vier Gruppen ein: Raumlicht-ATR -, Raumlicht-ATR+, Rot- oder Blaulicht-ATR - und Rot- oder Blaulicht-ATR+.
    3. Bereiten Sie 80 mM ATR-Stammlösung vor, indem Sie ATR in 100 % Ethanol auflösen. Ergänzen Sie das Futter mit 400 μM ATR zu den ATR+ Gruppen.
    4. Ergänzen Sie das Futter mit der gleichen Konzentration an Ethanol, jedoch ohne ATR, zu den ATR-Gruppen.
    5. Heck alle Gruppen im Dunkeln22.
    6. Starve Gr5a>CsChrimson fliegt 16-24 Stunden lang in Fläschchen, die nur feuchtes Gewebe enthalten. Die ATR+ Fläschchen enthalten 400 μM ATR gemischt mit Wasser, während die ATR+ Fläschchen dH2O gemischt mit der gleichen Konzentration an Ethanol enthalten.
  3. Fliegen-Aspirator
    1. Montieren Sie den Fliegensauger (Abbildung 1B) mit Kunststoffschläuchen, Insektennetzen und zwei 3-ml-Transferpipetten.
    2. Schneiden Sie die Spitzen und Kügelchen der Transferpipetten ab und stellen Sie sicher, dass die Fliegensaugspitze einen bequemen Durchgang einer Fliege ermöglicht. Dieses Design ermöglicht eine sanfte Aspiration der Fliegen durch Inhalation, minimiert den Schaden und erleichtert das effiziente Einfangen und Übertragen einzelner Fliegen.
    3. Drapieren Sie ein Insektennetz über den Kunststoffschlauch und befestigen Sie die Kolbenenden der Pipette mit Parafilm am Schlauch.

