Methodenartikel

Schätzung der telomerischen Repeat-enthaltenden RNA aus DNA/RNA-Hybridkomplexen

DOI:

10.3791/67984

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5. Dezember 2025

 ,  ,  ,  , 
1Betul-Ziya Eren Genome and Stem Cell Center, Erciyes University, 2Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 3INSERM-CNRS, Université de Nice

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung von DNA:RNA-Hybriden und deren zugehöriger RNA (einschließlich TERRA) über mehrere Gewebe hinweg. Während unser Ansatz eine Teilmenge hybrider Interaktionen erfasst, wäre für eine vollständige genomweite Charakterisierung eine zusätzliche genomische Kartierung erforderlich.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomerische wiederholungshaltige RNA (TERRA) ist eine lange, nicht-kodierende RNA, die aus allen Telomeren höherer Eukaryoten transkribiert wird, und nur eine Teilmenge dieser Moleküle bildet stabile DNA/RNA-Hybriden an den Telomeren. Wir haben ein detailliertes molekulares Protokoll entwickelt, um diese Hybrid-Schätzungen zu identifizieren und zu reinigen. Diese schlanke Methode ermöglicht die direkte Extraktion von DNA/RNA-Hybrid-Interaktionen, die natürlich in vivo gebildet wurden, und kann zur Detektion aller dieser Regionen eingesetzt werden. Durch die Minimierung der prozeduralen Schritte ist diese Technik äußerst effizient bei der Isolierung von RNA, die an DNA gebunden ist, und schätzt so die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der nachgelagerten Sequenzierung. Guanidin-Isothiocyanat-Reagenz wird zur vollständigen Zelllyse und Homogenisierung eingesetzt, wodurch die Integrität von Nukleinsäuren (DNA und RNA), insbesondere DNA/RNA-Hybriden, erhalten bleibt. Das Zufügen von Chloroform initiiert die Phasentrennung durch Zentrifugation (drei verschiedene Schichten): eine untere Phenol-Chloroform-Phase, eine Interphase und eine obere wässrige Phase. RNA, die sowohl aus dem Zellkern als auch aus dem Zytoplasma freigesetzt wird, bleibt in der wässrigen Phase erhalten, während hochmolekulare DNA, einschließlich der DNA/RNA-Hybridregionen, auf die Interphase beschränkt ist. Mit Isopropylalkohol, gefolgt von Zentrifugation, werden die wässrige Phase (freie RNA), Interphase und DNA, insbesondere DNA/RNA-Hybride, gewonnen. Um die verbleibenden Spuren von Proteinen zu entfernen, wird die Probe mit Proteinase K inkubiert. Die Behandlung mit DNase, Phenol/Chloroform-Extraktion, Isopropylalkohol und Zentrifugation erfolgt zur Freisetzung von RNA, die mit DNA hybridisiert ist.

Einleitung

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Die Transkription des Genoms führt zur Bildung temporärer Hybridmoleküle, bekannt als R-Schleifen, die aus dreisträngigen Strukturen bestehen. Diese Strukturen umfassen die nicht-kodierenden und kodierenden DNA-Stränge, wobei der nicht-kodierende Strang durch die Bildung von Hybriden mit der komplementären RNA1 verdrängt wird. Während der Genomtranskription werden aus beiden DNA-Strängen eine große Anzahl nicht-kodierender RNAs mit unterschiedlicher Rate produziert. Die meisten dieser RNAs dienen als kurzlebige Zwischenprodukte, aber einige spielen eine entscheidende Rolle in den regulatorischen Netzwerken, die die Genombiologie steuern, insbesondere in solchen, die aus nicht-kodierenden Regionen wie Telomeren und Centromeren1 entstehen. Die Verteilung von DNA/RNA-Hybriden im Genom kann auch die Transkriptionsaktivität der Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt widerspiegeln.

Mit wachsendem Interesse an den regulatorischen Funktionen nicht-kodierender RNAs wächst die Neugier, deren Transkription und Verteilung im Genom zu verfolgen, insbesondere in Form temporärer DNA/RNA-Hybriden. Um dem entgegenzuwirken, entwickelten wir einen unabhängigen Test zur Detektion stabiler DNA/RNA-Hybriden, der auf jede biologische Zelle oder jedes Gewebe anwendbar ist. Diese Methode ermöglicht die Isolierung komplementärer RNAs, die mit der DNA co-purieren, gefolgt von einer Analyse mittels PCR-Präzipitation oder -Sequenzierung.

