Anwendung von I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, HADDOCK Server und HEX loria für das De Novo und In Silico Design von Proteinen

Zusammenfassung

Proteindesign beinhaltet die Konstruktion von Aminosäuresequenzen und die Einbeziehung spezifischer Motive, um funktionelle Varianten zu erzeugen. Dieser Ansatz ist entscheidend für die Entwicklung von antimikrobiellen Peptiden (AMPs) zur Bekämpfung antibiotikaresistenter Erreger. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Proteinkonstruktion mit verschiedenen bioinformatischen Werkzeugen vorgestellt.

Zusammenfassung

Die Grenzen des Proteindesigns liegen in der Konstruktion von Aminosäuresequenzen und dem Einbau spezifischer Motive, wie z. B. Bindungsstellen, in Rezeptoren, Ionenkanäle oder andere Proteine. Dieser Ansatz ermöglicht die Herstellung von Proteinvarianten mit spezifischen Funktionen und Zwecken. Eine beispielhafte Anwendung dieser bioinformatischen Ressourcen ist die Verbesserung antimikrobieller Peptide (AMPs) oder das Design synthetischer AMPs. Diese Entwicklung ist aufgrund der jüngsten Zunahme neu auftretender Krankheiten von Bedeutung, die häufig durch schwer auszurottende Krankheitserreger verursacht werden, die Antibiotikaresistenzen aufweisen. Zu den Folgen dieses Trends gehören das weltweite Aussterben von Tierarten und das menschliche Sterben. Die schnelle Synthese neuartiger und wirksamer AMPs ist daher unerlässlich. Diese Server und Programme können die schnelle Entwicklung von Impfstoffen, AMPs oder wirksamen Behandlungen gegen diese Krankheitserreger erleichtern. Das Ziel dieser Arbeit war es, ein Verfahren zur Proteinkonstruktion aus Sequenzen vorzustellen und vorzuschlagen und den Prozess der Verwendung verschiedener Werkzeuge zum Aufbau dieser Moleküle Schritt für Schritt aufzuklären.

Einleitung

Das Auftreten von Tierseuchen nimmt zu, und dieses Phänomen wird durch den Klimawandel beeinflusst. Der Anstieg der globalen Temperatur hat zur Vermehrung von Mikroorganismen und zum Auftreten opportunistischer Krankheitserreger geführt, die zur Entwicklung virulenter und arzneimittelresistenter Krankheiten beitragen¹. Der Klimawandel wirkt sich auf das Mikrobiom von Boden, Wasser, Haut und Darm aus, was zu einer anhaltenden Belastung der Tierphysiologie und der Anpassung an die Umwelt führt. Es hat sich gezeigt, dass dieses Phänomen die Immunreaktion beeinträchtigt und die Tiere anfälliger für neu auftretende Krankheitserreger macht, was tödliche Folgen haben und möglicherweise zum Aussterben bestimmter Arten führen kann 2,3,4,5. Ein herausragendes Beispiel ist das Weißnasensyndrom (WNS), eine Krankheit, die durch den Pilz Pseudogymnoascus destructans verursacht wird und Fledermäuse im Winterschlaf befällt. Diese und andere Krankheiten wurden erst identifiziert, als 2006 ein erhebliches Sterbeereignis auf dem amerikanischen Kontinent^{auftrat 6}. Um die durch solche Krankheitserreger verursachten Schäden zu mildern, haben sich die Forscher der Verabreichung von Antimykotika wie Itraconazol und Ketoconazol und Probiotika zugewandt, einschließlich der Inokulation mit der nützlichen Mikrobiota Pseudomonas fluorescens⁷. Ein weiteres Beispiel für eine durch einen Pilz verursachte Krankheit ist die von Ophidiomyces ophiodiicola, einem Pilz, der sowohl bei in Gefangenschaft als auch bei wilden Schlangen Dermatitis und multisystemische Erkrankungen verursacht ^4,8.

