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Methodenartikel

Mausmodell der chirurgischen Gebärmutterverletzung und der nachfolgenden Schwangerschaftsergebnisse

1.8K Aufrufe

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DOI:

10.3791/67977

⸱

27. Juni 2025

 , 
1Department of Physiology and Membrane Biology, University of California, Davis, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of California, Davis

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Induktion einer Gebärmutterschädigung im Mausmodell, gefolgt von nachgelagerten Analysen während einer nachfolgenden Schwangerschaft.

Zusammenfassung

Uterusverletzungen durch Kaiserschnitte (Kaiserschnitte) und andere Eingriffe (Dilatation und Kürettage, Myomektomien usw.) können zu verschiedenen Morbiditäten in nachfolgenden Schwangerschaften führen, darunter Placenta praevia, Placenta accreta-Spektrum (PAS), Kaiserschnittnarbenschwangerschaft und Uterusruptur. Kaiserschnitte machen etwa 30 % der Entbindungen in den USA aus, Tendenz steigend. Daher sind ein tieferes Verständnis der Mechanismen, durch die verletzungsassoziierte Schwangerschaftsstörungen entstehen, und eine Plattform zur Erprobung möglicher Interventionen unerlässlich. Um diese Ziele zu erreichen, besteht ein dringender Bedarf an Tiermodellen für Gebärmutterverletzungen, insbesondere solchen, die sich mit den Auswirkungen der Verletzung auf die nachfolgenden Ergebnisse in utero befassen. Dieses Protokoll beschreibt ein neuartiges chirurgisches Verfahren für ein Modell der mechanisch induzierten Uterusverletzung bei der Labormaus (Mus musculus). Es werden die Schritte zur Vorbereitung der Operation, die Einleitung der Gebärmutterverletzung selbst und die postoperativen Genesungsverfahren gezeigt. Zusätzliche Informationen werden zur nachgeschalteten Dissektion sowohl von nicht trächtigen als auch von trächtigen Mäusen bereitgestellt. Insgesamt stellt dieses Protokoll durch die Beschreibung einer Reihe von Verfahren zur Induktion von Uterusverletzungen in einem In-vivo-Modell eine handhabbare Methode zur Aufklärung der molekularen und zellulären Ereignisse der Gebärmutterwundheilung und ihrer Auswirkungen auf die nachfolgende Schwangerschaft dar.

Einleitung

Obwohl 1 von 3 Geburten in den USA per Kaiserschnitt (Kaiserschnitt) durchgeführt wird, ist wenig darüber bekannt, wie die Gebärmutter heilt und wie eine verletzte Gebärmutter zu Komplikationen bei nachfolgenden Schwangerschaften führt 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13. Schadenfreude Zu diesen Komplikationen gehören Uterusruptur, Placenta praevia, PAS und Kaiserschnittnarbenschwangerschaft, die zusammen ~2,5% der Patientinnen betreffen, die einen oder mehrere Kaiserschnittehatten 1,2,6,8,12,14,15,16,17. Die Plazenta praevia ist gekennzeichnet durch die abnormale Platzierung der Plazenta im unteren Teil der Gebärmutter 4,16. Dies führt nicht nur zu einer körperlichen Obstruktion des Gebärmutterhalses und einem erhöhten Blutungsrisiko in der Schwangerschaft, sondern ist auch ein wesentlicher Risikofaktor für die schwerere, invasive Erkrankung des PAS 8,12. PAS ist definiert durch eine übermäßige Invasion der Plazenta zu tief in das mütterliche Gewebe, sogar bis zur Blase oder zum Rektum, und erfordert oft eine Kaiserschnitt-Hysterektomie, um lebensbedrohliche mütterliche Blutungen auszuschließen12,17. Kaiserschnitt-Narbenschwangerschaften sind zwar selten, weisen aber eine hohe Rate an damit verbundenen Morbiditäten auf, darunter Fehlgeburten, fetaler Tod und Frühgeburten18,19. Zusätzlich zu den Komplikationen, die mit früheren Kaiserschnitten in der Vorgeschichte verbunden sind, führen auch andere Uteruseingriffe wie Myomektomie oder Dilatation und Kürettage (D&C) zu Morbiditäten bei der Patientin. Zum Beispiel entwickeln ~30% der Patientinnen, die sich nach einer späten Spontanabtreibung einer D&C unterziehen, und bis zu 46% der Patientinnen, die sich einer zweiten hysteroskopischen Resektion wegen Leiomyoms unterziehen, intrauterine Adhäsionen, die für das Asherman-Syndrom (AS) charakteristisch sind20,21. AS betrifft ~2% der Frauen und verursacht Amenorrhoe, Dysmenorrhoe, Versagen der Embryonenimplantation, wiederholte Fehlgeburten, vorzeitige Wehen und/oder PAS21,22. Angesichts der erheblichen Morbiditäten und Mortalitäten, die mit früheren Uterustraumata verbunden sind, ist ein experimentelles Tiermodell daher nicht nur für die Aufklärung der Mechanismen, durch die Gebärmutterwunden heilen, und wie sich Gebärmutterverletzungen auf spätere Schwangerschaftsergebnisse auswirken, von entscheidender Bedeutung, sondern auch als Plattform für die Entwicklung neuartiger Diagnostika und Therapeutika23,24.

