Methodenartikel

Ein In-vitro-Blasenmodell für katheterassoziierte Harnwegsinfektionen

DOI:

10.3791/67966

⸱

24. Juni 2025

 ,  , 
1The Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, The University of Liverpool, 2Department of Life Sciences, The University of Bath

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt ein in vitro Modell der katheterisierten Harnwege, das zur Untersuchung sowohl planktonischer als auch biofilmassoziierter bakterieller Zellpopulationen bei simulierten katheterassoziierten Harnwegsinfektionen verwendet werden kann. Dieses Modell kann weiter verwendet werden, um die Wirksamkeit von antimikrobiellen Produkten zur Kontrolle von Harnwegsinfektionen zu untersuchen.

Zusammenfassung

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Katheterassoziierte Harnwegsinfektionen (CAUTIs) gehören zu den häufigsten nosokomialen Infektionen. Die Biofilmbildung auf Harnkathetern ist ein Schlüsselaspekt in der Pathogenese dieser Infektionen und führt häufig zu Verstopfungen der Katheter und schwerwiegenden Komplikationen wie Pyelonephritis und Septikämie. Ansätze zur Modellierung und Untersuchung der Biofilmbildung in diesem Umfeld sind sowohl für ein grundlegendes Verständnis der Mechanismen, die der Pathogenese von CAUTI zugrunde liegen, als auch für die Entwicklung und robuste präklinische Bewertung wirksamer therapeutischer Strategien zur Kontrolle von CAUTI und Katheterblockaden unerlässlich. Dieses Protokoll beschreibt ein in vitro Modell der katheterisierten Harnwege, das das in der klinischen Praxis verwendete kathetergeschlossene Drainagesystem repliziert und die Untersuchung von CAUTI und Katheter-Biofilmbildung unter repräsentativen Bedingungen erleichtert. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll die Anwendung des In-vitro-Blasenmodells zur Bewertung der Wirksamkeit von antimikrobiellen Kathetererhaltungsprodukten, einschließlich der derzeit in der NHS-Lieferkette erhältlichen Produkte.

Einleitung

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Harnkatheter gehören mit einer geschätzten Prävalenz von 19 % in Akuteinrichtungen zu den am häufigsten eingesetzten Medizinprodukten 1,2,3. Katheter werden in erster Linie zur Unterstützung der Urinausscheidung bei Blasenfunktionsstörungen eingesetzt und direkt in die Blase eingeführt, so dass der Urin über ein zentrales Lumen aus der Blase entleerenkann 2,3. Harnkatheter können entweder intermittierend verwendet werden, wobei sie periodisch in die Blase eingeführt werden, um den Urin abzulassen, oder Verweilkatheter, bei denen Katheter in der Blase an Ort und Stelle belassen werden, um den Urin kontinuierlich abzuleiten 3,4. Trotz ihrer weit verbreiteten Verwendung sind Harnkatheter der größte Risikofaktor für die Entwicklung von Harnwegsinfektionen (HWI), die schätzungsweise ein Fünftel der nosokomialen Infektionen ausmachen 5,6. Tatsächlich fungiert der Katheter selbst oft als erster Ort der mikrobiellen Besiedlung und bietet eine Oberfläche für Uropathogene, um an den Harnwegen zu haften und diese weiter zu besiedeln 1,6,7,8. Praktisch alle Patienten, die sich einer langfristigen kontinuierlichen Katheterisierung unterziehen (bei der der Katheter ≥28 Tage an Ort und Stelle bleibt), leiden an einer Bakteriurie, wobei das Risiko mit jedem Tag, an dem der Katheter in situ ist, um ~5% steigt 2,9,10,11. Dementsprechend sind etwa 80 % der Harnwegsinfektionen mit der Verwendung eines Harnkatheters verbunden6.

Katheterassoziierte Harnwegsinfektionen (CAUTIs) stellen eine erhebliche Belastung für das Gesundheitswesen dar und sind oft mit schwerwiegenderen Symptomen der oberen Harnwegsinfektionen (wie Ureteritis und Pyelonephritis) verbunden als unkomplizierte Harnwegsinfektionen sowie mit einem erhöhten Risiko für sekundäre Blutbahninfektionen 1,7,12,13,14 . Zu den Standardbehandlungen für CAUTIs gehört eine Antibiotikatherapie, jedoch sind diese Infektionen aufgrund der Entwicklung komplexer Biofilmgemeinschaften auf der Katheteroberfläche oft widerspenstig gegenüber einer antimikrobiellen Behandlung 15,16,17,18,19,20. Es wird geschätzt, dass ~80% der CAUTIs auf biofilmbildende Harnwegserreger zurückzuführensind 19. Die Biofilmbildung ist gekennzeichnet durch die Anheftung von Bakterienzellen an Katheteroberflächen und die Entwicklung von Gemeinschaften, die in eine umfangreiche Matrix extrazellulärer polymerer Substanzen (EPS) eingebettet sind21,22,23,24. Die Produktion von EPS ist ein definierendes Merkmal von Biofilmgemeinschaften und verantwortlich für viele der emergenten Eigenschaften von Biofilm-assoziierten Zellen, wie z. B. eine erhöhte Resistenz gegen antimikrobielle Wirkstoffe und Immunclearance 21,22,24. Das EPS kann eine direkte Rolle bei diesen Phänotypen spielen, indem es Zellen physisch abschirmt und sie vor antimikrobiellen Mitteln oder Immuneffektoren schützt, sowie indirekt, indem es die Entwicklung breiterer Aspekte von Biofilmgemeinschaften erleichtert, wie z. B. die physikalisch-chemische Mikroumgebung des Biofilms und die Bildung von Persisterzellen 23,24,25,26. Darüber hinaus besitzen einige Uropathogene, einschließlich Proteus spp., die ~11% der CAUTIs ausmachen, potente Urease-Enzyme, die es ihnen ermöglichen, den im Urin vorhandenen Harnstoff zu hydrolysieren, was zu einem allgemeinen Anstieg des pH-Werts im Urin von 2,27,28,29,30 führt. Dieser pH-Anstieg geht einher mit der Ausfällung von Calcium- und Magnesiumphosphatkristallen, die in den wachsenden Biofilm eingebaut werden können, was zu einer Biomineralisation und der Bildung dichter kristalliner Biofilmstrukturen führt, die Katheter blockieren können. Diese kristallinen Biofilme machen nicht nur die Behandlung problematisch, sondern können auch schwerwiegende Komplikationen wie Pyelonephritis und Septikämieauslösen 2,28,31,32,33,34.

Die komplexe Umweltnische in den katheterisierten Harnwegen und die wichtige Rolle der Biofilmbildung bei diesen Infektionen stellen besondere Herausforderungen bei der Erforschung der CAUTI-Pathogenese dar. Einfache und weit verbreitete Labormodelle zur Untersuchung und Quantifizierung der Biofilmbildung, wie z. B. 96-Well-Platten-basierte Assays, sind für die Untersuchung der Biofilmbildung in CATUI, insbesondere bei kristallinen Biofilmen, unzureichend. Zum Beispiel berücksichtigen solche Modelle nicht Schlüsselaspekte der CAUTI-Nische, wie z. B. die komplexe Nährstoffumgebung, die der Urin bietet, wie die Katheteroberfläche die Adhäsion und die anschließende Biofilmproduktion beeinflusst, und den kontinuierlichen Fluss von Urinmedien 35,36,37,38,39,40 . Darüber hinaus spiegeln Standardassays, die zur Bestimmung der antimikrobiellen Empfindlichkeit von Uropathogenen verwendet werden, oft nicht die reale klinische Empfindlichkeit wider. Assays mit minimaler inhibitorischer Konzentration und mikrobielle Suspensionstests werden häufig verwendet, um auf die antimikrobielle Empfindlichkeit von CAUTI-Erregern zu schließen, simulieren jedoch typischerweise keine wichtigen Variablen der CAUTI-Umgebung, wie z. B. die Auswirkung, die das Vorhandensein eines Harnkatheters und eine anschließende Biofilmbildung auf die antimikrobielle Empfindlichkeit haben können 41,42,43.

Diese Studie beschreibt den Aufbau und die Ausführung eines in vitro Blasenmodells, das die Umgebung der katheterisierten Harnwege simuliert und ein in der klinischen Praxis verwendetes Standardkatheter-Drainagesystem repliziert, das erstmals 1999 von Stickler et al.44 beschrieben wurde (Abbildung 1). Dieses Modell verwendet Foley-Katheter in Standardgröße (die derzeit in der NHS-Lieferkette erhältlich sind) und künstliche Urinmedien (AUM), wie zuvor von Nzakizwanayo et al.45beschrieben, um CAUTI und Biofilmbildung zu simulieren. Das In-vitro-Blasenmodell besteht aus einer doppelwandigen Glaskammer, die als "Blase" fungiert und über einen Ausgang verfügt, durch den ein Foley-Katheter in die zentrale Glaskammer eingeführt werden kann. Am oberen Ende der zentralen Glaskammer befindet sich ein Einlass, durch den die AUM mit einer biologisch relevanten Durchflussrate mit einer Peristaltikpumpe in die "Blase" geleitet werden kann, die durch den Katheter über die Drainageösen in einen Abfallbeutel fließt. Zusätzlich ist die äußere Kammer mit einem Wasserbadkreislauf verbunden, der es ermöglicht, die Modelle auf einer konstanten Temperatur zu halten. Das in vitro Blasenmodell kann über die zentrale Kammer geimpft werden, was die Untersuchung von CAUTI-Erregern in einer biologisch repräsentativen Nische ermöglicht. Da die Modelle katheterisiert und ständig mit frischem AUM versorgt werden, können außerdem das Wachstum und die Populationsdynamik sowohl von planktonischen als auch von Biofilm-assoziierten Zellen untersucht werden.