Forschungen aus Zellkulturmodellen haben gezeigt, dass während der DNA-Replikation und -Transkription Replikationsstress, DNA-Schäden, Kollisionen mit der Replikationsgabel und das Pausieren der RNA-II-Polymerase aufgrund topologischer, struktureller und hybrider Ereignisse auftreten können. Diese Prozesse, insbesondere das Aufwinden der DNA-Doppelhelix, führen zu Torsionsspannungen, die während der Transkription1 zur Bildung abnormer Strukturen wie R-Schleifen führen können.

Die meisten R-Loop-Daten wurden mit Hefe- oder kultivierten Krebszellen erzeugt und basieren dabei auf dem DNA-RNA-hybrid-spezifischen monoklonalen Antikörper S9.6. Strukturelle Studien haben gezeigt, dass das antigenbindende Fragment (Fab) von S9.6 spezifisch an ein 13 bp starkes RNA-DNA-Hybrid-Duplex1 bindet. Die antikörperbasierte Detektion von R-Loops hat hauptsächlich Hybride identifiziert, die sich während der Transkription in guaninreichen Regionen bilden, wo eine verstärkte RNA-DNA-Hybridisierung wahrscheinlich stattfindet. In-vitro-Studien mit dem S9.6-Antikörper deuten darauf hin, dass RNAs mit vier oder mehr aufeinanderfolgenden Guaninen nahe ihrem 5′-Ende leichter nachgewiesen werden, was mit einer erhöhten R-Schleifenbildung1 korreliert. Verschiedene Enzyme wie Helikasen, Topoisomerasen, RNase H1 und RNase H2 helfen, das R-Loop-Gleichgewicht während der Transkription aufrechtzuerhalten. Die Störung der R-Schleifen-Homöostase steht im Zusammenhang mit erhöhter genomischer Instabilität und trägt zu Krankheiten wie Krebs und neurodegenerativen Erkrankungenbei.

Telomere, von denen einst angenommen wurde, sie seien transkriptionell still, wurden entdeckt, dass sie lange nicht-kodierende RNAs, bekannt als telomerische Repeat-Containing RNA (TERRA)3, transkribieren. Diese Transkripte stammen aus subtelomeren Regionen und enthalten telomerische Wiederholungen, die eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Telomerhomöostasespielen. In diesem Manuskript bezeichnen wir 'TERRA-hybride RNA' als die RNA-Moleküle, die aus DNA/RNA-Hybridkomplexen durch die DNase-I-Behandlung freigesetzt werden, wobei angenommen wird, dass sie TERRA-Sequenzen basierend auf Extraktionseigenschaften und Primer-Spezifität enthalten.

Die TERRA-Transkription erfolgt in Richtung des Zentromers zum Telomer und ist variabel in der Länge, von 100 bp bis 9 kb, wobei der Großteil des TERRA in der wässrigen Phase als freies RNA-Molekül gewonnen wird. Ein kleiner Anteil bleibt an der DNA gebunden und ist mit wichtigen biologischen Prozessen wie Krebs und Alterungverbunden. TERRA-Niveaus variieren je nach subtelomeren Loci und werden durch den heterochromatischen Zustand derTelomere 6 reguliert. Zellkulturstudien zeigen außerdem, dass TERRA-Transkripte aus verschiedenen subtelomeren Regionen eine Heterogenität in der Länge aufweisen. In einigen tumorabgeleiteten Zellkulturstudien haben Forscher festgestellt, dass die 20q-subtelomere Region die Hauptquelle von TERRA-Transkripten ist und diese Region oft an ihren CpG-Inseln 7,8,9 methyliert ist. Bei Mäusen ist der subtelomere Bereich des Chromosoms 18 ein Hauptort der TERRA-Produktion10,11. Zusätzlich wurde gezeigt, dass PAR-TERRAs, also TERRA-Transkripte aus pseudoautosomalen subtelomeren Regionen embryonaler Zellen, bis zu 200-mal mehr TERRA aufweisen als Chromosom18 11,12.