2. Optogenetischer thermotaktischer Positionspräferenz-Assay mit einer einzigen Fliege mit blauem Licht

  1. Drosophila-Stämme und Fliegenaufzucht
    1. Kreuzen Sie die HC-Gal410-Treiberlinie mit UAS-GtACR23, was zum experimentellen Genotyp HC>GtACR2 führt. HC>GtACR2-Fliegen exprimieren GtACR2 in Heizzellen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass für jede Bedingung die gleiche Anzahl männlicher und weiblicher Fliegen verwendet wird.
  2. Experimenteller Aufbau und Durchführung von Assays
    1. Richten Sie zwei Stahlplatten auf separaten Kochplatten so aus, dass sich ihre Kanten treffen. Legen Sie eine Plastikfolie darauf und sichern Sie sie mit Klebeband, um Bewegungen zu minimieren. Positionieren Sie ein weißes Blatt Papier auf der Schutzfolie, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren (Abbildung 1C).
      HINWEIS: Ersetzen Sie das weiße Papier zu Beginn jedes Experiments oder bei Verschmutzung.
    2. Legen Sie eine durchsichtige Kunststoffabdeckung (2 mm Höhe × 58 mm Breite × 83 mm Länge) auf das weiße Papier. Diese Abdeckung lässt die Fliege frei laufen und verhindert gleichzeitig, dass sie fliegt.
    3. Schneiden Sie ein Loch in den Boden einer Styropor-Schaumstoffbox (27 cm Höhe × 22 cm Breite × 16 cm Länge), um die Kamera und das blaue Licht (1.000 mA) ca. 12 cm über der Versuchsfläche zu verkleben.
    4. Positionieren Sie die Kamera und das blaue Licht, um die Blendung zu minimieren und gleichzeitig die Aktivierung zu ermöglichen.
      HINWEIS: Möglicherweise ist ein Vortest erforderlich, um den Aktivierungsbereich des blauen Lichts zu bestimmen.
    5. Stellen Sie die Kamera so ein, dass sie mit den folgenden Einstellungen aufzeichnet: 1 s Zeitraffer, schmales Feld, 4000 × 3000 Pixel.
    6. Passen Sie die Kochplatteneinstellungen so an, dass auf den jeweiligen Stahlplatten eine Oberflächentemperatur von 25 ± 1 °C und 31 ± 1 °C erreicht wird.
      HINWEIS: Für Bedingungen, die Temperaturen unter 25 °C erfordern, sind alternative Kühlmethoden wie Peltier-Geräte oder Eis erforderlich. Wenn die Temperaturen der Stahlplatten die gewünschten Werte überschreiten, besprühen Sie die Oberfläche mit destilliertem Wasser, um die erforderlichen Bedingungen zu erreichen und aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie dann eine Serviette, um überschüssige Feuchtigkeit von der Plastikfolie aufzunehmen.
    7. Überwachen Sie vor und nach jedem Versuch die Temperaturen mit einem Oberflächentemperaturfühler.
      HINWEIS: Eine präzise Temperaturregelung ist entscheidend, da Schwankungen die Ergebnisse beeinflussen können.
    8. Setzen Sie die Kunststoffabdeckung auf die 25 °C-Seite. Lassen Sie mit einem Fliegensauger vorsichtig eine einzelne Fliege unter der Abdeckung los. Positionieren Sie die Box über dem Versuchsbereich, um schwaches Licht (<10 Lux) zu erzeugen und die Fliege 1 Minute lang akklimatisieren zu lassen.
    9. Heben Sie nach der Eingewöhnungsphase die Box an und stellen Sie die Kunststoffabdeckung schnell ein, indem Sie sie so positionieren, dass die Mitte der Abdeckung mit der Stahlplattengrenze ausgerichtet ist, um eine gleichmäßige Abdeckung der Seiten von 25 °C und 31 °C zu gewährleisten.
      HINWEIS: Während dieses Vorgangs steigen die Lufttemperatur und die Temperatur im Inneren der Abdeckung auf der 31 °C-Seite innerhalb von 5 s auf etwa 27 °C an (Ergänzende Abbildung 1), was ausreicht, um die Heizzellen11 zu aktivieren.
    10. Starten Sie den Test, indem Sie die Kamera und das blaue Licht (20 kLux) einschalten.
      HINWEIS: Schalten Sie das blaue Licht nicht bei Raumlicht ein. Schalten Sie die Kamera ein und nehmen Sie einige Bilder auf, bevor Sie das blaue Licht einschalten, falls es zu einer Bewegung kommt.
    11. Beenden Sie den Test nach mehr als 2 Minuten, indem Sie die Kamera und das Licht ausschalten. Entsorgen Sie die Fliegen mit dem Sauger.
      HINWEIS: Nehmen Sie einige zusätzliche Bilder auf, falls sich die Kamera ausschaltet.
  3. Verhaltens- und statistische Analyse
    1. Analysieren Sie nur Daten von Fliegen, die sich zu Beginn des Versuchs auf der 25 °C-Seite befinden.
      HINWEIS: Daten von Fliegen, die Versuche auf der 31 °C-Seite beginnen, sind zu verwerfen, die oft veränderte Präferenzen aufweisen23. Versuche mit Fliegen, die sich nicht dem Rand der 31 °C-Seite nähern, sind zu verwerfen, um sicherzustellen, dass sie eine Wahl zwischen den Temperaturen getroffen haben. Verwerfen Sie Daten von Fliegen, die länger als 30 s stationär bleiben.
    2. Analysieren Sie die Ergebnisse mit den zuvor beschriebenen Verfahren23. Berechnen Sie den Präferenzindex (PI) als das Verhältnis der Zeitdifferenz, die die Fliege in jeder Temperaturzone verbracht hat, zur Gesamtzeit, wie in der folgenden Formel dargestellt:
      figure-protocol-1
      HINWEIS: Statistische Details zu den Experimenten finden Sie in den Abbildungslegenden. Die Datenanalyse wird mit einer geeigneten Datenanalysesoftware durchgeführt.