In früheren Studien wurden In-vitro-Blasenmodelle für verschiedene Anwendungen verwendet, einschließlich der grundlegenden Untersuchung der Biofilmbildung bei prominenten CAUTI-Krankheitserregern, einschließlich Proteus mirabilis und Escherichia coli 43,45,46,47,48,49. Darüber hinaus wurde das In-vitro-Modell verwendet, um die Wirksamkeit von Produkten zu bewerten, die zur Kontrolle von CAUTI oder zur Verhinderung von Verstopfungen bestimmt sind 50,51,52. In jüngerer Zeit wurden Modelle verwendet, um zu bestimmen, ob Anpassungen und Mutationen, die mit AMR verbunden sind, die Biofilmbildung und die CAUTI-Pathogenese bei P. mirabilis beeinflussen 43,46. Das In-vitro-Blasenmodell wurde auch verwendet, um neuartige antimikrobielle Behandlungen zur Behandlung von CAUTI zu untersuchen, einschließlich neu formulierter theranostischer Katheterbeschichtungen und Phagentherapiebehandlungen47,48. Dieses Protokoll umfasst die Einrichtung und Durchführung von In-vitro-Blasenmodellen, die Zählung lebensfähiger planktonischer und biofilmassoziierter Zellen aus der Modell- bzw. Harnkatheteroberfläche sowie die Messung des pH-Werts im Urin zur Überwachung der Ureaseproduktion. Es werden auch Protokolle für die Bewertung von antimikrobiellen Produkten zur Behandlung oder Vorbeugung von CAUTI detailliert beschrieben, einschließlich Blasenspüllösungen und antimikrobieller Gleitgele, die derzeit in der NHS-Lieferkette erhältlich sind.

Protokoll

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Eine schematische Darstellung des in vitro Blasenmodellaufbaus ist in Abbildung 1 dargestellt. In-vitro-Blasenmodelle sind so konzipiert, dass sie mit Standard-Foley-Kathetern kompatibel sind (die in Abbildung 1 gezeigten Abmessungen sind mit französischen Standardkathetern der Größe 14 kompatibel). Sterilisieren Sie alle In-vitro-Blasenmodellgeräte und klemmen Sie alle verwendeten Silikonschläuche vor der Verwendung in den Medienkreislauf. Die strikte Einhaltung der aseptischen Technik ist während des gesamten Aufbaus von In-vitro-Modellen erforderlich, und es wird empfohlen, das Modell unter sterilen Bedingungen (d. h. in einer mikrobiellen Sicherheitswerkbank der Kategorie II oder einer Laminar-Flow-Haube) zusammenzubauen. Ein Minimum von n = 5 Replikaten wird empfohlen, um die statistische Signifikanz für in vitro Blasenmodellexperimente zu bestimmen. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Aufbereitung von Kunsturinmedien

HINWEIS: Künstliche Urinmedien (AUM) werden für die Verwendung in In-vitro-Blasenmodellen empfohlen, da für Experimente große Mengen an Medien erforderlich sind und die Variabilität mit menschlichen Urinproben verbunden ist. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung von AUM, wie sie zuvor beschrieben und für die Verwendung im in vitro Blasenmodell von Nzakizwanayo et al. optimiert wurde. (5 L Endvolumen) 43,45,46,48,53,54.

  1. AUM-Lösung vorbereiten 1
    1. Wiegen Sie die folgenden Verbindungen ab und geben Sie in eine 1-l-Borosilikatflasche mit 850 ml entionisiertem Wasser: 3,25 g Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2,6H 2O), 23 g Natriumchlorid (NaCl), 11,5 g wasserfreies Natriumsulfat (Na2SO4), 3,25 g Trinatriumcitrat (Na3C6H5O7), 0,1 g Natriumoxalat (Na2C2O4), 14 g Monokaliumphosphat (KH2PO4), 8 g Kaliumchlorid (KCl), 5 g Ammoniumchlorid (NH4Cl), 25 g Gelatine und 5 g Trypton-Sojabrühe.
  2. Messen Sie unter Rühren der AUM-Lösung den pH-Wert mit einem pH-Messgerät und stellen Sie ihn auf 5,75 (± 0,02) ein, indem Sie je nach Bedarf 3 M NaOH oder HCl hinzufügen.
    HINWEIS: NaOH/HCl zur pH-Einstellung sollte tropfenweise zum AUM hinzugefügt werden, um eine Salzausfällung aus der Lösung zu verhindern.
  3. Sobald der AUM an den pH-Wert angepasst wurde, füllen Sie die Lösung auf ein Endvolumen von 1 l mit entionisiertem Wasser auf und sterilisieren Sie sie im Autoklavier.
    HINWEIS: Nach der Sterilität kann die Lösung bis zu drei Monate bei Raumtemperatur gelagert werden (AUM-Lösung 1 sollte verworfen werden, wenn Niederschläge oder Trübungen beobachtet werden).
  4. Separat wird die AUM-Lösung 2 hergestellt, indem 125 g Harnstoff (CH4N2O) und 2,45 g Calciumchlorid (CaCl2) zu 400 ml sterilem, entionisiertem Wasser in einem sterilen 500-ml-Becherglas gegeben werden.
    HINWEIS: Die Herstellung der Calciumharnstofflösung 2 führt zu einer endothermen Reaktion, daher wird empfohlen, die AUM-Lösung 2 zu rühren und auf einer Heizplatte/einem Magnetrührer auf ~ 50 °C zu erhitzen, während sich die Verbindungen auflösen, um ein Einfrieren zu verhindern.
  5. Sobald sich der Harnstoff und das Calciumchlorid aufgelöst haben, wird Lösung 2 mit einer Vakuumpumpe und 0,45 μM Nitrozellulose-Filtereinheiten in eine sterile 500-ml-Glasflasche filtriert. Nach der Sterilisation ist Lösung 2 drei Monate bei 4 °C oder einen Monat bei Raumtemperatur stabil
    HINWEIS: AUM-Lösung 2 sollte verworfen werden, wenn Niederschlag oder Trübungen beobachtet werden.
  6. Kombinieren Sie in einer Laminar-Flow-Haube oder einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank der Kategorie II die AUM-Lösungen 1 und 2 aseptisch mit 3,6 l sterilem deionisiertem Wasser in einer sterilen 5-l-Glasaspiratorflasche. Das verwaltete Vermögen sollte hellgelb und transparent sein.
  7. Entnehmen Sie mit einer serologischen Pipette 50 ml aus dem Gesamtvolumen des verwalteten Vermögens und aliquotieren Sie es in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und bewahren Sie es für die spätere Verwendung auf.
  8. Verschließen Sie die Aspiratorflasche mit einem Gummistopfen oder einer Aluminiumfolie und lassen Sie sie bei Raumtemperatur, bis die In-vitro-Modelle zusammengebaut sind.
  9. Entfernen Sie aseptisch 10 mL AUM aus dem 50 mL Aliquot und bewahren Sie den Rest der Lösung für die Inokulumvorbereitung auf. Messen Sie mit einem pH-Messgerät den pH-Wert des 10 mL AUM aliquot, der ~pH 6,1 (±0,2) betragen sollte. Zubereitetes AUM ist bei Raumtemperatur etwa einen Monat lang stabil und sollte bei Niederschlag oder Bewölkung verworfen werden.

2. Aufbau eines In-vitro-Blasenmodells

  1. Führen Sie einen Foley-Katheter in die zentrale Glaskammer des In-vitro-Blasenmodells ein (schematisch in Abbildung 1 dargestellt). Befestigen Sie den Katheter, indem Sie den Ballon mit der mitgelieferten Spritze mit sterilem Wasser aufblasen, und befestigen Sie den Abfallbeutel am Katheteranschluss.
  2. Verbinden Sie das in vitro Blasenmodellgerät45 über einen Verbindungsschlauch mit dem AUM-Reservoir. Schließen Sie die Schläuche des Medienkreislaufs gemäß den Anweisungen des Herstellers an die Schlauchpumpe an und stellen Sie sicher, dass die Schläuche eine ausreichende Spannung haben, ohne gedehnt zu werden.
  3. Befestigen Sie In-vitro-Blasenmodelle an Klemmständern und befestigen Sie Abfallsäcke in Ständern unter den Modellen, um den Durchfluss durch die Modelle durch die Schwerkraft zu gewährleisten.
  4. Verbinden Sie die äußere Kammer des Blasenmodells über einen Silikonschlauch mit einem zirkulierenden Wasserbad (Abbildung 1B). Stellen Sie das Wasserbad auf 37 °C ein und schalten Sie die Umwälzpumpen ein.
    1. Lassen Sie Wasserbäder 30 Minuten lang laufen, bevor Sie In-vitro-Blasenmodelle inokulieren, um sicherzustellen, dass die Temperatur bei 37 °C stabil ist, und stellen Sie sicher, dass das Wasserbad für die Dauer des Experiments auf den entsprechenden Wasserstand aufgefüllt bleibt.
  5. Entfernen Sie alle Klemmen von den Medienschläuchen und stellen Sie die Schlauchpumpen so ein, dass sie mit ca. 0,75 ml/min laufen, um die menschliche Urinproduktion (~1080 mL/Tag) zu replizieren. Die tatsächlichen Durchflussraten werden während des Experiments berechnet.
  6. Führen Sie die AUM vor der Inokulation 30 Minuten lang über die Peristaltikpumpe durch die In-vitro-Blasenmodelle, um zu bestätigen, dass der Medienfluss mit einer konstanten Geschwindigkeit erfolgt und das sterile Drainagesystem intakt ist.
  7. Entleeren Sie vor dem Experimentieren alle angesammelten Medien aus dem Abfallbeutel. Das Volumen des Mediums kann gemessen werden, um genaue Durchflussraten zu berechnen (siehe Schritt 4).