Die Transkription von TERRA wird durch DNA-Methylierung und Histonmodifikationen wie H3K9- und H4K20-Trimethylierung gesteuert, die TERRA unterdrücken, während die Histonacetylierung positiv mit der TERRA-Transkription 6,13,14 korreliert. TERRA bindet auch an extratelomere Regionen, einschließlich intergener Stellen und Intronen, was auf eine breitere Rolle in der Genomregulationhinweist 2.

Zusätzlich führt die Erschöpfung von TERRA zu einer Dysregulation zahlreicher Gene, insbesondere solcher in der Nähe der Bindungsstellen, was auf seine Rolle bei der epigenetischen Regulation von Chromatin und Genexpression2 hindeutet. Die TERRA-Akkumulation an verkürzten Telomeren fördert die homologe Rekombination (HR)-basierte Telomerverlängerung und trägt zur Telomerlängen-Homöostasebei 15,16 bei.

Um die Rolle von TERRA und anderen DNA/RNA-Hybriden zu untersuchen, setzten wir einen Assay ein, der speziell darauf ausgelegt war, RNA-Moleküle zu isolieren, die stabil mit DNA hybridisiert sind. Kurzzeitig wurden die Kerne isoliert und mit DNase-freier RNase behandelt, um ungeschützte RNA zu entfernen. DNA/RNA-Hybriden wurden anschließend mittels selektiver DNase-Verdauung extrahiert, die ursprünglich mit DNA hybridisierte RNA freisetzt. Dieser Anteil, bezeichnet als "DNA/RNA-hybrid-assoziierte RNA", wurde anschließend mit RNA-seq analysiert und mit der vollständig löslichen RNA verglichen mit der Standard-Phenol-Chloroform-Extraktion17. Dieser Ansatz ermöglichte es uns, sowohl telomerische als auch nicht-telomere Stellen der RNA-DNA-Hybridbildung zu identifizieren und die transkriptomischen Profile von DNA-gebundenen versus löslichen RNA-Pools zu vergleichen. Früher als Nebenprodukt der Telomer-Transkription angesehen, wird TERRA heute für seine doppelte Rolle bei der Telomererhaltung anerkannt, indem sie die Telomerasenaktivität und die homologe Rekombination beeinflusst, die für die Telomerlängen-Homöostase entscheidend sind. Darüber hinaus haben Fortschritte bei den Nachweistests ein detaillierteres Verständnis der dynamischen Interaktionen zwischen RNA und DNA im Genom ermöglicht. Dieses Wissen ebnet den Weg für eine weitere Untersuchung der Auswirkungen von DNA/RNA-Hybriden wie TERRA auf zelluläre Prozesse und deren mögliche Verbindungen zu Krankheiten wie Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen. Die laufende Forschung auf diesem Gebiet wird zweifellos unser Verständnis der genomischen Regulation und ihrer Relevanz für Gesundheit und Krankheit vertiefen.

Die in dieser Studie verwendete Methode zur Identifizierung von TERRA-Molekülen und DNA/RNA-Hybriden ist das hier beschriebene optimierte Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsprotokoll. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die gleichzeitige Isolierung von RNA-DNA/RNA-Hybriden, Gesamt-RNA und genomischer DNA in einem einheitlichen Workflow zu ermöglichen. Durch die strategische Modifikation der klassischen Dreiphasentrennmethode erleichtert dieses Protokoll die selektive Retention von DNA/RNA-Hybriden an der Phenol-Interphase und minimiert so deren Verlust – eine inhärente Einschränkung herkömmlicher Extraktionstechniken.

Traditionell basierte der Nachweis und die Isolierung von DNA/RNA-Hybriden auf der Immunpräzipitation mit dem S9.6-monoklonalen Antikörper, der speziell DNA/RNA-Hybridstrukturen18,19 erkennt. Dieser auf S9.6 basierende Ansatz ist zwar weit verbreitet, kann jedoch durch Antikörper-Zugänglichkeit, Kosten und potenzielle Kreuzreaktivität eingeschränkt werden. Im Gegensatz dazu bietet unser Protokoll eine kosteneffiziente, antikörperunabhängige Alternative, die sowohl auf zelluläre als auch auf gewebeabgeleitete Proben leicht anwendbar ist.

