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Methodenartikel

Eine einfache Doppelzentrifugationsröhrchenmethode zur Gewinnung von plättchenreichem Plasma aus Pferdeblut

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DOI:

10.3791/67985

15. August 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Plättchenreiches Plasma (PRP) wird bei der Behandlung von Erkrankungen des Bewegungsapparates bei Pferden eingesetzt. Verschiedene Techniken führen zu PRP mit unterschiedlichen Thrombozyten- und Leukozytenkonzentrationen. In diesem Artikel wird eine Methode zur Gewinnung von PRP aus Pferdeblut beschrieben.

Zusammenfassung

Plättchenreiches Plasma (PRP) wird häufig als Routinebehandlung für chronische Muskel-Skelett-Erkrankungen bei Pferden wie Osteoarthritis, Tendinopathien und Desmopathien eingesetzt. Diese Wirksamkeit beruht auf der hohen Konzentration an Wachstumsfaktoren und entzündungshemmenden Zytokinen, die bei der Aktivierung dieses orthobiologischen Wirkstoffs freigesetzt werden, unabhängig davon, ob er endogen oder exogen aktiviert wird. Trotz seiner wachsenden Popularität gibt es einen bemerkenswerten Mangel an Lehrvideos, die die Techniken zur Gewinnung von PRP bei Pferden demonstrieren.

In dieser Studie wird ein Doppelzentrifugationsröhrchenverfahren zur Gewinnung von PRP bei Pferden untersucht. Vollblut von sechs Pferden wurde in Natriumcitratröhrchen gesammelt und zweimal bei 120 × g für 5 min und 240 × g für 5 min zentrifugiert. Die mittlere Thrombozytenkonzentration für PRP betrug 360,95 ± 56,31 Thrombozyten (PLT) × 103/μl, während die mittlere Leukozytenkonzentration 3,05 ± 1,53 Zellen × 103/μl betrug. Die Thrombozytenzahl in PRP war 2,41x höher als im Vollblut, während die Leukozytenkonzentration in PRP 0,44x niedriger war. Die Sammeleffizienz für PLT in PRP betrug 17 %, während die Sammeleffizienz für Leukozyten in PRP 3,1 % betrug. Die mittleren Konzentrationen des transformierenden Wachstumsfaktors Beta 1 und des von Blutplättchen abgeleiteten Wachstumsfaktors BB in PRP betrugen 2601,82 (95 % Konfidenzintervall (KI): 2358,88-2844,76) pg/ml bzw. 1208,05 (95 % KI: 1051,09-1365,02) pg/ml. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PRP effizient und reproduzierbar durch eine einfache, kostengünstige Methode gewonnen werden kann, die für die Anwendung durch Pferdepraktiker geeignet ist.

Einleitung

Plättchenreiches Plasma (PRP) ist ein orthobiologisches Produkt, das häufig zur Behandlung chronischer Erkrankungen des Bewegungsapparates bei Pferden wie Tendinopathien, Desmopathien, Osteoarthritis und Hufrehe eingesetzt wird 1,2,3. Es ist auch wirksam bei der Behandlung von Wunden an den Gliedmaßen und Erkrankungen der Augenoberfläche 4,5. Die Begründung für seine Verwendung basiert auf den hohen Konzentrationen von Wachstumsfaktoren (GFs), die hauptsächlich von Blutplättchen freigesetzt werden6. Leukozyten tragen auch dazu bei, indem sie regulatorische und entzündungshemmende Zytokine freisetzen7. GFs wie der transformierende Wachstumsfaktor Beta 1 (TGF-β 1) und der von Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktor BB (PDGF-BB) üben starke anabole, proliferative, angiogene und entzündungshemmende Wirkungenaus 8. Bei exogener oder endogener Aktivierung polymerisiert PRP zu einem plättchenreichen Gel, das den Zelltransport, die Verankerung und die Differenzierung erleichtert 6,9. Auf diese Weise dient das PRP als komplexes lebendes Gerüst und nicht nur als Behälter für GFs und Zytokine10.

