Methodenartikel

Vorbereitung und Durchführung eines IsoPositiv-Käfig-Experiments zur Stuhltransplantation von Menschen in keimfreie Mäuse

DOI:

10.3791/68029

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28. Februar 2025

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1Department of Medicine, University of Florida College of Medicine, 2Department of Infectious Diseases and Immunology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt die Best Practices für den keimfreien Transfer von Mäusen zu und die Unterbringung in experimentellen Einzelkäfig-Isolatoren (Isokäfigen) unter Beibehaltung steriler Bedingungen. Methoden zur Stuhltransplantation in keimfreie Mäuse und die Gewinnung lebensfähiger Bakterien aus diesen darmisierten "humanisierten" Mäusen für weitere Anwendungen werden diskutiert.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Keimfreie Mäuse sind ein wichtiges Untersuchungsinstrument, um den Beitrag von Mikroorganismen zur Gesundheit und Krankheit des Wirts zu verstehen und die spezifische Rolle von Individuen, definierten oder komplexen Gruppen von Mikroorganismen bei der Wirtsreaktion zu bewerten. Traditionell in flexiblen Folien oder halbstarren Isolatoren gezüchtet und aufgezogen, sind keimfreie Mäusehaltung und experimentelle Manipulation kostspielig und erfordern zahlreiches geschultes Personal und einen großen Platzbedarf in Tierställen. Das IsoPositive-Käfigsystem ermöglicht die experimentelle Manipulation von keimfreien Mäusen in einzelnen, hermetisch abgedichteten Überdruck-Isolatorkäfigen (IsoCages), wodurch die Kosten gesenkt und eine größere Flexibilität bei experimentellen Manipulationen ermöglicht werden.

Hier wird ein Protokoll für den Transfer keimfreier Mäuse aus Zuchtisolatoren in Isokäfige und den anschließenden Stuhltransfer aus dem Stuhl von menschlichen Spendern in Mäuse beschrieben, um stabile Langzeit-Darm-"humanisierte" Mäuse für zukünftige Studien zu schaffen. Die Materialien und Vorbereitungen, die für die Verwendung des Isokäfigsystems erforderlich sind, werden beschrieben, einschließlich der Verwendung von chemischem Chlordioxid-Sterilisationsmittel zur Reinigung von Käfigen, Vorräten, Geräten und persönlicher Schutzausrüstung. Es werden die Methoden zur Bestätigung des keimfreien Status von übertragenen Mäusen und die Bestimmung von Kontaminationen im Käfigsystem diskutiert. Das Vorgehen bei der Haltung, einschließlich Einstreu, Futter und Wasserversorgung, wird weiter diskutiert. Das Protokoll für die Vorbereitung und Sonde von menschlicher Fäkalaufschlämmung in keimfreie Mäuse zur Erzeugung von "humanisierten" Mäusen im Darm sowie die Stuhlsammlung zur Überwachung der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft dieser Mäuse werden beschrieben. Ein Experiment zeigt, dass eine zweiwöchige posthumane Stuhltransplantation eine stabile Besiedlung der Spendermikrobiota in den murinen Wirten ermöglicht, was eine spätere experimentelle Verwendung ermöglicht. Des Weiteren wird die Sammlung von humanisiertem Mauskot in Viabilitätskonservierungsmedien beschrieben, die den Einsatz in weiteren funktionellen Experimenten ermöglichen. Insgesamt ermöglichen diese Methoden die sichere und effektive Etablierung humanisierter Mausgemeinschaften in experimentellen gnotobiotischen Käfigen für weitere Manipulationen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Keimfreie Mäuse sind ein wesentliches Werkzeug im Repertoire der Mikrobiomforscher, das es ermöglicht, den Beitrag der Mikrobiota zur Gesundheit und zum Krankheitszustand des Wirts zu analysieren. Keimfreie Mäuse werden völlig steril geboren und bleiben ihr Leben lang axenisch1. Die Besiedlung keimfreier Mäuse mit spezifischen Bakterienstämmen ermöglicht ursächliche Studien zwischen diesen Taxa und Stoffwechsel-, Immun- oder anderen Wirtsfunktionen 2,3,4,5. Besonders vorteilhaft ist die Möglichkeit, keimfreie Mäuse auf der Ebene der Mikrobiota durch die Transplantation von Kot von menschlichen Spendern zu "humanisieren" und, wenn sie unter Barrierebedingungen untergebracht sind, eine Kontamination durch von Mäusen stammende Mikroorganismen zu verhindern1. Dieser Ansatz hat viele wichtige Entdeckungen auf dem Gebiet des Mikrobioms ermöglicht, z. B. die Wirkung des menschlichen Darmmikrobioms auf das Ansprechen auf die Immuntherapiebei Krebs 6,7,8.