In mehreren Studien wurden daher Mausmodelle für Gebärmutterverletzungen entwickelt. Frühe Studien untersuchten jedoch entweder nicht die Folgen einer Gebärmutterverletzung auf nachfolgende Schwangerschaften25 oder beschränkten die Schädigung der luminalen Oberfläche der Gebärmutter, um die Embryonenimplantation außerhalb des Fensters der Empfänglichkeit des Endometriums bei ovariektomierten Mäusen zu untersuchen26. Um diese Wissenslücken zu schließen, stellt das in diesem Protokoll beschriebene Modell zusammen mit anderen neueren Studien eine neuartige chirurgische Methode zur Einführung von Gebärmutterverletzungen bei Mäusen vor27,28. Dieses Protokoll verwendet die gewöhnliche Labormaus als Modellorganismus aufgrund ihrer breiten Zugänglichkeit, genetischen Nachvollziehbarkeit, kurzen Schwangerschaft, schnellen Zeit von der Geburt bis zur Pubertät, großer Würfe und Kosteneffizienz. Darüber hinaus ermöglicht die anatomische Besonderheit von zwei Gebärmutterhörnern bei Mäusen eine interne Kontrolle mit einem unverletzten Horn bei jedem Versuchstier sowie die Fähigkeit, lokale Defekte direkt an der Narbe vs. zu trennen. globale Defekte in der gesamten Gebärmutterumgebung. Der in diesem Protokoll beschriebene Ansatz beinhaltet eine einfache dorsale Laparotomie, gefolgt von der Verwendung einer gegrateten Nadel, um einen Schnitt sowohl durch die Endometrium- als auch durch die Myometrienschicht eines einzelnen Gebärmutterhorns zu erstellen. Diese Methodik ahmt Verletzungen bei Kaiserschnitten und Myomektomien am ehesten nach, kann jedoch leicht modifiziert werden, um nicht-inzisionale Verletzungen wie D&Cs zu untersuchen, die AS29,30 vorausgehen. Nach der Verletzung dürfen sich die Tiere erholen und paaren sich dann mit Deckrüden für zeitlich begrenzte Trächtigkeiten, um die Folgen der Verletzung für die späteren In-utero-Ergebnisse zu untersuchen27,28.

Obwohl die Gesamtstrategie anderen neueren Studien ähnelt, gibt es Aspekte dieses Protokolls, die deutliche Vorteile bieten. Zum Beispiel haben sowohl Li et al. als auch Burke et al. den Zugang zum Uterus abdominal und nicht dorsal, wie hier beschrieben 31,32. Ein dorsaler Zugang ist sowohl einfacher durchzuführen als auch förderlicher für eine schnelle postoperative Genesung des Tieres. Bei den nicht schwangeren Mäusen in der Studie von Burke et al. wurden gebogene Nadeln oder Küretten verwendet, um das Endometrium abzukratzen, wodurch D&Cs besser nachgeahmt wurden, im Gegensatz zu den Inzisionsverletzungen in voller Dicke in diesem Protokoll, die Kaiserschnitte und Myomektomien genauer modellieren32. Bei peripartalen Mäusen führten Burke et al. Schnitte auf dem Mesometrial ein, im Gegensatz zu der anti-mesometrialischen Oberfläche, auf der sich die Embryonen einnisten, wie hier beschrieben. Durch die Verwendung einer entgrateten Nadel im Gegensatz zu einer Schere, die von Li et al.31 verwendet wurde, kann dieser Ansatz leichter von Verletzungen in voller Dicke zu endometriumeingeschränkten Verletzungen modifiziert werden, um sowohl D&Cs als auch Kaiserschnitte und Myomektomien zu modellieren. Sowohl Li et al. als auch Burke et al. schlossen Uteruswunden mit Nähten, was zwar den Ereignissen während eines Kaiserschnitts besser entspricht, aber zusätzliche Variabilität in den Heilungsprozess sowie das Potenzial für Fremdkörpereffekte einführt 31,32,33,34,35,36. Ähnliche Studien an Ratten haben abdominale Wege verwendet, um sowohl bei nicht trächtigen38,39 als auch bei trächtigen37,39 Tieren inzisionale 37,38 oder exzisionale39 Gebärmutterwunden zu erzeugen, die mit Nähten 37,38,39 verschlossen wurden. Daher eignet sich das hier vorgestellte Protokoll besonders für Forscher, die an einem einfachen und reproduzierbaren Ansatz interessiert sind, der nur minimale chirurgische Erfahrung erfordert, embryonale Implantations- und Plazentationsereignisse nach einer Gebärmutterverletzung in voller Dicke behandelt und sich leicht an eine Vielzahl von Fragestellungen anpassen lässt, einschließlich D&C-ähnlicher Verletzungen des Endometriums27,28.