Mehrere Systeme klassifizieren PRP-Produkte, die sowohl bei Menschen als auch bei Pferden verwendet werden 6,11,12. Eines der einfachsten und gebräuchlichsten Systeme kategorisiert diese Hämokomponenten basierend auf der Leukozytenkonzentration11,12. Nach dieser Klassifikation werden PRP-Produkte mit niedrigen bis vernachlässigbaren Leukozytenkonzentrationen und niedrigen bis moderaten Thrombozytenkonzentrationen -- bezogen auf die Werte im Vollblut des Pferdes -- als reines PRP (P-PRP)6,11,12 bezeichnet. Im Gegensatz dazu werden PRP-Produkte mit nachweisbaren bis hohen Leukozytenkonzentrationen und moderaten bis hohen Thrombozytenkonzentrationen als leukozyten- und thrombozytenreiches Plasma (L-PRP) bezeichnet6,11,12.

P-PRP-Produkte werden in der Regel durch Röhrchen-zu-Röhrchen-Zentrifugation gewonnen, bei der Vollblut von Pferden in Röhrchen entnommen wird, die Antikoagulanzien wie Natriumcitrat und Citrat, Phosphat und Dextroseenthalten 13. Das Blut wird zweimal zentrifugiert, um Blutplättchen von anderen Bestandteilenzu trennen 14. Im Gegensatz dazu werden L-PRP-Produkte hauptsächlich mit halbautomatischen Kits hergestellt, die für menschliches Blut entwickelt wurden und von denen einige für die Verwendung bei Pferden validiert wurden 6,15. Diese halbautomatischen Kits erfordern in der Regel spezielle Zentrifugen und sind mit höheren Kostenverbunden 16 sowie mit potenziellen Bedenken hinsichtlich der aseptischen Handhabung, was ihren praktischen Einsatz in klinischen Umgebungen erschweren kann17. Darüber hinaus können diese Kits zu einer unerwünschten Konzentration von übermäßigen Leukozyten oder roten Blutkörperchen führen, was sich in bestimmten klinischen Situationen nachteilig auswirken kann18. Zum Beispiel kann eine erhöhte Leukozytenzahl eine übermäßige Entzündung hervorrufen, und ein Übermaß an roten Blutkörperchen kann den Heilungsprozess beeinträchtigen oder zu Komplikationen wie Gewebereizungen oder Abstoßung führen15; Ein häufig verwendetes Verfahren zur Herstellung von L-PRP bei Pferden beinhaltet jedoch einen Gravitationsprozess, der keine spezielle Ausrüstung erfordert19.

Angesichts dieser Einschränkungen sind einfachere und kostengünstigere Alternativen für die PRP-Aufbereitung sehr wünschenswert. Verschiedene In-vitro-Studien, experimentelle Modelle für Muskel-Skelett-Erkrankungen und Beobachtungen an Pferden haben gezeigt, dass sowohl P-PRP- als auch L-PRP-Produkte positive Auswirkungen auf behandelte Zellen und Gewebe haben 1,2,20. Diese Produkte fördern die Heilung, reduzieren Entzündungen und verbessern die Geweberegeneration6. Die Entscheidung, P-PRP oder L-PRP zur Behandlung eines Pferdes zu verwenden, kann jedoch von technischen und wirtschaftlichen Faktoren beeinflusst werden.

Laut den Autoren gibt es keine veröffentlichten Studien, die ein breit validiertes Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Gewinnung eines PRP-Produkts aus Pferdeblut beschreiben und vollständig demonstrieren. In diesem Artikel werden die Verfahren beschrieben, die erforderlich sind, um Vollblut von Pferden sicher zu entnehmen und ein PRP-Produkt herzustellen, das sowohl für den experimentellen als auch für den klinischen Einsatz geeignet ist. Es umfasst auch die Validierung dieses Orthobiologikums durch Quantifizierung von Blutplättchen und Leukozyten und Bestimmung der Konzentration von TGF-β1 und PDGF-BB, die für seine therapeutische Wirkung unerlässlich sind. Durch die Standardisierung des Prozesses und den Nachweis der Wirksamkeit des Produkts zielt diese Studie darauf ab, Pferdepraktikern eine zuverlässige und zugängliche Methode zur sicheren und präzisen Zubereitung von PRP zu bieten.