Um die Reinheit und strukturelle Integrität des isolierten DNA/RNA-Hybridanteils weiter zu verbessern, integrierten wir eine Proteinase-K-vermittelte Deproteinisierung, gefolgt von einer Behandlung mit DNase-I. Der DNase-I-Schritt verdaut selektiv den DNA-Strang der DNA/RNA-Hybriden und setzt so die hybridisierte RNA für die anschließende Isolierung und nachgelagerte molekulare Analysefrei 20. Dieser Ansatz stellt sicher, dass die gesicherten RNA-Arten speziell solche sind, die stabil mit DNA in vivo hybridisiert wurden. Dank seiner modularen Konfiguration und Skalierbarkeit ist unser Protokoll breit anpassbar an verschiedene biologische Kontexte und bietet Forschern ein robustes Werkzeug zur Untersuchung der DNA/RNA-Hybridbiologie in einer Vielzahl experimenteller Systeme.

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Protokoll

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Alle experimentellen Protokolle mit Tieren wurden vom Erciyes University Animal Ethics Committee genehmigt (Lizenznummer 19-07-2019, Entscheidung Nr. 19/127). In dieser Studie wurden Balb/c-Mäuse eingesetzt: fünf gesunde Weibchen, 6 Wochen alt (25 g), und fünf Männchen, 8 Wochen alt (30 g). Mäuse wurden nach den Prinzipien der Labortierpflege (europäische Regeln) gepflegt und behandelt. Die hier vorgestellte Studie verwendete Blutproben von 13 gesunden Kontrollpersonen, die aus einem früheren Forschungsprojekt stammten, das ethische Zustimmung des Human Ethics Committee der Erciyes University erhielt (Entscheidung Nr. 17/002). Eine grafische Zusammenfassung dieses Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Verwenden Sie RNase-freie Materialien und aseptische Techniken in allen Schritten, um den RNA-Abbau zu minimieren.

1. Mäusehaltung

  1. Um die angemessene Anästhetikumsdosis für die Euthanasie zu bestimmen, wiegen Sie jede Maus und verabreichen Sie Ketamin in einer Dosis von 60 mg/kg sowie Xylazin mit 10 mg/kg per intraperitonealer Injektion.
  2. Nach der Verabreichung der Anästhesie sollte die vollständige Anästhesie durch das Fehlen des Pedalrückzugsreflexes (Zehenkneifen) und fehlender Reaktion auf taktile Stimulation bestätigt werden. Sobald die Anästhesie bestätigt ist, wird eine Euthanasie durch zervikale Verrenkung durchgeführt.

2. Menschliche Proben

  1. Wählen Sie nach dem Screening die Teilnehmer als gesunde Kontrollpersonen aus, um jegliche Vorgeschichte chronischer Erkrankungen (wie Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Bluthochdruck oder Krebs), akute Infektionen, Autoimmun- oder entzündliche Erkrankungen, neurologische oder psychiatrische Erkrankungen sowie die kürzliche Anwendung von verschreibungspflichtigen Medikamentenauszuschließen 17.
  2. Nehmen Sie Hautbiopsieproben aus dem Bereich hinter dem Knie (Poplitealfossa) jedes Freiwilligen mit einem 2-mm-Stempelwerkzeug. Führen Sie vor dem Eingriff eine lokale Betäubung subkutan an und führen Sie alle Biopsien unter sterilen Bedingungen durch.