Schritt 1 dieses Protokolls beschreibt die präoperativen Schritte. Schritt 2 beschreibt das chirurgische Vorgehen zur Herbeiführung einer Verletzung des Gebärmutterhorns. In Schritt 3 schließlich wird die Dissektion einer trächtigen Mutterin beschrieben, um die Auswirkungen einer Gebärmutteroperation auf eine spätere Schwangerschaft zu untersuchen. Insgesamt stellt diese Studie ein einzigartiges chirurgisches Modell für Nagetiere zur Wundheilung der Gebärmutter und der damit verbundenen Schwangerschaftsergebnisse vor, das schnell durchzuführen und einfach anzuwenden ist.

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Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of California, Davis, genehmigt (IACUC-Protokoll #23985). Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren werden in der Regel an C3H-Weibchen im Alter zwischen 7 und 10 Wochen und einem Gewicht von 19 bis 25 g durchgeführt, obwohl dieses Protokoll je nach Fragestellung des Forschers für weibliche Mäuse aller Stämme, Altersgruppen und Gewichte geeignet ist. Überwachen Sie die Tiere vor der Operation, um sicherzustellen, dass nur gesunde Tiere ohne Anzeichen von Verletzungen oder Leiden für Studien verwendet werden. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung des Operationsfeldes

