Methodenartikel

Differentielle Genanalyse und Validierung der Disulfideptose im Rattenmodell für myokardiale Ischämie-Reperfusionsschäden

630 Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/68019

⸱

18. April 2025

 , 
1Department of Cardiovascular Medicine, The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt die Identifizierung mehrerer neuer Disulfideptose-verwandter Differentialgene, die mit myokardialer Ischämie-Reperfusionsschädigung assoziiert sind, durch bioinformatische Analyse und experimentelle Validierung.

Zusammenfassung

Die myokardiale Ischämie-Reperfusionsverletzung (MIRI) ist eine zusätzliche Verletzung, die während des Prozesses der Wiederherstellung des Blutflusses des Herzgewebes nach einer Ischämie-induzierten Verletzung auftritt. MIRI beeinträchtigt die Wirksamkeit und die kurz- und langfristige Prognose der Reperfusion nach einem Myokardinfarkt erheblich. Derzeit ist der Mechanismus von MIRI noch nicht vollständig geklärt. Die Disulfideptose ist eine neue Art des Zelltods, und die Beziehung zwischen MIRI und der Expression von Disulfideptosis-verwandten Genen (DRGs) ist noch unklar. Zunächst werden in dieser Studie die differentiell exprimierten Gene untersucht, die mit Disulfideptose bei MIRI assoziiert sind, und zwar durch bioinformatische Analyse. Zweitens wurden durch die Konstruktion eines Rattenmodells von MIRI weitere DRGs nachgewiesen. In dieser Studie wurden 12 verwandte Gene identifiziert, darunter Myh9, SLC7A11, SLC3A2, Myh7b, ACTB, FLNB, Actn1, Actn4, Flnc, Dbn1 und Pdlim1. Myokardgewebe von Ratten mit MIRI zeigt offensichtliche pathologische Schäden und Apoptose-Ereignisse. Die Ergebnisse der Immunhistochemie deuteten darauf hin, dass die MIRI-Stimulation die Expression des GLUT1-Proteins im Myokardgewebe erhöhte, aber die Expression des F-Aktin-Proteins einschränkte. Darüber hinaus wurden signifikante Unterschiede in der Expression von drei Proteinen mit externen Datensätzen und MIRI-Rattenmodellen validiert. Diese Studie zeigte, dass DRGs einen signifikanten prädiktiven Wert bei MIRI haben, was neue Perspektiven für die Erforschung von Biomarkern und potenziellen therapeutischen Zielen von MIRI eröffnet.

Einleitung

Der akute Myokardinfarkt (AMI) ist eine schwere kardiovaskuläre Erkrankung und nach wie vor eine der weltweit häufigsten Todesursachen. Die perkutane Koronarintervention hat die Mortalitätsraten bei AMI-Patienten signifikant gesenkt1. Die Reperfusionstherapie, die auf die Wiederherstellung der myokardialen Blutversorgung abzielt, wird jedoch von einer Reihe unerwünschter pathologischer und physiologischer Reaktionen begleitet. Diese Prozesse können zu einer erhöhten Infarktgröße, zum Absterben von Myokardzellen, anhaltenden ventrikulären Arrhythmien und zum plötzlichen Tod führen2. Die myokardiale Ischämie-Reperfusionsverletzung (MIRI) ist eine komplexe kardiovaskuläre Erkrankung, die von Faktoren wie Zytokinen, Chemokinen, Wachstumsfaktoren, oxidativem Stress und Kalziumüberladung beeinflusstwird 3. Die Eindämmung von MIRI ist nach wie vor eine große Herausforderung.