Obwohl die Doppelzentrifugationsmethode zur Herstellung von equinem PRP erstmals 2006 von Argüelles et al.14 beschrieben wurde, ist dies das erste Mal, dass das Protokoll in einem Video vollständig vorgestellt wird. Dieses Video soll als praktische Ressource für Pferdepraktiker dienen, die mit technischen Einschränkungen und Budgetbeschränkungen konfrontiert sind, die sie daran hindern, anspruchsvollere und teurere PRP-Kits für Pferde mit Muskel-Skelett-Erkrankungen zu verwenden.

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Protokoll

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den internen Protokollen für die Vorbereitung und Anwendung von PRP bei Pferden am Veterinärkrankenhaus der Universidad de Caldas, Manizales, Kolumbien, durchgeführt. Für diese Studie war keine Genehmigung des Internal Animal Care Committee erforderlich, da die Daten von lahmen Pferden stammten, die in unserer Einrichtung klinisch behandelt wurden. Für die Entwicklung dieses Protokolls wurden Daten von sechs kolumbianischen kreolischen Pferden, drei Stuten und drei Wallachen mit einem Durchschnittsalter von 7,4 (± 2,6) Jahren verwendet. Die Besitzer der Pferde wurden über die Art der Studie informiert und unterschrieben eine Einverständniserklärung. Alle in die Studie eingeschlossenen Pferde waren klinisch gesund, mit Ausnahme des zu behandelnden Muskel-Skelett-Problems. Es wurden nur Tiere mit einer basalen Thrombozytenzahl von mehr als 100 × 103/ml Vollblut eingeschlossen. Es ist wichtig zu beachten, dass Pferde mit niedrigeren Thrombozytenkonzentrationen als thrombozytopenisch angesehen werden können14. Darüber hinaus wiesen diese Tiere ein normales Blutbild, klinische biochemische Parameter für Leber und Niere sowie Urinanalysewerte auf, die im normalen Bereich für die Pferdearten lagen.

1. Pferderestriktion und Hautdesinfektion

  1. Zur Sicherheit sowohl des Pferdes als auch des Tierarztes sollte das Pferd (Eqqus caballus) je nach Verhalten des Tieres sicher in einem klinischen Untersuchungsschacht oder mit einem Zaumzeug (Abbildung 1A) fixiert werden. Schneiden Sie als Nächstes eine 5 cm x 5 cm große Haarpartie mit einem Elektrorasierer im mittleren Drittel einer Seite des Halses über die Halsvene.
    HINWEIS: Einige Besitzer bevorzugen es, dass das Pferd nicht geschoren wird. Eine Studie zeigt, dass ein Haarschnitt an der Venenpunktionsstelle nicht notwendig ist, um eine bakterielle Kontamination von P-PRP21 zu verhindern. Daher liegt dieses Verfahren im Ermessen des Tierarztes.
  2. Führen Sie eine vorbereitende unsterile Hautaufbereitung über den abgeschnittenen Bereich der Halsvene für mindestens 10 cm mit unsteriler Gaze und Handschuhen für ca. 3 min durch. Tragen Sie mehrere Stücke in antiseptischem Schaum getränkte Gaze in einem kreisförmigen Muster auf (Abbildung 1B).
  3. Bereiten Sie die Venenpunktionsstelle aseptisch vor, indem Sie sowohl sterile Handschuhe als auch in Desinfektionsmittel getränkte Gaze verwenden. Schrubben Sie die Haut im Halsbereich in kreisenden Bewegungen für ca. 5 min. Reinigen Sie den Bereich mit steriler Gaze, die in 95%igem Ethylalkohol getränkt ist.