  1. Legen Sie vor dem Tag der Operation alle chirurgischen Instrumente (feine Pinzette (#5 oder #55), Nadelhalter, gebogene Irisschere und Hautclip-Applikator (mit Clips bestückt)) in Sterilisationsbeutel und Autoklaven.
  2. Wenn Sie ein injizierbares Anästhetikum verwenden, bereiten Sie eine Arbeitsverdünnung von 10 mg/ml Ketamin und 1 mg/ml Xylazin in 0,9% Natriumchlorid-Kochsalzlösung vor.
    HINWEIS: Alternativ ist die Verabreichung von Isofluran über den Nasenkonus eine akzeptable Form der Anästhesie40.
  3. Ziehen Sie unmittelbar vor der Operation persönliche Schutzausrüstung (PSA) an: Laborkittel, OP-Haarkappe, chirurgische Gesichtsmaske und Handschuhe.
  4. Bereiten Sie den präoperativen Bereich vor.
    HINWEIS: Dieser kann aus einer saugfähigen Bankunterlage bestehen, die mit Papiertüchern ausgelegt ist, und einem Käfig, in dem sich das Tier nach der Narkose vor der Operation ausruhen kann. Legen Sie den Tierkäfig mit Papiertüchern aus und legen Sie ihn neben die Arbeitsunterlage.
  5. Wiegen Sie das Tier, das für die Operation bestimmt ist, in einem tarierten Plastikbecherglas oder einem ähnlichen Behälter auf einer Waage (Abbildung 1A). Notieren Sie das Gewicht, um die entsprechenden Mengen an Anästhetika, Analgetika und Kochsalzlösung zu berechnen.
  6. Verabreichen Sie dem Tier eine injizierbare Anästhesie mit den folgenden Schritten:
    1. Füllen Sie eine Insulinspritze mit dem entsprechenden Volumen der Arbeitsverdünnung von Ketamin/Xylazin (siehe Schritt 1.1), um eine Dosis von 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin zu erreichen (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Zum Beispiel würde ein Tier mit einem Gewicht von 22 g 0,22 ml der 10 mg/ml Ketamin und 1 mg/ml Xylazin-Anästhesielösung benötigen.
    2. Injizieren Sie die entsprechende Dosis Ketamin/Xylazin intraperitoneal (I.P.), nachdem Sie das Tier sicher abgerieben und in eine Rückenlage gebracht haben41 (Abbildung 1C).
      HINWEIS: Bei Bedarf kann ein Abriebschutz verwendet werden.
  7. Überwachen Sie das Tier ca. 3 Minuten lang. Injizieren Sie zusätzlich 0,02 ml Ketamin/Xylazin-Lösung I.P.41, wenn während dieses Zeitfensters Bewegungen beobachtet werden.
  8. Überprüfen Sie, ob eine ausreichende Sedierung vorliegt, indem Sie ~10 Minuten nach der Anästhesie eine Kneifung der vorderen Zehen durchführen40,42.
    HINWEIS: Die Tiere erreichen in der Regel innerhalb von 10-15 Minuten eine chirurgische Anästhesieebene. C3H-Mäuse benötigen in der Regel ~20 % mehr Anästhetikum als C57BL/6- oder BALB/c-Tiere (z. B. 0,24 ml Ketamin/Xylazin-Lösung für ein 20-g-Tier). Die Dosierung muss möglicherweise empirisch auf der Grundlage jedes einzelnen Stammes bestimmt werden.
  9. Nach Beendigung der Bewegung injizierten41 dem Tier subkutan (S.C.) 0,5 mg/kg Buprenorphin mit verlängerter Freisetzung (Abbildung 1D).
    HINWEIS: Angesichts des geringen Volumens und der viskosen Beschaffenheit des Buprenorphin mit verlängerter Freisetzung wird empfohlen, es in der Nähe des Schulterblatts zu injizieren, während die Haut mit der anderen Hand gezeltet wird.
  10. Um die Augen des Tieres zu schützen, tragen Sie eine Augensalbe mit einem sterilen Wattestäbchen auf (Abbildung 2A).
  11. Legen Sie das betäubte Tier auf das präoperative Saugkissen, das mit Papiertüchern ausgelegt ist.
  12. Rasieren Sie die Schnittstelle am unteren bis mittleren Rücken vorsichtig mit einem Fellschneider (Abbildung 2B). Entfernen Sie überschüssiges Fell mit Papiertüchern, gefolgt von einer Fusselrolle (Abbildung 2C).1.12
    HINWEIS: Die Haarentfernungscreme kann mit einem sterilen Wattestäbchen aufgetragen werden, um das Fell vollständig zu entfernen.
  13. Desinfizieren Sie die Inzisionsstelle mit Alkoholpräparationspads und Povidon-Jod-Tupfern auf folgende Weise:
    1. Beginnen Sie in der Mitte der vorgesehenen Inzisionsstelle und wischen Sie mit dem Alkoholpräparationspad in kreisenden Bewegungen nach außen (Abbildung 2D).
    2. Wischen Sie anschließend die Inzisionsstelle auf ähnliche Weise mit einem Povidon-Jod-Tupfer ab (Abbildung 2E).
    3. Wechseln Sie zwischen frischen Alkohol-Vorbereitungspads und Povidon-Jod-Tupfern für insgesamt 3 Runden.
  14. Bereiten Sie das Operationsgebiet wie folgt vor (siehe Abbildung 3A):
    1. Legen Sie ein zweites saugfähiges Pad unter einen Strahler, gefolgt von einem sterilen OP-Tuch über das saugfähige Pad.
    2. Handschuhe und Illuminator mit 70% Ethanol sterilisieren.
    3. Platzieren Sie sterile chirurgische Instrumente an den Rändern des OP-Tuchs und platzieren Sie das Tier in der Mitte des Operationsbereichs.
  15. Schaffen Sie ein steriles Feld, indem Sie ein steriles Tuch (z. B. Glad Press 'n Seal) über das Tier legen, so dass nur die Schnauze freiliegt (Abbildung 3B).
    HINWEIS: Während des Gebrauchs können saubere chirurgische Instrumente auf sterilen Oberflächen wie dem sterilen Tuch im Operationsbereich platziert werden.
  16. Schneiden Sie ein kleines Quadrat über den rasierten Bereich, um einen Schnitt an dieser Stelle zu erstellen (Abbildung 3C,D). Siehe HINWEIS zu Schritt 2.1 (unten) für die genaue Position der Inzisionsstelle.

2. Chirurgische Einleitung einer Gebärmutterverletzung

HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt die Operation und das Verfahren zur Einführung einer Verletzung in ein einzelnes Gebärmutterhorn einer nicht schwangeren weiblichen Maus. Zunächst wird eine dorsale Laparotomie durchgeführt, um die Oberseite des Gebärmutterhorns freizulegen. Dann wird eine gegratete 25-G-Nadel in das Gebärmutterlumen eingeführt, um das Gebärmutterschleimhaut zu schädigen und auf Wunsch das Myometrium zu durchtrennen. Dadurch entsteht eine Längswunde im verletzten Gebärmutterhorn, die weitere Experimente ermöglicht, um Fragen wie die Heilung der Gebärmutter und die Auswirkungen einer Verletzung auf eine spätere Schwangerschaft zu beantworten. Es ist wichtig, dass das Tier vor der Durchführung der Operation ordnungsgemäß sediert wird. Wie in Schritt 1 beschrieben, deuten mehrere Parameter darauf hin, dass ein Tier ausreichend betäubt ist. Dazu gehören die Einstellung der Bewegung, eine Verringerung der Atemfrequenz und das Fehlen eines Reflexes der Vordergliedmaßen. Darüber hinaus sollte der Reflex der Hintergliedmaßen bei leichter Berührung fehlen, obwohl dieser Reflex manchmal trotz ausreichender Anästhesie vorhanden bleibt, wenn ausreichender Druck ausgeübt wird40,42.

