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Methodenartikel

Isolierte Behandlung von Pankreasinseln und Apoptosemessung

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DOI:

10.3791/67996

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2. Mai 2025

 ,  , 
1Chemical & Biological Engineering, Colorado School of Mines, 2Quantitative Biosciences & Engineering, Colorado School of Mines, 3Barbara Davis Center for Diabetes, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Studie werden mehrfach gefärbte fluoreszenzbasierte Marker für Zelltod und Apoptose in Kombination mit konfokaler Mikroskopie verwendet, um die Zytokin-induzierte Apoptose und den β-zellspezifischen Tod in Pankreasinseln zu bewerten. Sie zeigt räumliche und zeitliche Veränderungen des Zelltods und der Apoptose als Reaktion auf extrazelluläre Reize.

Zusammenfassung

Diese Studie untersucht die Wirkung von proinflammatorischen Zytokinen auf Pankreasinseln, insbesondere auf insulinproduzierende β-Zellen, unter Verwendung einer Kombination aus Fluoreszenzfärbetechniken und konfokaler Mikroskopie, um die Zellviabilität, Apoptose und den β-zellspezifischen Tod zu beurteilen. Isolierte Mausinseln wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen eines Zytokincocktails behandelt, einschließlich TNF-α, IL-1β und IFN-γ, um die immunvermittelte Apoptose während der Entwicklung von Typ-1-Diabetes nachzuahmen. Die Lebensfähigkeit von Inselzellen wurde mit der FDA/PI-Doppelfärbung bewertet, bei der die FDA-Umwandlung in Fluorescein lebensfähige Zellen und PI-markierte membrankompromittierte Zellen anzeigte. YOPRO-1 und die Kernfärbung lieferten zusätzliche Daten zur Apoptose, wobei Annexin-V frühe apoptotische Zellen bestätigte. Die quantitative Analyse ergab einen signifikanten Anstieg der Apoptose- und Zelltodraten bei mit Zytokinen behandelten Inseln. Um die Auswirkungen auf β-Zellen spezifisch zu bewerten, wurde die selektiveZn2+ -Indikatorfärbung verwendet, um insulinproduzierende Zellen durch die Zinkassoziation in Insulingranulaten zu markieren, wobei ein erheblicher β-Zell-Verlust nach Behandlung von Inselzellen mit proinflammatorischen Zytokinen für 24 Stunden festgestellt wurde. Diese Multifärbeprotokolle erfassen und quantifizieren effektiv das Ausmaß der Zytokin-induzierten Schädigung in Inselzellen und können zur Bewertung von Therapeutika verwendet werden, die entwickelt wurden, um die β-Zell-Apoptose bei frühem Typ-1-Diabetes zu verhindern.

Einleitung

Die Pankreasinseln, auch bekannt als Langerhans-Inseln, sind eine Ansammlung von endokrinen Zellen, die sich in der Bauchspeicheldrüse befinden. Die insulinproduzierenden β-Zellen sind der am häufigsten vorkommende und funktionell bedeutendste Bestandteil der Pankreasinseln. Diese β-Zellen sezernieren Insulin, ein Hormon, das eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase spielt1. Bei Typ-1-Diabetes (T1D) greift das Immunsystem auf die Inseln der Bauchspeicheldrüse ab und infiltriert sie, wodurch insulinproduzierende β-Zellen zerstört werden. Dieser Autoimmunangriff wird hauptsächlich durch proinflammatorische Zytokine vermittelt, darunter Interleukin-1β (IL-1β), Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) und Interferon-gamma (IFN-γ)2. Diese Zytokine lösen eine Kaskade von Signalereignissen innerhalb β Zellen aus, die schließlich die Apoptoseauslösen 3. Apoptose, der programmierte Zelltod, ist ein streng regulierter Prozess, der die Aktivierung von Caspasen, die DNA-Fragmentierung und den zellulären Zerfall umfasst. Es trägt zum allmählichen Verlust der β-Zellmasse und -Funktion während des Beginns von T1D3 bei.

Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die die β-Zell-Apoptose antreiben, ist entscheidend für die Identifizierung von Strategien zur Verhinderung oder Abschwächung der β-Zell-Zerstörung bei T1D. Um dies zu erreichen, dienen isolierte Pankreasinseln aus experimentellen Modellen oder menschlichen Leichen als robustes und gut etabliertes Modellsystem für die Untersuchung der β-Zell-Pathologie 2,3. Durch die Behandlung dieser isolierten Inselzellen mit proinflammatorischen Zytokinen können die Forscher die Umgebung replizieren, die für frühes T1D charakteristisch ist, was eine detaillierte Untersuchung der β-Zell-Dysfunktion und des Todes in vitro ermöglicht 4,5. Diese Experimente liefern wichtige Einblicke in die Verwundbarkeit und das Überleben von β-Zellen unter krankheitsassoziierten Bedingungen und dienen auch als Plattform für die Erprobung therapeutischer Interventionen, die darauf abzielen, β-Zellen vor Zytokin-induzierter Apoptose zu schützen oder zu retten. Durch die Verwendung dieses In-vitro-Systems können wir effektiv analysieren, wie Inselzellen verschiedener Arten auf verschiedene Bedingungen reagieren, was zu einem besseren Verständnis der funktionellen und apoptotischen Variationen zwischen den Arten führt.

Frühere Studien haben gezeigt, dass Maus- und menschliche Inselzellen, die 24 Stunden lang mit einem Cocktail (1x = 10 ng/ml TNF-α, 5 ng/ml IL-1β und 100 ng/ml IFN-γ) von Maus- bzw. humanen Zytokinen behandelt wurden, zu einem signifikanten Tod von Inselzellen führten 4,5,6. Die Lebensfähigkeit der Inselzellen wurde durch Färbung der mit Zytokinen behandelten Zellen mit Fluoresceindiacetat (FDA) und Propidiumiodid (PI) bestätigt5,6. Weltweit wird die Lebensfähigkeit der Inselzellen unter Verwendung der Standardtechnik zum Ausschluss von Desoxyribonukleinsäure (DNA)-bindenden Farbstoffen mit FDA und PI7 bewertet. Fluoreszierende Färbungen oder farbstoffkonjugierte Substrate beurteilen die Lebensfähigkeit der Zellen auf der Grundlage der Membranintegrität und Permeabilität. FDA, ein zelldurchlässiger Farbstoff, wird von lebenden Zellen in grüne Fluoreszenz (Fluorescein) umgewandelt. Im Gegensatz dazu färbt PI, ein zellundurchlässiger Farbstoff, nur die Zellkerne toter Zellen mit kompromittierten Membranen7. Die Zellen werden dann durch zweifarbige Bildgebung an einem konfokalen Mikroskop analysiert, wobei grüne und rote Fluoreszenzen lebensfähige bzw. tote Zellen markieren.

Die Einschränkung des FDA/PI-Färbeprotokolls besteht darin, dass PI nur in Zellen eindringt, die ihre Membranselektivität verloren haben, was bedeutet, dass es frühe apoptotische Zellen nicht unterscheiden kann. Darüber hinaus kann diese Methode nicht zwischen Zelluntergruppen unterscheiden, was sie für die selektive Beurteilung der Lebensfähigkeit β Zellen ungeeignet macht. Das Annexin V/PI-Protokoll wird häufig für die Untersuchung apoptotischer Zellen verwendet, und das Protokoll wurde modifiziert, um seine Genauigkeit zu verbessern8. In den frühen Stadien der Apoptose kommt es zur Translokation von Phosphatidylserin von der inneren in die äußere Schicht der Plasmamembran. Annexin V, ein calciumabhängiges Protein, bindet mit hoher Affinität an dieses exponierte Phosphatidylserin. Die Färbung mit PI wird zusammen mit Annexin-V durchgeführt, um apoptotische Zellen (nur Annexin V-positiv) von nekrotischen Zellen (positiv für Annexin-V und PI) zu unterscheiden, da nekrotische Zellen aufgrund einer beeinträchtigten Membranintegrität auch Phosphatidylserin aufweisen9. Andere Farbstoffe, wie z. B. YOPRO-1, werden ebenfalls verwendet, um die Apoptose von Inselzellen zu quantifizieren. Die Zellmembran lebensfähiger Zellen ist für YOPRO-1 undurchlässig, im Gegensatz zu Annexin-V, das lebende Zellen, die sich einer Apoptose unterziehen, nicht quantifizieren kann.