Obwohl humanisierte keimfreie Mäuse für die Forschungsbemühungen im Bereich des Mikrobioms von unschätzbarem Wert sind, gibt es viele Einschränkungen, die eine breitere Adaption dieses Ansatzes verhindert haben. Keimfreie Mäuse werden in halbstarren oder flexiblen Isolatoren gezüchtet und gehalten, aber funktionelle Experimente erfordern die Einrichtung separater Mini-Isolatoren, wobei ein Mini-Isolator mehrere Käfige beherbergt, aber nur unter einer experimentellen Bedingung. Dieser Mini-Isolator-Ansatz erhöht den Platzbedarf und die Kosten und schränkt gleichzeitig die Anzahl der experimentellen Bedingungen, die in einem Experiment untersucht werden können, und die Anzahl der Experimente, die parallel durchgeführt werden können, stark ein. Eine vielversprechende Lösung ist die Verwendung eines individuellen, modularen Käfigsystems, das ISOcage P Bioexclusion System (hier als Isokäfigsystem bezeichnet)9,10. Das Isokäfigsystem ermöglicht die experimentelle Manipulation von keimfreien Mäusen in einzelnen, hermetisch abgedichteten Überdruck-Isolatorkäfigen, wodurch separate experimentelle Bedingungen zwischen den einzelnen Käfigen und nicht zwischen den einzelnen Mini-Isolatoren möglich sind. Mit der richtigen aseptischen Technik können Tiere bis zu 12 Wochen lang unter keimfreien Bedingungen in Isokäfigen untergebracht oder durch menschliche Stuhltransplantationen vermenschlicht werden, um sie in jedem kompatiblen experimentellen Ansatz zu verwenden (d. h. sie können unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden). Mehrere unabhängige Experimente können mit dem Isokäfigsystem parallel durchgeführt werden, und der Platzbedarf und die Kosten sind erheblich geringer als bei der Durchführung mehrerer Experimente über Mini-Isolatoren.

Der Zweck der Zucht keimfreier Mäuse in flexiblen Folienzüchtungsisolatoren besteht darin, den axenischen Status sorgfältig zu erhalten11. Zu den Techniken zur Überwachung des keimfreien Status gehören routinemäßige Abstriche von Körperoberflächen und Mundhöhlen von Mäusen sowie die aseptische Entnahme von Stuhlproben, die sowohl kultiviert als auch mit PCR-basierten kommerziellen Assays getestet werden. Bakterien-, Serologie- und Pilztests dieser Proben sind erforderlich, um den keimfreien Statuszu bestimmen 11. Wenn keimfreie Mäuse für den experimentellen Einsatz von Zuchtisolatoren in Isokäfige überführt werden, werden die Mäuse abgestrichen und getestet, um ihren keimfreien Status nach dem Transfer zu validieren. Isocage-Sterilitätskontrollen werden durch aseptische Entnahme von Kotproben durchgeführt, die dann zum Nachweis von bakteriellen, viralen und pilzlichen Verunreinigungen kultiviert werden. Das sorgfältige Sammeln und Aufzeichnen der Ergebnisse dieser Sterilitätskontrollen von der Geburt bis zum Ende eines Versuchsprotokolls ist notwendig, um den keimfreien Status dieser Mäuse zu validieren.