  1. Schneiden Sie mit einer Schere (gerade oder gebogene Irisschere) einen 2-3 mm großen Schnitt in die Rückenhaut der Maus, während Sie die Haut mit einer feinen Pinzette (#5 oder #55) festhalten.
    HINWEIS: Schneiden Sie ~1/3 Abstand zwischen dem Ansatz des Schwanzes und dem Hals und ~0,5 cm von der Mittellinie ab. Siehe Abbildung 4A.
  2. Schneiden Sie einen 2-3 mm großen Schnitt in die Faszie, der unmittelbar über dem Eierstockfettpolster liegt (Abbildung 4B).
  3. Fassen Sie das Eierstockfettpolster vorsichtig mit einer Pinzette an und ziehen Sie es aus den Schnitten in den Faszien und der Haut heraus (Abbildung 4C).
    HINWEIS: Es kann sein, dass Teile des Fettpolsters geschnitten werden müssen, damit der Eierstock und die Gebärmutter aus der Körperhöhle entfernt werden können. Vermeiden Sie es, Teile des weiblichen Fortpflanzungstrakts selbst sowie die Milz und große Blutgefäße in der Nähe des Fettpolsters zu verletzen.
  4. Nachdem Sie das obere Drittel der Gebärmutter freigelegt haben, gehen Sie wie folgt vor (Abbildung 4D):
    1. Befestigen Sie die uterotubale Ligatur vorsichtig mit einer Pinzette (Abbildung 5A,B).
    2. Verwenden Sie das scharfe Ende einer entgrateten Nadel, um ein kleines Loch in der Oberseite der Gebärmutter zu erzeugen (Abbildung 5A,B).
    3. Führen Sie die Nadel vorsichtig ein und beginnen Sie, die antimesometriale Oberfläche des Gebärmutterhorns abzukratzen (Abbildung 5C).
    4. Fahren Sie mit dem Schaben fort, bis die vollständige Perforation sowohl der Endometrium- als auch der Myometrienschicht erreicht ist (Abbildung 5D).
      HINWEIS: Übermäßiger Druck mit einer Pinzette und/oder einer Nadel kann die Gebärmutter an der uterotubalen Ligatur aufreißen, was zur Trennung des Gebärmutterhorns vom Eileiter und dem Eierstock führt. Wenn es schwierig ist, mit der gegrateten Nadel ein Eintrittsloch in die Gebärmutter zu schaffen, ohne die uterotubale Ligatur zu beschädigen, kann alternativ eine ungegratete 25 G oder 27 G Nadel verwendet werden. In dieses Loch kann dann die gegratete Nadel eingeführt werden, um den Schnitt wie oben beschrieben zu erzeugen. Bei dem hier beschriebenen Ansatz werden Schnitte in voller Dicke in das Gebärmutterhorn eingeführt. Ist jedoch eine weniger großflächige Gebärmutterschädigung gewünscht, kann mit der gegrateten 25-G-Nadel nur die innersten Schichten der Gebärmutter, wie zum Beispiel die Gebärmutterschleimhaut, abgeschabt werden. Darüber hinaus werden bei diesem Verfahren keine Nähte verwendet, um die Gebärmutter zu schließen, um Fremdkörperreaktionen als zusätzliche Variable zu vermeiden. Die Uterusnaht ist jedoch eine akzeptable Alternative für dieses Verfahren.
  5. Bringen Sie das verletzte Gebärmutterhorn mit einer Pinzette vorsichtig in die Körperhöhle zurück (Abbildung 6A,B).
  6. Naht43: Schließen Sie die Faszie mit einer Naht der Größe 4-0 und entfernen Sie den überschüssigen Faden (Abbildung 6C-E).
    HINWEIS: In der Regel reicht eine einzige Naht aus, um den Schnitt in der Faszie zu schließen.
  7. Verschließen Sie den Hautschnitt mit Clips mit dem Hautclip-Applikator (Abbildung 6F).
    HINWEIS: Ein bis zwei Clips sind notwendig, um den Schnitt zu schließen.
  8. Subkutan injizierenSie 41 10 mg/kg Carprofen als Analgesie und 0,5 ml Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) zur postoperativen unterstützenden Versorgung. Siehe Abbildung 7A.
  9. Verwenden Sie einen Ohrlocher oder nummerierte Ohrmarken aus Metall, um das Tierzu identifizieren 44.
  10. Setzen Sie das Tier zur postoperativen Genesung in einen beheizten Käfig (Abbildung 7B).
    HINWEIS: Sobald das Tier in der Lage ist, seinen Kopf zu heben, bringen Sie es in einen normalen Käfig mit Einstreu zurück. Siehe Schritt 2.12 unten.
  11. Wenn Sie weitere Operationen mit denselben chirurgischen Instrumenten durchführen, führen Sie die folgenden Schritte aus:
    1. Zuerst mit 70% Ethanol und Papiertüchern reinigen.
    2. Sterilisieren Sie die Werkzeuge dann erneut, indem Sie sie für 30 s in einen trockenen Glasperlensterilisator legen.
    3. Lassen Sie die Werkzeuge vor dem weiteren Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen.
  12. Bringen Sie das/die Tier(e) in die Tiereinrichtung zurück, nachdem die Bewegung wieder aufgenommen wurde, ~1-2 Stunden nach der Genesung von der Operation, wenn Ketamin/Xylazin verwendet wurde, oder ~5 Minuten nach der Anästhesie mit Isofluran.
  13. Überwachen Sie die Tiere täglich auf Anzeichen von Schmerzen und Leiden und injizieren Sie täglich 10 mg/kg Carprofen nach Bedarf bis zu 3 Tage nach der Operation.
    HINWEIS: Die Grimassen-Skala45 und die Bewertung des Körperzustands46 sind tierärztliche Standardbewertungen des Wohlbefindens von Tieren.