3. Optogenetischer Rotlicht-Positionspräferenz-Assay mit einer einzigen Fliege

  1. Drosophila-Stämme und Fliegenaufzucht
    1. Überqueren Sie die Gr66a-Gal421-Treiberlinie zu UAS-CsChrimson2, was zum experimentellen Genotyp Gr66a>CsChrimson führt. Gr66a>CsChrimson Fliegen exprimieren CsChrimson in bitteren Geschmacksneuronen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass für jede Bedingung die gleiche Anzahl männlicher und weiblicher Fliegen verwendet wird.
  2. Experimenteller Aufbau und Durchführung von Assays
    1. Führen Sie den Assay in einem dunklen Raum oder einer abgedunkelten Umgebung durch, um eine kontrollierte Aktivierung von CsChrimson zu gewährleisten (Abbildung 1D).
    2. Positionieren Sie einen Camcorder ca. 45 cm über der Versuchsfläche.
      1. Verwenden Sie einen Camcorder ohne Infrarotfilter. Wenn ein Camcorder über einen internen Kurzpass-Infrarotfilter verfügt, der Wellenlängen von mehr als 700 nm blockiert, entfernen Sie ihn.
      2. Kleben Sie einen 830-nm-Langpassfilter mit Sekundenkleber über das Objektiv, um die Infrarotwellenlängen einzufangen. Diese Einstellung ist für die Aufzeichnung von Fliegenbewegungen unter Infrarotlichtbedingungen unerlässlich.
    3. Positionieren Sie eine rote Lichtquelle24 ca. 45 cm über der Versuchsfläche, um eine Lichtintensität von ca. 2,5 kLux (1.000 mA) zu gewährleisten.
      HINWEIS: Es wird ein geeigneter Augenschutz empfohlen, der rote Laser/Lichter herausfiltern kann. Eine Laserschutzbrille hilft, mögliche Augenschäden durch direkte Einwirkung von intensivem rotem Licht zu vermeiden.
    4. Verwenden Sie ein Infrarotlicht, um die Fliegen innerhalb des Setups zu visualisieren. Lassen Sie es während des gesamten Experiments eingeschaltet.
      HINWEIS: Vermeiden Sie Blendung im Versuchsbereich, die durch das Infrarotlicht verursacht wird. Blendung kann die Datenanalyse erschweren.
    5. Verwenden Sie Kleber, um einen 780-nm-Infrarot-Langpassfilter an der Hälfte der Kunststoffabdeckung zu befestigen.
      HINWEIS: Verwenden Sie einen beliebigen Langpassfilter, der Wellenlängen unter 780 nm blockiert. Die ungefilterte Seite lässt rotes Licht und Infrarot durch, während die gefilterte Seite nur Infrarotlicht durchlässt.
    6. Platzieren Sie ein schwarzes, mattes Material unter dem Versuchsbereich, um Hintergrundgeräusche zu minimieren.
    7. Legen Sie eine einzelne Fliege mit einem Fliegensauger unter eine durchsichtige Kunststoffabdeckung (2 mm Höhe × 58 mm Breite × 83 mm Länge) und lassen Sie sie 1 Minute lang akklimatisieren.
    8. Warten Sie, bis die Fliege auf der ungefilterten Seite sichtbar ist. Starten Sie die Testversion, indem Sie den Camcorder und das rote Licht einschalten.
      HINWEIS: Der Camcorder reagiert sofort nach dem Start auf Bewegungen. Sichern Sie die Kamera während der Aufnahme gründlich und schalten Sie die Kamera einige Sekunden vor der Aufnahme ein, um Fehlbewegungen zu vermeiden, die die Analyse erschweren könnten. Schalten Sie das rote Licht erst zu Beginn der Testversion ein.
    9. Zeichnen Sie die Bewegung der Fliege 1 Minute lang auf.
      HINWEIS: Versuche, bei denen sich die Fliege nicht der Mittellinie nähert oder sich nicht länger als 15 s bewegt, sind zu verwerfen.
    10. Beenden Sie die Testversion nach 1 Minute, indem Sie den Camcorder und das Licht ausschalten. Entsorgen Sie die Fliegen mit dem Sauger.
      HINWEIS: Nehmen Sie einige zusätzliche Bilder auf, um die Auswirkungen von Bewegungen beim Ausschalten der Kamera zu vermeiden.
  3. Verhaltens- und statistische Analyse
    1. Analysieren Sie die Ergebnisse mit den zuvor beschriebenen Verfahren23. Berechnen Sie den Präferenzindex (PI) als Verhältnis der Differenz zwischen der Zeit, die die Fliege in dem Bereich ohne Filter verbracht hat, und dem Bereich mit dem Filter zur Gesamtzeit, wie in der folgenden Formel dargestellt:
      figure-protocol-2
      HINWEIS: Statistische Details zu den Experimenten finden Sie in den Abbildungslegenden. Die Datenanalyse wird mit einer geeigneten Datenanalysesoftware durchgeführt.