Das Isokäfigsystem besteht aus einzelnen Käfigen (Abbildung 1), Transferscheiben für den Transport aus den Zuchtisolatoren (Abbildung 1) und dem Isokäfiggestell, in dem die Käfige untergebracht sind (Abbildung 2). Jeder Isokäfig enthält einen HEPA-Filter (High Efficiency Particulate Air) auf Käfigebene, der am Zulufteinlass installiert ist, und eine Silikondichtung, die im geschlossenen Zustand luftdicht abschließt und sicherstellt, dass keine Verunreinigungen durch die Luft in den Käfig gelangen können (Abbildung 1A). Dieser Käfigdeckel kann als sterile Arbeitsfläche verwendet werden, wenn er kopfüber in einer sterilisierten Biosicherheitswerkbank platziert wird (Abbildung 1A). Ein Drahtgitter im Käfig hält die Futter- und Wasserflasche (Abbildung 1B). Die im Käfig autoklavierte Pinzette wird für alle Manipulationen verwendet, die einen Kontakt mit den inneren Käfigoberflächen erfordern. Der Käfig selbst verfügt über Kerben für einen abnehmbaren Käfigkartenhalter zur Identifizierung von Tieren an der Außenseite sowie über Lufteinlass- und -auslassdüsen, die an das Isokäfiggestell andocken (Abbildung 1C-E). Sichere Verschlussklammern und eine Laschenverriegelung am Deckel dichten den Käfig ab, wenn er bereit ist, wieder auf das Rack-System angedockt zu werden (Abbildung 1F). Die empfohlene Einstreu ist Alpha-dri, und eine autoklavierbare Anreicherungshütte wird ebenfalls empfohlen (Abbildung 1F). Transferscheiben werden verwendet, um keimfreie Mäuse aus Zuchtisolatoren in die Isokäfige zu transportieren, und enthalten einen drehbaren Fachdeckel mit einer dreieckigen Öffnung, um die Manipulation der Tiere zu ermöglichen (Abbildung 1G-H). Die Scheiben sind in den Größen klein (21,6 cm Durchmesser) und groß (28 cm Durchmesser) erhältlich, die beide eine Kapazität von acht Mäusen haben. Autoklaviertes Klebeband wird verwendet, um luftdichte Dichtungen am Umfang und an den Luftlöchern der Scheibe zu erzeugen, was vor dem Einweichen mit Sterilisationsmittel und dem Transport in einem mit Sterilisationsmittel getränkten Beutel durchgeführt wird (Abbildung 1I). Das Rack-System selbst verfügt über einen Bildschirm zur Überwachung der Luftgebläse, des HEPA-Filterstatus auf Rack-Ebene und der Notstromversorgung des Racks, die alle zu den im System enthaltenen Funktionen gehören (Abbildung 2A). Ein beiliegendes Magnehelic-Messgerät zeigt den vom Käfigsystem aufrechterhaltenen Überdruck an, und eine automatische visuelle Andockanzeige zeigt den Andockstatus der Käfige an (gelbe Lasche bedeutet, dass kein Käfig angedockt ist oder das Andocken nicht erfolgreich war) (Abbildung 2B-D). Ebenfalls notwendig für die Manipulation von Isokäfigen ist eine normzertifizierte Biosicherheitswerkbank.