3. Paarung und Sektion trächtiger Mäuse zur Beurteilung der Folgen einer Gebärmutterverletzung

HINWEIS: Abhängig von der spezifischen Forschungsfrage können verschiedene Endpunktanalysen nach einer Gebärmutterverletzung durchgeführt werden. Zum Beispiel können nicht trächtige Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verletzung seziert werden, um die Kinetik der Wundheilung zu untersuchen27. Darüber hinaus können verletzte Tiere durch natürliche Verpaarung oder Embryotransfer geschwängert werden, um die Auswirkungen der Verletzung auf spätere Trächtigkeiten zu untersuchen27. Dieser Schritt beschreibt die Beurteilung der embryonalen und plazentaren Entwicklung in einem geschädigten uterinen Milieu. Dieser Schritt enthält insbesondere Einzelheiten zum Einrichten von zeitgesteuerten Paarungen und zum Sezieren von Tieren am embryonalen Tag 12.5 der Trächtigkeit (E12.5, wobei der Morgen des Vaginalplugs als E0.5 definiert ist; weitere Informationen zur Identifizierung von Vaginalplugs in Schritt 3.2 unten). Insgesamt stellt Schritt 3 ein Beispiel für nachgelagerte Analysen dar, die nach einer Verletzung durchgeführt werden können, um eine bestimmte Reihe von experimentellen Fragen zu untersuchen.