4. Reaktion der optogenetischen Rüsselverlängerung durch rotes Licht

  1. Drosophila-Stämme und Fliegenaufzucht
    1. Überqueren Sie die Gr5a-Gal420-Treiberlinie mit UAS-CsChrimson2, was zu dem experimentellen Genotyp führt, der als Gr5a>CsChrimson bezeichnet wird. Gr5a>CsChrimson-Fliegen exprimieren CsChrimson in Rezeptorneuronen für süße Geschmacksrichtungen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass für jede Bedingung die gleiche Anzahl männlicher und weiblicher Fliegen verwendet wird.
    2. Starve fliegt 16-24 h mit ATR (ATR+) oder ohne (ATR -) vor dem Testen.
      HINWEIS: Längere Hungerperioden können erforderlich sein, um eine starke Reaktion hervorzurufen.
  2. Experimenteller Aufbau und Durchführung von Assays
    1. Betäuben Sie Fliegen, indem Sie sie auf Eis abkühlen (Abbildung 1E).
      HINWEIS: Vermeiden Sie den direkten Kontakt zwischen Fliegen und Eis. Begrenzen Sie die Abkühlzeit auf ca. 1 min; Längeres Abkühlen kann zu Erholungsproblemen und Sterblichkeit führen.
    2. Tragen Sie mit der Spitze einer 1000-μl-Pipettenspitze 7-10 kleine Punkte Kleber auf die Objektträger auf.
      HINWEIS: Kleine Leimtropfen auf der Rutsche sorgen dafür, dass der Hosenschlitz nicht untergetaucht wird, und verhindern, dass der Kleber an seinem Rüssel oder seinen Beinen kleben bleibt.
    3. Positionieren Sie eine Fliege mit der Bauchseite nach oben auf jedem Klebepunkt. Stellen Sie sicher, dass der Brustkorb und die Flügel den Kleber berühren, um Bewegungen zu minimieren. Fächern Sie die Flügel zu jeder Seite auf, um die Klebefläche zu vergrößern.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, Fliegen zu nah beieinander zu platzieren, da dies bei Lichteinwirkung versehentlich mehrere Fliegen aktivieren kann.
    4. Lass den Kleber ca. 10 min trocknen.
    5. Übertragen Sie die Objektträger in eine Feuchtigkeitsbox (eine Plastikbox mit nassen Papiertüchern) und lassen Sie die Fliegen 2 Stunden lang ruhen.
    6. Legen Sie den Objektträger unter das Mikroskop. Verwenden Sie eine Spritze, um einen Tropfen Wasser zu verabreichen, um die Fliegen zu sättigen und durstbedingte Rüsselausdehnungen zu verhindern.
    7. Halten Sie manuell einen roten Laserpointer, um rotes Licht auf den Rüssel/Kopf einer einzelnen Fliege (700 Lux) zu richten, während Sie die PER-Reaktion durch das Mikroskop beobachten.
      HINWEIS: Ein Augenschutz, der rote Laser/Licht herausfiltern kann, ist bei der Beobachtung des roten Lichts durch das Mikroskop unerlässlich.
    8. Beobachten und Aufzeichnen der Rüsselausdehnung innerhalb eines 30-s-Fensters. Bewerten Sie jeden Flug mit dem folgenden Aufzeichnungssystem: 0 bedeutet keine Dehnung, 0,5 bedeutet 1-2 s Dehnung, 1 bedeutet, dass die Dehnung länger als 3 s dauert.
    9. Nach dem Testen der lichtinduzierten Rüsselverlängerung untersuchen Sie das Ansprechen auf 4% Saccharose mit einer Spritze. Stoße ein Tröpfchen Saccharose am Ende der Nadel aus und bringe es in die Nähe des Fliegenrüssels.
      HINWEIS: Verwerfen Sie die Daten von Fliegen, die nicht auf das Saccharose-Tröpfchen reagieren.
  3. Verhaltens- und statistische Analyse
    1. Führen Sie statistische Analysen mit geeigneter Datenanalysesoftware durch.
      HINWEIS: Statistische Details zu den Experimenten finden Sie in den Abbildungslegenden.

