Methodenartikel

Identifizierung von Mikroglia und peripher infiltrierenden Makrophagen im verletzten Rückenmark mittels Durchflusszytometrie

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DOI:

10.3791/67967

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24. Juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Laboratory Medicine, Bengbu Medical University, 3Anhui Province Key Laboratory of Immunology in Chronic Diseases, Bengbu Medical University, 4The Second Affiliated Hospital of South China University, 5Anhui Province Key Laboratory of Basic and Translational Research of Inflammation-related Diseases, Bengbu Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Identifizierung von Mikroglia (MG) und peripheren infiltrierenden Makrophagen (Mø) im verletzten Rückenmark ist schwierig. In diesem Protokoll wurde die Durchflusszytometrie (FCM) verwendet, um M1-like MG, M2-like MG, M1-like Mø bzw. M2-like Mø zu identifizieren. Diese Technologie kann auch auf andere Erkrankungen des Zentralnervensystems angewendet werden, um die Rolle von MG und Mø zu verstehen.

Zusammenfassung

In einem gesunden Rückenmark sind periphere infiltrierende Makrophagen fast nicht nachweisbar, und Mikroglia (MG) beteiligen sich an der Aufrechterhaltung der Stabilität der Mikroumgebung des Rückenmarks durch Phagozytose, Beseitigung von Zelltrümmern und Produktion neurotropher Faktoren. Nach einer Rückenmarksverletzung (SCI) werden MG aktiviert und periphere Immunzellen infiltrieren in das verletzte Rückenmark. Unter diesen Immunzellen spielen aktivierte MG und periphere infiltrierende Makrophagen (Mø) eine entscheidende Rolle im pathologischen Prozess der Rückenmarksverletzung. Diese Zellen können in proinflammatorische (M1-ähnliche) und antiinflammatorische (M2-ähnliche) Phänotypen unterschieden werden; Ihre Unterscheidung ist jedoch aufgrund ihrer Ähnlichkeit in der Morphologie und vieler zellulärer Marker eine Herausforderung. Die Durchflusszytometrie (FCM), eine weit verbreitete Technik im biomedizinischen Bereich, kann gleichzeitig mehrere zelluläre Parameter wie Zellgröße, Partikelgröße, Zelloberfläche und intrazelluläre Marker in einem einzigen Experiment nachweisen. In jahrelanger Forschung wurde versucht, MG und Mø im Rückenmark zu identifizieren und kontinuierlich optimiert, um schließlich eine stabile Nachweismethode zu entwickeln. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von M1/M2-ähnlichem MG und M1/M2-ähnlichem Mø nach Querschnittlähmung, indem die Expressionsprofile von CD45, CD11b, CD68, CCR7 und anderen Markern detektiert werden. In diesem Protokoll können CD11b+CD45−/niedrigeCD68+CCR7+-Zellen, CD11b+CD45−/niedrigeCD68+CCR7-, CD11b+CD45hoheCD68+CCR7+- und CD11b+CD45hoheCD68+CCR7-Zellen als M1-ähnliche MG, M2-ähnliche MG, M1-ähnliche Mø bzw. M2-ähnliche Mø identifiziert werden.

Einleitung

Eine Rückenmarksverletzung (SCI) ist eine Folge einer Rückenmarksschädigung, die aus verschiedenen Gründen verursacht wird. Querschnittlähmung hat eine hohe Behinderungsrate, und derzeit gibt es keine wirksamen Behandlungsmöglichkeiten, was sie zu einem der schwerwiegendsten Probleme der öffentlichen Gesundheit in der Welt macht 1,2. Der pathophysiologische Prozess der Rückenmarksverletzung ist komplex und in zwei Stadien unterteilt. Zunächst führt ein mechanisches Trauma durch die Verletzung sofort zu einer akuten zellulären Dysfunktion und zum Zelltod. Dann führt eine sekundäre Schädigung über Tage, Wochen oder sogar Monate zu weiteren zellulären Funktionsstörungen und Zelltod. Innerhalb der sekundären Verletzungsmechanismen hat sich gezeigt, dass die Entzündung eine Schlüsseldeterminante für die Schwere der sekundären Schädigung ist, die letztendlich den Zelltod und die Zellfunktionalität bestimmt3. Die Merkmale von Entzündungsreaktionen sind die Infiltration und Aktivierung von Entzündungszellen im verletzten Rückenmark, was zu einer Zunahme von Entzündungszellen und Entzündungsfaktoren führt, eine entzündliche Mikroumgebung schafft und schließlich eine Dysfunktion des Rückenmarks verursacht4.