  1. Nach der postoperativen Genesung führen Sie zeitgesteuerte Paarungen47 durch, indem Sie das verletzte Weibchen mit einem Deckrüden zusammenbringen, der 11 Wochen oder älter ist.
    HINWEIS: Die Dauer der Genesung nach einer Verletzung wird durch die jeweilige Forschungsfrage bestimmt. Studien, die dieses Protokoll verwenden, erlauben in der Regel eine Erholungsphase von 30 Tagen (mit einer Spanne von 5-105 getesteten Tagen), bevor zeitgesteuerte Paarungen eingeleitet werden. Trio- oder Haremspaarungen senken die Wohnkosten und erhöhen die Effizienz dieses experimentellen Ansatzes. Bitte beachten Sie jedoch, dass solche Verpaarungskonfigurationen einer institutionellen Genehmigung bedürfen und ausschließlich zum Zwecke der Sektion während der Schwangerschaft bestimmt sind. Lebendgeburten aus Trio- oder Haremspaarungen verursachen Stress für die Tiere und werden in der Regel nicht empfohlen oder erlaubt.
  2. Führen Sie jeden Morgen Vaginalpfropfen durch, bis ein Pfropfen identifiziert ist (siehe Abbildung 8). Zu diesem Zeitpunkt kann das Weibchen getrennt vom Rüden untergebracht werden.
    HINWEIS: Die Pfropfen erscheinen entweder als weiße Masse im Vaginalkanal (Abbildung 8A) oder als Ausbeulung des gesamten Vaginalbereichs. Wenn äußerlich keine Anzeichen eines Stopfens sichtbar sind, kann ein Sondensucher langsam in den Vaginalkanal eingeführt werden (Abbildung 8C,D). Jeder Widerstand vor dem vollständigen Einstecken der Spitze bis zur Biegung im Sondensucher ist ein Hinweis auf einen Stecker. Die Überprüfung der Stecker sollte um ~7 Uhr morgens oder so früh wie möglich am Morgen durchgeführt werden, da die Stecker im Laufe des Tages herausfallen. Weitere Einzelheiten zur Überprüfung von Vaginalstöpseln finden Sie unter Behringer et al.48. Für eine zusätzliche und zuverlässigere Bestätigung der Schwangerschaft kann der Hochfrequenzultraschall eingesetzt werden49,50. Wenn Ultraschall nicht verfügbar oder unerwünscht ist, hat sich gezeigt, dass die Gewichtszunahme eine Schwangerschaft mit hinreichender Genauigkeit vorhersagt (E7.7551).
  3. Tötet das Tier (nach institutionell anerkannten Protokollen) im gewünschten Gestationsalter. In der ANMERKUNG unten finden Sie Einzelheiten zur Durchführung der Euthanasie von Tieren und zur Auswahl eines Gestationsalters für die Sektion.
    HINWEIS: Das Steckdatum wird als E0.5 bezeichnet. Wählen Sie ein Gestationsalter zum Zeitpunkt der Opferung basierend auf der experimentellen Fragestellung, die behandelt wird. Zum Beispiel eignet sich E4.5-E5.5 für die Untersuchung der Periimplantationsbiologie. E11.5-E14.5 ist ratsam zur Untersuchung von Plazentadefekten in der Mitte der Schwangerschaft, einschließlich des Vorhandenseins von verschmolzenen Plazenten. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien für die Euthanasie von Tieren. Ein akzeptables Verfahren ist eine 8-minütige CO2 -Inkubationszeit, gefolgt von einer 2-minütigen Warte- und Beobachtungszeit und schließlich die sekundäre Bestätigung der Euthanasie durch Zervixdislokation.
  4. Bereiten Sie sich nach der Sterbehilfe wie folgt auf die Sektion vor (siehe Abbildung 9A):
    1. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf eine Sezierfläche.
    2. Besorgen Sie sich die notwendigen Präparierwerkzeuge (Pinzette, Schere) sowie Petrischale, die mit 1× PBS gefüllt sind.
    3. Um zu verhindern, dass lose Fellsträhnen an der Präparierstelle haften bleiben, befeuchten Sie das Bauchfell vor der Präparierung zuerst mit entweder 70 % Ethanol, Wasser oder 1× PBS.
  5. Machen Sie einen Schnitt im Unterbauch, indem Sie die Haut des Bauches mit einer Zange festhalten und mit einer Schere eine V-Form entlang des Bauches schneiden, bis Sie die Unterseite des Brustkorbs erreichen (~2 cm Schnitt für jeden Strich des Buchstabens "V"). Siehe Abbildung 9B-D.
  6. Setzen Sie einen V-förmigen Schnitt in die darunterliegende Bauchmuskelwand (~2 cm Schnitt für jeden Strich des Buchstabens "V"), während Sie ihn mit einer Pinzette halten und in V-Form schneiden, bis die Bauchhöhle sichtbar ist. Siehe Abbildung 9E,F.
  7. Legen Sie die Gebärmutter frei, indem Sie den Darm und andere Bauchinhalte vorsichtig zur Seite schieben. Ziehen Sie die Gebärmutter mit den Embryonen aus der Bauchhöhle in Sichtweite. Siehe Abbildung 9G.
  8. Entnehmen Sie die Gebärmutter zusammen mit den eingeschlossenen Embryonen aus der Bauchhöhle. Legen Sie die Gebärmutter in eine Petrischale, die mit 1× PBS vorgefüllt ist. Siehe Abbildung 9H.
    HINWEIS: Verwenden Sie eine Pinzette, um zuerst das Eierstockfettpolster zu greifen. Trennen Sie dann die Gebärmutter mit einer Schere vom Rest der Körperhöhle, indem Sie zuerst das Eierstockfett durchtrennen, dann die mesometrialen Arterien, die Vagina, die mesometrialen Arterien entlang des anderen Gebärmutterhorns und schließlich das zweite Eierstockfettpolster. Weitere Dissektionen können bei Bedarf für die gewünschte nachgelagerte Analyse, wie z. B. Mikroskopie oder Histologie, durchgeführt werden. In Abbildung 10 finden Sie Beispieldaten.

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Ergebnisse

Nach einer Operation mit Ketamin/Xylazin als Anästhetikum sind die Tiere in der Regel innerhalb von ~1 h teilweise mobil und innerhalb von ~4-6 h vollständig mobil. Die Genesung von der Isofluran-Anästhesie erfolgt in der Regel innerhalb von Minuten. Eventuell auftretende Komplikationen wie Wunddehiszenz oder Schmerzen treten in der Regel innerhalb von 1-3 Tagen nach der Operation auf. Führen Sie tägliche Tierschutzkontrollen durch, um Schmerzen oder Komplikationen zu überwachen, bis der Hautschnitt verheilt ist und die ...