Diese Studien unterstreichen die Notwendigkeit eines erhöhten Bewusstseins und Verständnisses für Pilzkrankheiten bei Wildtieren, um praktische Lösungen schnell umsetzen zu können. Bei Amphibien wurden Pilzinfektionen berichtet, und ein weit verbreiteter Erreger, der diese Tiere befällt, ist der Wasserpilz Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), der Chytridiomykose verursacht. Diese Krankheit verursacht bei empfänglichen Tieren schwere Hautläsionen und stört die normale Hautfunktion, was möglicherweise zur Mortalität führen^{kann 9}. Dieser Erreger wird seit dem 20. Jahrhundert umfassend verbreitet und trug zum Aussterben von 90 Amphibienarten bei. Die Prävalenz dieser Infektionen stellt eine erhebliche Herausforderung bei der Prävention und der Identifizierung wirksamer Behandlungen dar, da sie die Berücksichtigung verschiedener ökologischer, physiologischer, Mikrobiom- und anderer Faktoren erfordern¹⁰.

Es ist ein gut dokumentiertes Phänomen, dass pathogene Mikroorganismen die Fähigkeit besitzen, Resistenzmechanismen durch genetische Kodierung schnell zu entwickeln, ein Prozess, der durch die Herstellung externer Effluxpumpen für Medikamente und Antibiotika veranschaulicht werden^{kann 11}. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass diese Mikroorganismen die Zusammensetzung der Membranlipide modifizieren, mit dem Ziel, den Wirkungen bestimmter Moleküle entgegenzuwirken¹². Das Gebiet der Proteinsequenzen hat großes Interesse geweckt, insbesondere im Zusammenhang mit der Integration in Behandlungsansätze und der Konstruktion von Proteinstrukturmodellen. Diese Modelle sind so konzipiert, dass sie die Laborzeit und -ressourcen vor Beginn der Proteinsynthese optimieren¹³. Die Prävention von Infektionen ist in diesen Fällen eine komplexe Aufgabe, an der mehrere ökologische, physiologische und mikrobiome Faktoren beteiligt sind¹⁴. Dieser Ansatz ermöglicht ein effektiveres Zeit- und Ressourcenmanagement im Labor und unterstreicht die Komplexität der Aufgabe.

Um das Potenzial bestehender Verbindungen für praktische Anwendungen zu erhöhen und neue Verbindungen mit einem größeren Potenzial für solche Anwendungen zu schaffen, ist es unerlässlich, Fachwissen aus verschiedenen Disziplinen wie Chemie, Molekularbiologie, Physik und Programmierung einzusetzen. Zu diesem Zweck stehen verschiedene Werkzeuge zur Verfügung, darunter I-TASSER (Iterative Threading ASSembly Refinement)^15,16 und trRosetta^17,18 (Protein structure prediction by TRansform-restrained Rosetta). Vorhersage von Strukturproteinen und UCSF Chimera (ein Visualisierungssystem für explorative Forschung und Analyse von der University of California, San Francisco)¹⁹ und HEX loria (ein interaktives Protein-Docking- und molekulares Superpositionsprogramm)²⁰ für molekulares Docking und PDB-Dateibearbeitung.

I-TASSER ist ein automatisierter Online-Server, der Struktur und Funktion vorhersagt. Dieses Programm ist über einen Webbrowser oder als Download zugänglich. Auf der Einreichungsseite können Benutzer die Sequenz im FASTA-Format eingeben oder ein Archiv in .txt Format herunterladen. Der Serverprozess umfasst die Identifizierung von Strukturvorlagen mit einem gewissen Grad an Homologie, wie in Local Meta-Threading Server LOMETS 20,21,22,23,24,25 beschrieben. Nach der Verarbeitung von einer Million potenzieller Ergebnisse durch den Server wird ein Filtrationsprozess eingeleitet und die Fragmente werden auf der Grundlage der Root Median Square Deviation (RMSD), TM (eine Metrik zur Bewertung der strukturellen Ähnlichkeit zwischen zwei Modellen) und des C-Scores (eine Metrik zur Bewertung der Zuverlässigkeit von Proteinstrukturmodellen, die von Tools generiert werden) ausgewählt. Der Benutzer kann die Ergebnisse auf der Grundlage von vorgegebenen Parametern, die im Programm bereitgestellt werden, anpassen oder seine eigenen Werte eingeben, abhängig von seiner spezifischen Sequenz oder seinen strukturellen Erwartungen 20,21,22,23,24,25.