Mikroglia im zentralen Nervensystem (ZNS) und peripher infiltrierende Makrophagen spielen eine entscheidende Rolle bei der Entzündungsreaktion nach einer Rückenmarksverletzung (SCI)5,6. Als residente Makrophagen des ZNS machen Mikroglia 5%-10% der ZNS-Zellen aus und sind essentiell für die SCI-Genesung 7,8. Mikroglia können Zelltrümmer nach einer Rückenmarksverletzung verschlingen und entfernen, was die Bildung von Heilungsnarben vermittelt 9,10. Eine übermäßige Aktivierung von Mikroglia kann jedoch zu einer anhaltenden Entzündungsreaktion führen und die Bildung von Glianarben fördern, die die axonale Regeneration behindern11. Nach der Rückenmarksverletzung weisen aktivierte Mikroglia hauptsächlich zwei Phänotypen auf: M1-like und M2-like12,13. Der M1-ähnliche Phänotyp ist pro-inflammatorisch und fördert die Synthese von Entzündungsfaktoren, die zur Zellapoptose und sekundären Schädigung beitragen. M1-ähnliche Mikroglia haben auch neurotoxische Wirkungen, die Verletzungen und neuronale Apoptose verschlimmern14,15. Im Gegensatz dazu hat der M2-ähnliche Phänotyp entzündungshemmende Eigenschaften und fördert die Angiogenese, die Remyelinisierung, das axonale Wachstum und die Gewebereparatur16,17. M2-ähnliche Mikroglia spielen eine entscheidende Rolle bei der Modulation von Entzündungs- und Reparaturprozessen.

Periphere Makrophagen infiltrieren nach einer Querschnittlähmung durch geschädigte Blut-Rückenmarks-Barrieren und Gefäße in die Läsionsstelle17,18 und regulieren die Entzündungsreaktion, Phagozytose, Narbenbildung und Regeneration des Nervengewebesweiter 19,20. Peripher infiltrierende Makrophagen können die Entzündungsreaktion nach einer Rückenmarksverletzung reduzieren, Gewebetrümmerphagozytieren 21, die neuronale Regeneration und den Matrixumbau fördern. Eine anhaltende Entzündungsreaktion, die durch peripher infiltrierende Makrophagen vermittelt wird, kann jedoch zu einer sekundären Schädigung führen, die sich nachteilig auf die langfristige Genesung auswirkt22,23. M1-ähnliche periphere infiltrierende Makrophagen haben starke phagozytische und antigenpräsentierende Fähigkeiten, die in der Lage sind, nekrotische Zellen zu beseitigen24. Ihre übermäßige Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen, reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und reaktiven Stickstoffspezies (RNS) kann jedoch Neuronen und Gliazellen schädigen, was zu einer schwereren neuronalen Apoptose führt25. Umgekehrt können M2-ähnliche peripher infiltrierende Makrophagen die neuronale Apoptose hemmen und die Entzündungsreaktion nach einer Rückenmarksverletzung abschwächen, wodurch die Reparatur von Nervengewebe gefördertwird 26.

Aktivierte Mikroglia und peripher infiltrierende Makrophagen nach Querschnittlähmung weisen morphologische und molekulare Ähnlichkeiten in der Expression auf, die eine Unterscheidung erschweren. Die Durchflusszytometrie (FCM), eine weit verbreitete Technik, wird eingesetzt, um die Expression von Zelloberflächen- und intrazellulären Molekülen zu analysieren, verschiedene Zellsubpopulationen zu identifizieren und gleichzeitig mehrere Parameter einzelner Zellen zu bewerten. Es wurde ein stabiler FCM-Assay verfolgt, um aktivierte Mikroglia von peripher infiltrierenden Makrophagen zu unterscheiden, was die Untersuchung ihrer Rolle bei der Rückenmarksverletzung erleichtert. In diesem Artikel wird die stabile Nachweismethode beschrieben, die entwickelt wurde.

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Protokoll

Diese Studie wurde von der Animal Care Ethics Commission der Bengbu Medical University genehmigt (Nr. 2020-050). Die Tierhaltung entsprach den Vorschriften des chinesischen Ministeriums für Wissenschaft und Technologie. Insgesamt wurden 18 acht Wochen alte weibliche C57/BL6-Mäuse kommerziell gewonnen und verwendet. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Versuchs- und Tierpräparation

  1. Halten Sie die Mäuse vor der Operation in beatmeten Käfigen. Halten Sie einen 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus ein und bieten Sie freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Halten Sie die Umgebungstemperatur im Raum bei 20-22 °C und die Luftfeuchtigkeit bei 30%-70% für eine Woche der Akklimatisierung.
  2. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente für die Mäuse durch Autoklavieren und trocknen Sie sie vor dem Gebrauch. Unterziehen Sie die Instrumente und den Operationssaal eine halbe Stunde vor der Operation einer UV-Sterilisation. Gruppieren und markieren Sie die Mäuse nach dem Prinzip der Zufallsgruppierung. Notieren und registrieren Sie ihre Gewichte für die spätere Verwendung.
  3. Betäuben Sie die Mäuse mit einem Cocktail aus Ketamin (80 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion (gemäß institutionell anerkannten Protokollen). Rasieren Sie die Haare auf dem Rücken von den Wirbeln T8 bis T10.

