Ein zweisprachiger computergestützter Workflow zur Identifizierung potenzieller PLK1-Inhibitoren in der amerikanischen Gebärdensprache und im Englischen

Summary

Dieses zweisprachige Protokoll bietet einen computergestützten Workflow zur Wirkstoffentdeckung, der die Protein-Ligand-Interaktionen von Polo-ähnlichen Kinasen 1 bis 3 (PLK1–3) sowie die Eigenschaften Absorption, Distribution, Metabolism, Exkretion, Toxicity and Stability (ADMET-S) von datenbankbezogenen natürlichen Molekülen bewertet.

Abstract

Polo-ähnliche Kinase 1 (PLK1) spielt eine wesentliche Rolle in den Phasen S, G2 und M des Zellzyklus, und ihre Überexpression wird häufig bei mehreren Krebsarten, einschließlich Brustkrebs, beobachtet, wo sie zu genomischer Instabilität und dysregulierter Apoptose beiträgt. Im Gegensatz zu herkömmlichen ATP-kompetitiven Inhibitoren, die die Kinase-Domäne anvisieren, bietet die selektive Hemmung der Polobox-Domäne (PBD) von PLK1 eine vielversprechende Strategie, um die Protein-Ligand-Interaktionen zu stören, die für die mitotische Entwicklung entscheidend sind, und so Apoptose in Krebszellen auszulösen. Die hohe strukturelle Ähnlichkeit zwischen PLK1 und seinen Homologen (PLK2 und PLK3), die für die neurologische Funktion bzw. die Stressreaktion entscheidend sind, erfordert jedoch außergewöhnliche Selektivität, um Off-Target-Effekte zu vermeiden. Um diese Herausforderung zu bewältigen, beinhaltet das Protokoll einen zweisprachigen (amerikanischen Gebärdensprache und Englisch) rechnergestützten Workflow, der virtuelles Screening, strukturelles Clustering, Protein-Liganden-Andocken, Bindungsaffinitätsvorhersage, ADMET-S-Profilierung und quantenmechanische (QM) Stabilitätsanalyse integriert. Ausgehend von der SuperNatural 3.0 Naturproduktdatenbank wurden Verbindungen anhand von Brustkrebsrelevanz- und Arzneimittelähnlichkeitskriterien gefiltert, um chemische Vielfalt sicherzustellen, und ihre Interaktionen mit PLK1-, PLK2- und PLK3-PBD-Strukturen bewertet. Während virtuelle Andockungen und in silico ADMET-S-Bewertungen die Selektivität oder den Wirkmechanismus nicht eindeutig bestätigen können, generiert diese Studie testbare Hypothesen und priorisiert eine gezielte Auswahl von Kandidaten aus natürlichen Produkten für zukünftige molekulare Dynamiksimulationen, biochemische Validierung oder experimentelle Screening.

Introduction

Polo-ähnliche Kinasen (PLKs) sind eine Familie von Proteinkinasen, die strukturell aus einer N-terminalen Domäne und einem C-Terminus bestehen, bestehend aus einem oder zwei Polo-Box-Domänen (PBD)^1,2.  Die Anzahl und funktionelle Vielfalt dieser Polobox-Domänen variiert zwischen verschiedenen PLK-Familienmitgliedern. PLK1 ist an den S-, G2- und M-Phasen der Zellteilung beteiligt. Im Zellzyklus fungiert PLK1 als DNA-Schadenskontrollpunkt in der S-Phase und als Regulator der chromosomalen Kondensation und Zentrosomenreifung in der G2-Phase. PLK1 fördert außerdem den mitotischen Eintritt in die M-Phase, gefolgt von der Spindelmontage, dem Anaphaseneintritt und der Zytokinese ^3,4. Eine Überexpression von PLK1 führt zu genetischer Instabilität aufgrund abnormaler Zentrosomenbildung, was zu fehlfunktionierenden Zellzyklen führt, die die Apoptose nicht mehr regulieren können.  Eine solche Überexpression wird bei Lungen-, Kopf- und Hals-, Speiseröhren-, Magen-, Darm- und Brustkrebs beobachtet⁴. Daher könnte die Hemmung von PLK1 durch Wirkstoffe, die das PBD anvisieren, Apoptose ^5,6 auslösen. Dieser Workflow zielt darauf ab, eine hohe Selektivität zu erreichen, um eine Hemmung von PLK2 und PLK3 zu vermeiden, die für die neurologische Funktion und das Management von genotoxischem Stress³ entscheidend sind.

PLK2 wirkt in bestimmten Kontexten als Tumorsuppressor, reguliert den G1/S-Übergang und fördert den Abbau von Cyclin E, um unkontrollierte Zellproliferation zu verhindern. PLK3 spielt eine komplexe Rolle sowohl in der Regulation des Zellzyklus als auch in der Reaktion auf genotoxischen Stress und trägt durch seine Beteiligung an der Aktivierung von DNA-Schadenskontrollpunkten und der Apoptose-Induktion⁷ zur Aufrechterhaltung der Genomintegrität bei. Wichtig ist, dass sich die PLK1-Hemmung zwar als vielversprechende therapeutische Strategie für die Krebsbehandlung erwiesen hat, aber die wesentlichen Rollen von PLK2 und PLK3 in der neurologischen Funktion und Stressreaktion erfordern die Entwicklung hochselektiver Inhibitoren, um Off-Target-Effekte auf diese entscheidenden Kinasen^zu minimieren. Dieser biologische Kontext und strukturelle Ähnlichkeiten über 38%³ unterstreichen die Bedeutung der Identifizierung von Verbindungen, die speziell die Polobox-Domäne (PBD) von PLK1 angreifen, ohne die Schutzfunktionen von PLK2 und PLK3 in der normalen zellulären Physiologie zu beeinträchtigen.

Bekannte poloähnliche Kinase-(PLK)-Inhibitoren, insbesondere solche, die auf PLK1 abzielen, wurden aufgrund ihrer potenziellen therapeutischen Anwendungen in der Krebsbehandlung umfassend untersucht. Mehrere Verbindungen, darunter BI 2536, Volasertib (BI 6727), Onvansertib (NMS-1286937) und GSK461364, wurden entwickelt und in klinische Studien eingeführt, oft als ATP-kompetitive Inhibitoren ^8,9,10. Andere Inhibitortypen zielen auf das PBD ab, darunter Thymoquinon (TQ)^11,12, Poloxin^13,14 und Allopole-A¹⁵. Obwohl es Berichten zufolge vielversprechend ist, gibt es derzeit aufgrund von Herausforderungen, darunter suboptimale ADMET-S-Eigenschaften und Off-Target-Effekte⁶, derzeit keine zugelassenen PBD-spezifischen Inhibitoren oder klinische Studien in der Spätphase. Zum Beispiel sind mehrere PLK1-PBD-Inhibitoren Berichten zufolge unspezifische Proteinalkylatoren¹⁶, was ihre klinische Anwendbarkeit einschränkt. Daher bleibt die Verbesserung der Selektivität und der ADMET-S-Profile potenzieller PLK1-PBD-Inhibitoren ein zentrales Ziel in der Arzneimittelforschung.

Ziel dieser Studie ist es, potenzielle PLK1-PBD-Inhibitoren mit ADMET-S-Eigenschaften mittels virtuellem Screening, struktureller Ähnlichkeitsfilterung, Andocken, Bindungsenergieberechnungen und ADMET-S-Bewertung zu erforschen. PLK2 und PLK3 wurden denselben Protokollen unterzogen, um potenzielle Selektivität zu bewerten. Obwohl zahlreiche Rechenpipelines zur Entdeckung von Kinase-Inhibitoren existieren, integrieren nur wenige das gleichzeitige Selektivitätsscreening über PLK1–3 PBDs mit umfassenden ADMET-S- und quantenmechanischen Stabilitätsanalysen, insbesondere unter Verwendung natürlicher Produktbibliotheken. Der Workflow baut auf etablierten virtuellen Screening-Paradigmen auf, ist jedoch auf die Zugänglichkeit von Bildung und die Generierung von Hypothesen in der frühen Phase zugeschnitten. Das Protokoll benötigt nur einen Standard-Laptop (8 GB RAM), kostenlose akademische Software und keine vorherige Programmierkenntnisse, was es für High-School-, Bachelor- und Master-Settings geeignet macht, einschließlich kursbasierter Undergraduate-Forschungserfahrungen (CUREs).

Die Rechenpipeline für diese Arbeit beginnt mit der Proteinpräparation, bei der Strukturen von PLK1-PBD, PLK2-PBD und PLK3-PBD aus der Proteindatenbank (PDB) abgerufen oder modelliert und verarbeitet werden, um strukturelle Unstimmigkeiten zu beheben. Anschließend wurde ein Datenbankscreening für Naturprodukte durchgeführt, bei dem Verbindungen nach Potenzial als Brustkrebsbekämpfung und der Einhaltung der Lipinski-Regel der Fünf gefiltert wurden. Weitere Schritte sind die Clusterung in 50 repräsentative Strukturen basierend auf molekularem Fingerabdruck und Ähnlichkeit. Diese Vertreter unterzogen sich Protein-Liganden-Andocken und Bindungsaffinitätsberechnungen und generierten Interaktionsdaten für die drei PLKs. Anschließend werden die Eigenschaften von ADMET-S mit drei verschiedenen Webservern bewertet, um Pharmakokinetik, Arzneimittelähnlichkeit, Toxizität und metabolische Stabilität vorherzusagen. Quantenberechnungen wurden verwendet, um die molekulare Stabilität mittels der Analyse des HOMO-Lückens (HOMO) und des niedrigsten unbesetzten Molekularorbitals (LUMO) der HOMO-LUMO-Lücke zu bewerten. Schließlich wurden die ADMET-S-Daten analysiert, um Verbindungen anhand der physikochemischen, Absorptions-, Verteilungs-, Stoffwechsel-, Ausscheidungs-, Toxizitäts- und Stabilitätskriterien als potenzielle und selektive PLK1-PBD-Inhibitoren zu filtern und zu bewerten.