3. Inokulation von in vitro Blasenmodellen

  1. Bereiten Sie über Nacht Kulturen für In-vitro-Blasenmodelle vor, indem Sie eine Schleife voller Bakterienkolonien, die auf festem Agar gezüchtet wurden, in 10 ml LB-Brühe suspendieren. Über Nacht bei 37 °C unter Rühren inkubieren.
    HINWEIS: Das In-vitro-Blasenmodell kann zur Untersuchung einer Vielzahl von CAUTI-Krankheitserregern verwendet werden, einschließlich Urease-positiver Stämme wie Proteus mirabilis, und die verwendeten Wachstumsmedien können entsprechend modifiziert werden.
  2. Das gesamte Volumen der Übernachtkultur wird 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 4.500 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 mL AUM und messen Sie die Extinktion bei OD595 nm mit einem Spektrometer.
  3. Normalisieren Sie die resuspendierten Kulturen auf einen OD595 nm von 1,0 und ein Endvolumen von 10 mL im AUM unter Verwendung der folgenden Gleichung:
    figure-protocol-1
    wobei A1 die Extinktion bei OD600 nm der Übernachtkultur, A2 die gewünschte Extinktion bei OD600 nm des Inokulums (1,0), V2 das gewünschte Volumen des Inokulums (10 ml) und V1 das erforderliche Volumen der Übernachtkultur für die Normalisierung ist.
    HINWEIS: 10 ml einer OD595 nm 1.0-Suspension stellen sicher, dass die Modelle mit etwa 10bis 10 KBE der meisten Bakterienstämme (validiert für Proteus mirabilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus) geimpft werden, was eine etablierte Infektion repliziert. Das Ausgangsinokulum kann je nach verwendeter Spezies oder dem zu modellierenden Infektionsstadium modifiziert werden (d. h. eine niedrigere Inokulumdichte kann verwendet werden, um eine Infektion im Frühstadium zu simulieren)47.
  4. Sterilisieren Sie In-vitro-Blasenmodelle mit 70 % Ethanol und entfernen Sie den Stopfen (Medieneinlass), damit die Innenkammer zugänglich ist. Entfernen Sie 10 ml AUM mit einer serologischen Pipette aus dem Volumen im Blasenmodell.
    HINWEIS: Achten Sie bei der Inokulation und Probenahme von In-vitro-Modellen aus der zentralen Kammer auf eine schnelle und aseptische Arbeit, tragen Sie immer geeignete PSA und dekontaminieren Sie Handschuhe und Oberflächen regelmäßig mit 70 % Ethanol.
  5. Beimpfen Sie die in vitro Blasenmodelle über die zentrale Kammer mit der gesamten normalisierten 10 mL Suspension und mischen Sie sie gründlich mit einer serologischen Pipette. Entfernen Sie 10 ml aus der zentralen Kammer der In-vitro-Blasenmodelle mit einer serologischen Pipette und aliquotieren Sie sie in einen 15-ml-Universalbehälter für spätere KBE/ml-Berechnungen und pH-Messungen.
  6. Dekontaminieren Sie die Außenflächen des Blasenmodells gründlich und stopfen Sie es mit 70 % Ethanol und setzen Sie den Stopfen wieder ein. Setzen Sie den Medienfluss kurz fort, um sicherzustellen, dass der AUM-Pegel in der zentralen Kammer das Augenloch erreicht, bevor Sie den Fluss stoppen.
  7. Lassen Sie die Kulturen 1 h lang im Blasenmodell egenerieren, bevor Sie den Medienfluss über die Peristaltikpumpe bei ~0,75 mL/min einschalten.
  8. Während sich das Inokulum etabliert, bereiten Sie Verdünnungen aus der Probe vor, die aus der zentralen Kammer entnommen wurde.
    1. 100 μl der Probe werden seriell in 900 μl sterilem PBS verdünnt, bis die Probe auf 10-7 verdünnt ist. 10 μl der Verdünnungen werden in dreifacher Ausfertigung auf geeigneten festen Medien ausgefüllt und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
    2. Zählen Sie nach der Inkubation die Kolonien auf jeder Verdünnungsplatte und berechnen Sie die genaue KBE/ml des ursprünglichen Inokulums.
      HINWEIS: Wenn Sie Spezies verwenden, die schwärmen, z. B. Proteus mirabilis, verwenden Sie MacConkey-Agar ohne Salz (Pepton 20,0 g/L, Laktose 10,0 g/L, Gallensalze 5,0 g/L, Neutralrot 0,075 g/L und Agar 12,0 g/L), um sicherzustellen, dass einzelne Kolonien noch sichtbar sind, um die Zählung zu erleichtern.
  9. Schalten Sie nach 1 Stunde Inkubation den Medienfluss über die Peristaltikpumpe ein, um mit der Ausführung von In-vitro-Blasenmodellen zu beginnen, und notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem die Modelle eingeschaltet werden.

4. Berechnung der in vitro Blasenmodell-Flussrate

  1. Sobald die In-vitro-Modelle inokuliert und der Medienfluss eingeleitet wurde, lassen Sie die Modelle 4 Stunden lang laufen. Unterbrechen Sie den Medienfluss kurz und sammeln Sie das gesamte Volumen des verbleibenden AUM aus dem Abfallbeutel in einem Messkolben über die Entleerungsöffnung. Notieren Sie sich das gesammelte Volumen.
    HINWEIS: Die Durchflussrate kann aus dem Volumen des in Schritt 2.7 gesammelten Mediums berechnet werden, genauere Durchflussraten können jedoch durch längeres Laufen der Modelle (d. h. empfohlen 4 h) erzielt werden, da dies die Wahrscheinlichkeit verringert, dass Restluft in den Schläuchen des Medienkreislaufs die berechnete Durchflussrate beeinflusst.
  2. Nehmen Sie den Medienfluss über die Schlauchpumpe wieder auf und stellen Sie sicher, dass die Entleerungsöffnung des Abfallbeutels geschlossen ist, um ein steriles Entleerungssystem aufrechtzuerhalten.
  3. Um die tatsächliche Flussrate von In-vitro-Modellen zu berechnen, verwenden Sie die folgende Gleichung:
    figure-protocol-2
    HINWEIS: Für die Replikation der menschlichen Urinproduktion werden Flussraten im Bereich von 0,55-1,0 ml/min empfohlen.
  4. Wenn die Mediendurchflussrate außerhalb des akzeptablen Bereichs berechnet wird, verwerfen Sie das Replikat und stellen Sie die Drehzahl an der Schlauchpumpe so ein, dass sie in den akzeptablen Bereich passt.

5. Probenahme von Planktonzellen aus dem in vitro Blasenmodell

HINWEIS: In-vitro-Blasenmodelle sollten während des gesamten Experiments routinemäßig entnommen werden, um die Populationsdynamik zu überwachen. Alle Modelle sollten unmittelbar nach der Inokulation zum Zeitpunkt der Aktivierung des AUM-Flusses, 4 Stunden nach der Inokulation (wenn die Flussrate berechnet wird) und an dem Punkt entnommen werden, an dem die Modelle beendet werden (entweder Verstopfung oder ein vorgegebener Endpunkt). Wenn Sie Modelle für >24 Stunden verwenden, wird empfohlen, alle 24 Stunden Proben zu entnehmen, um KBE/ml zu überwachen, und zusätzliche Proben können nach Bedarf des Benutzers entnommen werden.

  1. Dekontaminieren Sie den Stopfen des Blasenmodells mit 70 % Ethanol und entfernen Sie ihn, um Zugang zur zentralen Kammer zu erhalten.
  2. Vermeiden Sie die Katheterspitze und den Ballon und mischen Sie den Inhalt der zentralen Kammer vorsichtig mit einer serologischen Pipette.
  3. Entnehmen Sie mit einer serologischen Pipette eine 10-ml-Probe aus der Kammer und geben Sie sie in ein steriles Röhrchen. Dekontaminieren Sie den Stopfen sofort mit 70 % Ethanol und ersetzen Sie ihn, um den sterilen, geschlossenen Entleerungskreislauf zu vervollständigen.
  4. Entnehmen Sie 1 ml aus der Probe mit einer Pipette und aliquotieren Sie es in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für serielle Verdünnungen.
  5. Messen Sie den pH-Wert der verbleibenden Probe mit einem pH-Messgerät und stellen Sie sicher, dass die Probe gründlich gemischt und das pH-Messgerät vor der Verwendung kalibriert ist.
  6. Das reservierte 1-ml-Aliquot aus der Probe wird seriell verdünnt und wie zuvor in Schritt 3.8 beschrieben auf geeignete feste Medien plattiert, wobei alle Verdünnungen ausplattiert werden.
    HINWEIS: Planktonproben, die aus dem Blasenmodell entnommen werden, eignen sich für andere Analysen, einschließlich genomischer oder molekularbiologischer Anwendungen (optional).