2. Vorbereitung des SCI-Mausmodells

  1. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit einem Jodtupfer vom Kopf bis zum Schwanz, zentriert auf T9, gefolgt von der Desinfektion mit einem 75%igen Alkoholtupfer. Machen Sie einen 1 cm großen Schnitt in der Haut, der bei T9 zentriert ist. Präpariere die Faszien, Muskeln und Bänder, die T9 umgeben, 1 cm lang.
    1. Löse den Muskel, der an den T9-Dornfortsatz angrenzt, um T9 freizulegen. Verwenden Sie eine Augenschere, um die Lamina zwischen T9 und T10 freizulegen und zu entfernen, wobei das Rückenmark bei T9 mit einem Durchmesser von etwa 2 mm vollständig freigelegt wird.
      HINWEIS: Achten Sie beim Anheben der T9-Lamina darauf, dass die Schere das Rückenmark nicht berührt.
  2. Stabilisieren Sie die Wirbelsäule, indem Sie die Dornfortsätze von T7 und T11 einspannen. Erstellen Sie ein moderates SCI-Modell mit einem Stab mit einem Durchmesser von 1,3 mm und einer Kraft von 0,5 N. Beobachten Sie, wie sich der Schwanz nach oben krümmt und die hintere Gliedmaße nach einer Rückenmarksverletzung zuckt. Bei scheinoperierten Mäusen ist nur eine Laminektomie ohne Kontusion durchzuführen.
  3. Erreichen Sie eine Blutstillung an der Inzisionsstelle. Führen Sie einen mehrschichtigen Verschluss mit sterilen chirurgischen 5-0-Nähten durch. Für eine muskuläre Annäherung fassen Sie die tiefe Faszie mit einer Adson-Pinzette mit Zähnen und vernähen Sie die Panniculus carnosus-Schicht mit 5-0 resorbierbarem Monofil, indem Sie die Nadel senkrecht 2 mm vom Wundrand entfernt einführen, um symmetrische Bisse in voller Dicke (2-3 mm Tiefe) im Abstand von 3 mm zu erzielen.
    1. Binden Sie quadratische Knoten mit kontrollierter Spannung, um die Faszienebenen anatomisch auszurichten. Positionieren Sie die Hautränder mit einer Mikro-Irisschere neu, um eine epidermale Eversion von 1 mm zu erzeugen. Richten Sie die Dermis präzise auf die Pinzette des Uhrmachers aus und sichern Sie sie mit einfachen unterbrochenen 5-0-Nähten im Abstand von 2 mm, um eine gleichmäßige Koaptation ohne subkutanen Totraum zu gewährleisten.
    2. Desinfizieren Sie die Nahtlinie mit Jodtupfern mit unidirektionalen Strichen von der Wundmitte nach außen. Tupfen Sie das restliche Blut vorsichtig mit mit Kochsalzlösung angefeuchteter Gaze ab und tragen Sie eine dünne Schicht dreifacher antibiotischer Salbe entlang des Schnitts auf.
  4. Setzen Sie die Mäuse nach der Operation in einen Käfig, der bei geeigneter Temperatur und Luftfeuchtigkeit gehalten wird. Führen Sie zweimal täglich (morgens und abends) eine Urinierungspflege durch, um die Mäuse zu unterstützen, bis sie wieder selbstständig urinieren können.
  5. Injizieren Sie jeder Maus täglich subkutan 0,5 ml Kochsalzlösung und Antibiotika (Gentamicin, 2000-2500 U/Maus), um eine Infektion zu verhindern.

3. Isolierung von Rückenmarksgewebe aus C57/BL6-Mäusen

  1. Betäuben Sie die Mäuse vor der Operation (Schritt 1.3). Sobald sie vollständig betäubt sind, fixieren Sie sie in Rückenlage auf dem Operationstisch. Scheinoperierte Mäuse werden ähnlich behandelt.
  2. Machen Sie einen Querschnitt in der Brusthöhle, unterhalb des Brustbeins und entlang des Zwerchfells, um das Herz freizulegen. Stabilisieren Sie das Herz sanft mit Hämostaten und führen Sie die Perfusionskanüle in die apikale linke Herzkammer ein und schieben Sie sie in die Aorta vor.
    1. Schneiden Sie sofort die rechte Ohrmuschel ab und beginnen Sie mit der Perfusion mit einer Rate von 250 ml/h mit 10 ml PBS-Lösung. Die Perfusion gilt als erfolgreich, wenn die aus der rechten Ohrmuschel abfließende Flüssigkeit von blutig rot zu klar und farblos wird oder wenn die Leber von rot zu weiß übergeht27.
  3. Durchschneiden Sie die Wirbelsäule am hinteren Ende der Maus, um das Foramen der Wirbelsäule freizulegen. Präparieren Sie mit einer Augenschere vorsichtig das Rückenmarksgewebe 0,5 cm oberhalb und unterhalb der Verletzungsstelle. Legen Sie das isolierte Rückenmarksgewebe in eine sterile, enzymfreie Kulturschale mit 5 % Färbepuffer und lagern Sie es auf Eis bei 4 °C für die spätere Verwendung in der Dichtegradientenzentrifugation mit kolloidalem Siliziumdioxid-beschichtetem Polyvinylpyrrolidon (PVP).
    HINWEIS: Wenn Sie das Rückenmark in der Nähe des Verletzungszentrums präparieren, stellen Sie sicher, dass das Gewebe unversehrt bleibt, um ein Reißen oder Beschädigen des Rückenmarks an der Verletzungsstelle zu vermeiden. Der 5%ige Färbepuffer (SB) besteht aus 2,5 ml fötalem Rinderserum (FBS) und 47,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).