Um den β-Zelltod der Bauchspeicheldrüse zu beurteilen, werden spezifische Farbstoffe benötigt, die nur auf die insulinproduzierenden Zellen abzielen. Eine Besonderheit der Pankreas-β-Zellen ist, dass ein Teil des intrazellulären Zn2+ in Vesikeln als Zn2+-Insulin-Komplex (Verhältnis 2:1) gespeichert wird10. Freies Zn2+ existiert auch im extragranularen Raum um die β-Zellen als Reservoire. Freies Zn2+ und Zn2+, die lose an Insulin gebunden sind, können mit Hilfe von zinkbindenden Farbstoffen sichtbar gemacht werden. Dithizon, ein zinkbindender Farbstoff, wird häufig zur Beurteilung der Reinheit von Inselzellen verwendet, kann jedoch nicht mit Fluoreszenzfarbstoffen kombiniert werden, die zur Bewertung der Lebensfähigkeit und Funktion β-Zellen verwendet werden11. UV-Sonden wie TSQ und Zinquin, die hochselektiv gegenüber Zn2+ sind, wurden entwickelt, um β-Zellen durch Bildgebung und Messung von freiem intrazellulärem Zn2+ zu quantifizieren; 12,13. Ihre Verwendung ist jedoch durch eine schlechte Löslichkeit, eine ungleichmäßige Zellbeladung, einen UV-Anregungsbedarf und eine Kompartimentierung in saure Vesikel begrenzt14. Fluoreszenzsonden im sichtbaren Wellenlängenbereich, wie z. B. Newport-Grün und Zn2+-Selektivindikator, wurden ebenfalls entwickelt, um diese Einschränkungen zu überwinden, und werden heute häufig zum Nachweis von β-Zellen in isolierten menschlichen Inselzellen verwendet15,16. FluoZin-3 (selektiverZn2+-Indikator) hat eine höhereZn2+-Affinität und eine überlegene Quantenausbeute als Newport Green und hat sich bei der Bildgebung von Zn2+, das zusammen mit Insulin freigesetzt wird, in isolierten Inselzellen als wirksam erwiesen14,17.

Die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen wie FDA, PI, Annexin V, YOPRO-1 und Zn2+ ermöglicht die Messung und Unterscheidung zwischen lebensfähigen, apoptotischen und vollständig toten Zellen. Die Kombination kompatibler und hochselektiver Sonden bietet auch eine gezielte Methode zur Bewertung und Quantifizierung der β-Zell-Viabilität und Apoptose, was für das Verständnis und die Eindämmung der β-Zell-Zerstörung in der Diabetesforschung und -entwicklung von entscheidender Bedeutung ist.

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Protokoll

Alle Versuche mit Mäusen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Colorado Denver genehmigt (Protokolle 000929). C57Bl/6-Mäuse, die für dieses Experiment verwendet wurden, wurden vom Jackson Laboratory gekauft und in einer temperaturkontrollierten Einrichtung in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit Zugang zu Nahrung und Wasser ad libitum untergebracht. Die isolierten Mausinseln wurden unter Verwendung des zuvor beschriebenen Kollagenase-Verdauungsprotokolls gewonnen 5,18.

1. Vorbereitung der Lösungen und Nährmedien

HINWEIS: Nährmedien, Zytokinbestände und andere Reagenzien sollten unter sterilen Bedingungen hergestellt werden.