5. Optogenischer Rotlicht-Fliegenlabyrinth-Assay

  1. Drosophila-Stämme und Fliegenaufzucht
    1. Überqueren Sie die Gr66a-Gal421-Treiberlinie zu UAS-CsChrimson2, was zum experimentellen Genotyp Gr66a>CsChrimson führt. Gr66a>CsChrimson Fliegen exprimieren CsChrimson in bitteren Geschmacksneuronen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass jede Gruppe die gleiche Anzahl männlicher und weiblicher Fliegen enthält.
  2. Fliegenlabyrinth-Montage
    1. Erstellen Sie das Fliegenlabyrinth wie in Abbildung 1F gezeigt.
      HINWEIS: Alternativ können Sie die Komponenten des Fliegenlabyrinths in 3D drucken und wie zuvor beschriebenzusammenbauen 25.
    2. Schneiden Sie drei 5-ml-Kulturröhrchen aus Kunststoff auf die richtige Länge, um ein Laderöhrchen, ein unbedecktes klares Reagenzglas und ein mit Folie bedecktes Reagenzglas herzustellen. Befestigen Sie die Rohre am Fliegenlabyrinth, wie in Abbildung 1F gezeigt.
      1. Schneiden Sie die Reagenzgläser je nach Labyrinthmaterial so ab, dass für jede Prüfbedingung der gleiche Abstand gewährleistet ist. Kürzen Sie basierend auf der Länge der Haltekammer das unbedeckte Reagenzglas in einem klaren Labyrinth, während Sie das mit Folie bedeckte Reagenzglas kürzen, wenn das Labyrinth undurchsichtig ist.
  3. Experimenteller Aufbau und Durchführung von Assays
    1. Bei Dunkelheit oder schlechten Lichtverhältnissen 10 Männchen und 10 Hündinnen in das Laderohr setzen. Verbinden Sie das Laderohr mit der Haltekammer. Kippen Sie den Aufzug und klopfen Sie vorsichtig auf das Rohr, um die Fliegen in die Haltekammer zu befördern.
      HINWEIS: Senken Sie den Aufzug so ab, dass nur die Hälfte der Warmhaltekammer offen ist. Diese Manipulation erleichtert den Transfer von Fliegen aus dem Laderohr in die Haltekammer.
    2. Nachdem die Fliegen in die Haltekammer transportiert wurden, verwenden Sie den Aufzug, um die Fliegen zwischen dem Laderohr und den Löchern des Testrohrs abzusenken. Entfernen Sie dann das Laderohr.
    3. Positionieren Sie das Fliegenlabyrinth in einem Abstand von ca. 13 cm zur Rotlichtquelle (1000 mA), ohne das Licht einzuschalten.
    4. Senken Sie den Elevator ab, bis die Haltekammer mit den Löchern des Reagenzglases ausgerichtet ist, sodass sich die Fliegen frei zwischen den mit Folie umwickelten und den unbedeckten Reagenzgläsern bewegen können. Schalten Sie gleichzeitig das rote Licht ein, um CsChrimson zu aktivieren. Stellen Sie sicher, dass die Rotlichtintensität auf der Oberfläche des unbedeckten Reagenzglases etwa 40 kLux beträgt.
      HINWEIS: Schalten Sie das rote Licht erst ein, wenn die Haltekammer abgesenkt und mit den Löchern des Reagenzglases ausgerichtet ist. Aufgrund der intensiven Helligkeit des roten Lichts wird ein geeigneter Augenschutz empfohlen, der rote Laser/Licht herausfiltern kann.
    5. Die Fliegen wählen eine Minute lang zwischen der rotlichtexponierten Röhre und der schattierten Röhre.
    6. Heben Sie nach 1 Minute den Aufzug zwischen dem Laderohr und den Löchern des Testrohrs an. Zähle die Fliegen in jeder Tube.
      HINWEIS: Es werden nur aktive und unverletzte Fliegen gezählt.
    7. Reinigen Sie das Fliegenhöhenruder und das Fliegenlabyrinth nach jedem Versuch mit dH2O.
  4. Datenanalyse und Statistik
    1. Berechnen Sie den Präferenzindex (PI) als das Verhältnis der Differenz in der Fliegenzahl zwischen unbedeckten und abgedeckten Röhren zur Gesamtzahl der Fliegen, wie in der folgenden Formel dargestellt:
      figure-protocol-3
      HINWEIS: Statistische Details zu den Experimenten finden Sie in den Abbildungslegenden. Die Datenanalyse wird mit einer geeigneten Datenanalysesoftware durchgeführt