In jüngster Zeit hat sich die Disulfideptose als eine neuartige Form des Zelltods herausgestellt, die durch einen schnellen Zusammenbruch des Zytoskelett-Aktinnetzwerks aufgrund einer übermäßigen Akkumulation von Disulfiden, einschließlich Cystein, in den Zellen gekennzeichnet ist, die auf eine NADPH+-Depletion zurückzuführen ist. Eine übermäßige Disulfidakkumulation stört die Disulfidbindungen zwischen den Proteinen des Zytoskeletts, was zu Aktinmigration und Zelltod führt 4,5. Im Gegensatz zu zuvor berichteten Formen des Zelltods wie Apoptose, Nekrose, Pyroptose und Ferroptose wird die Disulfideptose durch die übermäßige Aggregation von intrazellulären Disulfiden ausgelöst und nicht durch spezifische Inhibitoren anderer Zelltodwege antagonisiert. Als charakteristischer Zelltod deuten Hinweise darauf hin, dass eine durch zellulären Glukosemangel hervorgerufene SLC7A11-Überexpression Disulfidptose auslösen kann4. Nach MIRI kann eine unzureichende Insulinsekretion eine Hypoglykämie und eine anschließende Disulfidptose induzieren, die weitere Schäden an den Myokardzellen verursachen kann und einer der neuen Mechanismen von MIRI5 sein könnte.

In dieser Studie bestand das primäre Ziel darin, umfassende Genexpressionsdatenbanken, wie z.B. den Gene Expression Omnibus (GEO), zu nutzen, um die differentielle Genexpression zwischen normalen und MIRI-Proben zu analysieren. Wir führten eine querreferentielle Analyse zwischen differentiell exprimierten Genen und Genen durch, die mit Disulfideptose assoziiert sind, mit dem Ziel, Disulfideptosis-verwandte Gene (DRGs) zu identifizieren, die eine differentielle Expression in MIRI aufweisen. Algorithmen des maschinellen Lernens wurden eingesetzt, um Schlüsselgene zu identifizieren, und wir validierten die Expressionsmuster der ausgewählten differentiellen Gene von Interesse anhand eines Tiermodells. Dieser Ansatz bietet eine neue Perspektive, um ein tieferes Verständnis der potenziellen Mechanismen zu erlangen, die dem Auftreten und Fortschreiten von MIRI zugrunde liegen. Der Hauptfokus dieser Forschung lag auf der Untersuchung eines neuen Zelltodmechanismus innerhalb von MIRI, der Aufdeckung assoziierter Differentialgene und der Durchführung von Vorexperimenten, um diese Ergebnisse zu validieren. Das ultimative Ziel war es, neue therapeutische Ziele zur Abschwächung von MIRI zu identifizieren, die auf diesem neuen Zelltodmechanismus basieren.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Für diese Studie wurden neun männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten im Alter von 6-8 Wochen und einem Gewicht von 180-220 g aus dem Hubei Experimental Animal Research Center [SCXK (Hubei) 20200018] ausgewählt. Die Ratten wurden 1 Woche lang in speziellen pathogenfreien Tierställen gehalten, um sich zu akklimatisieren, mit einem 12 h/12 h Hell- und Dunkelzyklus, freiem Trinken und Fressen. Die aktuelle Studie wurde mit Genehmigung der Tierethikkommission des Dritten angeschlossenen Krankenhauses der Zunyi Medical University durchgeführt (Zulassungsnummer: (2016)-1-56). Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des von den US National Institutes of Health veröffentlichten Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Es wurden strenge Maßnahmen ergriffen, um die Anzahl der eingesetzten Tiere zu minimieren und ihr Leid zu lindern.

1. Differentielle Expressionsanalyse von Genen, die mit MIRI und Disulfideptose in Verbindung stehen

HINWEIS: RNA-Sequenzierungsdaten von MIRI mit dem Namen GSE214122 wurden ausgewählt, um Gene zu screenen, die mit Disulfideptose assoziiert sind, gemäß Literaturbericht6.