  1. Bereiten Sie ein Inselkulturmedium vor, indem Sie 10 % fötales Rinderserum (FBS), 10.000 U/ml Penicillin und 10.000 μg/ml Streptomycin zu 500 ml 1640 RPMI Medium hinzufügen.
  2. Bereiten Sie 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4 vor. Bereiten Sie eine 1000-fache Stammlösung aus Maus-Zytokin-Cocktail, 10 μg/ml TNF-α 10 μg/ml, 5 μg/ml IL-1β und 100 μg/ml IFN-γ in sterilem PBS mit 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) vor und lagern Sie die Lösung in 10 μl Aliquoten bei -20 °C.
  3. Bereiten Sie eine 46 μM (50x) FDA-Stammlösung in Aceton vor und lagern Sie sie in 1 mL Aliquots bei -20 °C. Bereiten Sie eine 1,434 mM (50x) PI-Stammlösung in PBS vor und lagern Sie sie in 1 mL Aliquots bei 4 °C.
  4. Bereiten Sie 500 mL Bicarbonat-modifizierten Krebs-Henseleit HEPES (BMHH)-Puffer mit 125 mM NaCl, 5,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2 und 10 mM HEPES in 500 mL dH2O vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein.
  5. Bereiten Sie 100 mL Annexin-V-Bindungspuffer mit 10 mM HEPES, 140 mM NaCl und 2,5 mM CaCl2 in 100 mL dH2O vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein.
  6. 1 mM Zn2+ selektive Indikator-Stammlösung in DMSO herstellen und in 10 μl Aliquoten bei -20 °C lagern.
    HINWEIS: Fluoreszierende Farbstoffe sind lichtempfindlich, daher müssen Lagerung und Inkubation im Dunkeln erfolgen.

2. Behandlung isolierter Inselzellen mit Zytokinen

  1. Isolieren Sie Mausinseln mit einer 10-μl-Mikropipette in das Kulturmedium und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 , um sich vor der Behandlung mit Zytokinen vom Isolationsstress zu erholen.
  2. Geben Sie 2 ml des sterilisierten Inselkulturmediums in 35 mm große, nicht mit Gewebekulturen behandelte Petrischalen und markieren Sie sie entsprechend, um mit Zytokinen behandelte und unbehandelte Schalen ohne Zytokine zu unterscheiden.
  3. Bei mit Zytokinen behandelten Schalen entfernen Sie 6 μl Kulturmedium und ersetzen es durch 2 μl jedes Zytokins aus der Stammlösung, um eine endgültige relative Zytokinkonzentration von 10 ng/ml, 5 ng/ml IL-1β und 100 ng/ml IFN-γ (1x RCC) zu erhalten.
    HINWEIS: Ein niedrigerer RCC von 0,5x und 0,1x kann durch Verdünnen von Stammlösungen mit sterilem PBS mit 0,1 % BSA im Verhältnis 1:1 bzw. 1:9 hergestellt werden.
  4. Um 12 h-24 h nach der Isolierung werden 10-20 Inselzellen mit einer Mikropipette unter einem Lichtmikroskop entnommen und in die Schalen überführt und in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator mit 5 % CO2 -Inkubator für 24 h inkubiert.
    HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach den spezifischen Versuchszielen variieren.

3. Messung der Lebensfähigkeit von Inselzellen mit FDA/PI

  1. Geben Sie jeweils 20 μl FDA- und PI-Stammlösungen zu 960 μl BMHH-Puffer mit 0,1 % BSA, um eine Endkonzentration von 0,46 μM bzw. 14,34 μM der Fluoreszenzfarbstoffe zu erhalten.
  2. Aliquotieren Sie 100 μl der Färbelösung in eine 7 mm große Petrischale mit Glasboden, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurde.
  3. 24 Stunden nach der Inkubation mit Zytokinen werden mindestens 6 Inselzellen aus jeder Behandlung vorsichtig in die Petrischale mit Glasboden überführt. 5 - 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren (mit Folie abdecken).
  4. Nehmen Sie Bilder mit Fluoreszenzmikroskopie mit einem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv auf. Nehmen Sie Bilder innerhalb von 15 Minuten nach der FDA/PI-Färbung auf.
  5. Verwenden Sie Anregungslaser bei 488 nm und 514 nm, um die Fluoreszenzemissionen für FDA (520 nm) bzw. PI (620 nm) zu detektieren.
  6. Bildinseln als Z-Stapel, bestehend aus drei Bildern, die 10 μm voneinander entfernt sind. Bilden Sie nur die unteren 1/3 - 1/2 der Insel ab, um Signalverluste aufgrund von Lichtstreuproblemen auf der Insel zu reduzieren.
  7. Zählen Sie lebende grüne (FDA-positive) und tote rote (PI-positive) Zellen manuell in ImageJ (NIH) für mindestens 5 Inselzellen pro Maus (n = 3). Berechnen Sie den prozentualen Anteil des Zelltods wie folgt:
    Prozentsatz des Inselsterbens = Anzahl der toten Zellen/ (Anzahl der toten Zellen + Anzahl der lebenden Zellen) x 100%