Protocol

Die Research Resource Identifiers (RRIDs) und Versionsnummern aller verwendeten Softwaretools sind in der Materialtabelle angegeben.

1. Zielprotein-Präparation

1. Erstellen Sie ein Arbeitsverzeichnis für dieses Projekt, in dem strukturelle Dateien und Berechnungsergebnisse gespeichert werden können.
2. Besuchen Sie die Protein Data Bank, um den Identifikator des Zielproteins PLK1-PBD (4HCO¹¹) abzurufen, und setzen Sie sich anschließend mit Chemie von HARvard Molecular Mechanics - Graphical User Interface (CHARMM-GUI ^17,18) zusammen, um strukturelle Unstimmigkeiten zu beheben.
   1. Besuchen Sie CHARMM-GUI und registrieren Sie ein akademisches Konto. Nach der Registrierung eines akademischen Kontos klicken Sie auf den Eingabegenerator, dann auf PDB Reader, geben Sie die PDB-ID 4HCO ein und klicken Sie auf nächsten Schritt.
   2. Auf der nächsten Seite stellen Sie sicher, dass nur PROA – Proteinkette A ausgewählt ist und klicken Sie auf den nächsten Schritt für die nächsten zwei Seiten.
   3. Laden Sie step1_pdbreader.pdb in ein Verzeichnis herunter, benennen Sie die Datei in 4hco oder preferred um und verwenden Sie einen Texteditor oder Code, um Hitidin-Vorkommen (HSD) in (HIS) umzubenennen.
3. Wiederholen Sie das Verfahren für die PLK2-PBD (PDB-Kennung: 4XB0¹⁹) mit CHARMM-GUI.
   HINWEIS: Für Strukturen ohne PDB-Identifikatoren, wie die PLK3-PBD, verwenden Sie homologiemodellierte Strukturen oder Alphafold²⁰. Stellen Sie die Sequenzgenauigkeit von Uniprot²¹ sicher.

2. Überprüfung der Datenbank von Naturprodukten

1. Besuchen Sie die SuperNatural 3.0 Library-Datenbank mit Naturprodukten und wählen Sie die Unterseite²² der Krankheiten aus.
   1. Wählen Sie Brustkrebs mit jeglichen oder keinem Vertrauenslimit aus, da die gesamten Ergebnisse programmatisch gefiltert werden müssen, und klicken Sie auf Suchen. Klicken Sie auf Download the complete result file, um die Ergebnisse in einem bevorzugten Verzeichnis als .csv zu speichern. Anschließend verwenden Sie Code, um diejenigen mit Konfidenzgrenzen von 0,900–1,000 zu filtern (n = 1.193 von 73.406).
      HINWEIS: Alternativ kann der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Identifikator für Brustkrebs auf der Unterseiteseite²³ der Signalwege eingetragen werden.
   2. Gehen Sie zur FAQ-Unterseite , unten finden Sie den gesamten Datensatz, der als .csv zum Download verfügbar ist. Laden Sie dies herunter und verwenden Sie ein Skript, um die Simplified Molecular Input Line Entry System (SMILES)-Strings aus dem Datensatz mit SuperNatural-Kennungen der 1.193 Moleküle abzugleichen und eine Liste ihrer SMILES-Strings (smiles.csv) zu erstellen.

3. Cluster-Stichprobe

1. Laden Sie eine Anaconda-Distribution (https://www.anaconda.com/download) herunter, die fast alle Open-Source-Pakete enthält, oder laden Sie einzeln eine integrierte Entwicklungsumgebung (IDE) wie RStudio (RStudio Desktop - Posit) oder Jupyter (Jupyter Notebook) herunter. Installieren Sie RDKit²⁴, ein Open-Source-Cheminformatik- und Machine-Learning-Paket mit Conda.
   HINWEIS: Anweisungen zur Installation von Conda und zur Erstellung einer Conda-Umgebung finden Sie in der Dokumentation conda 25.9.2.dev31. Für RDKit-Installation und Moduleinrichtung in der Umgebung siehe Installation — Die RDKit 2025.03.6-Dokumentation.
2. Legen Sie das "Lipinski.py"-Skript in Supplemental File 1 in denselben Ordner wie "smiles.csv" und führen Sie es aus. Das Skript öffnet die Conda-Umgebung, lädt Module, liest die SMILES-Strings-Datei, wendet einen Filter basierend auf Lipinskis Rule of 5 zur Schätzung von Bioverfügbarkeit und Absorption an (n = 999 von 1.193) an und speichert eine Liste von SMILES-Strings als "all.csv".
   HINWEIS: Bestätigen Sie, dass "all.csv" erzeugt wurde und ~999 Verbindungen enthält (gefilterte Teilmenge). Öffnen Sie die Datei, um zu überprüfen, ob jeder Eintrag eine gültige SMILES-Zeichenkette enthält. Python läuft in RStudio, nachdem Folgendes in der Konsole ausgeführt wurde: library(reticulate); reticulate::use_condaenv(nameofcondaenv)
3. Legen Sie das "Clustering.py"-Skript (Supplemental File 1) in denselben Ordner wie "all.csv" und führen Sie es in der bevorzugten IDE aus. Die Skripte laden Clustering-Module, lesen die SMILES-Strings-Datei und gruppieren Compounds in 50 Cluster basierend auf molekularem Fingerprinting und Tanimoto-Ähnlichkeit.
   HINWEIS: 50 repräsentative Strukturen (rep_struct.csv, in der Supplemental File 1) werden im Verzeichnis als Liste von SMILES-Zeichenfolgen gespeichert. Die Tanimoto-Ähnlichkeit (auch bekannt als Jaccard-Index in der Chemieinformatik)²⁵ ist eine Metrik, die verwendet wird, um die strukturelle Ähnlichkeit zwischen zwei Molekülen anhand ihrer molekularen Fingerabdrücke zu quantifizieren, wobei der Tanimoto-Koeffizient von 0 (keine Ähnlichkeit) bis 1 (identische Fingerabdrücke) reicht. Stellen Sie sicher, dass "rep_struct.csv" genau 50 eindeutige SMILES-Einträge enthält, die jeden Cluster repräsentieren.

4. Berechnung der Protein-Liganden-Andockung und Bindungsaffinität

1. Besuchen Sie den AutoDock Vina-basierten Hohlraumerkennungs-Blind Docking-Webserver (CB-Dock2)²⁶.
   1. Gehe zum Docking-Tab und lade das 4HCO-Protein hoch.
   2. Um den Liganden hochzuladen, klicken Sie auf Ligand ziehen und fügen Sie einen Liganden aus der Liste der SMILES-Strings ein (rep_struct.csv, Supplemental File 1). Geben Sie im nächsten Feld eine E-Mail-Adresse ein, um die Datenerfassung zu erleichtern, und klicken Sie dann auf Auto Blind Docking. Wiederholen Sie das für die verbleibenden 49 kleinen Molekül-Cluster-Vertreter und kennzeichnen sie als lig1, lig2, ..., lig50.
2. Gehen Sie zum per E-Mail gesendeten Ergebnis und laden Sie die Zip-Ordner in ein Unterverzeichnis mit dem Titel 4HCO herunter, wobei Sie sie ordentlich benennen (4hco_lig1, 4hco_lig2, ..., 4hco_lig50).
   1. Entpacke die Ordner und entferne alle Dateien außer Protein-Ligand-Komplex-Dateien, die mit ".complex.pdb" enden.
      HINWEIS: Überprüfen Sie, dass jedes Ligandverzeichnis (4hco_lig1 to 4hco_lig50) die entsprechende Datei ".complex.pdb" enthält.
   2. Öffnen Sie eine Beispieldatei .complex.pdb mit einem Texteditor, um sorgfältig die Proteinketten-ID: P und die Liganden-ID A:UNL zu notieren und die Ordner mit einem Dateikompressionstool neu zu zippen.
   3. Besuchen Sie den PROtein binDing enerGY Prediction (PRODIGY) Webserver zur Bewertung der Selektivität und der Protein-Ligand-Bindungsaffinität²⁷.
      1. Klicken Sie auf den Tab PRODIGY-lig (Protein-kleines Molekül), um einen gezippften Ordner mit mehreren Protein-Liganden-Komplexen gleichzeitig (wie 4hco_lig1) hochzuladen. Geben Sie die Proteinketten- und Liganden-IDs ein, schließen Sie die Captcha-Verifizierung durch und klicken Sie dann auf Submit Prodigy-Ligand.
      2. Sobald die Daten verarbeitet wurden, klicken Sie auf die Archivdatei aller Ausgaben (.zip), um die Ergebnisse herunterzuladen. Wiederhole den vorherigen Schritt und die Ergebnissammlung für alle Unterverzeichnisse bis 4hco_lig50.
   4. Wiederholen Sie alle Schritte für die Proteine 4XB0 und PLK3 mit sorgfältiger Aufmerksamkeit für die Dateinomenklatur (wie 4xb0_lig1 oder plk2_lig1).
      HINWEIS: Bestätigen Sie, dass Ausgabe-CSVs für alle Protein-Liganden-Komplexe heruntergeladen werden und sowohl ΔG- als auch Grenzflächenrestdatenspalten enthalten.