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Diskussion

Kaiserschnitte machen ~33 % der Geburten in den USA und bis zu 55 % bis 65 % der Geburten in Ländern wie Brasilien und Ägyptenaus 12,52, und dennoch ist wenig darüber bekannt, wie die Gebärmutter nach einer Verletzung heilt oder wie sich diese Verletzungen auf nachfolgende Schwangerschaften auswirken. Während ein vorheriger Kaiserschnitt ein Hauptrisikofaktor für Schwangerschaftserkrankungen wie Placenta accreta-Spektrum (PAS) un...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Wir danken den UC Davis Teaching and Research Animal Care Services (TRACS) für ihre kontinuierliche Unterstützung in Bezug auf die Haltung, das Verfahren und die Logistik. Wir danken dem Animal Model Core des UC Davis Cardiovascular Research Institute (CVRI) und dem Core-Direktor Dr. Yi-Je (Jay) Chen, D.V.M., Ph.D. für die technische Anleitung und Unterstützung sowie für die Nutzung des Operationssaals für die Dreharbeiten. Wir danken allen Mitgliedern des Zhang-Labors für ihre Unterstützung dieser Arbeit. Abbildung 5A wurde mit BioRender.com (https://BioRender.com/ig9sfon) erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9 % NaCl zur Injektion, sterilFresenius Kabi63323-186-10
25 G x 5/8 Zoll BD PrecisionGlide™ NadelBD305122
70% EthanolFisher ScientificBP82031GAL
Resorbierbares 4-0 Vicryl-NahtmaterialEthikonNr. J214
TierkäfigeVWR10712-110 und 10715-323Käfige, die von der Tiereinrichtung des Forschers zur Verfügung gestellt werden, sind akzeptabel
Tierischer OhrlocherFisher Scientific13-812-201
AutoClip-WundverschlusssystemWerkzeuge für die Feinwissenschaft12020-00
U-100 Insulin-SpritzeFisher Scientific14-826-79Marke BD
Betadin-TupferMedlineMDS093901
Buprenorphin mit verlängerter Freisetzung, 1,3 mg/ml (Ethiqa XR)Fidelis Pharmazeutika099114Alternative Buprenorphin oder Buprenorphin HCl mit verlängerter Freisetzung sind akzeptabel
Carprofen (RIMADYL) 50 mg/ml ZoetisRIM-00284R1
Gebogene IrisschereWelt PräzisionsinstrumenteArtikel-Nr.: 501759G
Sterilisator für chirurgische Instrumente mit trockenen GlasperlenVWR INTERNATIONAL75999-324
Trockene Glasperlen-NachfüllungVWR INTERNATIONAL75999-332
Weibliche Mäuse, typischerweise 8 bis 12 Wochen alt, z. B. Stamm C3HDer Charles-Fluss025
Feine Schere - gebogen 10,5cmWerkzeuge für die Feinwissenschaft14370-23
PelztrimmerFisher Scientific50-195-4544
Frohe Presse ' n SiegelFisher ScientificNC1089054
Handschuhe, NitrilFisher Scientific19-130-1597C
H2O, steril destilliertWerkzeuge für die Feinwissenschaft15230170
Illuminator für OperationenAmScope (Englisch)HL150-AY
Ketamin, 100 mg/ml (Zetamin)Dechra501072
LaborkittelUlineNr. S-15376W-50
LichtmikroskopFisher ScientificNr. S13039
FusselrolleFisher Scientific17-018-329
Nair HaarentfernungscremeZiel049-06-3304
NadelhalterWerkzeuge für die Feinwissenschaft12500-12
PapierhandtücherScott1804
PetrischaleFisher Scientific08-757-100
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
Becherglas aus KunststoffThermo Fisher Scientific12010250
Sondensucher mit gebogenem EndeFisher Scientific08-995
Fisherbrand&Handel; Sterilisationsbeutel mit sofortiger Versiegelung 9 cm (B) x 13,3 cm (H)Fisher Scientific181250
Fisherbrand&Handel; Sterilisationsbeutel mit sofortiger Versiegelung 9 cm (B) x 23 cm (H)Fisher Scientific181251
Pinzette, Fein, #5Werkzeuge für die Feinwissenschaft11254-20
Pinzette, Fein, #55 Werkzeuge für die Feinwissenschaft11295-51
MaßstabFisher ScientificNr. S93805
Schere, chirurgischWerkzeuge für die Feinwissenschaft14060-09
SprühflascheFisher ScientificS413505P
Sterile Alkohol-VorbereitungspadsFisher Scientific22-363-750
Sterile ophthalmologische VeterinärsalbePuralubePH-PURALUBE-VET
Sterile Tupfer für die Anwendung von AugensalbenFisher Scientific18-366-472
Sterilisations-BeutelFisher Scientific19-910-673
OP-AbdecktuchFisher Scientific50-209-1792
Chirurgische HaarkappeUlineNr. S-10480BLU
Chirurgische MaskenFisher Scientific18-048-010
Thomas Scientific Saugfähige Bankunterlage, Bankauflagen, 16,5 x 23 Zoll/42 x 58 cmFisher ScientificNC1588452
Warmhalte-/Induktionskammer mit vollständiger FußbodenerwärmungFisher Scientific14-370-302
Nachfüllungen für gewickelte ClipsWerkzeuge für die Feinwissenschaft12022-09
100mg/ml XylazinDechraRompun 100 mg/ml Xylazin

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