6. Probenahme von Biofilm-assoziierten Zellen aus dem in vitro Blasenmodell

  1. Katheterentfernung und -aufbereitung
    HINWEIS: Die Biofilmprobenahme von In-vitro-Blasenmodellen ist eine Endpunktanalyse, die die Deaktivierung der Modelle und die Entfernung von Kathetern für die Verarbeitung erfordert.
    1. Trennen Sie den Abfallbeutel vom Katheteten und lassen Sie den Resturin aus dem Modell ab, indem Sie den Ballon entleeren. Entfernen Sie den Katheter mit einer sterilen Pinzette von der Unterseite des Modells.
    2. Legen Sie den entfernten Katheter auf ein steriles Brett und schneiden Sie den Katheter mit einem sterilen Skalpell an den erforderlichen Stellen für die Teilung ab (siehe Abbildung 2).
    3. Stellen Sie sicher, dass die Katheterabschnitte in Längsrichtung geschnitten sind, um das Lumen freizulegen. Tauchen Sie dann den Katheterabschnitt mit einer sterilen Pinzette 3 Mal in steriles PBS, um nicht adhärente Zellen zu entfernen.
      HINWEIS: Wenn Katheterabschnitte stromabwärts bildgeben, d. h. mit REM, lassen Sie 1 cm lange Abschnitte intakt (nicht in Längsrichtung schneiden) und entfernen Sie stattdessen überschüssige Feuchtigkeit aus dem Lumen mit einem sterilen Papiertuch, bevor Sie fixiert werden.
  2. Aufschluss über den Biofilm für die KBE/ml-Zählung
    HINWEIS: Protokolle, die den Aufschluss von Biofilm-assoziierten Zellen detailliert beschreiben, können weitere Optimierungen erfordern, wenn Biofilme weitgehend kristallin oder mukoid sind.
    1. Inkubieren Sie den vorbereiteten Katheterabschnitt in 0,25 % Trypsin bei 37 °C für 30 min. Das verwendete Trypsinvolumen sollte das Minimum sein, das erforderlich ist, um den Katheter abzudecken. Für einen senkrecht geschnittenen 1 cm Katheterabschnitt ist z. B. 1 ml 0,25 % Trypsin ausreichend.
    2. Nach der Inkubation die Lösung, die den Katheter enthält, 10 Minuten lang beschallen. Der Katheterabschnitt kann dann entfernt und entsorgt werden. Um das Trypsin zu deaktivieren, sollte die Zelllösung sofort in sterilem PBS verdünnt und für die KBE auf geeigneten festen Medien ausplattiert werden, wie zuvor in Schritt 3.8 beschrieben.
  3. Quantifizierung von Katheter-Biofilmen durch Kristallviolett-Färbung
    1. Geben Sie die vorbereiteten Katheterabschnitte in eine Vertiefung mit geeigneter Größe und flachem Boden. Verwenden Sie ein geeignetes Volumen von 0,1 % kristallvioletter Lösung, um den Katheterabschnitt vollständig einzutauchen, und inkubieren Sie ihn 15 Minuten lang statisch bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass auch ein steriler Katheterabschnitt als Hintergrundkontrolle enthalten ist.
    2. Entfernen Sie die Katheterabschnitte von der Platte und legen Sie sie auf eine neue Platte. Waschen Sie jeden Katheterabschnitt zweimal in destilliertem Wasser.
    3. Nach dem Spülen die Katheterabschnitte auf eine neue Platte übertragen und mit 33 % Essigsäure bedecken. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. Entfernen Sie den Katheterabschnitt von der Platte und messen Sie dann mit einem Plattenlesegerät OD595 nm für jedes Replikat, wobei Sie die Vertiefungen, die die sterilen Katheterabschnitte enthielten, als Hintergrundkontrollen verwenden.

7. Prüfung der antimikrobiellen Empfindlichkeit im In-vitro-Blasenmodell

HINWEIS: Die meisten Therapeutika zur Kontrolle katheterassoziierter Harnwegsinfektionen sind mit Standard-Foley-Kathetern kompatibel, überprüfen Sie die Kompatibilität, bevor Sie mit In-vitro-Blasenmodellexperimenten beginnen.

  1. Antimikrobielle Gleitgele
    HINWEIS: Um die Verwendung von Schmiermitteln beim Einführen des Katheters zu simulieren, sollte dieser Schritt während Schritt 2.1 unmittelbar vor dem Einführen des Foley-Katheters durchgeführt werden. Nach dem Einführen des Katheters sollte das Modell sofort angeschlossen sein und Schritt 2.6. sollte weggelassen werden, damit das Gel vor der Inokulation nicht verdünnt und abgelassen wird. Die Inokulation sollte am selben Tag wie das Einführen des Katheters erfolgen. Schmiermittel, die für die Verwendung mit Kathetern entwickelt wurden, werden als einzelne, sterile Einwegspritzen mit einem Volumen von 6 ml oder 11 ml verpackt. Ungefähr 5 ml Schmiermittel reichen aus, um sowohl den Hals des Blasenmodells zu füllen als auch die Basis des Modells zu beschichten.
    1. Führen Sie bei der aseptischen Technik das Ende der Spritze mit dem Schmiermittel in den Hals des Blasenmodells ein und führen Sie 5 ml Gel ein, um den Hals zu füllen und in den Boden der Kammer einzudringen.
    2. Drehen Sie das Modell so, dass die Basis gleichmäßig mit Gel bedeckt ist, führen Sie dann einen Foley-Katheter in das Modell ein, indem Sie die Katheterspitze durch das Gel schieben, und befestigen Sie es, indem Sie den Ballon wie gewohnt füllen.
    3. Verbinden Sie das Modell mit dem Rest des Setups und füllen Sie dann das Modelllumen mit Urin, bis er zu entleeren beginnt. Sobald der Urin durch das Katheteraugenloch abzufließen beginnt, stoppen Sie die Pumpe, um einen Verlust des Gels vor der Inokulation zu verhindern.
      1. Inkubieren Sie die Modelle 30 Minuten lang, um den Urin auf 37 °C zu bringen, und impfen Sie dann die Modelle wie zuvor beschrieben, um eine gleichmäßige Diffusionszeit der Gelkomponenten in das Urinvolumen zu gewährleisten.
    4. Beimpfen Sie das Modell wie in Schritt 3.5 beschrieben und lassen Sie es 1 h inkubieren, bevor Sie die Schlauchpumpen einschalten. Entnehmen Sie beim Einschalten der Pumpe eine 1 mL Planktonprobe und verdünnen Sie die Verdünnungen für die KBE-Zahl, wie in Schritt 3.8 beschrieben.
  2. Lösungen für die Bewässerung
    HINWEIS: Spüllösungen sind oft in loser Schüttung oder als einzelne, sterile Einweg-"Beutel" erhältlich. Wenn Sie einzelne Lösungen verwenden, stellen Sie vor dem Experimentieren sicher, dass sie mit den Drainageöffnungen der zu verwendenden Katheter kompatibel sind. Wenn Sie Spüllösungen in großen Mengen verwenden, stellen Sie sicher, dass dreilumige Katheter verwendet werden und die Anweisungen des Herstellers befolgt werden, um das Volumen/den Zeitrahmen der Produktverabreichung zu bestimmen.
    1. Führen Sie vor der Behandlung In-vitro-Modelle mindestens 4 Stunden lang durch, um sicherzustellen, dass die Biofilm-assoziierten Gemeinschaften ausreichend Zeit hatten, sich zu etablieren. Sobald die Modelle 4 Stunden lang gelaufen sind, unterbrechen Sie den Medienfluss und entnehmen Sie eine Vorbehandlungsprobe aus der Innenkammer der In-vitro-Modelle , wie in Schritt 5 beschrieben.
      HINWEIS: Wenn Sie Bewässerungslösungen in großen Mengen verwenden, fahren Sie mit Schritt 7.2.5 fort.
    2. Wenn Sie einen einzelnen Spülbeutel verwenden, trennen Sie den Abfallbeutel vom Katheter und verwenden Sie die mit dem Beutel gelieferte Kappe, um den Abfallbeutel zu verschließen. Befestigen Sie sofort den Spüllösungsbeutel am Katheter und drücken Sie das Produkt mit leichtem Druck in das zentrale Lumen. Wie in den Anweisungen des Herstellers angegeben auftragen (d. h. 15 Minuten Anwendung).
    3. Sobald die empfohlene Behandlung abgeschlossen ist, lassen Sie die restliche Lösung aus der inneren Kammer über das Katheteraugenloch in den Spülbeutel abfließen und trennen Sie dann den Beutel. Der restliche Inhalt des Beutels kann entsorgt oder für weitere nachgelagerte Anwendungen verwendet werden.
    4. Sterilisieren Sie den Katheterdrainageanschluss und den Anschlussanschluss für den Abfallbeutel mit 70 % Ethanol und schließen Sie sie wieder an, um ein steriles, geschlossenes Drainagesystem zu vervollständigen.
      HINWEIS: Fahren Sie mit Schritt 7.2.7 fort, wenn Sie Spülbeutel verwenden.
    5. Wenn Sie einen Drei-Lumen-Katheter verwenden, desinfizieren Sie den Spüllumenport mit 70 % Ethanol und beginnen Sie sofort mit der Bewässerung mit einer sterilen Spritze gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      HINWEIS: Messen Sie vor der Bewässerung das Volumen des Resturins im Abfallbeutel, damit dies bei der Berechnung der nachgeschalteten Verstopfungszeit oder der Durchflussrate berücksichtigt werden kann.
    6. Sobald die Spülung abgeschlossen ist, entsorgen Sie die Spritze und alle im Abfallbeutel verbliebenen Reste der Spüllösung.
    7. Entnehmen Sie eine Nachbehandlungsprobe aus der zentralen Kammer des In-vitro-Blasenmodells , wie in Schritt 5 beschrieben, und setzen Sie den AUM-Fluss über die Peristaltikpumpe fort, um den Versuch fortzusetzen.