4. Dichtegradientenzentrifugation mit kolloidalem Siliciumdioxid, das mit Polyvinylpyrrolidon beschichtet ist

  1. Legen Sie das Rückenmarksgewebe in ein 300-mesh-Zellsieb und zerkleinern Sie es mit dem Kolben einer 5 mL/10 mL Einwegspritze. Nach dem Mahlen filtrieren Sie die Zellsuspension durch das 300-Mesh-Sieb in ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen für die Zentrifugation (5 min, 110 x g, Raumtemperatur).
    1. Geben Sie nach der Zentrifugation 1 ml Trypsin-Zellaufschlusslösung in das Zellsediment und inkubieren Sie es in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C für 15 Minuten. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie 1,5 ml fötales Rinderserum hinzufügen und dann erneut zentrifugieren (110 x g, 5 min, Raumtemperatur). Resuspendieren Sie das Zellsediment in 1 ml 5%igem Färbepuffer (SB).
  2. Geben Sie nacheinander 4 ml 70 % mit kolloidaler Kieselsäure beschichtete Polyvinylpyrrolidonlösung, 4 ml 30 % mit kolloidaler Kieselsäure beschichtete Polyvinylpyrrolidonlösung und 1 ml der 5 % igen SB-resuspendierten Zelllösung in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Die Mischung zentrifugieren (300 x g, 30 min, 20 °C).
    HINWEIS: Bereiten Sie das mit kolloidaler Kieselsäure beschichtete Polyvinylpyrrolidon-Trennreagenz als 9:1-Mischung aus kolloidalem kieselsäurebeschichtetem Polyvinylpyrrolidon und 10× PBS vor. Verdünnen Sie die 70%ige mit kolloidaler Kieselsäure beschichtete Polyvinylpyrrolidonlösung mit 1× PBS und die 30%ige mit kolloidaler Kieselsäure beschichtete Polyvinylpyrrolidonlösung mit DMEM oder RPMI 1640 Zellkulturmedium.
  3. Nach der Zentrifugation bilden die Zellen Schichten im Zentrifugenröhrchen (Abbildung 1). Entsorgen Sie die Zelltrümmer und Thrombozytenschichten oberhalb der 8-ml-Kalibrierungsmarke. Saugen Sie die restliche Lösung vorsichtig ab (bis zur 1,5-ml-Kalibriermarkierung) und verwerfen Sie das Sediment unterhalb der Markierung.
    1. Übertragen Sie die restliche Lösung in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 1× PBS hinzu, um das Gesamtvolumen für die Zentrifugation auf 15 mL zu bringen (400 x g, 5 min, 4 °C).
  4. Den Überstand verwerfen und das Zellsediment in 5 % SB resuspendieren. Die Lösung zum Waschen und Zentrifugieren (110 x g, 5 min, 4 °C) in ein Durchflusszytometrie-Röhrchen (FCM) überführen. Resuspendieren Sie das Zellsediment im FCM-Röhrchen mit 200 μl 5 % SB.

5. FCM-Färbung

  1. 200 μl der Zellsuspension gleichmäßig auf zwei neue Durchflusszytometrie-Röhrchen aufteilen. Beschriften Sie ein Röhrchen mit "Isotypkontrolle" und das andere mit "Spezifische Färbung".
  2. Verfahren zum Färben
    1. Geben Sie in das "Isotyp-Kontroll"-Röhrchen die folgenden Isotyp-angepassten Antikörper: PE-markiertes Ratten-IgG2b-Kappa, FITC-markiertes Ratten-IgG2b-Kappa, APC-markiertes Ratten-IgG2b-Kappa und APC-eFluor 780-markiertes Ratten-IgG2b-Kappa.
    2. In das Röhrchen "Spezifische Färbung" geben Sie die folgende Platte fluoreszenzmarkierter Antikörper gemäß den empfohlenen Verdünnungsverhältnissen: Ratten-Anti-Maus-CD45 APC, Ratte Anti-Maus CD11b PE, Ratte Anti-Maus CD68 FITC und Ratte Anti-Maus CCR7 APC-eFluor 780.
    3. Inkubieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt für 30 min.
  3. Waschen Sie die gefärbten Zellen zweimal, indem Sie jedes Mal 1 ml SB hinzufügen. Die Zellen zentrifugieren (110 x g, 5 min, 4 °C). Fixieren Sie abschließend die Zellen mit 2 % Paraformaldehyd (PFA) für die durchflusszytometrische Analyse.