4. Apoptose-Messung mittels Färbung

  1. Geben Sie 8 μl YOPRO-1 (1 mM Lösung) zu 992 μl BMHH-Bildgebungspuffer für eine Endkonzentration von 0,8 μM.
  2. Aliquotieren Sie 500 μl der Färbelösung in eine 14 mm große Petrischale mit Glasboden, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurde.
  3. 24 h nach der Inkubation mit Zytokinen mindestens 6 Inselzellen aus jeder Behandlung vorsichtig in die Petrischale mit Glasboden überführen und 1 h bei 37 °C im Dunkeln inkubieren (mit Folie abdecken).
  4. Nach 20 Minuten Inkubation geben Sie einen Tropfen NucBlue (Kernfärbung, 20 μl) in jede Petrischale mit Glasboden und setzen Sie die Inkubation fort. Die Gesamtinkubationszeit beträgt 1 h für YOPRO-1 und 40 min für nukleare Färbung.
  5. Nach 1 Stunde Inkubation werden die Inselzellen in einen frischen BMHH-Bildgebungspuffer mit 0,1 % BSA (100 μl) in einer 7-mm-Petrischale mit Glasboden, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurde, übertragen.
  6. Nehmen Sie Bilder mit Fluoreszenzmikroskopie mit einem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv auf. Verwenden Sie Anregungslaser bei 405 nm und 488 nm, um die Fluoreszenzemissionen von Kernfärbung (460 nm) bzw. YOPRO-1 (509 nm) zu detektieren.
  7. Bildinseln als Z-Stapel, bestehend aus drei Bildern, die 10 μm voneinander entfernt sind. Bilden Sie nur die unteren 1/3 - 1/2 der Insel ab, um Signalverluste aufgrund von Lichtstreuproblemen auf der Insel zu reduzieren.
  8. Zählen Sie lebende blaue (nukleäre Färbung positiv) und apoptotische grüne (YOPRO-1-positive) Zellen manuell in ImageJ (NIH) für mindestens 5 Inselzellen pro Maus (n = 3). Berechnen Sie den Prozentsatz der apoptotischen Inselzellen wie folgt:
    Prozentsatz der apoptotischen Inselzellen = Anzahl der apoptotischen Zellen / (Anzahl der apoptotischen Zellen + Anzahl der lebenden Zellen) x 100%