2. Aseptische Blutentnahme

  1. Legen Sie 16 4,5-ml-Natriumcitratröhrchen, die zuvor mit in 95%igem Ethylalkohol getränkter Gaze gereinigt wurden, in ein sauberes Plastikgestell. Imprägnieren Sie die Gummikappen der Vakuumröhren mit 95%igem Ethylalkohol, insbesondere in der Aussparung für die Nadelkupplung.
    HINWEIS: Im Allgemeinen sind acht 4,5-ml-Natriumcitrat-Röhrchen erforderlich, um 2,5 mL PRP zu erhalten. Die Anzahl der im Einzelfall verwendeten Schläuche hängt von den zu behandelnden Weichteilen oder dem spezifischen Gelenk ab.
  2. Führen Sie steril eine Schmetterlingsnadel in die desinfizierte Halsschlagader ein (Abbildung 2A) und befestigen Sie 4,5-ml-Natriumcitratröhrchen an der Halterung (Abbildung 2B). Schütteln Sie die Röhrchen vorsichtig und legen Sie sie in ein Plastikgestell.
    HINWEIS: Ein 4,5-ml-Natriumcitrat-Röhrchen wird für automatisierte Hämogramme und zur Vorbereitung von Plasma nach der Hard-Spin-Zentrifugation verwendet. Dieses Plasma wird dann als Negativkontrolle für Vergleiche der Wachstumsfaktor- und Zytokinanreicherung mit PRP verwendet.