5. ADMET-S-Bewertung

1. Besuchen Sie die ADMETlab3 3.0 Plattform²⁸.
   1. Klicken Sie unter "ADMET Screening" auf START und geben Sie eine Liste von SMILES ein.
      1. Öffnen Sie rep_struct.csv in einem Verzeichnis, um die gesamte Liste der SMILES-Zeichenketten in das Textfeld einzufügen und einzureichen.
      2. Bewerten Sie die Pharmakokinetik und die Eigenschaften der Arzneimittelähnlichkeit mithilfe des farbcodierten Bewertungssystems der Plattform und laden Sie die Bewertungsergebnisse als .csv Datei zur weiteren Analyse herunter.
      3. Navigiere zum SwissADME-Tool²⁹.
2. Fügen Sie die Liste der SMILES-Strings für alle 50 Moleküle in das Eingabefeld ein.
   1. Klicken Sie auf Ausführen , um Bioverfügbarkeit und Permeabilitätseigenschaften zu berechnen, einschließlich der BBB-Durchdringung.
   2. Laden Sie die Ausgabe als .csv-Datei herunter, um sie mit anderen ADMET-Ergebnissen zu integrieren.
3. Laden Sie ToxTree³⁰ (Toxic Hazard Estimation mittels Entscheidungsbaum-Ansatz) herunter und installieren Sie, das mit dem Betriebssystem des Nutzers kompatibel ist.
   1. Öffne die Software über das Terminal mit dem Befehl: sh Toxtree.sh
   2. Gib die SMILS-Strings einzeln in ToxTree ein, um die Toxizität basierend auf Cramers Regeln zu klassifizieren.
   3. Exportiere die Ergebnisse als .csv-Datei zur Integration mit anderen ADMET-Daten.
      HINWEIS: Prüfen Sie, ob die CSVs von ADMETLab3 und SwissADME mit der Anzahl der Liganden übereinstimmen (n = 50) und dass die Toxtree-Ergebnisse jede Verbindung nach Cramers Regeln (I–III) klassifizieren.
4. Nach der Installation von ORCA³¹ erstellen Sie im Arbeitsverzeichnis einen Ordner namens Stability und Unterordner für jedes Molekül (zum Beispiel plk1_lig1, plk1_lig2, ..., plk1_lig50).
   1. Verwenden Sie Avogadro (Avogadro), um jedes Molekül aus seinem SMILES-String zu erstellen: Gehen Sie zum Reiter Erweiterungen und klicken Sie auf Geometrie optimieren, um das Molekül zu optimieren. Generiere ORCA-Eingabedateien über Erweiterungen > ORCA > Generiere ORCA-Eingaben und wende folgende Einstellungen an:
      ! B3LYP OPT FREQ def2-TZVP
      %maxcore 4000
      %pal
      nprocs 1
      Ende
   2. Ändern Sie die heruntergeladene .sh Jobdatei für jeden Liganden, um eindeutige Jobnamen und eine E-Mail-Adresse aufzunehmen. Anschließend wird das "Stability"-Verzeichnis mit folgenden Befehlen in ein Hochleistungsrechensystem (HPC) übertragen:
      Ssh xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu
      mkdir ~/4hco
      SCP -r /local/path/to/stability xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu:~/4hco
   3. Führen Sie die Jobs über das Simple Linux Utility for Resource Management (SLURM Workload Manager für HPC-Cluster) mit einem Loop-Skript aus:
      für i in {1..50}; Tun
      cd ~/4hco/stability/plk1_lig${i}
      chmod +x job_lig${i}.sh
      sbatch job_lig${i}.sh
      fertig
   4. Nach Erhalt der Auftragsabschluss-E-Mails navigieren Sie zu den Ligandordnern und öffnen Sie Ausgabedateien, um die Daten zu überprüfen und die HOMO- und LUMO-Werte zu notieren:
      CD ~/4hco/Stabilität/plk1_lig1
      nano lig1.out

6. Analyse der ADMET-S-Daten

1. Kombinieren Sie die physikalisch-chemischen Eigenschaften, die aus SwissADME-Bioverfügbarkeits- und Permeabilitätsradarkarten gewonnen wurden, zu einer .csv Datei.
   1. Speichere die .csv-Datei bei SwissADME und nenne sie "Physiochemical.csv".
   2. Legen Sie das "Physiochemical.py"-Skript (Supplemental File 1) in denselben Ordner wie "Physiochemical.csv" und führen Sie es aus.
   3. Wenden Sie folgende Kriterien an: nHD: 0–7, nHA: 0–12, nStereo: <2, LogP: 0–3, LogD: 1–3, LogS: –4 bis 0,5, Fsp3: >0,41 und nHet: 1–15.
2. Leiten Sie die Absorptions- und Verteilungsdaten aus SwissADME ab.
   1. Machen Sie einen Schnappschuss und speichern Sie das BOILED-Egg^32-Diagramm in SwissADME.
   2. Wenden Sie folgende Kriterien an: Moleküle müssen im "Ei"-Bereich liegen und als p-Glykoprotein-Inhibitoren wirken, da die roten Punkte bevorzugt werden.
3. Leite die Stoffwechseldaten aus ADMETlab3.0 für Cytochrom (CYP)-Substrat und Inhibitoren ab.
   1. Speichere .csv Datei aus ADMETlab3.0 und nenne sie "Metabolism.csv".
   2. Bearbeite die .csv-Datei und behalte nur die Spalten CYP-inh und CYP-sub.
   3. Legen Sie das Skript "Metabolism.R" (Supplemental File 1) in denselben Ordner wie "Metabolism.csv" und führen Sie es aus.
   4. Wenden Sie folgende Kriterien an: CYP p450-Inhibitor und Nicht-Substrat als Kategorie 0 werden bevorzugt.
4. Leite die Ausscheidungsdaten aus ADMETlab3.0 für Plasma-Clearance und Halbwertszeit ab.
   1. Speichere .csv Datei aus ADMETlab3.0 und nenne sie "Excretion.csv".
   2. Bearbeite die .csv-Datei und behalte nur die Spalten cl-plasma und t0.5.
   3. Platziere das "Excretion.py"-Skript (Supplemental File 1) in denselben Ordner wie "Excretion.csv" und führe es aus.
   4. Folgende Kriterien werden angewendet: Plasma-Clearance: 0,01–5 ml/min/kg.
   5. nToxizitätsdaten von Toxtree für die Toxizitätsklasse und ADMETlab3.0 für die Anzahl der Toxophore.
      1. Speichere .csv aus ADMETlab3.0 und nenne es "Toxicity.csv".
      2. Bearbeite die .csv-Datei, behalte nur die Spalte Toxicophore und füge eine neue Spalte hinzu, die die Toxizitätsklasse jedes Liganden aus Toxtree aufzeichnet.
      3. Legen Sie das "Toxicity.py"-Skript (Supplemental File 1) in denselben Ordner wie "Toxicity.csv" und starten Sie es.
      4. Verwenden Sie folgendes Kriterium: Anzahl der Toxophore soll 0–2 betragen.
   6. Leiten Sie die Stabilitätsdaten aus ORCA-Ausgabedateien ab. Die ("ORBITALENERGIEN", speziell die HUMO- und LUMO-Energiewerte).
      1. Erstellen Sie ein Excel-Diagramm, in dem die HUMO- und LUMO-Energien jedes Ligandens als separate Spalten erfasst werden.
      2. Fügen Sie eine neue Spalte hinzu, die die Bandlücke berechnet (HUMO–LUMO = Bandlücke).
      3. Speichere das Excel-Diagramm als "Stability.csv".
      4. Legen Sie das "Stability.py"-Skript (Supplemental File 1) in denselben Ordner wie "Stability.csv" und führen Sie es aus.
      5. Wenden Sie folgende Kriterien an: Bandlückendifferenz zwischen 3,6–5 eV.

Results

Das Zielprotein-Strukturdateiprotokoll stellt sicher, dass die Zielproteindatei für Analyse und strukturbasiertes Andocken optimiert ist. Die resultierende Strukturdatei im PDB-Format ist frei von fehlenden Resten und Wasserstoffen, fehlenden Atomtypen und unnötigen Komponenten wie Wassermolekülen und kokristallisierten Liganden. Abbildung 1A, B zeigen visuelle Unterschiede (visualisiert durch Mol* Viewer³³) in Strukturen vor und nach der Vorbereitung. Wenn noch Restformatierungsprobleme bestehen (wie unerkannte Atomnamen oder unvollständige Reste), gibt CB-Dock2 typischerweise beim Hochladen einen Fehler aus. An diesem Punkt können kleinere manuelle Korrekturen, wie die Umbenennung von HSD in HIS oder das Entfernen nicht standardisierter Rückstände, vor erneutem Andocken vorgenommen werden.

Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse des Clusterings durch Principal Component Analysis (PCA) basierend auf molekularem Fingerprinting und Tanimoto-Ähnlichkeit. In der Abbildung ist jeder Cluster durch ein grau schattiertes Oval gruppiert, das ähnlich farbige Punkte enthält, welche die Moleküle in diesen Clustern repräsentieren.  Die PCA-Komponenten 1 und 2 auf den Achsen liefern eine zweidimensionale lineare Darstellung der Reduktion aus hochdimensionalen Elementen in Tanimoto-Matrizen. In dieser Studie wird die Tanimoto-Ähnlichkeit während des Cluster-Probenahmeschritts verwendet, um Redundanz zu reduzieren und die chemische Vielfalt der 999 Lipinski-konformen Naturprodukte zu verbessern. Durch die Berechnung paarweiser Tanimoto-Ähnlichkeiten mithilfe molekularer Fingerabdrücke wird der Datensatz in 50 Cluster strukturell verwandter Verbindungen aufgeteilt. Anschließend wird aus jedem Cluster ein einzelnes repräsentatives Molekül ausgewählt, wodurch sichergestellt wird, dass der endgültige Satz von 50 Liganden einen großen chemischen Raum einnimmt und gleichzeitig die rechnerische Redundanz bei Downstream-Andockungen und ADMET-S-Analysen minimiert. Diese Strategie erhöht die Effizienz und Repräsentativität des virtuellen Screenings, insbesondere bei der Arbeit mit großen Naturproduktbibliotheken wie SuperNatural 3.0. (siehe Abbildung 2).

Optimale Posen für jeden Protein-Liganden-Komplex werden simuliert, begleitet von vorhergesagten Affinitäten in Form von Vina-Scores unter den fünf CurPocket-Posen des PLK1-Proteins in CB-Dock2, wobei Van-der-Waals-Kräfte und Wasserstoffbrücken berücksichtigt werden.  Eine Beispielsimulation von Ligand 1 in Abbildung 3 zeigt die beste Bindung an die zweite CurPocket-Pose (C2), mit dem niedrigsten Vina-Wert von –7,5 kcal/mol im Vergleich zu den anderen vier Top-Posen. Das molekulare Andocken mit CB-Dock2 erfolgt durch eine Bewertungsfunktion, die auf empirischen Parametern und einem stochastischen globalen Optimierungsalgorithmus basiert. CB-Dock2 wurde rigoros validiert und zeigte eine überlegene Leistung im Vergleich zu anderen hochmodernen Blindandock-Tools, was es zu einer ausgezeichneten Wahl für Andockstudien^macht. Der Server erreicht eine Erfolgsquote von etwa 85 % bei der Binding Pose Prediction (RMSD <2 Å) und übertrifft damit gängige Werkzeuge, darunter die erste CB-Dock-Version, SwissDock, COACH-D und MTiAutoDock³⁴. Diese hohe Genauigkeit ist der innovativen Integration von zwei komplementären Andockschemata durch CB-Dock2 zu verdanken: strukturbasierten und vorlagenbasierten Ansätzen.