5. Apoptose-Messung mit Annexin V/ nuklearer Färbung

  1. Geben Sie 2 Tropfen Kernfärbung (40 μl) zu 1 ml Annexin-Bindungspuffer. Aliquotieren Sie 100 μl der Lösung in eine 7 mm Glasboden, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurde.
  2. 24 Stunden nach der Inkubation mit Zytokinen spülen Sie vorsichtig aus, indem Sie mindestens 6 Inselzellen aus jeder PBS-Behandlung 3x auf und ab pipettieren, indem Sie mit der 10-μl-Mikropipette dreimal auf und ab pipettieren. Die Inselzellen mit der Kernfleckenlösung in die Petrischale mit Glasboden geben und 40 min bei 37 °C im Dunkeln inkubieren (mit Folie abdecken).
  3. Nach 25 Minuten Inkubation 5 μl Annexin V Alexa Flour 488 Konjugat in jede Petrischale mit Glasboden geben und die Inkubation fortsetzen. Die Gesamtinkubationszeit beträgt 40 Minuten für den nuklearen Farbstoff und 15 Minuten für Annexin V.
  4. Nach 40 Minuten Inkubation werden die Inselzellen in einen frischen BMHH-Bildgebungspuffer (ohne Annexin V oder nukleare Färbung) in einer 7-mm-Petrischale mit Glasboden überführt.
  5. Nehmen Sie Bilder mit Fluoreszenzmikroskopie mit einem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv auf. Verwenden Sie Anregungslaser bei 405 nm und 488 nm, um die Fluoreszenzemissionen von Kernfärbung (460 nm) bzw. Annexin-V-Konjugat (515 nm) zu detektieren.
  6. Bildinseln als Z-Stapel, bestehend aus drei Bildern, die 10 μm voneinander entfernt sind. Bilden Sie nur die unteren 1/3 - 1/2 der Insel ab, um Signalverluste aufgrund von Lichtstreuproblemen auf der Insel zu reduzieren.
  7. Zählen Sie lebende blaue (nukleäre Färbung positiv) und apoptotische grüne (Annexin V-positive) Zellen manuell in ImageJ (NIH) für mindestens 5 Inselzellen pro Maus (n = 3). Berechnen Sie den Prozentsatz der apoptotischen Inselzellen wie folgt:
    Prozentsatz der apoptotischen Zellen = Anzahl der apoptotischen Zellen / (Anzahl der apoptotischen Zellen + Anzahl der lebenden Zellen) x 100%

6. Messung des β-Zelltods mit selektivem Zn2+ -Indikator / Kernfärbung / PI

  1. Geben Sie 2 μl Zn2+ selektiver indicatorAM-Stammlösung zu 998 μl BMHH-Bildgebungspuffer, um eine Endkonzentration von 0,2 μM zu erreichen. Aliquotieren Sie 500 μl der Färbelösung in eine 14-mm-Petrischale mit Glasboden, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurde.
  2. 24 Stunden nach der Inkubation mit Zytokinen werden mindestens 6 Inselzellen aus jeder Behandlung vorsichtig in die Petrischale mit Glasboden überführt. Inkubieren Sie 1 h bei 37 °C im Dunkeln mit dem selektiven Indikator Zn2+ AM-Lösung (Abdeckung mit Folie).
  3. Nach 20 Minuten Inkubation geben Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers einen Tropfen Kernfleck (20 μl) in jede Petrischale mit Glasboden und setzen Sie die Inkubation fort. Die Gesamtinkubationszeit beträgt 1 h für den selektiven Zn2+ -Indikator und 40 min für die nukleare Färbung.
  4. Nach 1 Stunde Inkubation werden die Inselzellen in einen frischen BMHH-Bildgebungspuffer mit 0,1 % BSA (100 μl) in einer 7-mm-Petrischale mit Glasboden, die nicht mit Gewebekulturen behandelt wurde, übertragen. Fügen Sie 10 Minuten lang 2 μl PI-Stammlösung hinzu, um eine Endkonzentration von 20 μg/ml zu erreichen.
  5. Nehmen Sie Bilder innerhalb von 15 Minuten nach der PI-Färbung mit Fluoreszenzmikroskopie mit einem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv auf. Verwenden Sie Anregungslaser bei 405 nm, 488 nm und 514 nm, um die Fluoreszenzemissionen von Kernfärbung (460 nm),Zn 2+ selektivem Indikator (516 nm) bzw. PI (620 nm) zu detektieren.
  6. Bildinseln als Z-Stapel, bestehend aus drei Bildern, die 10 μm voneinander entfernt sind. Bilden Sie nur die unteren 1/3 - 1/2 der Insel ab, um Signalverluste aufgrund von Lichtstreuproblemen auf der Insel zu reduzieren.
  7. Zählen Sie lebende blaue (nukleare Färbung positiv), Zinkgrün (Zn2+ selektiver Indikator-positiv) und tote rote (PI-positive) Zellen manuell in ImageJ (NIH) für mindestens 5 Inselzellen pro Maus (n = 3). Berechnen Sie den prozentualen Anteil des β-Zelltods wie folgt:
    Prozentsatz des β-Zelltods = Anzahl der Zink- und PI-positiven Zellen / (Anzahl der toten + lebenden Inselzellen) x 100%
    oder
    Prozentsatz des β-Zelltods = Anzahl der Zink- und PI-positiven Zellen / (Anzahl der Zink-positiven Zellen) x 100%