3. Beschaffung von plättchenreichem Plasma

  1. Die 4,5 mL Natriumcitratröhrchen mit Vollblut werden in einem Winkel von 90° in einer Tischzentrifuge in einen viersitzigen Ausschwingrotor gegeben. Die Röhrchen bei 120 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Positionieren Sie nach der Zentrifugation die 4,5-ml-Röhrchen mit Citratblut und zwei weitere 10-ml-Normalröhrchen in einem Gestell und platzieren Sie das Gestell auf der nicht dominanten Handseite des Bedieners in einer Laminar-Flow-Haube der Klasse II über einem sterilen, undurchlässigen Tuch.
    HINWEIS: Eine Studie legt nahe, dass eine Laminar-Flow-Haube der Klasse II nicht unbedingt erforderlich ist, um eine bakterielle Kontamination bei der PRP-Beschaffung zu verhindern21. Stattdessen kann PRP in einem Reinraum hergestellt werden, der frei von Luftströmungen und Staub ist. In diesem Szenario kann das Blutröhrchengestell auf einen Tisch gestellt werden, der mit einem sterilen, undurchlässigen Tuch bedeckt ist.
  2. Erste Zentrifugation: Mit einer Gesichtsmaske und sterilen Handschuhen eine sterile 10-ml-Luer-Spritze in Verbindung mit einer sterilen Nadel (21 G 5/8") an der dominanten Handseite in der Innenseite der Laminar-Flow-Haube platzieren.
    HINWEIS: Von diesem Moment an bleibt die dominante behandschuhte Hand immer steril, während die Gummikappen der Natriumcitratröhrchen mit der behandschuhten, nicht dominanten Hand entfernt werden sollten.
  3. Führen Sie die sterile Nadel in jedes zentrifugierte Citrat-Blutröhrchen 3 mm über dem Buffy Coat ein (Abbildung 3A) und saugen Sie vorsichtig 50 % der Plasmafraktion ab, um Flüssigkeitsturbulenzen und Blutaspiration zu vermeiden. Sobald 10 ml Plasma aus vier 4,5-ml-Röhrchen aspiriert sind, verteilen Sie es in sterilen 5-10 ml-Röhrchen (Abbildung 3B).
    HINWEIS: Entfernen Sie die Gummikappen dieser Schläuche mit der nicht dominanten Hand und legen Sie sie über eine sterile Stelle des Tuchs oder halten Sie sie, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden.
  4. Zweite Zentrifugation: Die Röhrchen wieder mit den Gummistopfen verschließen und im ausgeglichenen Zustand in einen vierfach ausschwingenden Rotor in einem Winkel von 90° in die Tischzentrifuge legen und diese Röhrchen bei 240 × g für 5 min bei Raumtemperatur drehen.
    HINWEIS: Die Wahl der relativen Zentrifugationskraft (RCF oder g) basiert auf einer bahnbrechenden Studie14 , in der diese Methode zur Gewinnung von PRP aus Pferdeblut erstmals beschrieben wurde. Darüber hinaus wurde diese Methode von anderen Autoren auf ihre Reproduzierbarkeit hin evaluiert22.
  5. Legen Sie die Röhrchen in ein Gestell und positionieren Sie sie auf der nicht dominanten Seite innerhalb der Laminar-Flow-Haube der Klasse II auf dem zuvor verlegten, sterilen, undurchlässigen Tuch.
  6. Verwenden Sie die nicht-dominante Hand, um die Gummikappen zu entfernen, und die sterile dominante Hand, um die ersten 75 % des Plasmas langsam mit einer 18 G und 90 mm starken Spinalnadel zu aspirieren, die an einer sterilen 10-ml-Luer-Spritze befestigt ist (Abbildung 3C). Entsorgen Sie diese Spritze oder bewahren Sie sie für andere experimentelle oder klinische Anwendungen auf, da sie plättchenarmes Plasma (PPP) enthält. Befestigen Sie anschließend die zuvor verwendete sterile Spinalnadel an einer sterilen 5- oder 10-ml-Luer-Spritze, um das restliche Plasma (25 %) aus dem sterilen 5-10-ml-Röhrchen abzusaugen. Diese Fraktion wird als P-PRP bezeichnet (Abbildung 3D).
    HINWEIS: Unter bestimmten klinischen und experimentellen Bedingungen wird ein Aliquot von 0,5-1 ml PRP für automatisierte Hämogramme verwendet, gefolgt von einer Wachstumsfaktor-Analyse (TGF-β1 und PDGF-BB) mittels enzymgebundenem Immunosorbent-Assay. Die Messung dieser Mediatoren kann 3 Stunden nach Aktivierung von P-PRP mit Calciumsalzen oder Thrombin23 oder nach Induktion einer Zellschädigung durch Temperaturänderung oder Zugabe von nichtionischen Detergenzien24 durchgeführt werden.
  7. Wickeln Sie die sterile Luer-Spritze, die PRP enthält, in ein kleines, undurchlässiges steriles Tuch mit einer daran befestigten sterilen Nadel oder Kappe ein, um eine bakterielle Kontamination des orthobiologischen Produkts zu verhindern (Abbildung 4A).
    HINWEIS: Die anatomische Struktur des zu behandelnden Pferdes sollte für die aseptische Injektion vorbereitet werden, wie in Abschnitt 1 dieses Protokolls beschrieben. Das Pferd sollte ausreichend zurückgehalten und sediert werden, um Beschwerden zu minimieren und die Sicherheit sowohl des Pferdes als auch des Tierarztes zu gewährleisten. Das PRP-Produkt sollte mit sterilen Handschuhen und Nadeln gehandhabt werden und kann je nach Präferenz des Arztes aktiviert werden oder nicht (Abbildung 4B).

4. Statistische Auswertung

  1. Sammeln Sie Daten zur Thrombozyten- und Leukozytenzahl in Vollblut und PRP. Werten Sie die Daten auf Normalität mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test aus. Wenn die Daten normalverteilt sind (P > 0,05), vergleichen und analysieren Sie die Zelldaten mit dem t-Test. Wenn die Daten zur Thrombozyten- und Leukozytenkonzentration nicht normalverteilt sind (P < 0,05), vergleichen und analysieren Sie die Daten mit einem Wilcoxon-Test.
  2. Bestimmen Sie die Thrombozyten- und Leukozyteneffizienzkonzentration in P-PRP gemäß den folgenden Formeln25:
    Effizienz der Thrombozytenentnahme = figure-protocol-1 × 100
    Effizienz der Leukozytensammlung = figure-protocol-2 × 100
  3. Erfassung von Daten zu TGF-β1 - und PDGF-BB-Konzentrationen in Plasma- (Negativkontrolle), PRP-Überständen (nach 3 h Aktivierung mit Calciumgluconat) und PRP-Lysaten, die durch Zugabe einer nichtionischen Detergenzlösung erhalten wurden.
  4. Verwenden Sie ein verallgemeinertes lineares gemischtes Modell, um die Wachstumsfaktorkonzentrationen zwischen Plasma, PRP-Überständen und PRP-Lysat zu vergleichen. Bei signifikanten statistischen Unterschieden wenden Sie einen Tukey-Post-hoc-Test an.
  5. Betrachten Sie p < Werte von 0,05 für alle Tests als statistisch signifikant.