  1. Öffnen Sie die GEO-Datenbank, geben Sie GSE214122 in das Suchfeld ein und klicken Sie auf die Eingabetaste. Laden Sie die generierte(n) Serienmatrixdatei(en) im TXT-Format im Abschnitt Download herunter.
    HINWEIS: Vor der Durchführung der Datenanalyse ist es in der Regel erforderlich, die heruntergeladenen Daten vorzuverarbeiten. Dazu gehören die Überprüfung auf fehlende Werte, das Entfernen von Proben und Genen von geringer Qualität sowie das Durchführen einer Normalisierung oder Standardisierung der Daten. Der abgerufene GSE214122 Datensatz enthielt Proben aus der scheinbetriebenen und der MIRI-Gruppe.
  2. Führen Sie eine differentielle Genexpressionsanalyse der Proben mit dem DESeq2-Paket7 durch. Betrachten Sie Gene mit |log2FC|>1 (Faltungsänderung größer als 2) und FDR<0,05 als statistisch signifikant, was zur Identifizierung von differentiell exprimierten Genen führt, die mit MIRI assoziiert sind. Generieren Sie eine Heatmap der differentiellen Genexpression in Schritt 1.2 unter Verwendung des Pheatmap-Pakets7 von R.
  3. Erstellen Sie ein Venn-Diagramm mit dem VennDiagram-Paket7 von R (siehe Materialtabelle). Generieren Sie Volcano-Diagramme, um Disulfideptosis-bezogene Gene mit einem EnhancedVolcano-Paket in R7 zu visualisieren.
  4. Aufbau eines PPI-Netzwerks, das die differentiell exprimierten MIRI-Gene mit den Disulfideptose-Genen unter Verwendung der STRING-Datenbank7 verbindet (siehe Materialtabelle).

2. Aufbau des Ratten-MIRI-Modells

  1. Fasten Sie die Ratten über Nacht, bevor Sie eine Anästhesie durchführen. Betäuben Sie die Ratten durch intraperitoneale Injektion von 2% Natrium-Pentobarbital (40 mg/kg) und befestigen Sie die Gliedmaßen in Rückenlage an einem Rattenbrett. Bestätigen Sie die Narkosetiefe, indem Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen, den Verlust des Aufrichtreflexes und des Augenzwinkerns reagieren. Verwenden Sie Tierarztsalbe, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
  2. Desinfizieren Sie die Haut von Hals und Brust mit Jodophor und entjodieren Sie mit 75% Alkohol. Rasieren Sie das Fell des Halses und der linken Brust mit einem Elektrorasierer und machen Sie mit einem Skalpell einen etwa 2,5 cm langen mittleren Schnitt am Hals (siehe Materialtabelle).
  3. Trennen Sie die Luftröhre mit einer Pinzette und führen Sie eine endotracheale Intubation mit Anschluss an ein Kleintierbeatmungsgerät3 durch (siehe Materialtabelle).
  4. Schneiden Sie mit einer Augenschere 4 cm in Längsrichtung entlang der linken Seite des Brustbeins und trennen Sie die Unterhautmuskulatur stumpf mit einer Pinzette, um das Brustfell zwischen der dritten und vierten Rippe freizulegen.
  5. Machen Sie einen 4-5 cm langen Schnitt vom Processus xiphoideus bis zur Mitte des linken zweiten Interkostalraums, während Sie das Skalpell in einem Winkel von 45° halten. Trennen Sie sanft und langsam den Musculus pectoralis major und den Musculus anterior mit einer ophthalmologischen Zange, um Zugang zum Interkostalraum zu erhalten.
  6. Machen Sie mit einer Augenschere einen 1,5 cm langen Querschnitt zwischen der linken dritten und vierten Rippe. Nach dem Präparieren des Perikards mit einer ophthalmologischen Zange wird das linke Vorhofohr mit einer Pinzette angehoben, um das koronare Ostium an der Aortenwurzel zu identifizieren.
  7. Ligatur der linken vorderen absteigenden Koronararterie zwischen dem Lungenkonus und dem linken Vorhofohr mit einer 6-0-Naht (siehe Materialtabelle).
  8. Nach 30 Minuten wird die Naht gelockert, um eine Reperfusion von 120 Minuten zu ermöglichen, gefolgt von einem Verschluss der Muskel- und Hautschichten mit einer 6-0-Naht. Wenden Sie Penicillin (siehe Materialtabelle) durch intraperitoneale Injektion mit 80.000-100.000 Einheiten an.
  9. Führen Sie in der Scheingruppe alle Eingriffe wie in der Modellgruppe durch, fädeln Sie jedoch nur die linke vordere absteigende Koronararterie ohne Ligatur oder Reperfusion ein.
  10. Sobald die Ratten wieder zu Bewusstsein gekommen sind, entfernen Sie die Endotrachealtuben. Bringen Sie die Ratten zur Genesung in die Tiereinrichtung zurück, wo sie freien Zugang zu Futter und Wasser haben. Halten Sie die Ratte, die operiert wird, in einem einzigen Käfig mit einem unabhängigen Beatmungssystem in einem sterilen Labor unter.
  11. Während 30 Minuten Ischämie und 120 Minuten Reperfusion ist eine Echokardiographie durchzuführen. Die Modellierung wurde als erfolgreich angesehen, wenn die linksventrikuläre Ejektionsfraktion weniger als 50 % betrug1,6.