Abbildung 4 zeigt eine Heatmap der durchschnittlich vorhergesagten Affinitäten für jede Protein-Liganden-Kombination unter Verwendung der PRODIGY-Webserver-Affinitäten.  Höhere Affinitäten, gekennzeichnet durch niedrigere molare Energien (kcal/mol) und grünere Heatmap-Töne, sind günstige Bindungsaffinitäten. Im Gegensatz dazu sind niedrigere Affinitäten, gekennzeichnet durch höhere molare Energien und rötlichere Heatmap-Tönungen, weniger günstig. Aus Sicht der Selektivität ist es ideal, Verbindungen mit günstigen Affinitäten zum Zielprotein (PLK1) im Vergleich zu Homologen (PLK2–3) zu haben. Zum Beispiel ist Ligand 27 ein selektiver PLK1-PBD-Ligand im Vergleich zu Ligand 45, der ähnliche Affinitäten über alle drei Proteine hinweg aufweist. Obwohl die Treffer 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35 und 49 eine höhere Affinität für PLK1-PBD als für PLK2/3 zeigen, sind sie chemisch vielfältig im 2D-Fingerabdruckraum (Mittelwert ECFP4 Tanimoto ≈ 0,135, kein Paar ≥ 0,50), was darauf hindeutet, dass eine breitere Spezifität wahrscheinlich eher durch konservierte PBD-Taschengeometrie und gemeinsame 3D-Pharmakophor-/Interaktionsmuster als durch die Gerüst-Identität verursacht wird. Empfehlungen umfassen den Vergleich von Interaktions-Fingerabdrücken und die Kartierung der Pharmakophore zur Identifizierung der strukturellen Determinanten der PLK1-PBD-Erkennung.

Die Ergebnisse der physikochemischen Eigenschaftsbewertung sind in einer Radarkarte dargestellt (Abbildung 5). Zu den bewerteten Eigenschaften gehören atomare Wechselwirkungen, Löslichkeit und Bioverfügbarkeit. Einige Verbindungen zeichnen sich durch ihre wünschenswerteren physikochemischen Eigenschaften mit den akzeptablen Bereichen aus: nHD = 0–7, nHA = 0–12, nStereo < 2, LogP = 0–3, LogD = 1–3, LogS = –4 bis 0,5, Fsp3 > 0,41 und nHet = 1–15. Dieses Radardiagramm bietet eine umfassende, multidimensionale Visualisierung der physikalisch-chemischen Eigenschaften der 50 repräsentativen Liganden, die im computergestützten Screening-Workflow identifiziert wurden. Sie ist darauf ausgelegt, zu bewerten, wie gut jede Verbindung den vordefinierten "arzneimittelähnlichen" Kriterien entspricht, indem sie ihre Eigenschaften gegen festgelegte untere und obere Grenzen abzeichnet. Die Tabelle zeigt zehn wichtige molekulare Deskriptoren, die um die Polarachse angeordnet sind, darunter pKa sauer und pKa basisch. Der schattierte Bereich zwischen dem grünen Polygon (Untergrenze) und dem blauen Polygon (Obergrenze) markierte den idealen oder akzeptablen Bereich für jede Eigenschaft, basierend auf den im Protokoll angegebenen Schwellenwerte. Die oberen und unteren Grenzen von pKa-Säure (2–12) und pKa-Base (3–10)) wurden anhand von Literaturübersichten^{35, 36 und 37} festgelegt, da es keine einheitliche obere und untere Grenze für pKa in der Arzneimittelentwicklung gibt. Jede farbige Linie repräsentiert einen der 50 Liganden. Die Form, die durch das Verbinden der Datenpunkte eines einzelnen Ligands entsteht, zeigt ihr Profil über die ausgewählten zehn Eigenschaften gleichzeitig. Die überwiegende Mehrheit der 50 Liganden liegt innerhalb oder sehr nahe an der akzeptablen Region, die durch die grünen und blauen Polygone definiert wird. Dies zeigt, dass die ersten Filterschritte, insbesondere die Anwendung von Lipinskis Fünferregel und die Clusterbildung auf Basis der Tanimoto-Ähnlichkeit, äußerst effektiv waren, um den Datensatz mit Molekülen mit günstigen arzneimittelähnlichen Eigenschaften zu bereichern. Die Darstellung des gesamten Bereichs dokumentierter Werte für alle Parameter wird empfohlen.

Abbildung 6A–C zeigt Komponenten von ADME-Daten aus ADMETlab3.0 und SwissADME. Ausgehend von der Absorption und Verteilung stellt das BOILED-Egg-Modell³⁸ in Abbildung 6A von SwissADME die Absorption und Verteilung der Medikamente über Lipophilität und Permeabilität dar, wie durch die gelben und weißen Ellipsen im Diagramm angezeigt. Es umfasst P-gp-Substrate und -Inhibitoren, die jeweils durch blaue bzw. rote Punkte dargestellt werden, wobei die Hemmung von P-gp für höhere Absorptionsraten entscheidend ist. In Abbildung 6B visualisiert die Stoffwechsel-Heatmap die Hemmung und das Substrat von etwa 7 Varianten von CYP-Cytochrom-p450-Enzymen. Das gewünschte Ergebnis für die Liganden ist, als CYP-Nicht-Inhibitoren und Nicht-Substraten (grün) zu dienen, wobei bevorzugte Ergebnisse ein sicheres Arzneimittelsicherheitsprofil mit keinen/niedrigen Wirkstoffwechselwirkungen bestätigen. Abbildung 6C zeigt Ausscheidungsdaten zur Klarierung und Halbwertszeit des Medikaments. Die Ausscheidung kann durch die optimale Plasmaräumung (<5 mL/min/kg) unterschieden werden. Die Halbwertszeit aller Antikrebsmedikamente hängt vom Wirkmechanismus, der Toxizität und dem Zielpunkt des Medikaments ab. Die ideale Halbwertszeit balanciert die Aufrechterhaltung der Arzneimittelkonzentrationen innerhalb eines therapeutischen Zeitfensters, minimiert gleichzeitig die Toxizität und ermöglicht bequeme Dosierungspläne^39,40.

Die Kombination zweier Arten von Toxizitätsbewertungen wird dargestellt. In Abbildung 7A ist die Anzahl der von ADMETlab3.0 identifizierten Toxophore für jeden Liganden dargestellt.  Es gibt keine eindeutige Schwelle oder Informationen zu den akzeptablen Werten von Toxophoren.  In Abbildung 7B liefert die Anwendung von Toxtree Informationen zur Toxizitätsklasse (I-III) sowie zu Verstößen gegen die Cramers-Regel und zur Einhaltung der Cramer-Regel. Das Probeergebnis für Ligand 1 zeigt die Toxizitätsergebnisse und seinen SMILES-Code in der oberen Leiste, mit der Struktur im unteren linken Fenster. Die Klassentoxizitätsidentifikation im rechten oberen Fenster zeigt eine hohe Toxizität (Klasse III) basierend auf den Cramers Regeln für Ligand 1 an, statt anderer Möglichkeiten wie Klasse II (mittlere Toxizität) oder Klasse I (geringe Toxizität).  Das untere rechte Fenster zeigt die schriftliche Begründung der Klassenidentifikation basierend auf Cramers Entscheidungsbaum der Regel.

ORCA-QM-Berechnungen der Schwingungsfrequenz für optimierte Strukturen berechnen Orbitalenergiewerte zur Bestimmung der Bandlücke. Abbildung 8 zeigt die Bandlücke (eV) jedes Liganden, abgeleitet aus der Differenz zwischen HOMO und LUMO. Der Schwellenwert wird im schattierten Bereich zwischen 3,6 eV und 5,0 eV dargestellt, wobei jeder Punkt im schattierten Bereich die Energieniveaus erfüllt, die mit einer wünschenswerteren Stabilität und Reaktivität verbunden sind. Ein Überblick über den gesamten rechnergestützten Arbeitsablauf ist in Abbildung 9 zusammengefasst, die die sequentiellen Phasen von der Zielproteinpräparation und dem Screening der Naturproduktdatenbank bis zur ADMET-S-Bewertung darstellt, die darauf ausgelegt ist, selektive PLK1-PBD-Inhibitoren zu identifizieren und gleichzeitig arzneimittelähnliche Eigenschaften und chemische Stabilität sicherzustellen. Diese visuelle Roadmap unterstreicht die Modularität, Zugänglichkeit und Eignung des Protokolls für die Umsetzung von Bildungseinrichtungen.

Tabelle 1 operationalisiert das Protokoll, indem es von einer linearen Abfolge von Anweisungen in eine robuste, fehlerbewusste Pipeline umwandelt, die für den Einsatz im Unterricht und in der unabhängigen Forschung geeignet ist. Es adressiert explizit die Reproduzierbarkeit, eine bekannte Herausforderung in der computergestützten Arzneimittelforschung, indem Validierungskriterien an wichtigen Übergangspunkten eingebettet werden. Zum Beispiel verhindert die Bestätigung, dass Hitidinreste nach der CHARMM-GUI-Verarbeitung einheitlich als "HIS" gekennzeichnet sind, stille Ausfälle im nachgelagerten Andocken, während die Validierung der Integrität von SMILES vor dem Clustering kaskadende Fehler in der ADMET-Vorhersage vermeidet. Die Tabelle hebt außerdem das pädagogische Design hervor, wobei jeder Fehlerbehebungstipp mit minimalem Rechenhintergrund umsetzbar ist (zum Beispiel ".complex.pdb in einem Texteditor öffnen, um Ketten-IDs zu überprüfen"), was mit dem Ziel des Manuskripts übereinstimmt, Barrierefreiheit für Gehörlose, Bachelor-/Master- und Oberschüler zu gewährleisten. Darüber hinaus hilft die Tabelle, indem Schritte markiert werden, bei denen Ergebnisse die Ergebnisse überproportional beeinflussen, wie etwa die Selektivitätsbewertung mittels vergleichender PRODIGY-Bewertung, den Nutzern, Aufmerksamkeit und Ressourcen zu priorisieren.

