Zellfreier Dot-Blot als praktische und anpassungsfähige Immunoassay-Plattform zum Nachweis der Antikörperantwort in humanen und tierischen Seren

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine kürzlich entwickelte Immunoassay-Plattform, die auf den Prinzipien der zellfreien synthetischen Biologie und der Dot-Blot-Technik zum individualisierbaren Nachweis der Antikörperantwort in menschlichen und tierischen Seren basiert.

Zusammenfassung

Die Reihe von weltweiten Ausbrüchen von Krankheitserregern in den letzten zwei Jahrzehnten hat die Bedeutung von Serosurveillance Strategien deutlich gemacht. Immunoassay-Plattformen, die zum Nachweis krankheitsspezifischer Antikörper in den Seren von Patienten dienen, sind das Herzstück der Seroüberwachung. Gängige Beispiele sind enzymgebundene Immunsorbent-Assays und Lateral-Flow-Assays; Obwohl es sich hierbei um Goldstandardmethoden handelt, erfordern sie erregerspezifische Verbrauchsmaterialien und Spezialgeräte, was ihren Einsatz außerhalb gut ausgestatteter Labore einschränkt.

Vor kurzem haben wir eine neuartige Immunoassay-Plattform namens Cell-Free Dot-Blot (CFDB) entwickelt und anhand von menschlichen und tierischen Seren gegen SARS-CoV-2 validiert. Im Gegensatz zu herkömmlichen Immunoassays werden CFDB-Patientenserumproben in einer festen Phase (Nitrozellulosemembran) immobilisiert, während das Zielantigen in der mobilen Phase des Assays suspendiert wird. Um den Zugang zu Serosurveillance zu verbessern, werden CFDB-Antigene bei Bedarf und mit einer Infrastruktur mit geringem Aufwand unter Verwendung von In-vitro-Proteinexpression hergestellt. Hier wird das Antigen mit einem Peptid-Tag fusioniert, der mit einem einzigen universellen Reporterprotein für jeden CFDB-Assay nachgewiesen werden kann. Das Ergebnis ist, dass der CFDB keinen Zugang zu einem Multiwell-Plattenleser oder gereinigten kommerziellen molekularen Assay-Komponenten benötigt. Mit diesen Designüberlegungen adressiert CFDB die Unzulänglichkeiten bestehender Immunoassay-Plattformen, indem es den Zugang zu nicht zentralisierten Laboren, die Anpassungsfähigkeit für neu auftretende Krankheitserreger und die Erschwinglichkeit für einkommensschwache Gemeinden ermöglicht.

Im aktuellen Artikel stellen wir Ihnen ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Vorbereitung und Durchführung eines CFDB-Immunoassays zur Verfügung. Am Beispiel unserer jüngsten Arbeit an SARS-CoV-2 CFDB werden wir das Antigen-DNA-Design für die zellfreie On-Demand-Produktion behandeln, gefolgt von der Vorbereitung des CFDB-Reporterproteins, der Immobilisierung von Serumproben in der festen Phase und schließlich den Antigenbindungs- und Nachweisschritten des Assays. Wir gehen davon aus, dass die Forscher durch die Befolgung dieser Anweisungen in der Lage sein werden, den CFDB-Assay so anzupassen, dass er Immunreaktionen in menschlichen und tierischen Seren auf einen bestimmten Krankheitserreger nachweist.

Einleitung

Die COVID-19-Pandemie hat den dringenden Bedarf an erschwinglichen, skalierbaren Diagnoseinstrumenten gezeigt, insbesondere für ressourcenarme Umgebungen¹. Konventionelle Immunoassays wie Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs) haben sich als unverzichtbar für den Nachweis von Immunantworten erwiesen ^2,3. Ihre hohen Kosten, die Abhängigkeit von komplexen Reagenzien und die Abhängigkeit von Spezialgeräten schränken jedoch ihre Zugänglichkeit ein, insbesondere während globaler Gesundheitskrisen. Als Antwort auf diese Herausforderungen haben wir den Cell-Free Dot Blot (CFDB) entwickelt, eine kostengünstige, anpassungsfähige Immunoassay-Plattform, die für den Nachweis von Anti-SARS-CoV-2-Antikörpern in menschlichen und tierischen Seren entwickelt wurde.