3. DNA/RNA-Hybridextraktion aus allen Zelltypen

  1. Gewebeentnahme und -lyse
    1. Für jede Extraktion verwenden Sie 500 μL Herzblut, einen ganzen Hypothalamus-Hypophysenkomplex, eine ganze Nebenniere oder eine Spermienprobe von einer einzelnen Maus.
    2. Übertragen Sie alle gesammelten Proben in sterile 1,5-mL-Röhrchen. Gib 500 μL Phenol zu jedem Röhrchen. Wirbel-Blutproben gründlich zum Mischen durchführen.
      1. Bei Gewebeproben homogenisieren Sie vollständig mit einer 2-mm-Spritze, bis keine sichtbaren Fragmente mehr übrig sind.
    3. Stellen Sie die Röhren auf einen Kühlblock, um die Probenintegrität zu erhalten.
      HINWEIS: Beachten Sie stets die Sicherheitsrichtlinien des Labors beim Umgang mit gefährlichen Reagenzien wie Phenol, Chloroform und Ammoniadetat.
  2. Phasentrennung
    1. Fügen Sie 180 μL Chloroform zu jedem Rohr hinzu und wirbeln Sie kurz zum Mischen. Röhrchen auf Eis 15 Minuten inkubieren, um eine Phasentrennung zu ermöglichen.
    2. Untersuchen Sie die Proben – stellen Sie sicher, dass die wässrige Phase klar erscheint. Wenn die Phase trüb ist, wirbeln Sie erneut und kehren für weitere 5 Minuten ins Eis zurück.
    3. Zentrifugiere Proben bei 12.000 × g, 4 °C für 15 Minuten.
  3. RNA-Präzipitation
    1. Übertragen Sie vorsichtig die klare wässrige Phase auf ein neues, steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr, das auf einem Kühlblock angebracht ist.
    2. Fügen Sie der wässrigen Phase ein gleiches Volumen (1:1) Isopropanol hinzu, vorziehen Sie kurz zum Mischen und inkubieren Sie 15 Minuten auf Eis.
    3. Zentrifugiere bei 12.000 × g, 4 °C für 15 Minuten.
      HINWEIS: Das RNA-Pellet sollte am Boden des Röhrchens sichtbar sein.
  4. Waschen des RNA-Pellets
    1. Drehen Sie das Rohr vorsichtig um, um das Supernatant zu entsorgen, ohne das Pellet zu stören.
    2. Fügen Sie 1,5 ml 70 % Ethanol zum Pellet hinzu. Klopfe vorsichtig 5 Sekunden lang auf den Schlauch zum Waschen.
    3. Zentrifugiere bei 7.500 × g, 4 °C für 5 Minuten.
    4. Wenden Sie das Rohr um, um das Supernatant zu entsorgen. Wiederhole das Ethanol-Waschen zweimal (insgesamt drei Waschen).
  5. RNA-Reinigung
    1. Nach der abschließenden Ethanolwäsche wenden Sie das Rohr um und lassen Sie eventuelle Reste Ethanol an der Luft trocknen oder entfernen Sie es vorsichtig mit einer Pipette.
    2. Gib 100 μL RNase-freies Wasser zur RNA-Pellet und pipettiere vorsichtig auf und ab oder schnippe den Röhren, um die RNA vollständig zu suspendieren.
      HINWEIS: Bewahren Sie RNA-Proben immer auf Eis oder einem gekühlten Rack/Kühlblock auf, um einen Abbau zu verhindern.
  6. RNA-Quantifizierung und -speicherung
    1. Stellen Sie das Röhrchen mit resuspendierter RNA auf Eis.
    2. Missen Sie die RNA-Konzentration und -Reinheit mit einem Spektrophotometer. Erfassung der Absorption bei 260 nm (A260), um die RNA-Konzentration zu bestimmen. Beurteile die Reinheit durch Berechnung der A260/A280- und A260/A230-Verhältnisse.
    3. Verwenden Sie nur RNA-Proben mit A260/A280-Verhältnissen zwischen 1,9 und 2,1 für nachgelagerte Anwendungen.
      HINWEIS: In dieser Studie lagen typische RNA-Konzentrationen zwischen 100 und 180 ng/μL.
    4. Die RNA-Proben werden bis zur weiteren Verwendung bei −80 °C aufbewahrt.
  7. Proteinentfernung und Isolierung der DNA
    1. Nach der RNA-Isolierung wird die Interphase aus dem Phenol-Extraktionsschritt beibehalten.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, da die Interphase DNA enthält, die nach Phenolzugabe und Zentrifugation weiter verarbeitet werden kann, um die DNA zu isolieren.
    2. Fahren Sie mit der DNA-Extraktion fort, indem Sie den Schritten 3.2.1-3.4.1 folgen, beginnend mit der Interphase als Ausgangsmaterial. Übertragen Sie vorsichtig die gesamte Interphase (mit DNA) aus der Phenolextraktion in ein steriles 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr, das auf einem Kühlgitter steht.