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die geeigneten Methoden für den erfolgreichen Transfer von keimfreien Mäusen aus Zuchtisolatoren unter aseptischen Bedingungen in die Isokäfige unter Beibehaltung des keimfreien Status, die Humanisierung von keimfreien Mäusen mit humaner Spenderkotgülle und das Sammeln von Kot von Mäusen, die in dem Isokäfig untergebracht sind, entweder zur Bestätigung des keimfreien Status oder zur Erhaltung der Lebensfähigkeit für weitere funktionelle Studien. In diesem Beispiel werden keimfreie Mäuse mit gepoolten Kotproben von menschlichen Probanden, die mit einer Immuntherapie gegen Lungenkrebs behandelt wurden, humanisiert und als Responder oder Non-Responder auf die Therapie dichotomisiert. In diesem Fall wurde der Phänotyp des Ansprechens auf die Immuntherapie durch die Humanisierung der Darmmikrobiota auf die Empfängermäuse übertragen, die dann weiter mit Tumorzellen geimpft und mit Immuntherapie behandelt werden konnten. Das Protokoll der menschlichen Stuhlaufschlämmung kann leicht an jeden menschlichen Spenderkot oder jedes präklinische Krankheitsmodell angepasst werden, das der Prüfarzt wünscht. Mit diesem Protokoll ist es möglich, jede Mikrobiota eines menschlichen Stuhlspenders in den keimfreien Wirt zu übertragen, was eine weitere Untersuchung der Rolle der Mikrobiota bei Gesundheit und Krankheit ermöglicht.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der Isokäfig- und Transferscheiben. (A) Draufsicht auf die Unterseite des Käfigdeckels, mit Beschriftungen, die die Position des internen HEPA-Filters auf Käfigebene und der Silikondichtung angeben. (B) Draufsicht auf das Innere des Käfigs mit Etiketten, die den Drahtstangendeckel, die interne Wasserflasche und den Auslauf sowie die Position im Drahtgestell zur Aufnahme des autoklavierbaren Käfigs anzeigen. (C) Vorderansicht des Käfigs mit Kerben für den Käfigkartenhalter. (D) Draufsicht auf einen vollen Käfig mit aufgesetztem Deckel, der zeigt, wie der HEPA-Filter an der Luftansaugdüse installiert ist. (E). Rückansicht des Käfigs mit Lufteinlass- und Auslassdüsen, die an das Isokäfig-Racksystem andocken. (F) Seitenansicht eines vollen Käfigs mit dem Deckel nach oben, mit Etiketten, die die sicheren Verschlussklemmen in geöffneter Position anzeigen, mit weißen Laschen an jeder Klemme, die sie verriegeln. Das Innere des Käfigs zeigt Alpha-dri-Einstreu, die am Boden geschichtet ist, und eine vorgeschlagene Anreicherungshütte, die in Einstreu platziert ist. (G) Draufsicht auf Transferdisketten mit Deckel nach oben. (H) Draufsicht auf das Innere der Transferscheibe, die den drehbaren Fachdeckel mit einer dreieckigen Öffnung zeigt, um die Manipulation von Tieren zu ermöglichen. (I) Seitenansicht der vollständig montierten Transferscheibe, die die Platzierung des autoklavierten Bandes zeigt, das während des Transfers vom Zuchtisolator in den Isokäfig einen luftdichten Verschluss erzeugt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Schematische Darstellung des Isokäfig-Rack-Systems. (A) Komplettes Isocage-Rack mit angedockten Käfigen und einem Etikett, das den Überwachungsbildschirm für den Status des Luftgebläses, des HEPA-Filters und der Notstrombatterie anzeigt. Auf der unteren linken Seite des Racks befindet sich der Schlitz für den HEPA-Filter auf Rack-Ebene. (B) Geschlossenes Magnehelic-Manometer, das den vom Gestell aufrechterhaltenen Überdruck anzeigt. (C) Ein angedockter Isokäfig ohne sichtbare gelbe Andockanzeige, der eine erfolgreiche Verbindung zwischen dem Gestell und den Luftdüsen zeigt. (D) Ein leerer Schlitz im Rack mit einer sichtbaren automatischen visuellen Andockanzeige, die anzeigt, dass kein Rack vorhanden ist und die Luftdüsen nicht mit einem Isokäfig verbunden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protokoll

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Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Florida (UF) genehmigt und in UF Animal Care Facilities (IACUC Protocol #IACUC202300000005) durchgeführt. Kolonien des keimfreien Wildtyps (GF WT; C57BL/6) Mäuse wurden von der UF Animal Care Services Germ-free Division gezüchtet und in Isolatoren gehalten. Gemischtgeschlechtliche GF WT-Mäuse wurden aus Zuchtisolatoren übertragen und in das ISOcage P Bioexclusion-System gebracht, um eine mikrobielle Manipulation zu ermöglichen.