6. FCM-Erkennung

HINWEIS: Einzelheiten zum Verfahren finden Sie in den vorangegangenen Berichten27,28.

  1. Analysieren Sie Proben mit dem Durchflusszytometer mit der kompatiblen Software (siehe Materialtabelle).
    1. Analysieren Sie zunächst das Isotyp-Kontrollrohr, um das primäre Diagramm zu erstellen (FSC auf der x-Achse und SSC auf der y-Achse). Passen Sie die Spannungen für Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) an, um die Zellpopulation in einem geeigneten Bereich zu positionieren.
    2. Richten Sie zwei zusätzliche Diagramme ein: Eines mit IgG-APC auf der x-Achse und IgG-PE auf der y-Achse. Ein weiteres mit IgG-FITC auf der x-Achse und IgG APC-Cy7 (Hinweis: APC-eFluor 780 wurde in diesem Kanal detektiert) auf der y-Achse.
    3. Passen Sie die Fluoreszenzkanalspannungen für IgG-APC, IgG-PE, IgG-FITC und IgG APC-Cy7 an, um die Zellpopulation innerhalb des 103 des doppelt negativen Bereichs zu positionieren.
  2. Nachdem die FSC- und SSC-Spannungen sowie die Fluoreszenzkanalspannungen mit der Isotyp-Steuerröhre angepasst und optimiert wurden, sollten diese Einstellungen unverändert bleiben. Fahren Sie mit der Analyse der mit Antikörpern gefärbten Versuchsröhrchen fort.
    1. Erstellen Sie ein primäres Diagramm mit CD11b-PE auf der x-Achse und SSC auf der y-Achse. Richten Sie ein weiteres Diagramm mit CD68-FITC auf der x-Achse und CCR7 APC-Cy7 auf der y-Achse ein. Legen Sie unter Verwendung des Isotyp-Kontrollröhrchens als Referenz die Ausgangswerte fest und grenzen Sie die "Region" für CD11b+ -Zellen ab. Gate Sie im primären Diagramm die CD11b+ -Zellregion und definieren Sie sie als "P1-Gate ".
    2. Wählen Sie als Nächstes das Diagramm mit CD68-FITC auf der x-Achse und CCR7 APC-Cy7 auf der y-Achse aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, wählen Sie "Population anzeigen" aus, und wählen Sie dann "P1" aus. Dies zeigt die Zellpopulationen innerhalb der CD11b+ -Gruppe an, die entweder CD68+/CCR7+ oder CD68+/CCR7- exprimieren. Erfassen Sie 50.000 Ereignisse pro Stichprobe.
    3. Passen Sie nach der Erfassung der Daten die Fluoreszenzkompensation nach Bedarf an. Analysieren und bestimmen Sie den prozentualen Anteil von CD11b+ , CD68+ , CCR7+ (M1-ähnlichen) Zellen und CD11b+ , CD68+ , CCR7- (M2-ähnlichen) Zellen. Der durchschnittliche Prozentsatz der positiv markierten Zellen wird als Prozentsatz der gesamten Stichprobenpopulation ausgedrückt.
  3. Fahren Sie mit der Analyse der Versuchsröhren unter Verwendung der gut eingestellten Spannungsparameter aus der Isotyp-Steuerröhre fort.
    1. Erstellen Sie zunächst einen Graphen mit CD45-APC und CD11b-PE, gefolgt von zwei Graphen mit CD68-FITC und CCR7 APC-Cy7. Erfassen Sie 50.000 Ereignisse pro Probe und passen Sie nach der Erfassung der Daten die Fluoreszenzkompensation an.
    2. Analysieren Sie in den CD45/CD11b-Pseudofarbdiagrammen die "Regionen" für CD11b+, CD45−/low- und CD11b+, CD45-High-Zellen für jede Probe. Analysieren Sie dann die CD68+ CCR7+ Zellen und CD68+ CCR7- Zellen in diesen beiden Regionen.
    3. Integrieren Sie die Analysen, um die Prozentsätze der folgenden Zellpopulationen zu bestimmen: CD11b+ CD45−/niedrig CD68+ CCR7+ (M1-ähnliche Mikroglia), CD11b+ CD45−/niedrig CD68+ CCR7- (M2-ähnliche Mikroglia), CD11b+ CD45hoch CD68+ CCR7+ (M1-ähnliche Makrophagen), CD11b+ CD45high CD68+ CCR7- (M2-ähnliche Makrophagen).
      HINWEIS: Der durchschnittliche Prozentsatz der positiv markierten Zellen wird als Prozentsatz der gesamten Stichprobenpopulation ausgedrückt.