CFDB nutzt die zellfreie synthetische Biologie für die schnelle On-Demand-Produktion viraler Antigene unter Verwendung linearer DNA-Templates ^4,5. Dadurch entfallen herkömmliche zellbasierte Klonierungs-, Expressions- und Aufreinigungsprozesse, wodurch die Antigenproduktion erheblich beschleunigt und gleichzeitig die Kosten gesenkt werden. Die CFDB-Methode vereinfacht den Antikörpernachweis durch die Verwendung eines Dot-Blot-Formats, bei dem Seren direkt auf Nitrozellulosemembranen aufgetümmelt werden. Dieses System macht teure Multiwell-Platten und spezielle Laborgeräte überflüssig und ermöglicht einen einfachen "Tauch"-Arbeitsablauf für Inkubations- und Waschschritte. Die Plattform verwendet auch ein SpyCatcher-SpyTag-System, bei dem eine SpyCatcher2-Apex2-Peroxidase-Chimäre als universelles sekundäres Nachweisreagenz^{fungiert 5,6}. Dies wird unter Verwendung der standardmäßigen Escherichia coli-basierten Expression hergestellt, wodurch die Abhängigkeit von teuren kommerziellen Antikörperkonjugaten entfällt. Infolgedessen kann das CFDB-System serologische Assays mit einer vergleichbaren Leistung wie ELISAs zu deutlich geringeren Kosten durchführen – etwa 3 USD pro 96 Proben im Vergleich zu über 300 USD für ein kommerzielles ELISA-Kit⁵.

Um die Wirksamkeit von CFDB zu demonstrieren, haben wir seine Fähigkeit zum Nachweis von Antikörpern in vorcharakterisierten menschlichen und tierischen Seren getestet. Unsere Ergebnisse korrelierten eng mit dem ELISA bei der Identifizierung von COVID-19-positiven und -negativen Proben. Zusätzlich zur Humandiagnostik untersuchten wir den Nutzen von CFDB in Tiermodellen, indem wir Seren von SARS-CoV-2-infizierten Hamstern und solchen, die mit rekombinantem Nukleokapsidprotein geimpft wurden, testeten. Diese Tests bestätigten das Potenzial von CFDB für den Einsatz sowohl in der Human- als auch in der Veterinärdiagnostik und machen es zu einem vielseitigen Instrument zur Überwachung von Immunreaktionen über Spezies hinweg. Einer der wichtigsten Vorteile von CFDB ist seine Flexibilität. Durch einfaches Modifizieren des DNA-Templates, das für das interessierende Antigen kodiert, kann die Plattform schnell angepasst werden, um Antikörper gegen verschiedene Krankheitserreger nachzuweisen, was sie für die zukünftige Pandemievorsorge wertvoll macht. Aufgrund seiner geringen Kosten, seines einfachen Arbeitsablaufs und seiner minimalen Infrastrukturanforderungen eignet es sich besonders für dezentrale Labore und ressourcenarme Umgebungen, in denen der Zugang zu kommerzieller Diagnostik begrenzt ist.

In dieser Arbeit geben wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Vorbereitung und Durchführung eines CFDB-Assays. Zunächst befassen wir uns mit dem Design und der Synthese von linearen DNA-Templates für die zellfreie Produktion von Antigenen, die die primären Nachweisreagenzien des Assays sind. Anschließend beschreiben wir die Schritte zur Vorbereitung des sekundären Nachweisreagenzes des Assays, SpyCatcher2-Apex2. Danach geben wir Anleitungen für die zellfreie Herstellung und Qualitätskontrolle der Antigene selbst. Abschließend beschreiben wir detailliert den Prozess zur Durchführung eines CFDB-Assays an menschlichen oder tierischen Serumproben.

Protokoll

Alle Hamsterversuche wurden am National Microbiology Laboratory (NML) der Public Health Agency of Canada durchgeführt, vom Canadian Science Centre for Human and Animal Health genehmigt und nach den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt. Alle menschlichen Serum-/Plasmaproben wurden kommerziell für interne Tests gewonnen oder von klinischen Mitarbeitern dem NML für unabhängige Tests am NML zur Verfügung gestellt.