Humane Stuhlproben wurden aus einer prospektiven Beobachtungsstudie gewonnen, in der longitudinale Stuhlproben von Patienten entnommen wurden, die eine Behandlung mit Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICI) erhielten12. Die Einwilligungserklärung der Patienten wurde nach Studienzulassung durch Advarra IRB eingeholt (MCC#18611, Pro00017235). Die Probanden erhielten und füllten ein LDTM-Stuhlentnahmekit (Liquid Dental Transport Medium) aus, das die Lebensfähigkeit der Bakterien für funktionelle Studien erhalten sollte. Die Bewertung des Ansprechens charakterisierte n=4 Stichproben als Responder (R) und n=6 als Non-Responder (NR). Die homogenisierten LDTM-konservierten Patientenproben wurden einzeln aufgetaut, jeweils für nicht mehr als 90 s in eine anaerobe Kammer gelegt und nach Ansprechphänotyp gepoolt (R: n = 4, NR: n = 6). Die gepoolten Proben wurden dann aliquotiert und bei -80 °C eingefroren, um sie in diesem Protokoll zu verwenden. Um die Anzahl der anaeroben koloniebildenden Einheiten (KBE) des Spenderkots zu bestimmen, wurde der Kot jedes Probanden seriell auf 1 × 10-5 verdünnt, und 10 μl jeder Verdünnung wurden in doppelter Ausführung auf anaeroben Agarplatten für Hirn-Herz-Infusionen (BHI) und Luria Bertani (LB) plattiert und die KBE pro Gramm Stuhl geschätzt. Von jedem Probanden wurde die gleiche KBE in fäkale Inokulumproben für die Sonde in Mäuse gepoolt.

1. Vorbereitung der Käfige und Autoklavieren

  1. Vorbereitung der Isokäfige
    1. Füllen Sie die Käfige mit ~500 ml 2018SX-Futter oder einer beliebigen angereicherten autoklavierbaren Diät vor und beschichten Sie den Boden mit ALPHA-dri-Einstreu. Platzieren Sie eine autoklavierbare Anreicherungshütte in das Käfigbett. Lege eine leere, unverschlossene Wasserflasche und eine Düse sowie eine lange Pinzette mit breiter Spitze auf das Gitter.
    2. Geben Sie einen biologischen Indikator mit zwei Spezies innerhalb eines Käfigs pro Autoklavenzyklus in das Futter. Platzieren Sie einen Chemikalienintegrator-Streifen an der Außenseite jedes Käfigs.
    3. Autoklavieren Sie die Käfige in einem Vakuumzyklus für 45 Minuten bei 121 °C und mindestens 15 PSI, gefolgt von 30 Minuten Trocknungszeit. Sterilisieren Sie die Käfige mit einem Dekontaminationsgestell der internationalen Organisation für Normung (ISO), das es ermöglicht, dass die Käfige versiegelt bleiben und Dampf durch den internen HEPA-Filter strömt, der die sterile Umgebung aufrechterhält, bis der Käfig geöffnet wird.
    4. Füllen Sie 1-Liter-Flaschen mit Trinkwasser, verschließen Sie sie mit Gummikappen und legen Sie einen Chemikalien-Integrator-Streifen auf die Oberfläche der Flasche. Autoklav bei 121 °C und mindestens 15 PSI für 45 Minuten mit dem langsamen Absaugprogramm für Flüssigkeiten.
    5. Überprüfen Sie die an jedem Käfig angebrachten chemischen Integratoren visuell, um die entsprechenden Autoklavenparameter sofort zu überprüfen.
      HINWEIS: Der biologische Indikator muss beim ersten Öffnen des Isokäfigs unter sterilen Bedingungen entfernt werden. Inkubieren Sie den biologischen Indikator 24 Stunden lang bei 37 °C und beobachten Sie eventuelle Farbveränderungen. Ein lebhafter Farbwechsel von der ursprünglichen blau/violetten klaren Lösung zu einer gelben oder trüben Flüssigkeit deutet auf mikrobielles Wachstum hin. Wenn der Indikator klar und blau/violett bleibt, ist dies eine Bestätigung für die vollständige Sterilität des Innenraums der Käfige in diesem Autoklavenzyklus.