7. FCM-Datenanalyse

  1. Starten Sie die Durchflusszytometrie-Analysesoftware und ziehen Sie die Durchflusszytometrie-Experimentdateien in den Abschnitt "Alle Proben" auf der Benutzeroberfläche. Die Durchflusszytometrie-Experimente werden unter "Alle Proben" auf der Benutzeroberfläche angezeigt. Beginnen Sie mit der Analyse des Isotyp-Kontrollröhrchens, um den Schwellenwert zwischen positiven und negativen Fluoreszenzsignalen zu bestimmen.
    1. Doppelklicken Sie auf die Probe des Isotyp-Kontrollröhrchens , um ein grafisches Fenster mit einem zweidimensionalen Punktdiagramm aufzurufen. Wählen Sie FSC-A für die x-Achse und SSC-A für die y-Achse. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Rechteckiges Tor" am oberen Rand der Benutzeroberfläche und wählen Sie mit dem Rechteck den Bereich aus, nachdem Sie Zelltrümmer entfernt haben (Abbildung 2A).
    2. Doppelklicken Sie auf den markierten Bereich, um ein neues grafisches Fenster zu erzeugen. Wählen Sie FITC für die x-Achse und Histogramm für die y-Achse. Klicken Sie auf die Schaltfläche Region Gate am oberen Rand der Benutzeroberfläche, um ein Gate im Einzelparameter-Histogramm festzulegen, um den Schwellenwert zwischen negativen und positiven Fluoreszenzsignalen zu bestimmen. Das Region-Gate definiert den positiven Bereich (Abbildung 2A).
      HINWEIS: Der Bereich mit kleineren FSC-Werten stellt zelluläre Trümmer dar.
    3. Bestimmen Sie für jeden der vier im Experiment verwendeten fluoreszierenden Antikörper die Schwelle zwischen negativen und positiven Signalen mit Hilfe der Isotyp-Kontrollröhrchenprobe. Ändern Sie auf der x-Achse nacheinander die Fluorochrome in PE, APC und APC-Cy7, während Sie die y-Achse als Histogramm beibehalten.
    4. Verwenden Sie das Region-Gate-Werkzeug im Einzelparameter-Histogramm, um Gates festzulegen und den Schwellenwert zwischen negativen und positiven Signalen für jeden der vier fluoreszierenden Antikörper zu bestimmen (Abbildung 2A).
  2. So analysieren Sie die Anteile von M1-ähnlichen und M2-ähnlichen Zellen:
    1. Mit einem Doppelklick auf die Probe des Versuchsröhrchens wird ein zweidimensionales Punktdiagramm angezeigt. Wählen Sie FSC-A für die x-Achse und SSC-A für die y-Achse. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Rechteckiges Tor" am oberen Rand der Benutzeroberfläche und wählen Sie mit dem Rechteck den Bereich aus, nachdem Sie die Zelltrümmer entfernt haben (Abbildung 2B).
    2. Doppelklicken Sie auf den markierten Bereich, um ein neues grafisches Fenster zu erzeugen. Wählen Sie CD11b-PE für die x-Achse und SSC-A für die y-Achse. Klicken Sie auf die Schaltfläche Rechteckiges Gate am oberen Rand der Benutzeroberfläche und definieren Sie das CD11b+ -Gate mit dem vom Isotypregler eingestellten positiven/negativen PE-Schwellenwert als Referenz (Abbildung 2B).
    3. Doppelklicken Sie auf den Gate-Bereich CD11b+ , um ein neues grafisches Fenster zu erzeugen. Wählen Sie CD68-FITC für die x-Achse und CCR7 APC-Cy7 für die y-Achse. Klicken Sie auf die Schaltfläche Kreuztor . Unter Verwendung der von der Isotypkontrolle festgelegten positiven/negativen Schwellenwerte für FITC und APC-Cy7 verwenden Sie das Kreuzgatter, um die Zellen zu kategorisieren, indem Sie die Anteile von CD11b+ CD68+ CCR7+ (M1-ähnlichen) Zellen und CD11b+ CD68+ CCR7- (M2-ähnlichen) Zellen bestimmen (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Die Gating-Prinzipien für die Analyse der Anteile von M1-ähnlichen Makrophagen (M1-like Mø), M2-ähnlichen Makrophagen (M2-like Mø), M1-like microglia (M1-like MG) und M2-like microglia (M2-like MG) stimmen mit denen überein, die für die Analyse von M1-ähnlichen und M2-ähnlichen Zellen verwendet werden. Die Schwellenwerte für die Unterscheidung von positiven und negativen Fluoreszenzsignalen basieren auf der Isotyp-Kontrollröhre, die als Referenz für die Einstellung der Gates dient. Der Prozess der Softwarebedienung ist in Abbildung 2B dargestellt, und die Markerexpressionsprofile, die zur Bestimmung der Zellanteile verwendet werden, werden im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" ausführlich beschrieben.

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Ergebnisse

Die Immunzellen aus dem Rückenmarksgewebe werden mit kolloidalem Siliziumdioxid getrennt, das mit einer Polyvinylpyrrolidon-Dichtegradientenzentrifugation beschichtet ist. Während des Zentrifugationsprozesses werden die Zellen entsprechend ihrer Auftriebsdichte in verschiedene Schichten verteilt, wodurch eine Zelltrennung erreicht wird (Abbildung 1). Von oben nach unten ist die Verteilung wie folgt: Zelltrümmer, mononukleäre zellreiche Schicht, lymphozytenreiche Schicht und unten die Erythro...