1. Design und Erstellung von Antigen Linear Expression Templates (LETs)

1. Entwerfen Sie die zellfreien Expressions-LETs für das Zielantigen basierend auf den Anweisungen in Norouzi et ^al.7 und mit einem N/C-terminalen SpyTag, wie in Norouzi et ^al.5 beschrieben.
   HINWEIS: Hier finden Sie Details zur Herstellung von SARS-CoV-2 Nukleokapsid Protein (NP, Aminosäuren 2-419).
   1. Es ist sicherzustellen, dass das LET für den SARS-CoV-2-NP (Abbildung 1 und ergänzende Datei 1) 5'- und 3'-Ter-Stellen mit einer Puffersequenz von 50 Basenpaaren vor dem T7-Promotor und nach dem Stoppcodon enthält.
   2. Markieren Sie das NP-Protein am N-Terminus mit His 6-SpyTag-TEV.
   3. Beziehen Sie die Proteinsequenz aus der UniProt-Datenbank (Accession Code P0DTC9) und optimieren Sie sie für die E . coli-basierte Expression mit dem IDT-Codon-Optimierungstool⁸. Bestellen Sie diese Sequenz für die kommerzielle Synthese als einzelsträngiges DNA-Fragment, das in Wasser bei 10 ng/μL resuspendiert wird.
      HINWEIS: Die TEV-Protease-Spaltstelle und das His_6-Tag sind keine wesentlichen Merkmale im LET-Design.
2. PCR-Amplifikation des DNA-Fragments mit dem universellen Ter FW (GGCTCCGAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCGGCC
   ACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCG) und Ter RV (CCGAGGCAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCTCAG
   CTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCC) unter Verwendung des High-Fidelity-DNA-Polymerase-Kits (siehe Materialtabelle)
   1. Eine 100-μl-Reaktion wird wie folgt aufgebaut: 75 μl nukleasefreies Wasser, 20 μl 5x DNA-Polymerase-Puffer, 2 μl 10 mM dNTPs (Endkonzentration 200 μM), 0,5 μl 100 μM Ter-FW-Primer, 0,5 μl 100 μM Ter-RV-Primer, 1 μl 10 ng/μl einzelsträngiges LET, 1 μl(2U) DNA-Polymerase.
   2. Verwenden Sie die folgenden PCR-Einstellungen: Erstdenaturierung bei 98 °C für 30 s; 35 Zyklen: 98 °C für 6 s, 60 °C für 15 s, 72 °C für 90 s; Bei 4 °C halten.
3. Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem kommerziellen PCR-Aufreinigungskit, überprüfen Sie seine Qualität, indem Sie eine Probe auf ein 1%iges Agarosegel laufen lassen, und messen Sie seine Konzentration auf einem UV-Vis-Spektralphotometer.
   HINWEIS: Rohe PCR-Produkte können auch direkt für die zellfreie Expression verwendet werden. Die Reinigung ermöglicht jedoch ein standardisierteres Verfahren.

Abbildung 1: Lineare Expressionsvorlage für SARS-CoV-2-NP. Ein Schema, das die Merkmale des linearen DNA-Templates His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP darstellt. Wichtige DNA-Vorlagenelemente sind beschriftet. Die kodierende Sequenz für das interessierende Protein, hier das NP, wird für eine effiziente Expression unter die transkriptionelle Kontrolle eines T7-Promotors gestellt. Am N-Terminus wird das NP-Protein mit einem SpyTag für den spezifischen Nachweis unter Verwendung des SpyCatcher2-Apex2-Detektionsreagenzes angehängt. Die x6His-Tag- und TEV-Proteasestellen sind, obwohl sie als Teil des allgemeinen LET-Designs enthalten sind, für CFDB-Zwecke entbehrlich. An den Enden des linearen DNA-Templates sind "Upstream"- und "Downstream"-Ter-Stellen, denen jeweils jeweils 50 Basenpaar-Puffersequenzen vorangestellt sind, für den Tus-vermittelten Schutz vor dem Abbau exonukleolytischer DNA im zellfreien Lysat enthalten. Abkürzungen: NP = Nukleokapsidprotein; LET = lineare Ausdrucksvorlage; TEV = Tabakätzvirus; CFDB = zellfreier Dot-Blot. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Aufreinigung des Reporterproteins SpyCatcher2-Apex2