trRosetta ist ein hochwirksames Programm zur Vorhersage der Proteinstruktur. Auf diesem Server können Benutzer Sequenzen in einem Archivformat, TXT, FASTA, Eingabesequenz oder Multiple Alignment Sequences (MSA) senden. Dieses Programm ermöglicht es dem Benutzer, zwischen Vorlagen zu wählen oder trRosetta-single für die Sequenzfaltung auszuführen. Diese Server nutzen ein Deep-Learning-Netzwerk, um strukturelle Vorhersagen zu generieren. Der Prozess der Sequenzvorhersage umfasst einen ersten Schritt der Vorhersage von Kontakten und Entfernungskarten, gefolgt von der Auswahl der fünf besten Vorlagen für das endgültige Modell und einem Schritt zur Minimierung des Energies für Faltung und Verfeinerung¹⁷.

Der HADDOCK-Server (High Ambiguity Protein-Protein Docking) ist ein Rechenwerkzeug, das das flexible Andocken von zwei oder mehr PDB-Dateien ermöglicht, die Protein-, Peptid-, Liganden- und Rezeptorstrukturen umfassen. Dieser Server verwendet einen Ansatz, der AIRs (Ambiguous Interaction Restraints) beinhaltet, die Informationen von vorhergesagten oder identifizierten Proteinen während des Andockprozesses kodieren. AIRs umfassen Aminosäurebeschränkungen, die als passive oder aktive Aminosäuren kategorisiert werden. Von besonderer Bedeutung ist der Einbau aktiver Aminosäuren, da sie auf potenzielle Bindungs- oder Interaktionsstellen zwischen Proteinrezeptoren hinweisen. Das Design des Programms bezieht die Lösungsmittelexposition in das Modell²⁶ ein.

HEX Loria ist ein interaktiver Online-Server, der die Analyse von Proteinkomplexen und das molekulare Andocken erleichtert. Dieser Server kann Koordinatenarchive im PDB-Format (Protein Data Bank) lesen und schnell Docking-Berechnungen mit NVIDIA- oder CUDA-Grafikzielen erstellen. Das Programm kann bis zu 1.000 Andockvorhersagen erstellen und verwendet den Korrelations-Fourier für die Gesamtorientierung von zwei Molekülen²⁷. Die HEX Loria-Schnittstelle ist benutzerfreundlich gestaltet und ermöglicht es Forschern, ihre Proteinstrukturen nahtlos hochzuladen und Parameter für Docking-Simulationen zu konfigurieren. Es hat sich gezeigt, dass die Fähigkeit des Servers, NVIDIA- oder CUDA-Grafikprozessoren zu nutzen, zu einer erheblichen Beschleunigung der Rechenzeit führt, wodurch Forscher Ergebnisse mit größerer Zweckmäßigkeit erzielen können. Darüber hinaus bietet HEX Loria eine Reihe von Visualisierungsoptionen für das Andocken von Ergebnissen, die es dem Benutzer ermöglichen, eine detaillierte Analyse der vorhergesagten Protein-Protein-Wechselwirkungen durchzuführen.

Die Verwendung der UCSF-Chimäre ist unerlässlich, um die Genauigkeit der Forschungsergebnisse zu gewährleisten. Diese Software erfordert die Installation für die Ausführung des vorliegenden Protokolls, und die daraus resultierenden Funktionalitäten werden eingesetzt: Messung von interatomaren Abständen und verschiedene andere analytische Aufgaben. Die Software verfügt über Funktionen wie Beschriftung, Farbgebung, Oberflächendarstellung und Export von Abbildungen im JPG- oder PNG-Format. Die Einarbeitung von Markierungen und Farben erleichtert die Identifizierung von Aminosäuren mit einer hohen Wahrscheinlichkeit des Kontakts zwischen dem Rezeptor und dem entworfenen antimikrobiellen Protein. Darüber hinaus ermöglicht es die genaue Messung des Abstands zwischen diesen Aminosäuren.

Dieses Protokoll zielt darauf ab, alternative Behandlungsoptionen für das aufkommende Gesundheitsproblem von Amphibien zu identifizieren. Chytridiomykose, eine Pilzinfektion der Haut, wurde in verschiedenen Stadien der Amphibienentwicklung beobachtet. Die Hauptinfektionsquelle bei diesen Tieren sind die Gewässer, in denen sie sich typischerweise aufhalten und verschiedenen Aktivitäten nachgehen. Die Entwicklung eines wirksamen Antimykotikums erfordert die Identifizierung von mindestens drei molekularen Zielen: die Interaktion mit der Zellwand unter Verwendung von Ladungen, die Bindung an die Plasmamembran und schließlich die Bindung und Interaktion mit einem Rezeptorprotein auf Membranebene, das eine wichtige Rolle beim Pilz Bd spielt.