2. Chlordioxid-Sterilisationsmittel

ACHTUNG: Das Chlordioxid-Sterilisationsmittel ist nach Aktivierung extrem korrosiv. Aktiviertes Chlordioxid-Sterilisationsmittel läuft 24 h nach dem Mischen des Aktivators mit der Basis ab. Chlordioxid-Sterilisationsmittel erzeugt Dämpfe, die die Schleimhautoberflächen reizen und bei Kontakt mit der Haut Reizungen verursachen können. Stellen Sie sicher, dass der Raum für die Sterilisationsmittelvorbereitung Zugang zu einem Waschbecken und einer ordnungsgemäßen Belüftung hat. Tragen Sie eine Schutzbrille, eine Atemschutzmaske und chemikalienbeständige Handschuhe, wenn Sie mit Chlordioxid-Sterilisationsmittel arbeiten, zusätzlich zu der für die Tierhaltung erforderlichen persönlichen Schutzausrüstung (PSA).

  1. Mischbasis und Aktivator
    1. Um ein Standardvolumen von 6 l Chlordioxid-Sterilisationsmittel herzustellen, messen Sie zuerst 1 l Chlordioxid-Sterilisationsmittelbasis in einem 1-Liter-Messzylinder und gießen Sie es in einen Tauchtank mit einem Volumen von 20 l.
    2. Messen Sie mit demselben Messzylinder 4 l Leitungswasser ab und gießen Sie es in den Tauchbehälter.
    3. Legen Sie den Messzylinder, der für den Boden verwendet wurde, und das Wasser beiseite. Messen Sie mit einem neuen Messzylinder 1 l Chlordioxid-Sterilisationsaktivator ab und gießen Sie ihn in den Tauchbehälter.
    4. Nachdem der Aktivator in den Tank gegeben wurde, verwenden Sie den Messzylinder, um den Inhalt des Tanks zu mischen.
  2. Aktivierung
    1. Setzen Sie den Deckel auf den Tauchbehälter und beschriften Sie ihn als Chlordioxid-Sterilisationsmittel mit dem Datum und der Uhrzeit der Zugabe des Aktivators sowie dem Namen des Personals, das den Aktivator zubereitet hat. Falls gewünscht, kann der Messzylinder, der zum Mischen des Sterilisationsmittels verwendet wird, zum Umfüllen von 1 l in eine Sprühflasche verwendet werden.
    2. Bringen Sie den Tauchtank und die Sprühflaschen in den Stallraum, wo sich das Isocage-Gestell und die Käfige befinden. Das aktivierte Chlordioxid-Sterilisationsmittel muss vor der Verwendung mindestens 20 Minuten einwirken, um eine vollständige Aktivierung zu gewährleisten.
      HINWEIS: Für die Handhabung großer Mengen von Käfigen (>9) können bis zu 12 l gleichzeitig im Tauchbecken vorbereitet werden. Zur Manipulation von 1 Käfig oder für den Notfall können 1,2 l Chlordioxid-Sterilisationsmittel in einem kleineren Behälter aufbereitet und dann in 2 1 l Sprühflaschen umgefüllt werden. Es wird empfohlen, das Sterilisationsmittel mindestens 1 h vor dem erwarteten Transfer von keimfreien Mäusen herzustellen.