1. Verwenden Sie das pET24b-SpyCatcher2-Apex2-Plasmid, das ursprünglich in Norouzi et ^al.5 konstruiert wurde (vollständige Sequenz in Supplemental File 2 und Plasmidkarte in Supplemental Abbildung S1), um das SpyCatcher2-Apex-2-Reporterprotein herzustellen.
2. Bereiten Sie Agarplatten und Lysogenie-Bouillon (LB) mit 50 μg/ml Kanamycin vor. Transformieren Sie E . coli BL21 (DE3)-Zellen mit dem Plasmid pET24b-SpyCatcher2-Apex2. Impfen Sie eine einzelne Kolonie in eine 15-ml-Starter-LB-Kultur und züchten Sie sie über Nacht bei 37 °C und Schütteln bei 250 U/min.
3. Am nächsten Tag geben Sie 10 ml der Starterkultur in 500 ml frisches LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycin. Inkubieren Sie bei 37 °C und schütteln Sie bei 250 U/min, bis die Kultur bei 600 nm eine optische Dichte von 0,6-0,8 (~3 h) erreicht.
4. Induzieren Sie die Expression von SpyCatcher2-Apex2, indem Sie die Kultur mit 0,5 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid und 1 mM 5-Aminolävulinsäurehydrochlorid ergänzen. Reduzieren Sie die Wachstumstemperatur auf 30 °C und lassen Sie die Kultur weitere 4 Stunden inkubieren.
5. Ernten Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 8.000 × g für 15 min. Fahren Sie mit der Zelllyse fort oder lagern Sie das Pellet bis zur Verwendung bei -80 °C.
6. Resuspendieren Sie das Pellet in 20 ml Lysepuffer, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 300 mM NaCl, 1 mg/ml Lysozym, EDTA-freie Proteasehemmer-Tablette und 1 mM Dithiothreitol (DTT) enthält. Die Zellen werden durch Beschallung bei 50 % Amplitude in Intervallen von 5 s EIN und 10 s AUS für eine Gesamteinschaltzeit von 3 min lysiert.
7. Das Lysat wird durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 1 h bei 4 °C geklärt. Der Überstand wird durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter geleitet.
8. Häminchlorid in einer Endkonzentration von 250 μM zum geklärten Lysat geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren. Fahren Sie mit der Proteinreinigung fort.
   HINWEIS: Die Inkubation mit Häminchlorid maximiert den Häm-Einbau in die Apex-2-Peroxidase für eine optimale Enzymaktivität.
9. Geben Sie 2,5 mL Ni-Harz zum geklärten Lysat und inkubieren Sie bei 4 °C unter leichtem Schütteln für 45 Minuten. Tragen Sie die Mischung auf eine Schwerkraft-Flow-Säule auf und waschen Sie das Harz mit 50 mL Tris-Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 300 mM NaCl und 1 mM DTT).
10. Eluieren Sie das SpyCatcher2-Apex2-Protein in 25 ml Tris-Puffer, der 400 mM Imidazol enthält. Konzentrat und Puffer tauschen das Eluat mit einer Zentrifugalfiltereinheit in Tris-Puffer aus, wobei ein Endvolumen von 0,5 bis 1,0 ml angestrebt wird.
11. Verwenden Sie den molaren Extinktionskoeffizienten von SpyCatcher2-Apex2 (27.390 ^{M-1 cm-1}), um die Proteinkonzentration auf einem UV-Vis-Spektralphotometer zu bestimmen. Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 40 % zugeben und die Aliquote bei -20 °C lagern.
    HINWEIS: Es wird erwartet, dass dieses Protokoll etwa 40 mg hochreines und aktives SpyCatcher2-Apex2 liefert, ausreichend für 400 CFDB-Läufe mit einer Standard-Blot-Größe von 96 Proben.
12. Für den Nachweis von SpyTagged Proteinen mit herkömmlichem Western Blot⁹ und für CFDB-Experimente blockieren Sie die Membranen immer in 5 % fettfreier Trockenmilch in 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05 % Tween-20 (TBST). Verwenden Sie das SpyCatcher2-Apex2-Protein in einer Endkonzentration von 10 μg/ml in Blockierungslösung.
    HINWEIS: Der SpyCatcher2-Apex2-Reporter erfordert eine ECL-Lösung (Enhanced Chemilumineszenz) für die Signalentwicklung. Die ECL-Lösung kann kommerziell bezogen oder im eigenen Haus gemäß den Anweisungen in Mruk et ^al.10 hergestellt werden. Die endgültige ECL-Lösung besteht hier aus 0,4 mM p-Cumarsäure, 2,5 mM Luminol und 0,015 % H₂O₂ in 100 mM Tris-HCl (pH 8,6).

3. Zellfreie Produktion und Qualitätskontrolle von Antigenen

1. Bereiten Sie ein zellfreies Lysat und Reaktionskomponenten von E. coli BL21 vor und fügen Sie es zusammen, indem Sie den Anweisungen in Levine et ^al.11 und Norouzi et ^al.5 folgen. Ergänzen Sie das endgültige Reaktionsgemisch mit 5 μM Tus-Protein und 1,2 μM T7-RNA-Polymerase wie folgt für eine repräsentative 100-μl-Reaktion: 14,6 μl Lösung A, 14 μl Lösung B, 33,3 μl E. coli BL21-Lysat, 2,5 μl 200 mM Tus-Protein, 1,2 μl 100 mM T7-RNA-Polymerase, 1 μl 1,5 μM lineares DNA-Template, 33,4 μl nukleasefreies Wasser.
   HINWEIS: In der ergänzenden Datei 3 finden Sie wichtige Anweisungen zur Herstellung eines zellfreien Lysats BL21 für E . coli und in der ergänzenden Tabelle S1 für eine detaillierte Rezeptur der Lösungen A und B. Das zellfreie Expressionssystem für E. coli kann auch unter Verwendung alternativer Protokolle hergestellt oder kommerziell erworben werden, solange die Reaktion mit Tus und T7-RNA-Polymerase ergänzt wird.
2. Führen Sie einen ersten Expressionstest im 5-μl-Maßstab durch, indem Sie der zellfreien Reaktion in einem PCR-Röhrchen 10 % (v/v) Roh-PCR-Produkt zusetzen. Ohne Schütteln bei 30 °C für 15 h inkubieren.
3. Überprüfen Sie die Expressionsqualität des NP-Antigens, indem Sie 1 μl der zellfreien Reaktion auf ein 12%iges Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel (SDS-PAGE) laden und anschließend auf eine Nitrozellulosemembran für Western Blot übertragen, wie in Schritt 2.12 beschrieben. Verwenden Sie das Reporterprotein SpyCatcher2-Apex2 für die Blot-Markierung über den SpyTag und optional einen spezifischen kommerziellen Antikörper (hier einen Anti-SARS-CoV-2-NP) gegen das Zielantigen.
4. Assemblieren Sie eine zellfreie Reaktion im 1-ml-Maßstab mit 15 nM gereinigtem LET-Produkt, das für den CFDB-Assay verwendet wird. Die Expressionsmischung wird in einem konischen 15-ml-Röhrchen unter Schütteln bei 80 U/min für 15 Stunden bei 30 °C inkubiert. Überprüfen Sie die Expressionsqualität mit Western Blot und lagern Sie 50 μL Aliquots bei -20 °C.