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Diskussion

Die erfolgreiche Erstellung eines Querschnittgelähmten-Tiermodells ist unerlässlich. Das SCI-Modell wurde etabliert, indem das Rückenmark am T9-Segment einer Kraft von 0,5 N ausgesetzt wurde. Der Erfolg des Tiermodells zeigte sich darin, dass sich der Schwanz der Maus zusammenrollte, beide Hintergliedmaßen Krämpfe erlitten und die Hintergliedmaßen gelähmt waren, was es der Maus unmöglich machte, nach der Rückenmarksverletzung zu laufen (siehe Schritt 2.3). Die postoperative Versorgung is...

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Offenlegungen

Es wurden keine Interessenkonflikte erklärt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82072416); und der hochrangige Fonds für wissenschaftliche und technologische Innovation des First Affiliated Hospital des Bengbu Medical College (BYYFY2022TD001).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1&mal; PBS  Solarbio GmbHNr. P1020
10 mal; PBS  Solarbio GmbHNr. P1022
18 acht Wochen alte weibliche C57/BL6-Mäuse Cavens Laboratory Animal Ltd, Chang Zhou, China
APC-eFluor 780-markiertes Ratten-Anti-Maus-Medikament CCR7 (IgG2b kappa)Invitrogen47-1971-820,25 μm g/Prüfung
APC-eFluor 780-markiertes Ratten-IgG2b kappa  Isotyp-KontrolleInvitrogen47-4321-820,25 μm g/Prüfung
APC-markiertes Ratten-Anti-Maus-CD45 (IgG2b kappa)Invitrogen17-0451-820,125 μm g/Prüfung
APC-markiertes Ratten-IgG2b kappa  Isotyp-KontrolleInvitrogen17-4031-820,125 μm g/Prüfung
DMEMGibco11965092
Fötales RinderserumLonseraNr. S711-001
FITC-markiertes Ratten-Anti-Maus-CD68 (IgG2b kappa)Invitrogen  MA5-166760,25 μm g/Prüfung
FITC-markiertes Ratten-IgG2b kappa  Isotyp-KontrolleInvitrogen11-4031-820,25 μm g/Prüfung
ParaformaldehydBioscharf23319084
PE-markiertes Ratten-Anti-Maus-CD11b (IgG2b kappa)Invitrogen12-0112-810,25 μm g/Prüfung
PE-markiertes Ratten-IgG2b kappa  Isotyp-KontrolleInvitrogen12-4031-820,25 μm g/Prüfung
Percoll  Solarbio GmbHNr. P8370
Trypsin-LösungBioscharfBL526A