3. Herzgewebe entnehmen3

  1. Nach 120 Minuten Reperfusion legen Sie die Ratten in den Euthanasiebehälter, um die Euthanasie durch Einatmen von Kohlendioxid durchzuführen. Entnehmen Sie sofort das Herzgewebe der Ratte.
  2. Entfernen Sie die Bauchhaare der Ratten mit einem Rasiergerät und sterilisieren Sie den vorderen Brustbereich mit Jod und 75% Alkohol. Präpariere die Bauchhöhle der Ratte entlang der Mittellinie des Bauches mit einem Skalpell.
  3. Schneiden Sie die Haut vom Processus xiphoideus mit einer chirurgischen Schere nach oben in den Unterkieferraum und ziehen Sie die Haut und das Unterhautgewebe mit einer Pinzette zu beiden Seiten stumpf ab, um den Brustkorb und die oberflächliche Halsmuskelschicht freizulegen (siehe Materialtabelle).
  4. Öffnen Sie den Thorax und die Pleura entlang der Mittellinie mit einer chirurgischen Schere, um das Herz freizulegen, klemmen Sie die Aorta mit einem Gefäßclip fest und schneiden Sie die Arterie mit einer Augenschere. Nehmen Sie das Herz heraus und präparieren Sie es in 1 mm3 Gewebeblock in kalter Kochsalzlösung auf einem Eisbad und fixieren Sie es 48 h lang mit 4% Paraformaldehyd (siehe Materialtabelle).

4. Hämatoxylin-Eosin (H&E)-Färbung

  1. Dehydrieren und Einbetten: Dehydrieren Sie den Herzgewebeblock, indem Sie ihn nacheinander in 75 % Alkohol, 85 % Alkohol, 95 % Alkohol (I), 95 % Alkohol (II), 100 % Alkohol (I) und 100 % Alkohol (II) für 1 Stunde in jeder Lösung einweichen. Mit Xylol (I) und Xylol (II) transparentieren, indem 15 Minuten in jede Lösung getaucht wird. Legen Sie den Herzgewebeblock nacheinander 20-30 Minuten lang in flüssiges Paraffin (I), Paraffin (II) und Paraffin (III). Lassen Sie den Paraffinblock auf natürliche Weise abkühlen, bis er fest wird.
  2. Schneiden Sie den in Paraffin eingebetteten Herzgewebeblock mit einer Paraffinschneidemaschine in 4 μm große Abschnitte (siehe Materialtabelle). Legen Sie die Abschnitte mit einer weichen Bürste flach in ein 45 °C heißes Wasserbad und nehmen Sie dann die vollständig aufgeblähten Abschnitte mit einer Rutsche auf.
  3. Entparaffinieren: Die Scheiben im Ofen 30-60 min bei 55 °C backen und mit Xylol (I) 5-10 min und Xylol (II) 5-10 min entwachsen. Dann Xylol 1-5 min lang mit absolutem Ethanol, 1-5 min mit 95 % Ethanol und 1-5 min mit 75 % Ethanol waschen und 1-5 min mit Leitungswasser abspülen.
  4. Färbung: 5-20 min mit einer Hämatoxylinlösung färben, 5-10 s mit Leitungswasser spülen, 15-30 s mit einer Eosinlösung färben und 30 s mit 75%- 85% Ethanol waschen.
  5. Entwässern, transparent und versiegelnd: Dörren Sie mit 95 % Ethanol (I) für 0,5-2 min und 95 % Ethanol (II) für 2-5 min, gefolgt von absolutem Ethanol (I) für 2-5 min und absolutem Ethanol (II) für 2-5 min. Transparentisieren Sie 1 Minute lang mit Xylol (I) und 1 Minute lang mit Xylol (II) und versiegeln Sie dann die Schnittscheibe, indem Sie zwei Tropfen neutrales Harz auf die Scheibe geben und ein Deckglas platzieren. Drücken Sie leicht auf das Deckglas, um die Scheibe mit neutralem Harz zu füllen (siehe Materialtabelle).
  6. Beobachten Sie jede Scheibe unter einem optischen Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung in doppelblinder Manier durch zwei unabhängige Techniker.
    1. Wählen Sie drei zufällige Gesichtsfelder aus, um Myokardstauung, Blutung, Fibrose, Nekrose und Degeneration zu beurteilen. Verwenden Sie die folgenden Bewertungskriterien: 0 bedeutete keine Läsion; 0-1 angegebene Läsionen waren weniger als 1/4 des ausgewiesenen Bereichs; 1-2 angezeigte Läsionen reichten von etwa 1/4-1/2 des bezeichneten Bereichs; 2-3 angezeigte Läsionen reichten von etwa 1/2-3/4 des bezeichneten Bereichs; und 3-4 angezeigte Läsionen waren größer als 3/4 des ausgewiesenen Bereichs.