Protokoll

1. Identifizieren Sie molekulare Zielsequenzen in Bd

HINWEIS: Die Auswahl der Aminosäuren in der Sequenz basiert auf Empfehlungen aus der Literatur. Zu den wichtigsten Aminosäuren gehören K, W, G, A, V, I und L. Um herauszufinden, welche Programme verwendet werden sollten, sehen Sie sich die Materialtabelle an.

1. Abrufen von Zielsequenzen aus der NCBI-Datenbank.
   1. Greifen Sie auf die Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ zu.
   2. Wählen Sie Alle Datenbanken und dann Nukleotid als Suchkategorie aus.
   3. Geben Sie Batrachochytrium dendrobatidis in die Suchleiste ein und filtern Sie die Ergebnisse nach Stamm und Spezies.
   4. Laden Sie die Sequenz herunter und speichern Sie sie in einem Texteditor oder im FASTA-Format zur weiteren Analyse.

2. Analysieren Sie die Sequenz mit BLAST oder SMART BLAST

1. Führen Sie eine BLAST-Suche durch.
   1. Öffnen Sie einen Webbrowser und gehen Sie zu BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).
   2. Wählen Sie Protein BLAST aus, um die Abfragesequenz mit Proteindatenbanken https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi zu vergleichen.
2. Überprüfen Sie die Zielspezifität.
   1. Stellen Sie sicher, dass das ausgewählte molekulare Ziel nicht in anderen Spezies vorhanden ist. Wenn das Ziel in mehreren Spezies vorkommt, wiederholen Sie die Sequenzauswahl, bis die Spezifität bestätigt ist (siehe Abbildung 1).
      HINWEIS: Dieser Schritt stellt sicher, dass keine unerwünschten sekundären molekularen Ziele die Funktion von AMP oder antimykotischen Proteinen beeinträchtigen
3. Überprüfen Sie die Homologie in Proteinsequenzen.
   1. Stellen Sie sicher, dass die entworfene Aminosäuresequenz nicht mit homologen Proteinen in anderen Spezies übereinstimmt.
      HINWEIS: Dieser Schritt bestätigt, dass die antimykotische Funktion spezifisch für die beabsichtigten Ziele ist

3. Entwerfen Sie die antimikrobielle Proteinsequenz

HINWEIS: Der Aminosäuregehalt und die Aminosäuresequenz sollten auf die gewünschte Proteinfunktion abgestimmt sein, insbesondere auf die antimykotische Aktivität. Die entworfene Sequenz sollte für ein Protein mit antimykotischer Wirkung gegen Bd kodieren. Überprüfen Sie dies auf Antifp Predict Server²⁸.

1. Literaturrecherche und Sequenzdesign
   1. Durchführung einer umfassenden Überprüfung der aktuellen Literatur, um die wichtigsten Merkmale von Bd und potenzielle antimikrobielle Mechanismen zu identifizieren.
      HINWEIS: Frühere Studien beschreiben antimikrobielle Peptide (AMPs) gegen Bd, die von verschiedenen Tieren und Mikroorganismen synthetisiert werden. Shais Formel²⁹bietet einen Rahmen für die Entwicklung synthetischer antimykotischer Peptide. Diese Methode sollte verwendet werden, um Proteinsequenzen für eine maximale antimykotische Aktivität zu optimieren.

4. Vorhersage der 3D-Struktur mit I-TASSER

HINWEIS: Dieses Protokoll gilt für das molekulare Ziel und die entworfene antimikrobielle Sequenz.