Eine zentrale Stärke dieses integrierten Workflows ist seine Fähigkeit, Diskrepanzen zwischen komplementären rechnerischen Vorhersagen aufzudecken und so Randfälle aufzudecken, die die Grenzen jeder einzelnen Methode unterstreichen. Zum Beispiel zeigte Ligand 5 für PLK1-PBD einen starken CB-Dock2 Vina-Wert (−7,9 kcal/mol) und eine günstige PRODIGY-Affinität (ΔG = −9 kcal/mol, Abbildung 4), konnte jedoch mehrere ADMET-Filter nicht bestehen. Sie entsprach nicht dem BOILED-Egg-Absorptions-Verteilungsmodell, zeigte einen weniger wünschenswerten Plasma-Clearance-Wert (9,3 mL/min/kg, Abbildung 6), was auf eine schnelle Eliminierung hindeutet, und wurde von Toxtree mit fünf Toxophoren als Cramer Klasse III (hohe Toxizität) klassifiziert (Abbildung 7A). Umgekehrt zeigte Ligand 33 eine moderate, PRODIGY-vorhergesagte PLK1-Affinität (−5,4 kcal/mol), erfüllte jedoch alle ADMET-Kriterien, mit niedriger Toxizität (Klasse I), optimalem LogP (0,7) sowie günstiger Absorptionsverteilung und Plasma-Clearance. Trotz seiner schwächeren Affinität ist Ligand 33 ein eher medikamentenähnlicher Kandidat. Dieser Kontrast veranschaulicht ein grundlegendes Prinzip in der Frühphasen-Arzneimittelentwicklung: Eine hohe Bindungsaffinität allein reicht ohne günstige Pharmakokinetik und Sicherheit nicht aus. Gleichzeitig können Verbindungen wie Ligand 5, obwohl sie eine schlechte ADMET-Leistung besitzen, dennoch wertvolle Gerüstideen für zukünftige Optimierungen liefern, um Sicherheit oder metabolische Stabilität zu verbessern, ohne die Wirksamkeit zu beeinträchtigen.

Obwohl frühe Filter in diesem Workflow zur Triage und Priorisierung gedacht sind und nicht zur dauerhaften Ausgrenzung, führt eine weitere Straffung der 50 Kandidaten dazu, dass einige als "Top Hits" bezeichnet werden, indem wünschenswerte Grenzen aus ADMET-Tools und der Literatur angewendet werden. Von den 50 geprüften Liganden, die in 114 ADMET-bezogenen und elektronischen Deskriptoren bewertet wurden, erfüllten 13 mindestens 95 der gewünschten Eigenschaftskriterien. Unter diesen zeigten sechs Verbindungen (10, 13, 14, 32, 43 und 47) sowohl günstige ADMET-S-Profile als auch höhere Bindungsaffinitäten für PLK1-PBD als für PLK2/3 und werden daher als die besten Inhibitorkandidaten eingestuft (Abbildung 10). Die vergleichenden strukturell-funktionalen und quantitativen Ähnlichkeitsanalysen zeigten, dass die identifizierten Treffer wichtige pharmakohorische Merkmale mit bekannten PLK1-PBD-Inhibitoren teilen, was auf eine mögliche Konvergenz im Bindungsverhalten hindeutet. Alle Treffer enthielten aromatische oder heteroaromatische Gerüste, die die hydrophoben Ringsysteme von TQ, Poloxin und Allopole-A widerspiegeln und so π–π und hydrophobe Interaktionen innerhalb der PBD-Tasche ermöglichen. Funktionelle Überlappungen zeigten sich durch konservierte Wasserstoffbrücken-Motive (Carboxyl-, Amid- und Carbonylgruppen), die analog zu jenen vermittelten, die wichtige polare Kontakte in den Referenzinhibitoren vermitteln. Flexible aliphatische und zyklische Linker, die in mehreren Treffern auftreten, spiegeln die konformationelle Anpassungsfähigkeit von Poloxin-Analogen wider und erleichtern so die Ausrichtung auf essentielle Bindungsreste. Quantitativ bestätigten Tanimoto-Ähnlichkeitswerte (0,36–0,54) eine moderate strukturelle Ähnlichkeit zwischen den Treffern und bekannten Inhibitoren, wobei die Treffer 10, 13 und 14 Poloxin am ähnlichsten, Treffer 32 zu TQ und Treffer 43 und 47 zu Allopel-A waren. Zusammen heben diese Ergebnisse eine klare strukturelle und funktionale Überschneidung hervor, was darauf hindeutet, dass die Treffer wahrscheinlich die Bindungstopologie und Interaktionsmuster validierter PLK1-PBD-Inhibitoren nachahmen, während genügend Neuheit für weitere Optimierung erhalten bleibt (Abbildung 10).

Um die Robustheit des rechnergestützten Arbeitsablaufs zu bewerten, wurden bekannte PLK1-PBD-Inhibitoren (Poloxinpan¹⁴ und Allopole-A¹⁵) als positive Kontrollgruppen analysiert, wobei Metformin und Imeglimin (zwei strukturell nicht verwandte Antidiabetika ohne berichtete PLK1-PBD-Aktivität) als Negativkontrollen über ADMET-S, Andockungs- und Bindungsaffinitätsanalysen fungierten. Die positiven Kontrollgruppen zeigten Bindungsaffinitäten von –5,8 bzw. –5,6 kcal/mol, während die negativen Kontrollen schwächere Affinitäten von –5,1 kcal/mol (Metformin) und –4,8 kcal/mol (Imeglimin) zeigten, was mit ihrer fehlenden PBD-Bindungsaktivität übereinstimmt. Interessanterweise zeigte die ADMET-S-Bewertung, dass die negativen Kontrollen mehr wünschenswerte Deskriptoren (88 von 114 Eigenschaften) erfüllten als die positiven Kontrollen (80 von 114), wodurch die Fähigkeit des Workflows validiert wurde, pharmakokinetische Vorteilhaftigkeit vom zielspezifischen Bindungspotenzial zu unterscheiden. Diese Bindungen unterstreichen die Bedeutung einer ausgewogenen Perspektive: Verbindungen sollten nicht vorzeitig allein aufgrund suboptimaler ADMET-Vorhersagen verworfen werden, wenn sie eine starke Zielaffinität zeigen, da solche Gerüste dennoch wertvolle Ausgangspunkte für die Optimierung bieten können. Umgekehrt können Moleküle mit ausgezeichneten pharmakokinetischen Eigenschaften, aber schwacher Bindung als risikoarme Vorlagen für die Analogentwicklung dienen. Weitere biochemische und zelluläre Validierung ist erforderlich, um diese rechnerischen Beobachtungen zu bestätigen und die Priorisierungskriterien zu verfeinern.