5. TUNEL-Assay

  1. Proteinase K mit Phosphatpufferlösung (PBS) auf 40 μg/ml verdünnen und 100 μl Proteinase K in 4 μm Schnitte geben, die in Schritt 4.3 hergestellt wurden, um den gesamten Probenbereich abzudecken, und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    HINWEIS: Proteinase K ist im TUNEL-Apoptose-Nachweiskit enthalten (siehe Materialtabelle).
  2. Waschen Sie die Sektion 2x mit PBS für jeweils 5 Minuten, entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit durch Ansaugen mit Filterpapier und halten Sie die Sektion in einer Nassbox feucht.
    HINWEIS: Proteinase K muss sauber gewaschen werden, um nachfolgende Markierungsreaktionen nicht zu beeinträchtigen.
  3. 50 μl TUNEL-Reaktionslösung, bestehend aus 2 μl TdT-Enzym und 48 μl TUNEL-Reaktionspuffer, gleichmäßig zugeben und das Schnittstück in eine Nassbox geben, um dort 2 h lang bei 37 °C im Dunkeln zu inkubieren.
    HINWEIS: Das TdT-Enzym und der TUNEL-Reaktionspuffer sind im TUNEL-Apoptose-Detektionskit enthalten.
  4. Entsorgen Sie die TUNEL-Reaktionslösung und spülen Sie sie 2x mit PBS für jeweils 5 Minuten. Waschen Sie den Abschnitt 3x für jeweils 5 Minuten mit PBS mit 0,1% Triton X-100 und 5 mg/ml BSA.
  5. 50 μl DAPI-Färbelösung gleichmäßig zugeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Verwerfen Sie die DAPI-Färbelösung und tränken Sie den Abschnitt in PBS, jeweils 3x, 5 Minuten.
  6. Erzielen Sie TUNEL-Signale für Rot und DAPI Blau bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 593/614 nm bzw. 364/454 nm. Nehmen Sie Bilder unter einem Fluoreszenzmikroskop mit 200-facher Vergrößerung auf (siehe Materialtabelle).