    3. Proteinverdauung: Fügen Sie 0,5 ml Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM EDTA; 0,1% SDS; 400 μg/mL Proteinase K) in die Tube ein. Über Nacht bei 56 °C inkubieren, um Proteine zu verdauen.
    4. Salzausfällung der DNA
      1. Am folgenden Tag geben Sie 100 μL 5 M Ammoniumacetat zu jeder Probe und mischen Sie kurz. Zentrifugiere bei 1.788 × g für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
      2. Übertragen Sie vorsichtig die klare wässrige Phase in ein neues, steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie der wässrigen Phase ein gleiches Volumen molekularbiologisches Isopropanol (Verhältnis 1:1) hinzu, mischen Sie es durch sanfte Inversion und zentrifugieren Sie bei 1.788 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorge das Supernatant, ohne das DNA-Pellet zu stören.
      3. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 1 ml 70%-Ethanol und zentrifugieren Sie dann 1.788 × g für 10 Minuten.
      4. Entferne und entsorge das Ethanol-Wash. Lassen Sie das DNA-Pellet kurz an der Luft trocknen.
      5. Suspendiere das getrocknete DNA-Pellet in 50 μL nukleasefreiem Wasser.
  8. Entfernen Sie freie Nukleinsäure, um DNA zu reinigen:
    1. Laden Sie die gelöste DNA auf eine DNA-Spin-Säule. Zentrifugieren Sie mit 15.000 × g für 15 Sekunden und verwerfen Sie den Durchfluss.
    2. Waschen Sie die Säule zweimal mit 70 % Ethanol und zentrifugieren Sie jedes Mal 1 Minute bei 15.000 × g. Entsorge den Durchfluss nach jedem Waschen.
    3. Übertragen Sie die Spin-Säule auf ein sauberes 1,5-ml-Sammelrohr. Fügen Sie 30 μL nukleasefreies Wasser zur Säulenmatrix hinzu, inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie dann 1 Minute bei 15.000 × g , um DNA zu elutieren.
    4. Legen Sie die elutierte DNA auf Eis. Teilen Sie die Probe in zwei Röhren: eines zur DNA-Speicherung bei 4 °C, das zweite Aliquot für die anschließende DNA/RNA-Hybridextraktion.
  9. Extraktion von RNA, die an DNA gebunden ist (DNA/RNA-Hybride)
    1. DNase-Behandlung
      1. Bereiten Sie eine DNase-Verdautungsmischung vor, indem Sie 5 μL (15 U) DNase I und 75 μL 10-fachen DNase-Verdauungspuffer kombinieren.
      2. Fügen Sie 80 μL der DNase-Mischung dem getrockneten DNA-Pellet hinzu. Die Probe 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
    2. Phenol-Chloroform-Extraktion
      1. Fügen Sie der Probe 300 μL Phenol hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur.
      2. Fügen Sie 180 μL Chloroform zur Mischung hinzu und inkubieren Sie weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur.
      3. Zentrifugieren Sie mit Höchstgeschwindigkeit (z. B. 15.000 × g) für 10 Minuten bei 4 °C, um die Phasen zu trennen. Übertragen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase (mit RNA:DNA-Hybriden) in ein neues Röhrchen.
  10. DNA/RNA-Hybrid-Isolation
    1. Schließen Sie die Isolierung von DNA/RNA-Hybriden von den Schritten 3.3 bis 3.5.2 ab.
    2. Fügen Sie der wässrigen Phase ein gleiches Volumen (1:1) Isopropanol hinzu, vorziehen Sie kurz zum Mischen und inkubieren Sie 15 Minuten auf Eis.
    3. Zentrifugiere bei 12.000 × g, 4 °C für 15 Minuten. Schau nach dem RNA-Pellet am Boden des Röhrchens. Drehen Sie das Rohr vorsichtig um, um das Supernatant zu entsorgen, ohne das Pellet zu stören.
    4. Fügen Sie 1,5 ml 70 % Ethanol zum Pellet hinzu. Klopfe vorsichtig 5 Sekunden lang auf den Schlauch zum Waschen. Zentrifuge bei 7.500 × g, 4 °C für 5 Minuten. Wenden Sie das Rohr um, um das Supernatant zu entsorgen. Wiederhole das Ethanol-Waschen zweimal (insgesamt drei Waschen).
  11. RNA-Reinigung:
    1. Nach der abschließenden Ethanolwäsche wenden Sie das Rohr um und lassen Sie eventuelle Reste Ethanol an der Luft trocknen oder entfernen Sie es vorsichtig mit einer Pipette.
    2. Gib 30 μL RNase-freies Wasser zum DNA/RNA-Hybrid-Pellet hinzu und pipette vorsichtig auf und ab oder schnippe den Röhrchen, um die RNA vollständig zu resuspendieren.
    3. Lagern DNA/RNA-Hybridproben bei −80 °C bis zur weiteren Verwendung.