4. Serum-Proben

1. Beziehen Sie Serumproben (oder Plasmaproben für Menschen/Tiere) aus kommerziellen Quellen oder von klinischen Mitarbeitern oder intern unter Verwendung von Standardverfahren und gemäß den Richtlinien der institutionellen Ethikkommission für die Humanforschung oder der Kommission für Tierpflege und -verwendung. Stellen Sie sicher, dass geeignete Maßnahmen zur Probenvorbehandlung ergriffen wurden, um das Kontaminationsrisiko zu mindern.
   HINWEIS: Vorbehandlungsmaßnahmen können eine Behandlung mit Lösungsmittel und Reinigungsmitteln, eine Hitzeinaktivierung und Tests auf durch Blut übertragbare Virusmarker umfassen. Ein nützliches Protokoll für die Serum- und Plasmaisolierung aus Vollblut steht zur Verfügung¹². Wie bei anderen Immunoassay-Plattformen ist nicht zu erwarten, dass Serumproben, die früh (<3 Wochen) nach der Erstinfektion oder dem Ausbruch der Krankheit entnommen werden, ausreichende Mengen einer Antikörperreaktion enthalten, und ihre Ergebnisse sollten mit Vorsicht behandelt werden.
2. Für die Qualitätsüberprüfung der SARS-CoV-2 NP CFDB-Reagenzien verwenden Sie das internationale Referenzgremium der Weltgesundheitsorganisation (WHO) des National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) für Anti-SARS-CoV-2-Immunglobulin, das x1 prä-COVID-19 und x4 SARS-CoV-2-positive Proben mit unterschiedlichen Gehalten an Anti-NP-Immunglobulinen^{enthält 13}. Alternativ können Sie vorcharakterisierte gesunde und positive Serumproben aus anderen Quellen verwenden.
3. Für CFDB-Experimente können Sie eine negative Kontrollprobe gewinnen oder vorbereiten, indem Sie mehrere (>3) gesunde Serumproben zusammenfassen, um die Genauigkeit zu erhöhen und die Analyse und Interpretation der Ergebnisse zu erleichtern.