6. Immunhistochemische Färbung

  1. 200 μl verstärkter endogener Peroxidase-Blockierungspuffer in den Schnitt in Schritt 4.3 geben und 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Waschen Sie die Sektion 2x mit destilliertem Wasser für jeweils 5 min.
  2. 1 ml verbesserte Citrat-Antigen-Retrievallösung und 49 ml doppelt destilliertes Wasser in die Antikörper-Inkubationsbox geben und vorsichtig mischen. Tauchen Sie den Schnitt in die Antigen-Rückgewinnungslösung und erhitzen Sie ihn 20 Minuten lang bei 95 °C, bevor Sie ihn auf Raumtemperatur abkühlen (siehe Materialtabelle).
  3. Waschen Sie die Sektion 2x mit PBS für jeweils 5 min. Legen Sie den Abschnitt in die Antikörper-Inkubationsbox, um ihn über Nacht bei 4 °C mit 100 μl Primärantikörpern gegen F-Aktin (1:100), GLUT1 (1:200), Myh9 (1:200), SLC7A11 (1:200) und SLC3A2 (1:200) zu inkubieren.
  4. Waschen Sie die Sektion 2x mit PBS für jeweils 5 min. Geben Sie 100 μl Sekundärantikörper in den Schnitt und inkubieren Sie ihn 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  5. Waschen Sie die Sektion 2x mit PBS für jeweils 5 min. Mit 100 μl DAB-Arbeitslösung 5 min bei Raumtemperatur färben und die Farbreaktion durch Spülen mit gereinigtem Wasser stoppen.
    HINWEIS: Die DAB-Arbeitslösung wurde durch Mischen von DAB-Chromogenlösung A und DAB-Chromogenlösung B im Verhältnis 1:1 hergestellt, die im DAB-Meerrettichperoxidase-Farbentwicklungskit enthalten ist (siehe Materialtabelle).
  6. Färben Sie den Schnitt 3 Minuten lang mit 100 μl Hämatoxylin-Färbelösung und waschen Sie ihn 3 Minuten lang unter fließendem Wasser ab (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Das Hämatoxylin- und Eosin-Färbekit enthält eine Hämatoxylin-Färbelösung.
  7. Tauchen Sie den Abschnitt jeweils 2 Minuten lang in 75 % Ethanol, 95 % Ethanol und 100 % Ethanol.
  8. Versiegeln Sie den Schnitt mit neutralem Harz, decken Sie ihn mit einem Deckglas ab und untersuchen Sie den Schnitt unter einem Lichtmikroskop bei 200-facher Vergrößerung (siehe Materialtabelle). Gewebe, das eine braune Farbe aufweist, sind positive Reaktionen. Berechnen Sie die positive Ausprägungsrate als Verhältnis des gefärbten Bereichs zum Gesamtbereich des Sichtfelds. Führen Sie quantitative Analysen mit der Image J-Software durch.

7. Nachweis von Western-Blot-Flecken

HINWEIS: Lysepuffer und Proteaseinhibitor waren in einem BCA-Proteinquantifizierungskit enthalten (siehe Materialtabelle).

  1. 0,1 g frische Myokardproben aus Schritt 3.5 wiegen und mit 1 ml Lysepuffer und 10 μl Proteaseinhibitor mischen, anschließend in einem Glasmahlbehälter mahlen und 10 min bei 4 °C bei 10.304 x g zentrifugieren.
  2. Sammeln Sie den Überstand und führen Sie die Proteinquantifizierung mit der BCA-Methode gemäß den Anweisungen des Herstellersdurch 8. Den Überstand bei 95 °C 5 Min. kochen.
  3. Trennen Sie Proteine mit unterschiedlichem Molekulargewicht unter Verwendung eines 10%igen Trenngels, indem Sie eine 10-μl-Probe für die Proteinelektrophorese bei 80/120 V laden.
  4. Die Proteine auf dem Gel werden auf eine PVDF-Membran9 übertragen. Anschließend wird die Membran 1 h lang mit 5 % Magermilchpulver blockiert und über Nacht bei 4 °C mit Myh9-, SLC7A11-, SLC3A2- und β-Tubulin-Primärantikörpern in einer Verdünnung von 1:1000 inkubiert (siehe Materialtabelle).
  5. Nach dem Waschen mit PBS 3x für jeweils 5 min die Membran mit Sekundärantikörper (1:5000; siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur für 2 h inkubieren, gefolgt von einem Waschen mit PBS 3x für jeweils 5 min, bevor die Visualisierung mit einem Proteinvisualisierungsinstrument erfolgt (siehe Materialtabelle).
  6. Berechnen Sie das Graustufenverhältnis der Bänder zu β-Tubulin mit der Image J Software 8,9.