4. cDNA-Synthese

HINWEIS: Stellen Sie die Integrität von RNA, cDNA und DNA sicher, indem Sie RNase/DNase-freie Materialien verwenden und Proben während des gesamten Eingriffs auf Eis halten.

  1. Für jede Probe verwenden Sie 6 μL (20 ng RNA; wie isoliert in Schritt 3.6.5 für freie RNA oder Schritt 3.13.3 für DNA/RNA-Hybrid-RNA). Übertragen Sie das benötigte RNA-Volumen in markierte PCR-Röhrchen.
  2. Bereiten Sie die cDNA-Synthese-Mastermischung gemäß den Anweisungen des Kit-Herstellers vor. Für jede Reaktion wird sichergestellt, dass die Mastermischung Reverse-Transkriptase, dNTPs, Primer, Puffer und RNase-Inhibitoren enthält. Für jede Reaktion werden 14 μL Mastermischung mit 6 μL RNA-Probe in einer PCR-Röhre kombiniert (Gesamtvolumen: 20 μL pro Reaktion). Führen Sie mindestens eine No-Reverse-Transkriptase-Kontrolle (-RT) ein, indem Sie eine parallele Reaktion ohne Hinzufügen des Reverse-Transkriptase-Enzyms mit derselben Menge RNA vorbereiten.
  3. Führen Sie cDNA-Synthese in einem thermischen Zyklus unter Verwendung des in Tabelle 1 angegebenen Temperaturprogramms durch.
  4. Verdünnen Sie die resultierende cDNA 1:5 mit nukleasefreiem Wasser und lagern Sie bei −80 °C bis zur qPCR-Analyse.

5. Bestimmung der TERRA-Expressionsniveaus mittels Q-PCR

  1. Bereiten Sie die qPCR-Reaktionsmischung mit einem SYBR Green-basierten qPCR-Kit vor, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Für jede Reaktion werden 1 μL SYBR Green Master Mix, 0,μL Forward Primer für TERRA (siehe Tabelle 2), 0,μL Reverse Primer für TERRA (siehe b) und μL nukleasefreies Wasser kombiniert.
  2. Geben Sie 16 μL der Reaktionsmischung in jede Mulde einer 96-Well-qPCR-Platte.
  3. Fügen Sie jedem Bohrloch 4 μL verdünntes cDNA (aus Schritt 4.6) hinzu, um ein endgültiges Reaktionsvolumen von 20 μL zu erhalten.
    HINWEIS: Für jede Probe sollten mindestens zwei technische Replikate und zwei biologische Replikate enthalten werden. Integrieren Sie No-Template-Kontrollen (NTCs) zur Überprüfung von Kontaminationen und No-Reverse-Transkriptase-Kontrollen zur Sicherstellung der Spezifität RNA-abgeleiteter Signale.
  4. Führen Sie qPCR mit dem in Tabelle 3 angegebenen Temperaturprogramm durch.
  5. Normalisieren Sie die TERRA-Expression zu β-Actin (Housekeeping-Gen) mit der 2-ΔΔCt-Methode .