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetischer thermotaktischer Positionspräferenz-Assay mit einer einzigen Fliege mit blauem Licht
Es wurden vier Bedingungen getestet: Raumlicht ohne ATR-Supplementierung (Raumlicht, ATR -), Raumlicht mit ATR-Supplementierung (Raumlicht, ATR+), blaues Licht ohne ATR-Supplementierung (blau, ATR -) und blaues Licht mit ATR-Supplementierung (blau, ATR+). Die ersten drei Bedingungen dienten als Kontrollen. In Kontrollexperimenten mieden die Fliegen die 31 °C-Seite. In blauem Licht mit ATR-Supplementier...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die optogenetische Manipulation hat das Gebiet der Neurowissenschaften verändert, indem sie die präzise Steuerung neuronaler Schaltkreise mit raumzeitlicher Genauigkeit ermöglicht27. Ein neuronaler Schaltkreis umfasst Populationen von Neuronen, die durch Synapsen miteinander verbunden sind und bei der Aktivierung bestimmte Funktionen ausführen. Das Drosophila-Ganzhirnkonnektom wurde fertiggestellt und bietet umfassende Einblicke in die synaptischen Signalwege ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte bezüglich der Veröffentlichung dieses Beitrags gibt. Alle Autoren haben mögliche Konflikte offengelegt und versichern, dass sie keine finanziellen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in dieser Studie vorgestellte Arbeit beeinflussen könnten.