8. Statistische Auswertung

  1. Geben Sie Daten als Mittelwert ± Standardabweichung aus. Analysieren Sie Daten mit einer unidirektionalen Varianzanalyse, gefolgt von dem Post-hoc-Test mit der geringsten signifikanten Differenz. Führen Sie statistische Analysen mit einem kommerziellen statistischen Analysetool durch (siehe Materialtabelle) und betrachten Sie p < 0,05 als statistisch signifikant.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Screening von DRGs in MIRI
Der GSE214122 Datensatz von Gene Expression Omnibus enthielt Daten aus drei Schein- und drei MIRI-Proben. Unter Verwendung des DESeq2-Pakets in R wurden 1233 differentiell exprimierte Gene (DEGs) zwischen MIRI- und Scheinproben identifiziert. Basierend auf |log2FC|>2 und FDR<0.05 wurden 417 signifikant unterschiedliche Gene mit Hilfe des Pheatmap-Pakets von R weiter selektiert (Abbildung 1A). Dann wurden 15 Schnittgene zwischen diesen 1233...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Die Disulfideptose ist eng mit dem Aktin-Zytoskelett verbunden, einer kritischen zellulären Struktur, die für die Aufrechterhaltung der Zellform und -lebensfähigkeit unerlässlich ist. Das Aktin-Zytoskelett besteht aus Aktinfilamenten und verleiht die gesamte zelluläre Form und Struktur. F-Aktin dient als Marker für das zelluläre Zytoskelett, und unter Bedingungen des Glukosemangels nehmen die Disulfidbindungen signifikant zu, was zu einer Herunterregulierung von F-Aktin führt. Dieses Phä...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde vom Guizhou Provincial Bureau of Science and Technology (Qiankehe [2022]-583) und der Guizhou Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine (QZYY-2016-019) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
75% AlkoholHunan Tongruijian Pharmaceutical Co. Ltd., Hunan, China85026
6-0 Nylon-NahtShanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co. Ltd., Shanghai, ChinaCS002
BCA-Protein-QuantifizierungskitBeyotime Biotechnology, Shanghai, ChinaP0011
BullenserumalbuminBeyotime Biotechnology, Shanghai, ChinaST2254
ZentrifugeHunan Kaida Scientific Instrument Co. Ltd., Hunan, ChinaKH19A
DAB-Meerrettichperoxidase-FarbentwicklungskitBeyotime Biotechnology, Shanghai, ChinaP0203
DAPI-FärbelösungBeyotime Biotechnology, Shanghai, ChinaC1006
DESeq2-PaketVersion 4.1
ElektrorasiererKelmerpp235376
Verbesserter endogener Peroxidase-BlockierungspufferBeyotime Biotechnology, Shanghai, ChinaP0100B 
FilterpapierNanjing Keruicai Equipment Co., Ltd., Nanjing, China1.00049E+11
FluoreszenzmikroskopNikonECLIPSE Ci
GEO Datenbankhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
GlasschleiferShanghai Leigu Instrument Co. Ltd., Shanghai, ChinaB-013002
GraphPad PrismGraphPad SoftwareV8.0
Hämatoxylin- und Eosin-FärbekitBeyotime Biotechnology, Shanghai, ChinaC0105M
Image J SoftwareNational Institutes of Health, Bethesda, USAv1.8.0
Verbesserte Citrat-Antigen-Retrieval-Lösung (50X)Beyotime Biotechnology, Shanghai, ChinaP0083
IodophorFolca, Shenzhen, China1.00077E+11
Optisches MikroskopNikonECLIPSE Ci
Phosphat PufferlösungBeyotime Biotechnology, Shanghai, ChinaC0221A
Primärantikörper gegen GLUT1Proteintech Group, Inc, Wuhan, China21829-1-AP
Primärantikörper gegen MYH9Proteintech Group, Inc, Wuhan, China11128-1-AP
Primärantikörper gegen SLC3A2Wuhan Lingsi Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, ChinaLJS-D-7468
Primärantikörper gegen SLC7A11Proteintech Group, Inc, Wuhan, China26864-1-AP
ProteinvisualisierungsinstrumentThermo Fisher Scientific Inc.iBright CL750
RattenbrettZhengzhou Haopai Biotechnology Co. Ltd., Zhengzhou, ChinaJPB-E
SkalpellShanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd., Shanghai, China1.00471E+13
SekundärantikörperWuhan Boster Biological Technology, Ltd., Wuhan, ChinaBA1054
STRING-Datenbankhttps://cn.string-db.org/Version 12.0
Triton X-100Beyotime Biotechnology, Shanghai, ChinaST1722
TUNEL Apoptose-DetektionskitProteintech Group, Inc., Wuhan, ChinaPF00009