5. Verfahren des zellfreien Dot-Blots (CFDB)

1. Laden Sie die Master-Grid-Bilddatei herunter und drucken Sie sie aus (Ergänzende Abbildung S2). Das Master-Gitter ist ein 6 x 6 cm großes Muster mit 12 x 12 Kreisen mit je 2 mm Durchmesser und bietet eine ähnliche Fleckenkapazität wie eine 96-Well-Platte.
2. Schieben Sie das Gitter fest zwischen zwei Lagen selbstklebender PCR-Platten-Siegelfolie ein und schneiden Sie es entlang der äußeren Gitterränder zu. Verwenden Sie einen 2-mm-Biopsiestanzer, um jeden markierten Kreis auszuhöhlen.
   HINWEIS: Dieser Master-Rost kann nach dem Abwischen mit 70% Ethanol mehrmals wiederverwendet werden.
3. Schneiden Sie ein 6,5 x 6,5 cm großes Stück Nitrozellulosemembran ab und positionieren Sie es unter dem Master-Gitter auf einer sauberen Oberfläche, wobei Sie das Setup mit Klebeband sichern, wie in Abbildung 2 und Ergänzende Abbildung S3 gezeigt. Markieren Sie mit einem Markierungsstift die äußersten Kreispositionen auf der Nitrozellulosemembran, die als Leitfaden für das Schneiden der Membran nach der Probenaufschluss dienen sollen.
4. Verdünnen Sie die Serumproben zu 1/10 in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4). Verwenden Sie eine Mikropipette, um ein dreifaches Volumen von 0,4 μl jeder Probe an vorgegebenen Gitterpositionen auf die Nitrozellulosemembran zu dispensieren. Die Abgabe dauert ca. 15 s pro Stelle.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, dass Sie jedem Assay sowohl Negativ- als auch Positivkontrollproben beifügen, da dies für die Analyse der Ergebnisse erforderlich ist.
5. Lassen Sie die gefleckten Proben 10 Minuten bei Umgebungstemperatur binden und trocknen. Ziehen Sie die Nitrozellulosemembran vorsichtig mit einer Pinzette heraus und schneiden Sie entlang der markierten äußeren Kreise.
6. Blockieren Sie die Membran in 10 ml Blockierungslösung (5 % fettfreie Trockenmilch in TBST) in einer 10 cm Petrischale für 30 Minuten bei Raumtemperatur und schütteln Sie sie leicht bei 100 U/min.
7. Tauen Sie auf und geben Sie ein 50 μl Aliquot des zellfreien Antigenexpressionsgemisches zu 5 ml Blockierungslösung in einer 10 cm Petrischale. Die Membran wird direkt in diese antigenhaltige Lösung überführt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, wobei bei 100 U/min geschüttelt wird.
   HINWEIS: Dies ist der primäre Nachweisschritt, bei dem das SpyTagged-Antigen an antikörperhaltige Spot-Positionen bindet, falls vorhanden.
8. Spülen Sie die Membran aus, waschen Sie sie 5 Minuten lang und spülen Sie sie erneut in TBST, bevor Sie mit dem sekundären Nachweisschritt fortfahren.
9. Inkubieren Sie die Membran in 10 mL Blockierungspuffer mit 10 μg/ml gereinigtem SpyCatcher2-Apex2-Protein für 1 h unter Schütteln bei 100 U/min.
10. Spülen Sie die Membran aus und waschen Sie sie 2 x 5 min in TBST, mit einer abschließenden Spülung in TBS.
11. Kleben Sie ein Stück Parafilm auf eine saubere Arbeitsfläche in der Nähe des Blot-Imaging-Instruments und befestigen Sie es. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Sie mit einer Pinzette auf die Membran klopfen und die Membran auf den Parafilm legen.
12. Geben Sie sofort 3 mL (100 μL/cm²) ECL-Lösung auf die Membran und inkubieren Sie sie genau 90 s lang bei Raumtemperatur.
13. Trocknen Sie die Membran sofort ab und übertragen Sie sie zur Visualisierung der Ergebnisse auf ein Chemilumineszenz-kompatibles Bildgebungsinstrument.
    HINWEIS: Die optimale Bildgebungszeit kann bei verschiedenen Instrumenten variieren. Es wird empfohlen, die Standardeinstellungen für die automatische Erfassungszeit des Geräts zu verwenden und, falls nicht vorhanden, vorcharakterisierte Serumproben zu verwenden, um die Bildaufnahmezeit zu optimieren.
14. Verwenden Sie die Bildanalysefunktion des Geräts, um Punktintensitäten zu erhalten, einschließlich für drei leere (Hintergrund-)Positionen auf der Nitrozellulosemembran; Halten Sie ein konstantes Messvolumen pro Spot aufrecht. Exportieren Sie die Daten in eine Tabelle und denken Sie daran, jede Punktposition korrekt zu beschriften.
15. Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung (SD) der dreifachen Punktintensitäten. Subtrahieren Sie dann den Hintergrund der Nitrozellulosemembran von allen Proben.
16. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um einen Grenzwert für die Interpretation der -/+-Ergebnisse zu erhalten:
    (Mittelwert der Negativkontrollen) + (3 x SD der Negativkontrollen). Betrachten Sie Proben als positiv, wenn ihre durchschnittliche Intensität über den Grenzwert fällt, und als negativ, wenn ihre durchschnittliche Intensität unter den Grenzwert fällt.
    HINWEIS: Ein Schema des CFDB-Verfahrens ist in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 2: CFDB-Baugruppe. Ein Schema des Aufbaus des CFDB-Mastergitters und der NC-Membranbaugruppe. Das Master-Gitter wird auf der NC-Membran überlagert, um ein regelmäßiges, adressierbares Muster für die Spotting und Immobilisierung von Serumproben zu erhalten. Abkürzungen: CFDB = zellfreier Dot-Blot; NC = Nitrocellulose. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Eine schematische Darstellung des CFDB-Arbeitsablaufs. Bei einem CFDB-Assay wird eine kleine Menge (<0,4 μl) von 10x verdünnten Serumproben manuell auf eine vorgeschnittene Nitrozellulosemembran (linkes Bild) an diskreten, adressierbaren Stellen (mittleres Bild) aufgetragen. Ablage einer Serumprobe pro Spot in dreifachen Spots und Immobilisierung des Proteingehalts, einschließlich des gesamten Antikörperreservoirs der Seren, auf dem festen NC-Substrat (beige Flecken im mittleren Feld). In diesem Beispiel können die in den Serumproben enthaltenen Anti-NP-Antikörper zunächst durch das CFDB-Primärdetektionsreagenz SpyTag-NP gebunden und schließlich durch das CFDB-Sekundärdetektionsreagenz SpyCatcher2-Apex2 (vergrößerte Blase auf dem rechten Feld) nachgewiesen werden. Diese Abbildung stammt von Norouzi et ^al.5. Abkürzungen: CFDB = zellfreier Dot-Blot; NP = Nukleokapsidprotein; LET = lineare Ausdrucksvorlage. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergebnisse