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Ergebnisse

Die mittlere Thrombozytenzahl (Thrombozyten × 103/μl) war bei PRP signifikant höher als bei Vollblut (p < 0,001). Im Gegensatz dazu war die mittlere Leukozytenkonzentration (Leukozyten × 103/μl) im PRP signifikant niedriger als im Vollblut (p < 0,001) (Tabelle 1). Insbesondere war die Thrombozytenzahl in PRP 2,41x höher als im Vollblut, während die Leukozytenkonzentration in PRP 0,44x niedriger war. Die Sammeleffizienz für PLT bei PRP betrug 17 %, während die Effizienz der Leu...

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Diskussion

Die Verwendung von PRP in der Human- und Veterinärmedizin zur Behandlung chronischer Erkrankungen des Bewegungsapparates nimmt zu 1,8,26,27. Ein Hauptkritikpunkt an PRP-Anwendungen in experimentellen und klinischen Umgebungen ist jedoch der Mangel an grundlegenden Daten zu den Techniken und Protokollen, die zur Herstellung dieser Hämokomponenten verwendet werde...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken der Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados der Universidad de Caldas, Manizales, Kolumbien für ihre finanzielle Unterstützung bei der Veröffentlichung dieses Artikels.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 mL einfache venöse Blutentnahmeröhrchen BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, Vereinigte Staaten von AmerikaNr. 366430Dies ist nur ein Beispiel, es können Röhren anderer Marken verwendet werden.
4,5 mL Natriumcitrat-Röhrchen (105 M/3,2%) BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, Vereinigte Staaten von Amerika107451Dies ist nur ein Beispiel, es können Röhren anderer Marken verwendet werden.
Tisch-ZentrifugeRotofix 32A, Hettich GmbH, Tuttlingen, DeutschlandEs können auch andere Tischzentrifugen verwendet werden.
Schmetterlingsnadel (21 G & mal 0,75 Zoll) mit 12 Zoll Schläuche und vormontierte Halterung Safety-Lok Blutentnahme-Set, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, USAReferenz 367296Dies ist nur ein Beispiel, es können Schmetterlingsnadeln anderer Marken verwendet werden.
Chlorhexidin-Schaumlösung bei 2,3-4% Die Marken- oder Handelsnamen dieser Produkte können von Land zu Land variieren.
Laminar-Flow-Haube der Klasse IIThermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USAAndere Laminar-Flow-Hauben der Klasse II können verwendet werden
ELISA-LesegerätThermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA
Ethylalkohol bei 95%Die Marken- oder Handelsnamen dieser Produkte können von Land zu Land variieren.
Humaner PDGF-BB DuoSet ELISAForschung & Forschung D Systems, Inc., McKinley Place, MN, USADY220
Humaner TGF-beta 1 DouSet ELISAForschung & Forschung D Systems, Inc., McKinley Place, MN, USADY240
Povidon-Jod-Schaumlösung bei 4-10% Die Marken- oder Handelsnamen dieser Produkte können von Land zu Land variieren.
SPSS 25.0 SoftwareIBM Corp, SPSS, NY, USA
Sterile Luer-Spritzen mit verschiedenen Volumina Discardit-Spritze, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, USADies ist nur ein Beispiel, es können Spritzen anderer Marken verwendet werden.
Sterile Spinalnadel (18 G & mal 90 mm)  BD Quincke Spinell Needle, Franklin Lakes, NJ, USADies ist nur ein Beispiel, es können Spinalnadeln anderer Marken verwendet werden.

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

PRP Pr parationmuskuloskelettale ErkrankungenThrombozytenkonzentrationLeukozytenreduktionWachstumsfaktorenLaminar Flow WerkbankTischzentrifuge