1. Um auf Sequenzen zuzugreifen und diese einzureichen, besuchen Sie den I-TASSER-Server für https://zhanggroup.org/I-TASSER/ zur Vorhersage von Proteinstruktur und -funktion.
2. Registrieren Sie sich mit einer institutionellen E-Mail-Adresse, um einen Benutzernamen und ein Passwort für den Zugriff auf das Tool zu erhalten.
3. Senden Sie das molekulare Ziel oder die designte Sequenz im FASTA-Format, .txt Datei oder kopieren Sie es und fügen Sie es direkt in das Eingabefeld ein.
4. Weisen Sie der Sequenz einen eindeutigen Namen zu.
5. Klicken Sie auf Senden, und lassen Sie das Programm die Sequenz analysieren und eine geschätzte Verarbeitungszeit angeben.
   HINWEIS: Pausieren Sie das Protokoll, bis die Ergebnisse vorliegen. Die Verarbeitungszeit liegt in der Regel zwischen 24 und 72 Stunden für kleine Proteine (≤50 Aminosäuren) und kann für größere Proteine (bis zu 3.000 Aminosäuren) länger dauern.
   Anleitung zur Werkzeugauswahl: Verwenden Sie I-TASSER für kleine Proteine, wie z. B. designte antimikrobielle Peptide. Für große Proteine verwenden Sie trRosetta, das für die komplexe Strukturmodellierung optimiert ist.

5. Vorhersage der 3D-Struktur mit trRosetta

1. Besuchen Sie den trRosetta-Webserver: https://yanglab.qd.sdu.edu.cn/trRosetta/.
2. Geben Sie die Zielrezeptorsequenz im FASTA-, .txt- oder MSA-Format ein, oder fügen Sie sie direkt in den Server ein.
3. Weisen Sie dem strukturell vorhergesagten Protein einen Namen zu.
4. Klicken Sie auf Senden, und stellen Sie sicher, dass die Option zum Ausschließen von Vorlagen ausgewählt ist. Wählen Sie trRosettaX-single homologs , um den Vorhersageprozess zu starten.
   HINWEIS: Pausieren Sie das Protokoll, bis die Ergebnisse vorliegen.
5. Warten Sie auf eine Bestätigungs-E-Mail nach erfolgreicher Einreichung.
6. Analysieren Sie die Vorhersageergebnisse .
   1. Stellen Sie sicher, dass der TM-Score ein Maß für die Modellqualität ist.
   2. Untersuchen Sie Kontaktkarten, Entfernungskarten pro Aminosäure und Rotationskarten für Alpha- und Beta-Kohlenstoffe in den Winkeln ω (Omega), θ (Theta) und φ (phi).
7. Laden Sie die Ergebnisse im ZIP-Format zur weiteren Analyse herunter.

6. Molekulares Docking und Interaktionsanalyse (mit HADDOCK)

1. Greifen Sie auf den HADDOCK-Dockingserver zu: https://wenmr.science.uu.nl/haddock2.4/.
2. Registrieren Sie ein Konto mit einer institutionellen E-Mail-Adresse, bestätigen Sie das Konto und melden Sie sich an.
3. Kehren Sie zur Startseite zurück, wählen Sie Neuer Auftrag aus, und starten Sie eine Übermittlung.
4. Geben Sie auf der HADDOCK-Einreichungsseite die erforderlichen Informationen ein : Name des Auftrags, Molekülnummer (in diesem Fall 2). Alles auswählen.
5. Hochladen Moleküle zum Andocken. Laden Sie PDB-Strukturen für den Rezeptor und den Liganden hoch. Wählen Sie für beide das Protein-Liganden-Docking .
6. Wiederholen Sie die Schritte für die Ligandenübermittlung, wählen Sie alle Ketten aus, und behalten Sie die restlichen Einstellungen als Standard bei.
7. Klicken Sie auf Weiter , um den nachfolgenden Übermittlungsschritt auszuführen.
   HINWEIS: Fügen Sie in den Abschnitten 1 und 2 die Liste der Aminosäuren hinzu, die an Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen beteiligt sind, und markieren Sie sie als aktive Rückstände. Passive Rückstände bleiben vordefiniert. Die aktiven Zentren sind die Interaktionsstellen und müssen entsprechend den Eigenschaften des entworfenen Proteins und den exponierten Aminosäuren des Rezeptorproteins ausgewählt werden.
8. Schließen Sie den Andockvorgang ab, und führen Sie ihn aus.
   1. Klicken Sie auf Weiter , um die Standard-Docking-Parameter unverändert zu lassen.
   2. Klicken Sie auf Senden , um die Verarbeitung zu starten.
      HINWEIS: Die erwartete Verarbeitungszeit liegt zwischen 24 und 72 Stunden.
9. Überprüfen Sie die Andockergebnisse.
   1. Der Server wählt automatisch die besten Docking-Ergebnisse aus und ordnet sie ein. Analysieren Sie Aminosäureinteraktionen mit Hilfe von Strukturvisualisierungssoftware (z. B. PyMOL oder UCSF Chimera).
10. Laden Sie die endgültigen angedockten Strukturen im PDB-Format herunter, um weitere Studien zu erhalten.
    HINWEIS: Siehe Zusatzdatei 1: Ergänzende Abbildung S1, Ergänzende Abbildung S2, Ergänzende Abbildung S3, Ergänzende Abbildung S4 und Ergänzende Abbildung S5.