PCR-Amplifikation des linearen Expressions-Templates für das Zielantigen
Zur PCR-Amplifikation des SARS-CoV-2 NP LET wurden universelle Ter-Forward- und Reverse-Primer verwendet, wie in Protokollabschnitt 1.2 beschrieben, und 1 μl des Produkts wurde auf einem Agarosegel überprüft (Abbildung 4), bevor mit der Aufreinigung des PCR-Produkts fortgefahren wurde.

Diskussion

COVID-19 hat deutlich gemacht, wie wichtig zugängliche und robuste Diagnostika für die Kontrolle von Infektionsausbrüchen und die Optimierung globaler Gesundheitsstrategien sind. Serologische Tests zum Nachweis schützender Antikörper erwiesen sich als unerlässlich für die Verfolgung von Übertragbarkeitsmustern neuer Varianten, die Identifizierung von Hotspots, die Steuerung der Impfstoffentwicklung, die Triage von Verdachtsfällen und den Schutz gefährdeter Bevölkerungsgruppen

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 kb DNA-Leiter	NEB	N3232	Wird als Größenmarker für Agarosegele
verwendet 20 Aminosäuren	Sigma-Aldrich	LAA21-1KT	Ein Bestandteil der zellfreien Reaktion Lösung B
2 mm Biopsie-Stanze	Integra Miltex	33-31-P/25	Zur Herstellung von CFDB-Mastergittern
5-Aminolävulinsäurehydrochlorid	Sigma-Aldrich	A3785	Häm-Vorläufer zur Induktion von SpyCatcher2-Apex2
Agarosepulver	BioShop	AGA002	Für die elektrophoretische Analyse von DNA
Anti-SARS-CoV2-Nukleokapsid-Antikörper	Sinobiologisch	40588-T62	Für den WB-Nachweis von zellfrei produziertem NP-Antigen
Bio-Rad ChemiDoc  XRS+	Bio-Rad	N/A	Gel-Imager-Instrument
Zentrifugalkonzentratoren	Cytiva	28-9323-60	Für die Konzentration und den Pufferaustausch von Proteinen
Zentrifuge	Eppendorf	EP022628257	Für die Ernte von Bakterienkulturen
Coenzym  A Natriumsalzhydrat (CoA)	Sigma-Aldrich	C3144	Eine Komponente der zellfreien Reaktion Lösung A
Farbvorgefärbter Proteinstandard (breites Spektrum)	NEB	P7719	Wird als Größenmarker für SDS-PAGE-Gele verwendet
Covid-19-Serumpanel	RayBiotech	CoV-PosSet	Vorcharakterisierte Seren zur Verifizierung und Optimierung von CFDB-Reagenzien/-Bedingungen
D-(−)-3-Phosphoglycerinsäure-Dinatriumsalz (3-PGA)	Sigma-Aldrich	P8877	A Bestandteil der zellfreien Reaktion Lösung B
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	10197777001	Bestandteil von Puffern
E. coli 5-alpha	NEB	C2987	zur Plasmidpräparation
E. coli BL21	NEB	C2530	Zur Herstellung von zellfreien Lysaten
E. coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	Zur Ausprägung von SpyCatcher2-Apex2
EDTA-freier Proteasehemmer	Tablette Sigma-Aldrich	11836153001	Ein Bestandteil des E. coli Lysepuffers
Eppendorf  New Brunswick  Innova 43/43R Inkubator Shaker	Eppendorf	EPM1320	Inkubator für die Züchtung von E. coli-Zellen zur Proteinexpression und zellfreien Lysatzubereitung
Folinsäure	Sigma-Aldrich	47612	Eine Komponente der zellfreien Reaktion Lösung A
Glycerin	Sigma-Aldrich	G9012	Komponente des SpyCatcher2-Apex2 Speicherpuffers
Heminchlorid	Sigma-Aldrich	H9039	Zur Häm-Supplementierung von SpyCatcher2-Apex2
Wasserstoffperoxid 30%	Sigma-Aldrich	H1009	Zur Herstellung von ECL-Reagenz
Image Lab Software	Bio-Rad	1709690	Software für ChemiDoc Gel   Bildgebungsinstrument