Referenzen

  1. Rubiano, A. M., Carney, N., Chesnut, R., Puyana, J. C. Global neurotrauma research challenges and opportunities. Nature. 527 (7578), S193-S197 (2015).
  2. Fehlings, M., Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clin Epidemiol. 6, 309-331 (2014).
  3. Sterner, R. C., Sterner, R. M. Immune response following traumatic spinal cord injury: Pathophysiology and therapies. Front Immunol. 13, 1084101(2023).
  4. Sun, X., et al. Multiple organ dysfunction and systemic inflammation after spinal cord injury: A complex relationship. J Neuroinflammation. 13 (1), 260(2016).
  5. Brockie, S., Zhou, C., Fehlings, M. G. Resident immune responses to spinal cord injury: Role of astrocytes and microglia. Neural Regen Res. 19 (8), 1678-1685 (2024).
  6. Wang, Z., Zhou, W., Zhang, Z., Zhang, L., Li, M. Metformin alleviates spinal cord injury by inhibiting nerve cell ferroptosis through upregulation of heme oxygenase-1 expression. Neural Regen Res. 19 (9), 2041-2049 (2024).
  7. Li, F., et al. Lupenone improves motor dysfunction in spinal cord injury mice through inhibiting the inflammasome activation and pyroptosis in microglia via the nuclear factor kappa B pathway. Neural Regen Res. 19 (8), 1802-1811 (2024).
  8. Zhou, H. -Y., et al. Dynamic development of microglia and macrophages after spinal cord injury. Neural Regen Res. 20 (12), 3606-3619 (2024).
  9. Hakim, R., et al. Spinal cord injury induces permanent reprogramming of microglia into a disease-associated state which contributes to functional recovery. J Neurosci. 41 (40), 8441-8459 (2021).
  10. Brennan, F. H., et al. Microglia coordinate cellular interactions during spinal cord repair in mice. Nat Commun. 13 (1), 4096(2022).
  11. Zeng, F., et al. Microglia overexpressing brain-derived neurotrophic factor promote vascular repair and functional recovery in mice after spinal cord injury. Neural Regen Res. , (2024).
  12. Tang, Y., Le, W. Differential roles of M1 and M2 microglia in neurodegenerative diseases. Mol Neurobiol. 53 (2), 1181-1194 (2015).
  13. Butovsky, O., Weiner, H. L. Microglial signatures and their role in health and disease. Nat Rev Neurosci. 19 (10), 622-635 (2018).
  14. Wang, J., He, W., Zhang, J. A richer and more diverse future for microglia phenotypes. Heliyon. 9 (4), e14713(2023).
  15. Zeng, F., et al. Knockout of TNF-α in microglia decreases ferroptosis and convert microglia phenotype after spinal cord injury. Heliyon. 10 (17), e36488(2024).
  16. Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: One century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
  17. Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
  18. Hao, D., et al. Trends of epidemiological characteristics of traumatic spinal cord injury in China, 2009-2018. Eur Spine J. 30 (10), 3115-3127 (2021).
  19. Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell Mol Life Sci. 72 (21), 4111-4126 (2015).
  20. Kong, X., Gao, J. Macrophage polarization: A key event in the secondary phase of acute spinal cord injury. J Cell Mol Med. 21 (5), 941-954 (2016).
  21. Lech, M., Anders, H. -J. Macrophages and fibrosis: How resident and infiltrating mononuclear phagocytes orchestrate all phases of tissue injury and repair. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1832 (7), 989-997 (2013).
  22. Mosley, R. L., et al. The glial scar-monocyte interplay: A pivotal resolution phase in spinal cord repair. PLoS One. 6 (12), e27969(2011).
  23. Zhu, Y., et al. Hematogenous macrophage depletion reduces the fibrotic scar and increases axonal growth after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 74, 114-125 (2015).
  24. Hou, C., et al. Mono-macrophage-derived MANF protects against lipopolysaccharide-induced acute kidney injury via inhibiting inflammation and renal M1 macrophages. Inflammation. 44 (2), 693-703 (2020).
  25. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. -S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  26. Zhang, J., et al. The effects of the M2a macrophage-induced axonal regeneration of neurons by arginase 1. Biosci Rep. 40 (2), BSR20193031(2020).
  27. Li, J. L., et al. The polarization of microglia and infiltrated macrophages in the injured mice spinal cords: A dynamic analysis. PeerJ. 11, e14929(2023).
  28. Gratama, J. W., et al. Analysis of variation in results of flow cytometric lymphocyte immunophenotyping in a multicenter study. Cytometry. 30 (4), 166-177 (1997).
  29. Delarasse, C., Fontaine, B., El-Behi, M., Martin, E. Analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry. J Vis Exp. (124), e55781(2017).
  30. Chen, Y. J., et al. Temporal kinetics of macrophage polarization in the injured rat spinal cord. J Neurosci Res. 93 (10), 1526-1533 (2015).
  31. Chen, Y. -Q., et al. CRID3, a blocker of apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ameliorates murine spinal cord injury by improving local immune microenvironment. J Neuroinflammation. 17 (1), 255(2020).
  32. Vijay, S., Nair, R. R., Sharan, D., Jakkala, K., Ajitkumar, P. Percoll discontinuous density gradient centrifugation method for the fractionation of the subpopulations of Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis from in vitro cultures. MethodsX. 11 (7), 102344(2023).
  33. Sharma, A., et al. Successful transplantation of transfected enriched buffalo spermatogonial stem cells to homologous recipients. Theriogenology. 142, 441-449 (2020).
  34. Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nat Protoc. 3 (7), 1228-1239 (2008).
  35. Maurer, F., et al. Continuous Percoll gradient centrifugation of erythrocytes: Explanation of cellular bands and compromised age separation. Cells. 11 (8), 1296(2022).
  36. Gamboa-Suárez, B. A., Lotta-Arévalo, I. A., Sarmiento-Salazar, F., Matta, N. E. Finding a needle in a haystack: DNA Haemoproteus columbae enrichment using percoll density gradient and flow cytometry. Vet Parasitol. 328, 110170(2024).
  37. Cao, Y., et al. Paeoniflorin suppresses kidney inflammation by regulating macrophage polarization via KLF4-mediated mitophagy. Phytomedicine. 116, 154901(2023).
  38. Nishihara, T., et al. Chronic constriction injury of the sciatic nerve in rats causes different activation modes of microglia between the anterior and posterior horns of the spinal cord. Neurochem Int. 134, 104672(2020).
  39. Durafourt, B. A., et al. Comparison of polarization properties of human adult microglia and blood-derived macrophages. Glia. 60 (5), 717-727 (2012).
  40. Wachholz, S., et al. Microglia activation is associated with IFN-alpha induced depressive-like behavior. Brain Behav Immun. 55, 105-113 (2016).
  41. Chen, X., et al. Correlations between macrophage polarization and osteoinduction of porous calcium phosphate ceramics. Acta Biomater. 103, 318-332 (2020).
  42. Guo, S. D., et al. Nasal delivery of Fasudil-modified immune cells exhibits therapeutic potential in experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurosci Ther. 25 (6), 783-795 (2019).

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