Abbildung 1: Strukturelle Vergleiche zwischen einer unvorbereiteten und einer von CHARMM-GUI vorbereiteten 4HCO-Struktur. (A) 4HCO-Struktur direkt aus dem PDB hochgeladen und die fehlenden Rückstände hervorhebt. (B) 4HCO-Struktur nach CHARMM-GUI-Vorbereitungsprotokoll. 4HCO (PLK1-PBD gebunden an TQ) wurde ausgewählt, weil es zu den wenigen PLK1-PBD-Kristallen mit organischem Liganden gehört, was es direkt auf diese strukturbasierte Entdeckung von Kleinmolekülinhibitoren anwendbar macht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Hauptkomponentenanalyse (PCA) von 999 Lipinski-konformen Naturprodukten nach K-Means-Clustering basierend auf molekularer Fingerabdrückung und Tanimoto-Ähnlichkeit. Jeder Punkt stellt eine Verbindung dar, die nach seinem zugewiesenen Cluster (1–50) gefärbt ist, wobei die Cluster durch graue Ellipsen gruppiert sind, um die chemische Ähnlichkeit zu betonen. Die enge Clusterbildung innerhalb der Cluster und die Trennung zwischen den Clustern deuten darauf hin, dass Tanimoto-basierte Clustering die strukturelle Redundanz erfolgreich reduzierte und gleichzeitig die chemische Vielfalt im gesamten Datensatz bewahrte. Diese Vielfalt stellt sicher, dass die 50 repräsentativen Liganden, die für das Downstream-Andocken ausgewählt werden, einen breiten Bereich chemischen Raums abdecken, was die Robustheit und Generalisierbarkeit der virtuellen Screening-Ergebnisse erhöht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: CB-Dock2-Blinddocking identifiziert eine Hochaffinitätsbindungspose von Ligand 1 innerhalb der PLK1-Polobox-Domäne (PBD). Die dargestellte CurPocket-C2-Konformation (Vina-Wert = −7,5 kcal/mol) stellt die optimale Position unter fünf vorhergesagten Bindungsstellen dar, gekennzeichnet durch günstige Van-der-Waals-Kontakte und Wasserstoffbrücken mit wichtigen PBD-Resten (Trp414, His538 und Lys540). Dieses Ergebnis bestätigt den Einsatz strukturbasierter blinder Andockung, um biologisch relevante Bindungstaschen ohne einen kokristallisierten Liganden zu lokalisieren, und zeigt, wie der Workflow Posen mit der stärksten vorhergesagten Bindungsenergie für die nachgelagerte Selektivitätsanalyse priorisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Heatmap des PRODIGY-Webservers vorhersagt Affinitäten durch Protein-Ligand-Kombinationen. Die Heatmap adressiert direkt die Überlappung zwischen Liganden, wenn sie an PLK1, PLK2 und PLK3 gebunden sind. Während einige Liganden (einschließlich Ligand 45) vergleichbare Bindungsaffinitäten über alle drei PLK-Isoformen hindeuten, was auf eine geringe Selektivität hindeutet, zeigen andere (insbesondere Liganden 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35 und 49) eine starke PLK1-Präferenz (ΔΔG ≥ 3,0 kcal/mol vs. PLK2/PLK3), was mit dem Ziel der PBD-selektiven Hemmung übereinstimmt. Quantitativ zeigen 20 der 50 Liganden eine fast zweifache Selektivität für PLK1 gegenüber sowohl PLK2 als auch PLK3, basierend auf PRODIGY-vorhergesagten ΔG-Werten. Diese differenzielle Bindung wird auf subtile Variationen in den PBD-Bindungstaschen zurückgeführt, die vom Blind-Docking-Protokoll erfasst werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Darstellung physikochemischer Eigenschaften kombiniert aus ADMETlab3.0 und SwissADME. Die Parameter sind nHD = Anzahl der Wasserstoffspender, nHA = Anzahl der Wasserstoffakzeptoren, basisches pKa, saures pKa, nStereo = Anzahl der Stereozentren, LogP = n-Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizient, LogD = n-Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizient bei pH = 7,4, LogS = wässriger Löslichkeitswert, Fsp3 = die Anzahl der sp3-hybridisierten Kohlenstoffe/Gesamtkohlenstoffanzahl und nHet = Anzahl der Heteroatome. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Eine Kombination von ADME-Ergebnissen von ADMETlab3.0 und SwissADME. (A) BOILED-Egg-Diagramm von Wildman-Crippin LogP (WLOGP) vs. Topological Polar Surface Area (TPSA) von SwissADME repräsentiert die Permeabilität der Absorption and Distribution Blood-Brain Barrier (BBB) im gelben (Eigelb-)Bereich, die Absorption durch den Magen-Darm-Trakt (HIA) in der weißen Ellipse, P-Glykoprotein-Substrate und Nicht-Substrate in blauen bzw. roten Punkten. Moleküle, die außerhalb der "Eizelle" liegen, gelten als schlecht aufgenommen und verteilt. (B) Heatmap des Stoffwechsels mit verschiedenen Cytochrom-P450 (CYPs)-Identifikatoren, die die Stabilität des menschlichen Leberstoffwechsels (HLM) betreffen, wobei Rot als Inhibitor/Substrate dient und Grün als Nicht-Inhibitoren/Nicht-Substrate, sodass Grün als Wünschenswert übrig bleibt. (C) Die Ausscheidung betrifft die Parameter, die Plasma-Clearance und die Halbwertszeit. Die gestrichelte rote Linie zeigt die gewünschte Plasma-Clearance an (<5 mL/min/kg), während 5-15 mL/min/kg bzw. >15 mL/min/kg eine moderate bzw. hohe Clearance angeben.  Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Integriertes Toxizitätsprofiling zeigt kritische Sicherheitsrisiken bei gescreenten Liganden auf. (A) Verteilung der Toxophorzählungen auf die 50 repräsentativen Naturprodukte, wie von ADMETlab3.0 vorhergesagt. (B) Probe der Toxizitätswerte für Ligand 1, die die Klasse-III-Toxizität in Rot markiert und mit einer ausführlichen Erklärung verwandter Cramer's Rules im untenstehenden Textfeld aufgeführt sind. Dieser Doppelbewertungsansatz (Toxophore + Cramer-Klasse) ermöglicht eine frühzeitige Triage von Hochrisikoverbindungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 8: HOMO–LUMO-Bandlückenenergien (in eV) für die 50 repräsentativen, von natürlichen Produkten abgeleiteten Liganden, berechnet mit ORCA auf der theoretischen Ebene B3LYP/def2-TZVP. Der abgeschiedene Bereich (3,6 bis 5,0 eV) bezeichnet das optimale Stabilitätsfenster: Bandlücken unter 3,6 eV deuten auf eine hohe chemische Reaktivität oder potenzielle Photodegradation hin, während Werte über 5,0 eV auf eine schlechte elektronische Polarisierbarkeit und eine verminderte Anpassungsfähigkeit der Bindung hinweisen können. Liganden innerhalb dieses Bereichs zeigen ein günstiges Gleichgewicht zwischen kinetischer Stabilität und molekularer Reaktion, was ihre Priorisierung als potenzielle PLK1-PBD-Inhibitorkandidaten unterstützt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 9: Flussdiagramm des bilingualen Workflows zur computergestützten Wirkstoffforschung. Die Pipeline beginnt mit der Vorbereitung von PLK1-PLK3-PBD-Strukturen, gefolgt von krankheitsfokussiertem Screening der SuperNatural 3.0-Datenbank und der Filterung mittels Lipinskis Fünferregel (Molekulargewicht ≤ 500 Da, Wasserstoffbrückenspender ≤ 5, Akzeptoren ≤ 10, LogP ≤ 5). Repräsentative Verbindungen werden nach dem Clustering ausgewählt und anschließend durch Protein-Liganden-Andocken, Bindungsaffinitätsvorhersage und umfassende ADMET-S-Profilierung bewertet, einschließlich Absorption, Verteilung, Stoffwechsel, Ausscheidung, Toxizität und Quantenstabilitätsbewertung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 10: Vergleichende strukturell-funktionelle Überschneidung zwischen Top-Kandidaten-Liganden und bekannten PLK1-PBD-Inhibitoren. Die Abbildung hebt die sechs wichtigsten Kandidatenverbindungen (10, 13, 14, 32, 43 und 47) hervor, die aus den kombinierten Analysen des virtuellen Screenings, Clusterings, Bindungsaffinität und ADMET-S-Profilings identifiziert wurden. Diese Liganden erfüllten mindestens 95 von 114 wünschenswerten physikochemischen und pharmakokinetischen Deskriptoren und zeigten höhere Bindungsaffinitäten für PLK1-PBD im Vergleich zu PLK2/3. Um potenzielle strukturelle und funktionelle Konvergenz zu bewerten, wurde jeder Ligand mit bekannten PLK1-PBD-Inhibitoren TQ, Poloxin und Allopole-A verglichen, basierend auf gemeinsamen Kern-Pharmakophoren-Motiven und paarweise Tanimoto-Ähnlichkeitskoeffizienten (ECFP4-Fingerabdrücke). Moderate Ähnlichkeitswerte (0,36–0,54) und häufige funktionelle Gruppen wie aromatische oder heteroaromatische Ringe, Wasserstoffbrücken-Donor/Akzeptorpaare und hydrophobe Linker deuten auf eine teilweise Überlappung der Bindungsmerkmale hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Workflow-Phase	Zwischenkontrollpunkt (wie man den Erfolg bestätigt)	Kritischer Schritt (warum er über Erfolg/Misserfolg entscheidet)	Häufige Probleme und Leitlinien zur Fehlerbehebung
1. Zielproteinzubereitung	• PDB-Datei wird fehlerfrei in der Mol*-Ansicht geladen. • Keine fehlenden Rückstände in der Bindungstasche (Sichtkontrolle). • Histidinreste, die als "HIS" gekennzeichnet sind (nicht HSD/HSE)	Ungenaue Proteinstrukturen → falsche Bindungstaschen → irreführende Andockposen. CHARMM-GUI gewährleistet korrekte Protonierung, Wasserstoffplatzierung und Entfernung von Wasser/Liganden.	Problem: CB-Dock2 lehnt die PDB-Datei ab. Behebung: Entfernen Sie nicht standardmäßige Rückstände, stellen Sie sicher, dass nur die Proteinkette vorhanden ist, und standardisieren Sie Atom-/Residuennamen mit einem Texteditor.
2. Filterung natürlicher Produkte (Lipinskis Regel der 5)	• "all.csv" enthält nur gültige SMILES (nicht-leer, chemisch parseierbar). • Erwartete Zählübereinstimmungen (z. B. 999/1.193).	Ungültige SMILES stürzen RDKit, Docking-Server und ADMET-Tools ab. Das Filtern muss die chemische Validität bewahren.	Problem: Das Skript schlägt während des Clusterings fehl. Lösung: Fügen Sie die Validierung von SMILES mit Chem.MolFromSmiles(smiles, sanitize=True) in Python hinzu; Protokollieren und entfernen Sie ungültige Einträge, bevor Sie fortfahren.
3. Cluster-Stichprobe	• 50 einzigartige SMILES in "rep_struct.txt". • PCA-Diagramm (Abb. 2) zeigt eine klare Clustertrennung.	Schlechte Clustering → redundante oder nicht vielfältige Vertreter → ineffiziente Screening.	Problem: Alle Moleküle gruppieren sich zu einer Gruppe. Korrektur: Fingerabdrucktyp (z. B. Morgan/ECFP4), Tanimoto-Schwelle und die Standardisierung von SMILES überprüfen. Erwägen Sie, die Clusterzahl zu erhöhen, wenn die Diversität gering ist.
4. Protein-Liganden-Andocken (CB-Dock2)	• Jeder Ligand liefert ≥1 ".complex.pdb"-Datei zurück. • Vina-Werte sind negativ (z. B. ≤ −5 kcal/mol). • Der Ligand befindet sich in CurPocket (nicht an der Oberfläche).	Andocken definiert Bindungspose und Affinität. Falsche Pose → falsche PRODIGY-Vorhersagen.	Problem: Job scheitert oder Ligand nicht angedockt. Lösung: Liganden in CB-Dock2 mit SMILES neu zeichnen; Stellen Sie sicher, dass keine Sonderzeichen im Dateinamen verwendet werden; Überprüfen Sie die E-Mail für den Status der Stelle. Falls persistent, probiere SwissDock als Backup.
5. Bindungsaffinität (PRODIGY)	• PRODIGY liefert ΔG-Werte für alle Komplexe. • Affinitäten korrelieren mit CB-Dock (Vina)-Werten (Trendkonsistenz).	Die Selektivitätsbewertung hängt von der genauen ΔG für PLK1 im Vergleich zu PLK2/PLK3 ab. Falsch zugewiesene Ketten-/Liganden-IDs → falsche Vorhersagen.	Problem: Fehler "Kette nicht gefunden". Korrektur: Öffnen Sie .complex.pdb in einem Texteditor; bestätigen Sie die Proteinketten-ID (z. B. "P") und den Namen der Ligandenreste (z. B. "UNL"); Eingabe korrekt in PRODIGY ein.
6. ADMET-S-Bewertung	• Alle 50 SMILES liefern Ergebnisse in SwissADME, ADMETlab3.0 und ToxTree zurück. • Keine "N/A"- oder "Error"-Zeilen in den ausgegebenen CSVs.	Inkonsistente ADMET-Daten → fehlerhafte Kandidatenrangliste. Plattformen können auf Gerüsten exotischer Naturprodukte scheitern.	Problem: ADMETlab3.0 lehnt SMILES ab. Lösung: Kanonisiere SMILES mit RDKit (MolToSmiles(MolFromSmiles(...))). Für ToxTree geben Sie jeweils ein Molekül ein und überprüfen Sie die Strukturwiedergabe.
7. Quantenstabilität (ORCA)	• Jeder ORCA-Job wird ohne "SCF nicht konvergiert" oder "Geometriefehler" abgeschlossen. • HOMO/LUMO-Werte, die in der Ausgabedatei (.out) vorhanden sind.	Die Bandlücke bestimmt die chemische Stabilität/Reaktivität. Fehlgeschlagene Jobs = fehlende Daten für den Schlüsselfilter.	Problem: ORCA-Job stürzt ab. Korrektur: Geometrie in Avogadro neu optimieren; Stellen Sie sicher, dass keine doppelten Atome entstehen; %maxcore erhöhen oder auf die DEF2-SVP-Basis für große Moleküle umsteigen.
8. Integrierte ADMET-S-Filterung	• Die endgültige Liste der Liganden erfüllt alle Kriterien (z. B. LogP 0–3, Bandlücke 3,6–5 eV, Cramer-Klasse I/II). • ≥1 Ligand zeigt PLK1-Selektivität (ΔΔG ≥ 2 kcal/mol vs. PLK2/3).	Zu strenge oder inkonsistente Schwellenwerte schließen gültige Leads aus; Zu lockere Schwellenwerte fördern toxische/instabile Verbindungen.	Problem: Keine Liganden passieren alle Filter. Lösung: Lockere jeweils ein Kriterium (z. B. erlaube LogP ≤ 4 oder 3 Toxiophoren) und dokumentiere Abwägungen. Vergleichen Sie mit bekannten Medikamenten zum Benchmarking.