8. Beendigung der Experimente mit In-vitro-Blasenmodellen

HINWEIS: Urease-positive Organismen wie P. mirabilis können durch Bildung von kristallinen Biofilmen eine Verstopfung der Harnkatheter verursachen. Die Blockade kann somit als biologisch relevanter Endpunkt für in vitro Blasenmodelle verwendet werden und wird sichtbar durch einen vollständigen Verschluss der Katheteraugenlöcher mit kristallinen Biofilmen und eine Erhöhung des AUM-Volumens in der zentralen Kammer der Glasblase identifiziert (Abbildung 3).

  1. Sobald die in vitro Blasenmodelle bis zum vorgegebenen Endpunkt gelaufen sind, bei dem es sich um eine Blockade oder eine definierte Laufzeit handeln kann, schalten Sie den AUM-Fluss über die Peristaltikpumpe ab und entnehmen Sie eine Endpunktprobe aus der zentralen Kammer, wie in Schritt 5 beschrieben.
  2. Schalten Sie den Wasserbadfluss aus und trennen Sie den Medienkreislauf und die Schläuche des Wasserbadkreislaufs von den In-vitro-Blasenmodellen .
  3. Entfernen Sie die Stopfen von In-vitro-Blasenmodellen und entfernen Sie das gesamte Volumen des Restharns mit einer serologischen Pipette. Entsorgen Sie kontaminierte Medien ordnungsgemäß (z. B. im Autoklaven sterilisieren).
  4. Entleeren Sie die Abfallsäcke und entsorgen Sie alle Medienreste. Trennen Sie die Katheterabfallbeutel vom Katheteranschluss und entsorgen Sie sie.
  5. Entleeren Sie die Katheterballons mit einer Spritze langsam, bevor Sie die Katheter von den Modellen entfernen.
    HINWEIS: Bei der Verwendung von Urease-positiven Bakterienspezies können Katheter an den Glaswänden von In-vitro-Modellen "kleben" bleiben. Vermeiden Sie es, große Kräfte auf Katheter auszuüben, und fahren Sie stattdessen mit Schritt 8.6 fort.
  6. Weichen Sie In-vitro-Modelle über Nacht in einer 5%igen antimikrobiellen Reinigungslösung (siehe Materialtabelle) ein und waschen Sie sie dann gründlich mit Wasser, um sicherzustellen, dass alle Desinfektionsmittelreste entfernt werden. Autoklav zum Sterilisieren.
    HINWEIS: Wenn Sie Urease-positive Spezies verwenden, fügen Sie der Desinfektionslösung 5 % w/v Zitronensäure hinzu, um die Biomineralisation in der zentralen Kammer aufzulösen. Diese saure Lösung hilft auch, Katheter, die an den Modellen haften geblieben sind, freizusetzen, indem sie kristalline Biofilmablagerungen aufbricht.
  7. Trennen Sie die Schläuche des Medienkreislaufs vom AUM-Behälter und entsorgen Sie alle Medienreste. Spülen Sie den Schlauch mit Wasser durch, um alle AUM-Reste zu entfernen, und autoklavieren Sie ihn.
  8. Um die genaue Verstopfungszeit zu berechnen, notieren Sie sich das endgültige Volumen im Abfallsack und verwenden Sie die Gleichung in Schritt 4.4 und die zuvor berechnete Durchflussmenge, um die Zeit der Verstopfung zu bestimmen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der erfolgreiche Betrieb des in vitro Blasenmodells hängt von der Anwendung einer guten aseptischen Technik und einer sorgfältigen Beobachtung der Medientrübung während des gesamten Experiments ab (Abbildung 3). Vor der Inokulation war das sterile AUM blassgelb gefärbt und in der zentralen Kammer des In-vitro-Blasenmodells transparent (Abbildung 3A). Das AUM im Medienreservoir sollte während des gesamten Experiments klar bleiben, da auftretende Trübungsänderungen auf eine Ausfällung von Salzen aus der Lösung oder eine Kontamination des Mediums hinweisen können. Wenn das verwaltete Vermögen im Medienreservoir oder in den Schläuchen des Medienkreislaufs trüb wird oder eine drastische Farbveränderung aufweist, sollten die Replikate verworfen und wiederholt werden. Nach der Inokulation ist eine Zunahme der Trübung des AUM in der zentralen Kammer des in vitro Blasenmodells deutlich sichtbar (Abbildung 3B). Veränderungen der Trübung sind bei Urease-positiven Organismen wie P. mirabilis oft ausgeprägter, sollten aber auch nach der Inokulation bei Urease-negativen Organismen sichtbar sein. Nachdem der AUM-Fluss initiiert wurde, wird häufig eine Verringerung der AUM-Trübung beobachtet, da die planktonischen Zellen ausgewaschen werden, und deutet nicht auf einen Mangel an lebensfähigen Zellen im Modell hin. Die Beobachtung des Medienspiegels in der zentralen Kammer kann auch zur Bestimmung der Blockadezeit verwendet werden, wenn Urease-positive Organismen verwendet werden (Abbildung 3C). Während des Modellbetriebs sollten das Katheter-Augenloch und die Katheterspitze vollständig sichtbar sein, um eine ordnungsgemäße Entleerung in die Abfallbeutel anzuzeigen. Nach einer Verstopfung steigt der AUM-Spiegel in der zentralen Kammer über die Katheteraugenlöcher und die Katheterspitze, was darauf hinweist, dass das Experiment für alle Endpunktmessungen und den Abbruch bereit ist. Während des Experimentierens können Druckeffekte im Medienkreislauf des In-vitro-Blasenmodells dazu führen, dass die Modelle blockiert erscheinen. Wenn der Verdacht auf eine Verstopfung besteht, überprüfen Sie, ob der AUM-Kreislauf, der Katheter und der Abfallbeutelschlauch gespannt sind, bevor Sie den Test beenden, da mögliche Luftblasen oder Knicke in den Schläuchen "Luftschleusen" verursachen und das Entleeren des Katheters verhindern können.

Während in vitro Blasenmodellexperimenten kann die Planktonprobenahme wertvolle Einblicke in die Wachstumsdynamik innerhalb des Modells sowie in den Verlauf von CAUTI geben. Das Zellwachstum, der pH-Wert und die Biofilmbildung können während des gesamten Experiments überwacht werden, ohne dass Modelle beendet werden müssen (Abbildung 4). Bei Verwendung von Urease-positiven Organismen können die Berechnung der Blockadezeit als Maß für die Geschwindigkeit der Biofilmbildung verwendet und zum Vergleich der Eigenschaften verschiedener Bakterienstämme verwendet werden (Abbildung 4). Der Vergleich eines Wildtyp-Stammes von P. mirabilis und einer LPS-Mutante (mini-tn5-Insertion in waaC) zeigte eine Verlängerung der Zeit bis zur Blockade und damit eine reduzierte Biofilmbildung in der Mutante (Abbildung 4). Urease-negative Organismen blockieren in vitro Blasenmodelle in der Regel nicht, und es wird daher empfohlen, vor dem Experimentieren einen festgelegten Endpunkt zu bestimmen. In einigen Fällen können Urease-negative Organismen zu einer Katheterverstopfung führen. Zum Beispiel können Urease-negative Stämme von Klebsiella pneumoniae ausgedehnte, mukoide Biofilme produzieren, diese brauchen jedoch in der Regel viel länger als Urease-positive Biofilme, um die Drainage zu blockieren, so dass ein festgelegter Endpunkt immer noch empfohlen wird.

Die Messung des pH-Werts im Rahmen von Blasenmodellexperimenten kann auch Aufschluss über die Unterschiede zwischen den Stämmen sowie über den Fortschritt von CAUTI geben. Wenn Urease-negative Organismen verwendet werden, sollte der pH-Wert in der zentralen Kammer des In-vitro-Blasenmodells während des gesamten Experiments weitgehend stabil bleiben, obwohl geringe Schwankungen des pH-Werts zu erwarten sind, da sich die Populationsdynamik im Laufe des Experiments ändert. Die Inokulation von In-vitro-Modellen mit Urease-positiven Organismen führt zu einem signifikanten pH-Anstieg im Laufe der Zeit, wobei der höchste pH-Wert in der Regel zum Zeitpunkt der Verstopfung beobachtet wird, wo pH-Werte von bis zu ~8-9 beobachtet werden können (Abbildung 4B).