7. Entfernungen messen (OPTIONAL) [siehe Zusatzdatei 1: Ergänzende Abbildung S6, Ergänzende Abbildung S7 und Ergänzende Abbildung S8.]

1. Analysieren Sie die Andockergebnisse mit einem Strukturvisualisierungsprogramm (PDB). Öffnen Sie die PDB-Datei für das molekulare Andocken in UCSF Chimera und bewerten Sie die strukturelle Nähe und potenzielle Bindungsstellen (gemessene Entfernungen).
2. Doppelklicken Sie auf das Chimären-Symbol , um PDB zu öffnen . Wählen Sie Datei, Öffnen und wählen Sie eine Datei aus dem Dokumentverzeichnisfenster aus.
3. Atome identifizieren. Gehen Sie zu Aktionen, Atome/Bindungen und wählen Sie Anzeigen aus.
4. Wählen Sie Atome aus, die dem Liganden und Rezeptor am nächsten sind. Wählen Sie Atom 1 mit Strg+Klick und Atom 2 mit Strg+Umschalt+Klick aus.
5. Wechseln Sie zu Werkzeuge, Strukturanalyse, und wählen Sie Entfernungen aus.
6. Klicken Sie auf Erstellen (Atomauswahl überprüfen). Das Fenster zeigt Aminosäuren und die Positionen der Atome 1 und 2 an.
   HINWEIS: In der Spalte "Abstand" werden die Winkel zwischen den Atomen angezeigt.
7. Laden Sie die Tabelle herunter, und speichern Sie sie auf dem lokalen Computer.
   HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie in der Zusatzdatei 1 .

Ergebnisse

Die in der Entwicklung befindliche Sequenz verwendet die folgende Formel: K(X)³KW(X)²K(X)²K, wobei (X) G, A, V, I oder L²⁸ sein kann. Die erhaltenen Suchergebnisse umfassten Proteinsequenzen von mehr als 300 Aminosäuren, die aufgrund ihres Status als vollständige Proteinsequenzen ausgewählt wurden, im Gegensatz zu Teilsequenzen. Zu beachten ist, dass vollständige Sequenzen für die Studie unerlässlich sind. Die Funktionen der einzelnen Rezeptor-/Membrankanäle wurden...

Diskussion

Der bioinformatische Ansatz, der bei der Vorhersage von Proteinstrukturen verwendet wird, hat inhärente Einschränkungen, da er auf Computerprogramme angewiesen ist. Diese Programme versuchen, reale Proteinstrukturen zu approximieren, sind jedoch durch Faktoren wie Temperatur, Löslichkeit und Lösungsmittelpräsenz eingeschränkt, die unter vivo-Bedingungen möglicherweise nicht vollständig repliziert werden können. Darüber hinaus hängt die Methode von der genauen Identifizierung der wichtigs...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BLAST	N/A	N/A	Online-Server
Computer	AMD	N/A	SO: XP, W7, W8, W10, ubuntu, linux
HADDOCK server	BONVINLAB	N/A	Online-Server
HEX 5.2	BBSRC-INRIA	N/A	Download-Online Server
I-TASSER	ZHANG LAB	N/A	Download-Online Server
MUSCLE	N/A	N/A	Online-Server
NCBI	N/A	N/A	Online-Server
PYMOL	SCHRÖ DINGER	N/A	Download-XP, W7, W8, W10, W11, LINUX
SWISS-MODEL	BIOZENTRUM	N/A	Online-Server
trRosetta server	YANG LAB	N/A	Online-Server
USCF CHIMERA	RBVI	N/A	Download-XP, W7, W8, W10, W11, LINUX