Referenzen

  1. Lu, Z., et al. Tripartite motif 38 attenuates cardiac fibrosis after myocardial infarction by suppressing TAK1 activation via TAB2/3 degradation. iScience. 25 (8), 104780(2022).
  2. Tu, Q., et al. EGCG decreases myocardial infarction in both I/R and MIRI rats through reducing intracellular Ca2+ and increasing TnT levels in cardiomyocytes. Adv Clin Exp Med. 30 (6), 607-616 (2021).
  3. Li, Q., et al. Histone deacetylase HDAC4 participates in the pathological process of myocardial ischemia-reperfusion injury via MEKK1/JNK pathway by binding to miR-206. Cell Death Dis. 7 (1), 240(2021).
  4. Liu, X., et al. Actin cytoskeleton vulnerability to disulfide stress mediates disulfidptosis. Nat Cell Biol. 25 (3), 404-414 (2023).
  5. Yang, L., et al. Analysis of risk genes associated with disulfidptosis-related myocardial ischemia-reperfusion injury. J Chongqing Med Univ. 49 (4), 401-408 (2024).
  6. Xiao, G., et al. CXCR1 and its downstream NF-κB inflammation signaling pathway as a key target of Guanxinning injection for myocardial ischemia/reperfusion injury. Front Immunol. 13, 1007341(2022).
  7. Zhu, E. Y., et al. Screening of immune-related secretory proteins linking chronic kidney disease with calcific aortic valve disease based on comprehensive bioinformatics analysis and machine learning. J Transl Med. 21, 359(2023).
  8. Shi, D. C., et al. Potential of Dendrobium officinale oligosaccharides to alleviate chronic colitis by modulating inflammation and gut microbiota. FoodMedHomo. 2, 9420077(2025).
  9. Ning, E. J., et al. Artemisia argyi polysaccharide alleviates intestinal inflammation and intestinal flora dysbiosis in lipopolysaccharide-treated mice. FoodMedHomo. 1 (1), 9420008(2024).
  10. Zhou, H., Wang, J., Zhu, P., Hu, S., Ren, J. Ripk3 regulates cardiac microvascular reperfusion injury: The role of IP3R-dependent calcium overload, XO-mediated oxidative stress and F-action/filopodia based cellular migration. Cell Signal. 45, 12-22 (2018).
  11. Antonipillai, J., Rigby, S., Bassler, N., Peter, K., Bernard, O. Pharmacological inhibition of LIM kinase pathway impairs platelets functionality and facilitates thrombolysis. Exp Cell Res. 382 (2), 111458(2019).
  12. Kaumeyer, B. A., et al. GLUT1 immunohistochemistry is a highly sensitive and relatively specific marker for erythroid lineage in benign and malignant hematopoietic tissues. Am J Clin Pathol. 158 (2), 228-234 (2022).
  13. Patching, S. G. Glucose transporters at the blood-brain barrier: Function, regulation and gateways for drug delivery. Mol Neurobiol. 54 (2), 1046-1077 (2017).
  14. Zhou, H., et al. 3-iodothyronamine inhibits apoptosis induced by myocardial ischemia reperfusion via the Akt/FoxO1 signaling pathway. Ann Trans Med. 10 (4), 168(2022).
  15. Pecci, A., et al. MYH9: Structure, functions and role of non-muscle myosin IIA in human disease. Gene. 664, 152-167 (2018).
  16. Girolami, A., et al. Occurrence of thrombosis in congenital thrombocytopenic disorders: A critical annotation of the literature. Blood Coagulat Fibrino. 24 (1), 18-22 (2013).
  17. Li, P., et al. SLC7A11-associated ferroptosis in acute injury diseases: Mechanisms and strategies. Eur Rev Med Pharmaco Sci. 27 (10), 4386-4398 (2023).
  18. Wu, X., et al. Dihydrotanshinone I preconditions myocardium against ischemic injury via PKM2 glutathionylation sensitive to ROS. Acta Pharma Sinica B. 13 (1), 113-127 (2023).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Differentielle GenanalyseRattenmodellbioinformatische AnalyseDisulfidptose assoziierte GeneImmunhistochemieProteinexpressionBiomarker Identifizierung
Video demnächst verfügbar

Verwandte Artikel