Tabelle 1: Kritische Qualitätskontrollpunkte, entscheidende Entscheidungspunkte und Fehlerbehebungsstrategien im achtstufigen zweisprachigen Rechenabfluss zur Identifizierung selektiver PLK1-PBD-Inhibitoren. Jede Zeile entspricht einer wichtigen Protokollphase von der Proteinvorbereitung bis zur integrierten ADMET-S-Filterung und spezifiziert (i) wie ein erfolgreicher Abschluss überprüft wird (Zwischenkontrollpunkt), (ii) warum der Schritt entscheidend für den Gesamterfolg oder Misserfolg ist (kritische Schritt-Begründung) und (iii) praktische Lösungen für häufige technische Fehler (Fehlerbehebungsanleitung). Diese Tabelle dient sowohl als Validierungsfahrplan als auch als Lehrhilfe für Studierende und Forschende, die das Protokoll in akademischen oder ressourcenbegrenzten Umgebungen implementieren.

Ergänzende Datei 1: Python-Skripte. Enthält das Python-Skript für die Anwendung der Lipinski-Regel; das Python-Skript, das für die Clustering-Analyse verwendet wird; das Python-Skript für physikochemische Eigenschaftsberechnungen; das R-Skript für die Stoffwechselanalyse; das Python-Skript für die Ausscheidungsanalyse; das Python-Skript zur Toxizitätsvorhersage; das Python-Skript zur Stabilitätsbewertung; und die SMILES-Strings der 50 analysierten Verbindungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Diese Studie konzentriert sich auf einen explorativen rechnergestützten Workflow, um potenzielle PLK1-PBD-Inhibitoren mittels virtuellem Screening, Andocken und ADMET-S-Analyse zu identifizieren und zu bewerten. Die Pipeline priorisiert Verbindungen effektiv basierend auf vorhergesagten Bindungstrends und pharmakokinetischen Eigenschaften. In diesem Protokoll wird eine Reihe möglicher PLK1-Inhibitoren identifiziert und deren ADMET-Eigenschaften sowie Bindungsaffinitäten für PLK1–3-Proteine bewertet. Das Protokoll verwendet einen krankheitsorientierten Ansatz, um 50 Moleküle aus einer Datenbank von etwa 73.400 Molekülen zu identifizieren (Abbildung 9). Anschließend wurden diese 50 Moleküle einer ADMET-S-Bewertung unterzogen, bei der ihre pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften, Arzneimittelähnlichkeit und Stabilität berechnet wurden. Zusätzlich wurde ihre Bindungsaffinität für PLK1–3-Proteine berechnet, um deren hemmende Potenz gegen PLK1 und Selektivität zu bewerten. Basierend auf den Ergebnissen zeigten mehrere Moleküle wünschenswertere Eigenschaften. Nachfolgende Wirkstoffforschungsstudien entscheiden sich möglicherweise dafür, einige Moleküle auszuschließen und sich auf einige wenige aus dieser Untersuchung zu konzentrieren, oder sie vermeiden eine frühzeitige Ausscheidung und nutzen diese Ergebnisse später im Wirkstoffdesignprozess zur Optimierung der ADMET-Eigenschaften.

Die biologische Begründung für die Konzentration auf PLK1, PLK2 und PLK3 bei Ausschluss von PLK4 und PLK5 basiert sowohl auf strukturellen als auch funktionalen Überlegungen. PLK4 und PLK5 sind von dieser Arbeit ausgeschlossen, da sie sich strukturell und funktionell deutlich von PLK1 unterscheiden und für die Krebstherapie begrenzt relevant sind. PLK1, gekennzeichnet durch seine Kinase-Domäne und Polobox-Domäne (PBD), spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung mitotischer Ereignisse und ist damit ein zentrales Ziel für die Krebsbehandlung⁴¹. Im Gegensatz dazu sind PLK4 und PLK5 strukturell unterschiedlich: PLK4 enthält eine kryptische Polobox (CPB) statt eines kanonischen PBD und funktioniert hauptsächlich in Zentriolenduplikation. Gleichzeitig fehlt PLK5 eine funktionelle Kinase-Domäne und wird fast ausschließlich im Gehirn^exprimiert. Angesichts ihrer minimalen strukturellen Überschneidung mit PLK1-PBD und der begrenzten Relevanz für mitotische Dysregulation bei Krebs würde ihre Aufnahme die Selektivität für PLK1-PBD-Inhibitoren nicht sinnvoll beeinflussen. Daher bietet die Screening-Strategie einen biologisch relevanten und rechnerisch handhabbaren Rahmen zur Bewertung der Selektivität. Wichtig ist, dass die sechs Top-Kandidaten-Liganden (10, 13, 14, 32, 43 und 47) sogar noch günstigere Bindungsenergien und ADMET-S-Profile zeigten als die bekannten Inhibitoren TQ und Allopole-A, was sie als potenzielle PLK1-PBD-Modulatoren hervorhob.

Um eine robuste Implementierung zu unterstützen, insbesondere durch Studierende oder Forscher, die neu bei computergestützten Wirkstoffforschungstools sind, gibt es in Tabelle 1 eine Zusammenfassung der wichtigsten Kontrollpunkte (ebenfalls im Abschnitt Protokoll), kritische Schritte und Hinweise zur Fehlerbehebung für den Arbeitsablauf. Die Tabelle unterstützt Anpassungsfähigkeit; zum Beispiel kann ein Nutzer, der keinen HPC-Zugriff hat, feststellen, dass die ORCA-Stabilitätsanalyse aufschiebbar ist, und wenn ein Webserver ausgefallen ist, werden Alternativen wie SwissDock vorgeschlagen. Diese Flexibilität sorgt dafür, dass der Arbeitsablauf in verschiedenen institutionellen Kontexten tragfähig bleibt, während wissenschaftliche Strenge erhalten bleibt und die Neuheit der Studie als inklusiver, zweisprachiger und bildungsorientierter Beitrag zur Frühphasen-Arzneimittelentwicklung gestärkt wird. Obwohl der gesamte Workflow als integrierte Pipeline konzipiert ist, bestimmen mehrere entscheidende Schritte grundlegend seinen Erfolg oder Misserfolg (siehe Tabelle 1). Außerdem enthält das begleitende Video synchronisierte englische Untertitel und einen Gebärdensprecher (American Sign Language (ASL), der einen gerechten Zugang ohne Ablenkung ermöglicht. Die Anweisungen des Unterzeichners sind zeitlich mit den Aktionen auf dem Bildschirm abgestimmt, zum Beispiel das Signieren von "Nächster" und dann eine Pause, wenn der Cursor auf die Schaltfläche "Nächster" klickt. Während des 4HCO-Vorbereitungsschritts verwendet der Unterzeichner Fingerbezeichnungen ("A" und "B"), um die Kettenauswahl zu steuern, die in der Bildschirmaufnahme präzise gespiegelt wird. Im SuperNatural 3.0-Screening-Abschnitt vergrößert sich das Fenster des Unterzeichners und bewegt sich nach oben rechts, während die Aufmerksamkeit auf das "Pfad"-Symbol gelenkt wird, das pausiert, während der Cursor folgt. Diese Designentscheidungen stellen sicher, dass gehörlose und schwerhörige Zuschauer dieselbe integrierte, Echtzeit-Anleitung wie hörende Nutzer erhalten und so ein persönliches, vom Lehrer geleitetes Laborerlebnis effektiv nachbilden.