Isopropyl-b-D-1-thiogalactopyranosid	Bioshop	IPT001	Zur Induktion von SpyCatcher2-Apex2 Expressikon
Kanamycin Sulfate	Sigma-Aldrich	60615	Zur Herstellung von SpyCatcher2-Apex2 Bakterienkultur
LB Agar	BioShop	LBL406	Für E. coli Wachstum
LB Bouillon	BioShop	LBL407	Für E. coli Wachstum
Luminol	Sigma-Aldrich	A4685	Zur Herstellung von ECL-Reagenz
Lysozym	Sigma-Aldrich	L6876	Zur Lyse von Bakterienzellen
Magnesiumacetat	Sigma-Aldrich	M5661	Eine Komponente der zellfreien Reaktion Lösung B
NEBExpress Ni-Harz	NEB	S1428S	Zur Reinigung von SpyCatcher2-Apex2
Fettfreier Trockenmilch	Bioshop	SKI400	Zur Blockierung von WB- und CFDB-Membranen
Parafilm	Bemis	2099-1337410	Zur ECL-Inkubation von CFDB-Blots
p-Cumarsäure	Sigma-Aldrich	C9008	Zur Herstellung des ECL-Reagenzes
pET24b-SpyCatcher2-Apex2 Plasmid	Pardee Laboratory	N/A	Wird für die Expression des SpyCatcher2-Apex2-Proteins
Petrischale	verwendet Fisherbrand	FB0875712	Behälter für die Inkubation von WB- und CFDB-Membranen
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 10%	BioShop	PBS405	Bestandteil der Puffer
Kaliumglutamat	Sigma-Aldrich	G1501	Ein Bestandteil der zellfreien Reaktion Lösung B
Kaliumoxalat Monohydrat (Oxalsäure)	Sigma-Aldrich	223425	Ein Bestandteil der zellfreien Reaktion Lösung A
Vorgefertigtes SDS-PAGE Gel	BioRad	4561036EDU	Für die elektrophoretische Analyse der
Protein-Q5-High-Fidelity-DNA-Polymerase	NEB	M0491	Für die PCR-Amplifikation von LETs
QIAquick PCR-Aufreinigungskit	Qiagen	28106	Zur Aufreinigung von LETs
Ribonukleotid-Lösungssatz	NEB	N0450S	Ein Bestandteil der zellfreien Reaktion Lösung A
Magermilchpulver	BioShop	SKI400	Wird als Blockierungsmittel für Western Blot und CFDB
verwendet Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S9625	Ein Bestandteil von Proteinreinigungspuffern
Ultraschallgerät	Qsonica	Q500	Für die Lyse von Bakterienzellen
Spermidin	Sigma-Aldrich	S2626	Ein Bestandteil der zellfreien Reaktion Lösung A
Spritzenfilter	Sigma-Aldrich	SLGSR33SS	Zur Sterilisation von Puffern und Lösungen
Thermocycler	BioRad	T100	Gerät zur Inkubation von PCR-Reaktionen
Transfer-RNA (tRNA)	Sigma-Aldrich	R8759	Ein Bestandteil der zellfreien Reaktion Lösung A
Tris gepufferte Kochsalzlösung	Thermo Scientific	J60764. K2	Komponente aus WB- und CFDB-Waschpuffer
Trizma-Basis	Sigma-Aldrich	T1503	Zur Herstellung von Tris-Puffer
Tunair SS-5012 Half-Baffle Shake Flask, 2,5 L	Cole-Parmer	RK-01835-39	Gefäß für die Züchtung von E. coli-Zellen für die Proteinexpression und zellfreie Lysatvorbereitung
Tween-20	BioShop	TWN510	Komponente des WB- und CFDB-Waschpuffers
Pinzette	Almedic	7728-A10-100	Für die Handhabung von CFDB NC-Membran-UV-Vis-Spektralphotometern
	Thermo Scientific	13400518	Zur Messung der Nukleinsäure- und DNA-Konzentration und Bakterienkultur OD
WHO Internationales Referenzgremium für Anti-SARS-CoV-2-Immunglubulin	NISBC	20/268	Vorcharakterisierte Seren zur Verifizierung und Optimierung von CFDB-Reagenzien/-Bedingungen
β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Hydrat (NAD)	Sigma-Aldrich	10127965001	Eine Komponente der zellfreien Reaktion Lösung A