6. Bestimmung der Telomerlänge

  1. Bereite die qPCR-Mischung für die Telomerlängenmessung 21 vor. Für jede Reaktion werden 1 μL SYBR Green Master Mix, 0,0 μL Telomer-Forward Primer (siehe Tabelle 2]), 0,μL Telomer-Reverse-Primer (siehe Tabelle 2) und μL nukleasefreies Wasser kombiniert.
  2. Gib 16 μL des Telomer-Reaktionsgemisch in jede Mulde einer 96-Well-qPCR-Platte.
  3. Fügen Sie jedem Bohrloch 4 μL genomische DNA (aus Schritt 3.10.5) hinzu, was ein Endreaktionsvolumen von 20 μL ergibt.
  4. Führen Sie qPCR gemäß den vom Hersteller festgelegten Programmparametern durch (siehe Tabelle 3).
  5. Parallel werden Reaktionen für ein Einzelkopie-Referenzgen (36B4) mit denselben Konzentrationen und dem gleichen Endvolumen eingerichtet.
  6. Standardkurven wurden mithilfe serieller Verdünnungen eines synthetischen telomerischen Oligonukleotids erzeugt (Tabelle 2), um die relative Häufigkeit und die Amplifikationseffizienz zu schätzen. Eine absolute Quantifizierung wurde nicht durchgeführt. Die relative Telomerlänge wird als T/S-Verhältnis berechnet (Telomerwiederholungskopie zur Gennummer einer einzelnen Kopie) mit der ΔCt-Methode21.

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Ergebnisse

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In dieser Studie quantifizierten und verglichen wir die Niveaus von freier TERRA, DNA/RNA-Hybrid-TERRA und Telomerlänge über mehrere Mausgewebe (Blut, Spermien, Haut, Hypothalamus, Hypophyse, Nebennieren) sowie in menschlichen Blut- und Hautproben, um gewebespezifische Dynamiken und die Beziehung zur Telomerbiologie zu untersuchen. Freies TERRA wurde aus der wässrigen Phase nach der Phenol-Chloroform-Extraktion (Protokollschritte 3.6.1-3....

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Diskussion

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Eine zentrale Stärke des hier vorgestellten Protokolls liegt in der schrittweisen Extraktion und Diskriminierung von freiem TERRA und DNA/RNA-Hybrid-TERRA aus komplexen Gewebeproben. Kritische Schritte umfassen die sorgfältige Trennung der wässrigen und Zwischenphasenfraktionen während der Phenol-Chloroform-Extraktion, da Kreuzkontamination die Unterscheidung zwischen freier und hybrider TERRA verunreinigen kann. Die anschließende Behandlung der Interphasenfraktion mit DNase-I ist ebenfa...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir sind der Erciyes University Scientific Research Unit dankbar für die Unterstützung dieser Arbeit mit den Fördermittelnummern TYL-2019-9224 und TSA-2022-11929.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 mL PCR-Röhren Greiner671201
15-mL Falcon-RöhrenIsolab078.02.001
2-mL-SpritzeHayatN/A
96- MehrwellenplatteGreiner50-720-3203
Absolutes EthanolMerck1070172511
AmonniumacetatSigma238074-500G
cDNA-Synthese-KitRoche07 912 439 001
ChloroformMerck1024451000
DNAse I Kit ZymoE1010
EDTASigmaE9884-1KG
GlasflascheIsolabLB. IS.061.01.901
StufenzylinderIsolab  015.01.901
Guanidinisothiocyanat SigmaG9277-100G
IsoproponalMerck1096342511
Light Cycler 480 IIRoche5015278001
Mikrozentrifugenröhren (1,5 mL)Greiner616201
Mikropipetten (10 & Mikro; L)GilsonFD10001
Mikropipetten (100 & Mikro; L)GilsonFD10004
Mikropipetten (1000 & Mikro; L)GilsonFD10003
Mikropipetten (2 & Mikro; L)GilsonGFAM00064
NanodropShimadzuC101-E112
PBS TabletSigmaP4417-50TAB
PCR-GerätSensoquestT3-0140
PGL3 BasisvektorPromega #212936
Pipettenspitzen (10 & Micro; L, 200 & Mikro; L, 1000 & Mikro; L)Greiner772352
Plastik-PetrischalenGreiner627102
Proteinase KSigmaP6556-10MG
SDSSigma8170342500
Serologische PipetteGreiner760107
DrehenGilsonPMC880
Sybr Green MasterRoche4707516001
ThermomixerEppendorf#5355
Trizma-BasisSigma1503-1KG         
TrizolBiorad7326890
Unimax 1010 DT ShakerHeidolph543-12310-00-6
VortexHeidolph541-10000-00-1
Zymo-Spin I SpaltenZymoC1003-50

Referenzen

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Telomere RNADNA RNA HybrideTERRA Sch tzungnicht kodierende RNAHybridreinigungPhasentrennungProteinase KDNase BehandlungPhenol Chloroform ExtraktionNukleins ureisolierung

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