Danksagungen

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1000 mA LED-TreiberLuxeon Star3021-D-E-1000
5 mL VWR Kulturröhrchen, Kunststoff, mit Dual-Position-KappenVWR60818-664
780 Langpassfilter / IR 780 nm 100 mm x 100 mm LeeFilterBH #LE8744Zugeschnitten auf ca. 47 x 100 passend für die Kunststoffabdeckung
Agfabric 6,5 Fuß x 15 Fuß Insektennetz Gartennetz zum Schutz von Pflanzen GemüseBlumen ObstThe Home DepotEIBNW6515
All trans retinalSigma-Aldrich116-31-4
Aluminiumplatte (30,5 cm x 30,5 cm x 0,6 cm)Amazonbei Amazon gekauft
Black Plastic BoxLI-COR929-97101
CALCIUM CHLORIDE ANHYDRO 25GRThermo Fisher Scientific 
CX405 Handycam mit Exmor R CMOS-SensorSONYHDR-CX405
Elmer' s “ Schulkleber"Elmer
Ethyl alcohol, Pure (200 Proof)Sigma-AldrichE7023
Fisherbrand Isotemp Hot Plate RührerFisher ScientificSP88850200
Fliegenschnur: Gr5a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center57592
Fliegenschnur: Gr66a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center57670
Fliegenschnur: HC-Gal4 (II)Dr. Marco Gallio LabEin freundliches Geschenk
Fliegenschnur: UAS-CsChrimsonBloomington Drosophila Stock Center55136
Fliegenschnur: UAS-GtACR2/TM6BDr. Quentin Gaudry LabEin freundliches Geschenk
Fliegenzeug 62-101 Gelbes Maismehl (11,3 kg), Gelb, 11,3 kg/EinheitGenesee Scientific62-101
Flystuff 62-107 Inaktive Trockenhefe, 10 kg, Nährflocke, 10 kg/EinheitGenesee Scientific62-107
Flystuff 66-103 Nutri-Fly Drosophila Agar, Gelidium, 100 mesh, 5 kg (11.02 lbs)/EinheitGenesee Scientific66-103
FreeMascot OD 8+ 190 nm– 420 nm / 600 nm– 1100 nm Wellenlänge Violett/Rot/Infrarot Laserschutzbrille Freies Maskottchen B08LGMQ65Sbei Amazon
GoPro Hero8 BlackGoPro6365359
LEE Filters gekauft; 100 mm Infrarot #87 Infrarot Polyester FilterB& H PhotoLE8744
Langpassfilter, Farbglas, 50,8 x 50,8 mm, 830 nm Cut-on, RG830NewportFSQ-RG830
Methyl-4-hydroxybenzoat, 99%, Thermo Scientific ChemicalsThermo Fisher Scientific
MicroWell Mini Tray 60 Well, flaches Profil NS PSThermal Scientific NUNC 439225Die Deckel werden als "Kunststoffabdeckung"
verwendetOlympus Plastics 24-160RS, 1000 & micro; L Olympus Ergonomische Pipettenspitzen mit geringer Bindung, im Rack, steril, 8 Racks mit 96 Spitzen/EinheitEppendorf24-160RS
Parafilm M SiegelfolieHeathrow ScientificHS234526B4 Zoll x 125 Fuß
Kaliumchlorid, ACS, 99,0-100,5 %, Thermo Fisher Scientific 
PrismGraphPadVersion 9Datenanalysesoftware
Samco Graduated Transfer PipettenThermo Fisher Scientific2253 mL
ObjektträgerFisher Scientific12-544-2  5 mm x 75 mm x 1,0 mm
StereomikroskopOLYMPUSCZ61
Styroporbox (27 cm Höhe & mal 22 cm Breite - 16 cm Länge)
SaccharoseFisher Scientific225911
OberflächentemperaturfühlerFluke80PK-3A
SpritzeBD Integra305270
Tate & Lyle 457 Dextrose, Tate & Lyle, Pow, Tate & Lyle 457 Dextrose, Tate & Lyle, Pulver, 50 lbs/EinheitGenesee Scientific62-113
Rückführbares kalibriertes Big-Digit-Thermoelement-ThermometerRückführbar durch cple-parmer  UX-91210-07Fisherbrand Rückverfolgbares BigDigit Typ K Thermometer
Dreifach blaue LEDSteuerbord LEDSupply07007-PB000-D470 nm
Dreifach rote LEDSteuerbord LEDSupply07007-PD000-F627 nm
Tygon PVC Klarer Schlauch 1/4" ID, 3/8" OD, 5 ft. Länge McMaster Carr Supply Company 6516T21 
Univivi IR-Strahler, 850nm 12 LEDs Weitwinkel-IR-Strahler für NachtsichtUnivivi4331910725
Wakefield Thermal 25,4 mm Runder Kühlkörper Stern LED-Platine - 882-100ABWakefield-Vette882-100AB
Wireless PresenterDinoFire StoreB01410YNAMbei Amazon gekauft
AC297150250 100-mal 126960025AA1159530

Referenzen

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