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Ergebnisse

Die duale Färbung mit FDA und PI wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit von Inselzellen zu beurteilen, die mit Zytokinen behandelt wurden. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung (n = 3) durchgeführt, und die Daten wurden aus mehreren Z-Stapel-Bildern mit einem Abstand von 10 μm generiert, wobei jedes Replikat durchschnittliche Daten von 5 oder 6 Inselzellen enthielt, um die Reproduzierbarkeit und den statistischen Vergleich zwischen den behandelten und unbehandelten Inselzellen zu gewährleisten.

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Diskussion

Diese Studie zeigt die Wirksamkeit von Mehrfachfärbemethoden mit fluoreszierenden Farbstoffen und konfokaler Mikroskopie bei der Beurteilung der Lebensfähigkeit von Inselzellen, der Apoptose und des Überlebens von β-Zellen unter Zytokin-induziertem Stress. Die FDA/PI-Färbung zeigte eine dosisabhängige Zunahme des Zelltods bei Inselzellen, die Zytokinen ausgesetzt waren, was sich in der roten Fluoreszenz zeigt, die membrankompromittierte Zellen markierte, was die zytotoxische Wirkung von ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die folgenden Zuschüsse stellten Mittel für diese Arbeit zur Verfügung: NIDDK Award R01 DK137221, JDRF 3-SRA-2023-1367-S-B an N.L.F. und ADA 7-20-JDF-020 an N.L.F. Die Autoren danken dem Diabetes Research Center an der University of Colorado Anschutz Campus P30-DK116073 und den zugehörigen Core Facilities, die zur Unterstützung dieser Arbeit eingesetzt werden.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
14 mm Petrischale mit GlasbodenMattekP35G-1.5-14-C
1640 RPMICorning10-041-CV
35 mm PetrischaleCelltreat229638
7 mm Petrischale mit GlasbodenMattekP35G-1.5-7-C
Annexin V, Alexa Flour 488Thermo Fisher (Invitrogen)A13201ex488/em515
Calciumchlorid-DihydratFisherC79
Dimethylsulfoxid wasserfreiesSigma276855
fötales RinderserumThermo Fisher (Gibco)26140079
Flouzin-3, AMThermo Fisher (Invitrogen)F24195ex488/em516
Fluoresceindiacetat (FDA)Thermo Fisher (Invitrogen)F1303ex488/em520
HEPESSigma54457
BildverarbeitungssoftwareNIHImageJ
MagnesiumchloridSigmaM8266
NucBlue Live ReadyProbes Reagenz (Hoechst 33342)Thermo Fisher (Invitrogen)R37605ex360/em460
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher (Gibco)15-140-122 
Phosphatgepufferte KochsalztablettenFisherBP2944-100
Kaliumchlorid, granuliertMacron6858-04
PropidiumiodidThermo Fisher (Invitrogen)P1304MPex535/em620
Protein Rekombinante Maus IFN-gamma ProteinR& D Systems485-MI-100/CF
Rekombinante Maus IL-1 beta/IL-1F2 Forschung & Forschung D Systems401-ML-100/CF
Rekombinante Maus TNF-alpha (aa 80-235) ProteinF& T & D Systems410-MT-100/CF
Natriumchlorid, KristallMacron7581-12
Stellaris Konfokales Mikroskop mit SpektraldetektorenLeicaDMI-8  40x Wasser-Immersionsobjektiv.
Yopro-1 IodidThermo Fisher (Invitrogen)Y3603ex488/em509

Referenzen

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