Die Zählung der planktonischen KBE/ml ist ein wichtiger Bestandteil der In-vitro-Blasenmodellierung, die es den Anwendern ermöglicht, zu beurteilen, ob die Inokulation erfolgreich war, und den Fortschritt der Experimente zu überwachen. Die Messung von KBE/ml am Ende des Experiments kann Unterschiede in der Blasenbesiedlung zwischen verschiedenen Bakterienstämmen aufzeigen. Beim Vergleich des mini-Tn 5-Mutantenstamms von P. mirabilis mit dem Wildtyp wurde eine signifikante Verringerung der KBE/ml zum Zeitpunkt der Blockade beobachtet (Abbildung 4C). Darüber hinaus kann die Zählung von KBE aus Biofilmen auf der Katheteroberfläche und die Quantifizierung der Biofilmbiomasse Aufschluss über die Fähigkeit verschiedener Krankheitserreger geben, die katheterisierten Harnwege zu besiedeln. Kristallviolett-Färbungen wurden verwendet, um Unterschiede in der Biofilmbildung zwischen einem Wildtyp-P. mirabilis-Stamm HI4320 und in Chlorhexidin passageierten Isolaten zu bestimmen (Abbildung 5). Messungen der optischen Dichte bei 595 nm zeigten, dass Isolate, die in Chlorhexidin passaget wurden, eine Verringerung der Biofilmbildung im Vergleich zu Wildtyp- und Kontrollen, die in Abwesenheit von Chlorhexidin passaget wurden, aufwiesen.

Da das Ziel des In-vitro-Blasenmodells darin besteht, die CAUTI-Nische genau zu replizieren, können Modelle auch verwendet werden, um die Wirkung von antimikrobiellen Therapeutika zu untersuchen, die auf die Behandlung von CAUTI in einem klinisch relevanten Umfeld abzielen. Für Urease-positive Organismen kann der Vergleich der Blockadezeiten von behandelten Modellen mit unbehandelten Modellen einen nützlichen Einblick in die Wirksamkeit der Behandlung geben. Die Behandlung von In-vitro-Blasenmodellen , die mit P. mirabilis mit einer 0,02%igen Chlorhexidin-Blasenspüllösung geimpft wurden, verlängerte die Zeit bis zur Verstopfung signifikant im Vergleich zu Modellen, die unbehandelt oder mit 0,9%iger Kochsalzlösung behandelt wurden (Abbildung 6A). Darüber hinaus kann das in vitro Blasenmodell verwendet werden, um die bakterizide Wirkung von antimikrobiellen Therapeutika zu untersuchen. Die Überwachung der Veränderungen der KBE/ml von planktonischen und Biofilm-assoziierten Zellen nach einer antimikrobiellen Behandlung kann Aufschluss darüber geben, ob die Behandlungen wirksam sind. Die Behandlung von In-vitro-Blasenmodellen , die mit P. mirabilis geimpft wurden, zeigte eine Reduktion der planktonischen KBE/ml um >7 log unmittelbar nach der Behandlung im Vergleich zu unbehandelten und 0,9 % salzig gespülten Modellen, wenn sie gemäß den Anweisungen des Herstellers angewendet wurden (Abbildung 6B).

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der Hauptkomponenten des in vitro Blasenmodells. (A) Das Blasenmodell (geschlossenes Drainagesystem): (1) doppelwandige Glaskammer, die die Blase simuliert (2) Medieneinlass, AU wird über eine Peristaltikpumpe der inneren Kammer des Blasenmodells zugeführt (3) Wassereinlass wird über ein zirkulierendes Wasserbad zur äußeren Kammer (4) Wasserauslass (5) Foley-Katheter, eingeführt in die innere Kammer (6) Verbindungspunkt des Drainagelumens; Anschlusspunkt für Abfallbeutel/Spülbeutel (7) Drainagebeutel zum Auffangen des Urinabflusses. (B) Schematische Darstellung des Aufbaus des in vitro Blasenmodells und der Strömungsrichtung von Medien und Wasser durch das Modell. Künstlicher Urin wird in einem Medienreservoir (1) bei Raumtemperatur gelagert und dem Modell über eine Peristaltikpumpe (2) bei einer konstanten Flussrate von ~ 0,75 mL min-1 für die Dauer des Experiments zugeführt. Das Medium strömt in die zentrale Kammer des doppelwandigen Glasgefäßes, das die Blase (3) darstellt, und fließt über das Augenloch eines Foley-Katheters (4) in einen Drainagebeutel (5) ab, wodurch das steril geschlossene Drainagesystem vervollständigt wird. Das in vitro Blasenmodell wird über ein zirkulierendes Wasserbad (6), das durch die äußere Kammer des doppelwandigen Glasgefäßes strömt, auf einer konstanten Temperatur von 37 °C gehalten. Gestrichelte Linien stellen Silikonschläuche dar und Pfeile stellen die Strömungsrichtung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Durchtrennung von Harnkathetern zur Aufbereitung von Biofilm-assoziierten Zellen. Beispielpunkte auf einem Harnkatheter zur Dissektion für die nachgeschaltete Biofilmquantifizierung. (A) Die Katheter werden zuerst in der 8-cm-Region proximal der Spitze/der Augenlöcher (wo die meiste Biofilmbildung beobachtet wird) latitudinal geschnitten. 1 cm lange Abschnitte werden mit einem Skalpell entfernt, wobei der Bereich, in dem sich der entleerte Katheterballon befindet, aufgrund von Schwierigkeiten bei der Reproduzierbarkeit der Verarbeitung in der Regel vermieden wird (1-3). (B) Nachdem die Katheter zunächst in 1 cm große Stücke geschnitten wurden, wird ein weiterer Längsschnitt entlang des zentralen Lumens vorgenommen, um den vorhandenen Biofilm für eine weitere Biofilmquantifizierung freizulegen, d. h. die KBE/ml-Zählung der Kristallviolettfärbung. Gestrichelte Linien stellen Trennpunkte dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Stadien eines in vitro Blasenmodellversuchs. Bilder der zentralen Kammer des In-vitro-Blasenmodells in verschiedenen Stadien des Experiments. (A) AUM in der zentralen Kammer des In-vitro-Blasenmodells vor der Inokulation. Das Medium in der zentralen Kammer ist vollständig transparent, was auf eine erfolgreiche Sterilisation hinweist, und die Katheterspitze und die Augenlöcher sind oberhalb der Medienlinie sichtbar, was darauf hinweist, dass der Katheter erfolgreich entleert wird. (B) Medien in der zentralen Kammer des In-vitro-Blasenmodells nach Inokulation mit P. mirabilis (4 h nach der Inokulation). Eine erfolgreiche Inokulation wird durch die erhöhte Trübungen des Mediums angezeigt. Die Sichtbarkeit der Katheterspitze und der Augenlöcher deutet darauf hin, dass das verwaltete Vermögen erfolgreich durch den Katheter abfließt und keine Verstopfung aufgetreten ist. (C) Ein Beispiel für ein in vitro blockiertes Blasenmodell. Die Inokulation mit P. mirabilis und die anschließende Biofilmbildung und Mineralisierung führten zu einer Verstopfung der Katheteraugen, was eine Drainage verhinderte und dazu führte, dass der Medienspiegel in der zentralen Kammer über die Katheterspitze anstieg. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Endpunktmessungen für ein in vitro Blasenmodell, die bis zur Blockade durchgeführt wurden. Beispiele für Endpunktmessungen zum Zeitpunkt der Blockade aus einem in vitro Blasenmodell, das mit einem klinischen Stamm von P. mirabilis, RS47 (WT), und einem mutierten Stamm mit abgeschwächter Biofilmbildung, RS47-2 (Mutante), inokuliert wurde. (A) Blockadezeit (h) von WT und mutierten Stämmen von P. mirabilis. (B) pH-Wert von In-vitro-Blasenmodellen zum Zeitpunkt der Verstopfung. (C) KBE/ml von Planktonzellen in einer in vitro Blasenmodellkammer zum Zeitpunkt der Blockade. Alle Daten stellen den Mittelwert von fünf biologischen Replikaten dar. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) an. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01. Diese Abbildung wurde von Clarke et al.46 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Biofilm-assoziierte Zellmessungen aus dem in vitro Blasenmodell. Quantifizierung der Biofilmbildung von P. mirabilis , Vergleich des Wildtyp-Stammes HI4320 mit angepassten Populationen, die mit oder ohne Chlorhexidin (CHD) durchgelassen wurden, mittels Kristallviolett-Färbung und Messung der optischen Dichte (OD) bei 595 nm. WT: P. mirabilis HI4320; 1, 3, 5: Durchgangskontrollen ohne KHK-Exposition; 2, 4, 6: HI4320 in 4 μg/ml CHD. Alle Daten stellen den Mittelwert von fünf biologischen Replikaten dar. Fehlerbalken zeigen SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Messungen von in vitro Blasenmodellen nach antimikrobieller Behandlung. Planktonproben wurden aus einem In-vitro-Blasenmodell entnommen, das mit P. mirabilis geimpft wurde, nachdem es mit einer antimikrobiellen Lösung von 0,02 % Chlorhexidin (100 ml) oder einer 0,9 %igen Kochsalzlösung gespült worden war. (A) Blockadezeit von In-vitro-Blasenmodellen nach der Spülung. (B) Planktonische KBE/ml unmittelbar nach der Bewässerungsbehandlung. Alle Daten stellen den Mittelwert von fünf biologischen Replikaten dar. Fehlerbalken zeigen SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; *p ≤ 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die katheterisierten Harnwege stellen eine komplexe biologische Nische dar, die in einer Laborumgebung nur schwer replizierbar sein kann. Das In-vitro-Blasenmodell wurde zum Zweck der Simulation von CAUTI entwickelt und verwendet Standard-Harnkatheter, um das sterile, geschlossene Drainagesystem zu replizieren, das in der klinischen Praxis verwendet wird. Die katheterisierten Harnwege sind sehr anfällig für Infektionen, was sich daran zeigt, dass Harnkatheter der größte Risikofaktor für die Entwicklung von CAUTIsind 6,55. Dementsprechend ist eine sorgfältige aseptische Technik entscheidend für den Erfolg der Durchführung von In-vitro-Blasenmodellen. Die Trübung des verwalteten Vermögens ist ein klarer Indikator für die Sterilität, da kontaminierte oder abgelaufene Medien mit der Zeit trüb werden, so dass alle Replikate verworfen werden müssen. Auch bei der Inokulation und Probenahme des In-vitro-Blasenmodells sollte eine sorgfältige aseptische Technik angewendet werden, da das Öffnen der zentralen Kammer zur Zugabe des vorbereiteten Inokulums das sterile, geschlossene Drainagesystem unterbricht und das In-vitro-Blasenmodell anfällig für Kontaminationen macht. Um eine Kontamination der zentralen Kammer zu vermeiden, können dreilumige Katheter verwendet werden, um die planktonische Zellpopulation zu beproben (indem das Abfalllumen abgespannt und über das zusätzliche Lumen drainiert wird). Eine gewisse Auswaschung wird zum Zeitpunkt von 4 Stunden erwartet, aber eine Fehlerbehebung kann erforderlich sein, wenn zu diesem Zeitpunkt keine lebensfähigen Planktonzellen gezählt werden. Wenn nach 4 Stunden keine lebensfähigen Zellen gezählt werden, muss die verwendete Inokulumdichte oder AUM-Formulierung möglicherweise optimiert werden, um die bakterielle Besiedlung besser zu unterstützen. Darüber hinaus kann eine Auswaschung des Inokulums auf ein Problem mit dem Medienkreislauf hinweisen. Knicke in den Schläuchen könnten eine ausreichende Drainage verhindern, was zur Bildung toxischer Metaboliten führt, die das Bakterienwachstum behindern können, während jedes restliche Desinfektionsmittel, das zum Spülen der Medienschläuche verwendet wird, eine bakterizide Wirkung haben könnte.