Neben den Vorteilen gibt es zahlreiche Möglichkeiten, den Arbeitsablauf zu verbessern. Erstens kann die anfängliche Filterung modifiziert werden; Anstelle krankheitsorientierter und clusterbezogener Probenahmemethoden könnte man mit Andocksimulationen aller Moleküle in der Naturproduktdatenbank beginnen, um zu bestimmen, welche Verbindungen am besten für die Bindung von Liganden-Ziel-Proteinen geeignet sind. Darüber hinaus sind detailliertere Schätzungen notwendig, um die Bindungsaffinität genau vorherzusagen.  PRODIGYS "keine elektrostatische" Berechnungen der Protein-Liganden-Affinität beinhalten das Einfügen der Zahlen der kategorisierten Arten von atomaren Kontakten, die an der Wechselwirkung beteiligt sind (Kohlenstoff-Kohlenstoff, Stickstoff-Stickstoff, Sauerstoff-Sauerstoff und andere Atome), in ein trainiertes mehrfaches lineares Regressionsmodell mit vierfacher Kreuzvalidierung, und diese Methode korrelierte signifikant mit experimentellen Affinitäten zu verschiedenen Gelegenheiten^42,43.  Alternative Ansätze wie FoldX⁴⁴, fastDRH⁴⁵, Deep-Learning-Modelle⁴⁶ und MD mit fortgeschrittenem Sampling können eingesetzt werden, und es werden unterschiedliche Grade an Übereinstimmung in den Vorhersagen erwartet, abhängig von der Genauigkeit jeder Methode⁴⁷.

Ein weiterer Aspekt ist, dass die verschiedenen Softwarewerkzeuge, die in der ADMET-S-Bewertung verwendet werden, zahlreiche Kennzahlen generieren, und das Verständnis jeder zur Bewertung der Arzneimittelkandidatur verwendeten Kennzahl ist entscheidend. Eine Möglichkeit, die Genauigkeit sicherzustellen, könnte darin bestehen, mehrere auf dem Markt befindliche Medikamente dem Protokoll zu unterziehen, um festzustellen, wie sie die Schwellenwerte erfüllen.  In diesem Zusammenhang erfordert die Toxizität weitere Forschung, da Moleküle nicht allein aufgrund von Toxizitätsprofilen aus nuancierten Entscheidungsbäumen wie Cramers Regeln verworfen werden, da viele verfügbare Medikamente ähnliche Klassifikationen aufweisen.  Die Anzahl der Toxiophore ist auch nicht vollständig aufschlussreich für die Toxizität, selbst in Verbindung mit Toxizitätsprofilen.  In diesem Zusammenhang wäre eine Erweiterung dieses Arbeitsablaufs die Durchführung vergleichender Überprüfungen von Kleinmolekülproben mit verfügbaren Medikamenten, um Interpretationen zu unterstützen.  So bezogen Forscher beispielsweise auf frühere Literatur, die die Anwendung und Beobachtungen von DFT-Berechnungen in aktuellen Brustkrebsmedikamenten wie Tamoxifen⁴⁸, Letrozol⁴⁹ und Cisplatin⁵⁰dokumentiert, bei der Interpretation der durch QM-Berechnungen der HOMO–LUMO-Bandlücken bestimmten Stabilität. Zuvor wurden ähnliche Arbeitsabläufe verwendet, um potenzielle Inhibitoren für verschiedene Krankheits-/Störungsziele⁵¹ zu identifizieren. Kürzlich haben Stafford et ^al.6 die Designstrategien von PLK1-PBD-Inhibitoren und therapeutische Möglichkeiten bei Krebs überprüft. Die neuesten Studien haben dual-targeting-Inhibitoren gegen PLK1-PBD und PLK4-PB3 identifiziert, mittels strukturgesteuerter Pharmakophormodellierung, virtuellem Screening, molekularem Andocken, molekularer Dynamik (MD)-Simulation und biologischer Bewertung⁵². Zhou et al. identifizierten außerdem PLK1-PBD-Inhibitoren aus der marine Naturproduktbibliothek mit 3D-QSAR-Pharmakophor, ADMET, Scaffold Hopping, Molecular Docking und MD⁵³.

Insgesamt ist die Neuheit dieser Studie vierfach. Erstens handelt es sich um ein zweisprachiges rechnergestütztes Protokoll, das sowohl in amerikanischer Gebärdensprache als auch in Englisch vermittelt wird und so die Zugänglichkeit und Inklusion in den MINT-Fächern fördert, insbesondere für gehörlose und schwerhörige Schüler und Forscher. Diese zweisprachige Durchführung ist in der computergestützten Arzneimittelforschung selten und entspricht der Mission der Gallaudet University, eine gerechte wissenschaftliche Ausbildung voranzutreiben. Zweitens, obwohl PLK1 weiterhin ein überzeugendes Ziel gegen Krebs ist, sind strenge rechnergestützte Studien zur Bewertung der Selektivität über PLK1, PLK2 und PLK3 unter Verwendung integrierter struktureller, energetischer und ADMET-S-Kriterien knapp. Die meisten bisherigen Versuche konzentrieren sich ausschließlich auf die Hemmung des Kinase-Domains oder fehlen vergleichende Selektivitätsprofilierung. Diese Arbeit schließt diese Lücke, indem ein anfängliches, exploratives, gleichzeitiges Screening-Protokoll gegen drei PLK-PBDs bereitgestellt wird, mit Filtern, die Verbindungen aufgrund hoher PLK1-Affinität und minimaler Off-Target-Bindung priorisieren. Drittens wurde der Arbeitsablauf mit Blick auf Effizienz und Benutzerfreundlichkeit konzipiert, insbesondere für Bildungs- und ressourcenbegrenzte Umgebungen. Die gesamte Pipeline von der Datenbankfilterung bis zur ADMET-S-Bewertung kann innerhalb von zwei Wochen auf Standard-akademischer Hardware (einem Laptop mit 8 GB RAM) abgeschlossen werden, wobei kostenlose webbasierte Software (CB-Dock2, PRODIGY, SwissADME, ADMETlab) genutzt wird. Andock- und Bindungsaffinitätsberechnungen sind keine zeitintensiven Schritte (~30 Sekunden pro Ligand). Der zeitaufwändigste Schritt ist die QM-Stabilitätsanalyse mit ORCA, die auf spätere Stufen verschoben oder auf Hochleistungsressourcen ausgeführt werden kann, wie demonstriert. Die Skripte sind modular und erfordern nur grundlegende Kommandozeilen- oder Jupyter-Notebook-Bearbeitungen, was eine nahtlose Integration in bestehende Lehrpläne ermöglicht. Die Laufzeit ist bescheiden, mit Datenbankfilterung und Lipinski-Konformität, die nur wenige Minuten benötigt; Das Clustern von ~1.000 Molekülen wird auf einem typischen Desktop in weniger als 30 Minuten abgeschlossen. Alle Software-Tools sind frei für akademische Nutzung, plattformübergreifend verfügbar (Windows, macOS, Linux) und erfordern keine kommerziellen Lizenzen, was die Einstiegshürden erheblich senkt. Viertens zeigen die identifizierten Liganden vielversprechende Bindungsaffinitäten, die mit nanomolaren Interaktionen übereinstimmen, verbunden mit günstiger Arzneimittelähnlichkeit, metabolischer Stabilität und niedrigen Toxizitätsprofilen. Mehrere Kandidaten ergeben sich als starke, selektive PLK1-PBD-Binder mit wünschenswerten ADMET-S-Eigenschaften, die eine weitere Validierung durch molekulardynamische Simulationen oder In-vitro-Tests erfordern.

Daher zeigt diese Studie über ihren methodischen Nutzen hinaus beispielhaft, wie zugängliche, Open-Source- und effiziente Computerwerkzeuge als Ausgangspunkt genutzt werden können, um eine hochwertige biomedizinische Herausforderung anzugehen und gleichzeitig inklusive wissenschaftliche Ausbildung zu fördern. Da PLK1-PBD-Inhibitoren in der Onkologie weiterhin an Bedeutung gewinnen, bietet dieser Workflow einen reproduzierbaren, bildungsfreundlichen Bauplan für die Frühphasen-Arzneimittelforschung. Seine Vielseitigkeit macht es geeignet für Highschool-, Bachelor- und Master-Bereiche und bietet eine ausgezeichnete Grundlage für CUREs, die den Studierenden authentische, praxisnahe Forschungsmöglichkeiten bieten. Im Gegensatz zu Pipelines, die ausschließlich auf Kinase-Domänen-Docking oder Single-Protein-Screening basieren, bewertet der Ansatz gleichzeitig die PBD-Selektivität über PLK1–3 hinweg, was aufgrund ihrer >38%igen strukturellen Homologie und unterschiedlicher biologischer Rollen notwendig ist. Darüber hinaus wurden durch die Kombination von Clustering, ADMET-S und QM-Stabilität in einem Open-Access-Framework Redundanz und Ausfallrisiko im Vergleich zum Brute-Force-Virtual-Screening reduziert.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADMETLab3	Simulationen Plus. Inc	V3.0	ADMET-Eigenschaften
Alphafold	Google DeepMind & Isomorphe Labs (Alphabet-Tochtergesellschaften)	V3.0.1	3D-Proteinmodellierung
Anaconda/Conda	Anaconda, Inc.	V24.9.2	Open-Source-Paketverwaltungssystem
CB-Dock2	Yang Cao Labor	V2.0	Protein-Ligand-Blindandocking
CHARMM-GUI	Lehigh Universität	V3.8	Biomolekulare Manipulation und Simulation
DARWIN AUF ZUGANG	Universität von Delaware	N/A	Hochleistungsrechnen
ORCA	FAccTs GmbH	V6.1.0	Quantenchemie-Paket
Proteindatenbank	Weltweite Proteindatenbank	RRID:SCR_006555	Proteindatenbank
RDKit	Open Source	RRID:SCR_014274	Cheminformatik-Programmierung
SuperNatural 3.0	Institut für Physiologie und Science-IT (Berlin)	V3.0	Bibliothek natürlicher Moleküle
SwissADME	Schweizerisches Institut für Bioinformatik	RRID:SCR_017865	ADME-Eigenschaften
Toxtree	Ideaconsult Ltd	V3.1.0	Toxizitätsklassifikation