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von AUM, wie sie zuvor von Nzakizwanayo et al. beschrieben wurde, da es zuvor für die Verwendung im In-vitro-Blasenmodell mit prominenten CAUTI-Krankheitserregern, einschließlich Proteus mirabilis und Escherichia coli 43,45,46,48, validiert wurde . Es besteht jedoch Spielraum, die in dem Protokoll verwendete AUM-Formulierung zu modifizieren, um für das Wachstum anderer Krankheitserreger zu selektieren. Zahlreiche verschiedene AUM-Formulierungen wurden veröffentlicht und könnten stattdessen in den Medien verwendet werden 28,56,57,58,59,60. Zusätzlich kann das AUM im Medienreservoir mit Nährstoffen oder Antibiotika ergänzt werden, um für das Wachstum bestimmter Krankheitserreger selektiert zu werden. In der Vergangenheit wurden In-vitro-Blasenmodelle auch mit gepooltem menschlichem Urin versorgt, jedoch können die großen Medienmengen, die für die Durchführung einer In-vitro-Blasenmodellreplikation erforderlich sind, die Entnahme von menschlichen Proben unpraktisch machen53,54. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung des menschlichen Urins zwischen den Patientenproben stark variieren, was sich auf die Reproduzierbarkeit des Experiments auswirkt, da sich Unterschiede in der Konzentration von Hormonen, Salzen und Proteinen sowie dem Hydratationsstatus nachweislich auf das Bakterienwachstum und die Biofilmbildung auswirken 38,39,61,62.

Das obige Protokoll beschreibt die Inokulation des in vitro Blasenmodells mit ~1010 KBE/ml, die CAUTI im Spätstadium replizieren. Die Inokulationsstelle des in vitro Blasenmodells könnte jedoch in zukünftigen Assays modifiziert werden, um die früheren Stadien der CAUTI, d.h. die anfängliche Besiedlung des Harnkatheters und die Ascension in die Blase, besser zu replizieren. Die manuelle Kontaminierung von Foley-Kathetern mit einem bekannten bakteriellen Inokulum vor der Einrichtung von In-vitro-Modellen könnte einen Einblick in die frühen Stadien der CAUTI geben. Tatsächlich wurde die Inokulumdichte in früheren Arbeiten modifiziert, um eine Infektion in einem früheren Stadium zu replizieren; zum Beispiel Nzakizwanayo et al. In vitro inokulierte Blasenmodelle mit einer niedrigeren KBE / ml (ca. 103 KBE/ml) zur Replikation einer Infektion in einem früheren Stadium47. Es ist jedoch erwähnenswert, dass eine Veränderung der Inokulumdichte zu einer längeren Zeit bis zur Verstopfung führen kann und eine zusätzliche Validierung vor dem Experimentieren erfordert.

Während das Protokoll die Inokulation des In-vitro-Modells mit bakteriellen Monokulturen beschreibt, besteht jedoch die Möglichkeit, Modelle mit pilzlichen Krankheitserregern zu impfen. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass bis zu 8% der CAUTIs auf eine Infektion mit Candida spp. zurückzuführen sind, die in der Lage sind, Biofilme zu produzieren, die einer antimykotischen Behandlung oft widerspenstig sind27,63. Darüber hinaus kann das In-vitro-Blasenmodell modifiziert werden, um die Untersuchung von polymikrobiellem CAUTI zu ermöglichen. In der Tat wurde vermutet, dass bis zu 86 % der CAUTIs polymikrobiell sind, und diese Infektionen sind oft mit schwereren Symptomen und einer höheren Sterblichkeitsrate verbunden als Monospezies-Infektionen 27,64,65,69. In-vitro-Modelle können mit mehreren Spezies inokuliert werden, um die Bildung polymikrobieller Biofilme und das Fortschreiten von CAUTI zu untersuchen, aber vor der Inokulation sollte eine sorgfältige Validierung der polymikrobiellen Gemeinschaften und eine Modifikation der Inokulumdichte durchgeführt werden. Frühere Studien haben das in vitro Blasenmodell verwendet, um Unterschiede in der Biofilmbildung bei einzelnen Spezies P. mirabilis CAUTI im Vergleich zu Dualspezies CAUTI mit E. faecalis zu überwachen, wobei das metabolische Zusammenspiel zwischen den Stämmen hervorgehoben wurde, was zu einer verstärkten Biofilmbildung im Vergleich zur Einzelspeziesinfektion führte70.

Ein großer Vorteil der Verwendung des In-vitro-Blasenmodells zur Untersuchung von CAUTI ist die Möglichkeit, die Biofilmbildung auf der Oberfläche eines Standard-Harnkatheters zu beobachten. Die Bildung von Biofilmen in CAUTI wird häufig durch die Bildung von Konditionierungsfilmen auf dem Katheterlumen eingeleitet, die aus organischen Bestandteilen des Urins bestehen, an denen Uropathogene haften können, bevor sie sich vermehren und reife Biofilme bilden 2,18,71,72,73. Standardassays, die zur Untersuchung der Biofilmbildung verwendet werden, verwenden häufig standardmäßige bakterielle Wachstumsmedien anstelle von AUM und basieren oft auf der Einhaltung von Polystyrol-Mikrotiterplatten oder PEGs, d. h. dem Calgary-Gerät; Frühere Arbeiten haben jedoch gezeigt, dass die Nährstoffumgebung, der pH-Wert und der Sauerstoffgehalt des Systems sowie physikalische Eigenschaften wie Fließfähigkeit und unterschiedliche Oberflächenstruktur (Silikon vs. Kunststoffe) die Biofilmbildung beeinflussen können 36,37,74,75,76,77,78. Darüber hinaus kann die Kultivierung von Bakterien mit umfangreicher Ureaseaktivität, wie z. B. P. mirabilis in einem geschlossenen System bei AUM, zum Aufbau toxischer Metaboliten führen, was zum Zelltod führen kann78,79. Dies wird im In-vitro-Blasenmodell gemildert, da das AUM in der zentralen Kammer über den Medienkreislauf ständig durch frische Medien ersetzt wird, was die Untersuchung von CAUTI-Biofilmen unter klinisch relevanteren Bedingungen ermöglicht45. Der tägliche Ablauf des in vitro Blasenmodells und der für die Modelle gewählte Endpunkt hängen weitgehend davon ab, ob die Modelle mit Urease-positiven oder -negativen Organismen inokuliert werden. Theoretisch könnten In-vitro-Modelle unbegrenzt laufen, wenn sie mit einem ausreichenden Volumen an AUM versorgt werden und die Sterilität des Modells erhalten bleibt. Es wird jedoch empfohlen, vor dem Experimentieren einen Endpunkt auszuwählen, unabhängig davon, ob es sich um eine Blockade oder eine beliebige Anzahl von Tagen handelt. Es wird allgemein empfohlen, In-vitro-Modelle, die mit Urease-negativen Organismen geimpft wurden, ≤7 Tage lang laufen zu lassen, um die klinische Umgebung zu simulieren, da dies in der Regel ausreicht, um die Biofilmbildung in den meisten Organismen zu beobachten, während dies im Einklang mit klinischen Interventionen steht, da die gängige Best Practice besagt, dass Katheter nach sichtbarer Infektion ausgetauscht werden sollten 1,2. 3,47,48. Obwohl Urease-positive Organismen wahrscheinlich kristalline Biofilme produzieren, gibt es innerhalb der Urease-positiven Stämme eine große Variation in der Zeit bis zur Blockade des In-vitro-Blasenmodells, wobei einige Stämme von Proteus mirabilis eine Katheterblockade in weniger als 10 Stunden verursachen und andere mehr als 30 Stunden benötigen, umzu blockieren 39,46. Ein Standard-Urease-Test könnte vor In-vitro-Experimenten mit Blasenmodellen verwendet werden, um zu bestimmen, ob Modelle für die Blockade oder einen vordefinierten Endpunkt80 ausgeführt werden sollen.

Die vielleicht wichtigste Einschränkung bei der Verwendung des In-vitro-Blasenmodells zur Untersuchung der Biofilmbildung besteht darin, dass Biofilmmessungen eine Endpunktmessung sind, da sie die Entfernung und Dissektion des Harnkatheters erforderlich machen. Umgekehrt können zu jedem Zeitpunkt des Experiments planktonische Proben aus dem in vitro Blasenmodell entnommen werden. Darüber hinaus können nach der Entnahme von Biofilmproben aus den In-vitro-Blasenmodellen zahlreiche zusätzliche nachgelagerte Techniken eingesetzt werden, um die Biofilmproduktion besser zu quantifizieren. In früheren Studien wurde die Flammenphotometrie verwendet, um die Menge an Kalzium und Magnesium in kristallinen Biofilmen zu quantifizieren, und komplexere Färbungen können verwendet werden, um Komponenten der EPS-Matrix von Urease-negativen Biofilmen genau zu identifizieren 45,73,81,82,83,84.

Diese Arbeit beschreibt auch die Anwendung des in vitro Blasenmodells zur Untersuchung der Wirkung von Therapeutika zur Behandlung von CAUTI. Das in vitro Blasenmodell simuliert wichtige Aspekte der CAUTI-Nische, wie z.B. die Verwendung von AUM sowie die klinisch relevante Biofilmbildung und die erhöhte organische Belastung, die bei CAUTI beobachtet wird. Therapeutika wie Antibiotika können direkt in den AUM-Tank gegeben werden, um die klinisch relevante Bioverfügbarkeit von Arzneimitteln zu simulieren, und in früheren Studien wurden umfunktionierte Medikamente wie Thioridazin und Fluoxetin verwendet, um eine Antibiofilmwirkung zu demonstrieren81. Darüber hinaus werden häufig Assays mit minimaler Hemmkonzentration und bakterielle Suspensionstests verwendet, um auf die antimikrobielle Aktivität von Bioziden zu schließen, obwohl es nur wenige Hinweise darauf gibt, dass Assays mit der realen Biozidempfindlichkeit korrelieren 41,85,86,87,88. Das In-vitro-Blasenmodell ist vorteilhaft für die Prüfung von Biozidprodukten zur Behandlung oder Vorbeugung von CAUTI, da das Vorhandensein des Harnkatheters und die repräsentativere Simulation der CAUTI-Nische bedeuten, dass Produkte wie antimikrobielle Gleitgele und Spüllösungen gemäß den Anweisungen des Herstellers getestet werden können. Frühere Studien haben auch das in vitro Blasenmodell verwendet, um die Wirksamkeit der Phagentherapie zu bestimmen, und gezeigt, dass die Phagenbehandlung die Zeit von P. mirabilis zur Blockierung des in vitro Blasenmodells um über 100 h verlängern konnte47. Die Verwendung eines Foley-Katheters in Standardgröße im In-vitro-Blasenmodell bedeutet auch, dass neuartige, beschichtete Katheter auf antimikrobielle Aktivität getestet werden können. Frühere Arbeiten von Slate et al. zeigte, dass Katheter, die mit einer theranostischen Ciprofloxacin-Beschichtung beschichtet sind, die Zeit bis zur Verstopfung von P. mirabilis in einem in vitro Blasenmodell um ~60 h verlängern können48. Dies unterstreicht die potenzielle Anwendung des In-vitro-Blasenmodells bei der Erforschung neuartiger Therapeutika zur Behandlung von CAUTI, die eine genauere Bewertung von Antibiotika in einer biologisch relevanten simulierten CAUTI-Nische ermöglichen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Dr. Jonathan Nzakizwanayo und Dr. Anthony J. Slate für ihre gemeinsame Expertise bei der Entwicklung dieses Protokolls. Die Arbeit an der University of Bath wurde vom Medical Research Council GW4 Biomed DTP als Stipendium für V.B. (MR/N0137941/1) finanziert. B. V. J. wird auch durch Mittel des Dunhill Medical Trust (RPGF1906\171) unterstützt. Die Forschung von O.E.C. wurde von Kidney Research Northwest (RCN: 1144798) finanziert. Abbildung 1 wird mit Biorender.com erstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
313 Schnelllader-PumpenkopfverlängerungWatson-Marlow313Schlauchpumpe - zusätzliche Pumpenkopfverlängerung 
323S/D manuelle Steuerung Pumpe mit variabler DrehzahlWatson-Marlow323S/DSchlauchpumpe
3L Bettsäcke, steril mit Hebelhähnen Großer Bär Gesundheitswesen GDW173
platingehärteter Silikonschlauch mit 3 mm InnendurchmesserFisher10111801Kleine AUM-Schläuche (verbinden Sie die Pumpenschläuche mit den Modellen)
platingehärtete Silikonschläuche mit 5 mm InnendurchmesserFisher10539201mittlere AUM-Schläuche (verbinden Sie die Pumpenschläuche mit dem AUM-Reservoir)
Ammoniumchlorid (NH4Cl)Fisher11473713
wasserfreies Natriumsulfat (Na2SO4)Fisher11498717
Azlon Konischer Verbinder Fisher10712807Wird verwendet, um verschiedene Längen von Schläuchen im AUM-Kreislauf zu verbinden
Bettsackaufhänger Großer Bär Gesundheitswesen 10705P
Bochem Quetschhahn-Schlauchklemmen, 25 mm DurchmesserFisher11805101
Calciumchlorid (CaCl2)Fisher10021681
Zitronensäure-Monohydrat MerckC1909-500GWird verwendet, um kristallinen Biofilm von Modellen nach dem Experimentieren zu entfernen 
Fisherbrand  Pipetten aus Glas mit Graduierung Klasse B Typ 1Fisher11992168Wird verwendet, um In-vitro-Blasenmodelle über gebohrte Spundgelatine mit AUM zu versorgen
VWR24360.233
Graphpad Prism 10GraphPadV10.0Analysesoftware für die grafische Darstellung von In-vitro-Blasenmodellergebnissen und statistische Analysen.
Hanna HI 2211-02 pH-TischmessgerätPhillip Harris PP00057414
In vitro Blase Modell --Maßgeschneiderte Ausrüstung, wie zuvor von Nzakizwanayo et al. (2019) beschrieben.
Instillagel 6 mL Gleitgelmydoctorshop.co.uk40-006Gleitgele, die in Abschnitt 7.1. verwendet werden; andere Anbieter sind verfügbar.
Kartell Plastilab Ungleichmäßiger konischer VerbinderFisher 11914289Zum Verbinden von Schläuchen mit unterschiedlichen Durchmessern
MacConkey-Agar ohne Salz (dehydriert)Fisher10472643Zur Zählung einzelner Kolonien von schwärmenden Bakterien, z.B. Proteus mirabilis
Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2.6H2O)Fisher10386743
Monokaliumphosphat (KH2PO4)Fisher10573181
Nalgene Y-förmiger SteckverbinderFisher10186070Wird verwendet, um mehrere AUM-Stromkreise von einem AUM-Reservoir aus zu betreiben (1-4 Modelle pro Tank)
Kaliumchlorid (KCl)Fisher10375810
Pyrex Aspiratorflasche mit Schliffglas-Seitensockel, Fassungsvermögen: 5000 mLFisher11347884AUM Reservoir
Gummistopfen mit Bohrung, Durchmesser außen: 37mm, rot, Durchmesser: 37mmFisher11517612Wird im AUM Reservoir und zur Versorgung von In-vitro-Modellen mit AUM
verwendetGröße 14 Französischer Foley-Katheter aus 100 % Silikon mit steriler Spritze mit Wasser zum Aufblasen;Großer Bär Gesundheitswesen 4833-0514
Natriumchlorid (NaCl)Fisher10735921
Natriumoxalat (Na2C2O4)Fisher10442211
Teknon Biocleanse Konzentrat Biozidreiniger 5L Fisher12447580Wird zur Sterilisation von Modellen nach Experimenten
Trinatriumcitrat (Na3C6H5O7)Fisher11434993
Trypton-SojabrüheFisher10198002
Harnstoff (CH4N2O)Fisher10404185
Uro-Tainer M NaCl 0,9%B.BraunFB99833Kochblasenspülbeutel, verwendet in Abschnitt 7.2. 
Watson-Marlow Pumpsil 1,6 mm Innendurchmesser platingehärteter SilikonschlauchFisher12406280Dicker AUM-Kreislaufschlauch (für den Einsatz in perstaltischen Pumpen)
, verwendet

Referenzen

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