3. Sterilisation

  1. PSA anziehen
    1. Als primärer Käfigmanipulator sollten Sie eine Schutzbrille, eine Atemschutzmaske, chemikalienbeständige Handschuhe, einen sterilen OP-Kittel, einen Bouffant, Ärmelüberzieher und Schuhüberzieher tragen. Tragen Sie Peelings unter der PSA, da jeder Kontakt des Gewebes mit dem Chlordioxid-Sterilisationsmittel zu starken Flecken führt.
    2. Ein Assistent des primären Käfigmanipulators wird empfohlen. Lassen Sie den Assistenten die gleiche PSA wie der primäre Käfigmanipulator anziehen, obwohl er möglicherweise einen unsterilen OP-Kittel trägt.
  2. Vorbereitung der Biosicherheitswerkbank
    1. Legen Sie 10 Tücher in den Chlordioxid-Sterilisationstank und stellen Sie sicher, dass sie vollständig durchnässt sind.
    2. Schieben Sie die eingeweichten Tücher in die Biosicherheitswerkbank und tränken Sie alle Oberflächen des Schranks in der folgenden Reihenfolge von hinten nach vorne: flache Arbeitsfläche, linke Seite, Rückseite der Haube, rechte Seite und vordere Innenscheibe. Führen Sie ein berührungsloses Einweichen der nicht geschützten Oberflächen der Biosicherheitswerkbank durch, indem Sie die Tücher über diese Oberflächen drücken, ohne sie zu berühren.
    3. Legen Sie die Tücher nach einer Reinigungsrunde zurück in den Chlordioxid-Sterilisationsbehälter, um sie einzuweichen.
  3. Vorbereitung der Isokäfige
    1. Bereiten Sie eine große Plastiktüte vor, indem Sie sie mit mindestens 100 ml Chlordioxid-Sterilisationsmittel mit einem Messzylinder füllen und den Beutel schütteln, um sicherzustellen, dass alle Innenflächen durchnässt sind. Stellen Sie den Beutel auf eine ebene Fläche.
    2. Nehmen Sie einen einzelnen Isokäfig aus dem Gestell und stellen Sie ihn in den Chlordioxid-Sterilisationsbehälter, so dass jede Oberfläche des Käfigs mit der Flüssigkeit in Kontakt kommt. Verwenden Sie die eingeweichten Tücher im Tank, um die Käfigoberflächen weiter zu schrubben, um einen vollständigen Flüssigkeitskontakt zu gewährleisten.
    3. Lassen Sie den Assistenten, nachdem Sie den Käfig eingeweicht haben, die eingeweichte Plastiktüte öffnen. Setzen Sie den Käfig in den Beutel ein und lassen Sie den Assistenten die Öffnung sofort schließen. Sprühen Sie die Beutelöffnung mit der Sprühflasche mit Chlordioxid-Sterilisationsmittel ein. Befolgen Sie dieses Verfahren für jeden Käfig, der verwendet werden soll. Bis zu vier Käfige passen in eine einzige 36" 32" 48" Tasche.
    4. Tauchen Sie so viele sterilisierte 1-Liter-Wasserflaschen wie nötig (1 l Wasser für 2 Käfige) in den Chlordioxid-Sterilisationsbehälter und legen Sie sie dann in eine andere getränkte Plastiktüte. Wenn alle Vorräte in den Beutel gelegt wurden, schließen Sie den Beutel und besprühen Sie die Beutelöffnung mit dem Chlordioxid-Sterilisationsmittel mit der Sprühflasche.
    5. Sobald alle Käfige und Vorräte eingetütet sind, tauchen Sie die chemikalienbeständigen Handschuhe in Chlordioxid-Sterilisationsmittel (so weit wie möglich an den Handschuhen, ohne die Öffnung zu erreichen).
  4. 20 min Sterilisationszeit
    1. Für die vollständige Sterilisation sind mindestens 20 Minuten Kontaktzeit mit der Flüssigkeit erforderlich. Sobald der letzte Gegenstand sterilisiert und der Plastikeinweichbeutel verschlossen ist, lassen Sie den Assistenten einen 20-Minuten-Timer einstellen. Stellen Sie sicher, dass die chemikalienbeständigen Handschuhe nach dem Starten des Timers keine Oberflächen berühren, die nicht mit Chlordioxid-Sterilisationsmittel getränkt sind.
    2. Führen Sie die Sterilisation der Biosicherheitswerkbank (Schritt 3.2) so lange durch, bis der Timer anzeigt, dass 20 Minuten vergangen sind.
    3. Lassen Sie den Assistenten die Außenflächen der durchnässten Plastiktüte häufig schütteln, um einen gleichmäßigen Flüssigkeitskontakt mit den Käfig- und Flaschenoberflächen im Inneren zu gewährleisten.
    4. Lassen Sie den Assistenten nach Ablauf der 20 Minuten die eingeweichte Plastiktüte öffnen, um die sterilisierten Käfige und Wasserflaschen freizulegen, und achten Sie darauf, nur die Außenflächen der Tüte zu berühren.
    5. Bewegen Sie mit den sterilisierten, chemikalienbeständigen Handschuhen jeden Käfig und jede Flasche in die sterilisierte Biosicherheitswerkbank. Wenn zu viele Käfige vorhanden sind, um in die Biosicherheitswerkbank zu passen, lassen Sie die restlichen Käfige in den Plastiktüten, da sie steril bleiben, solange die Öffnung der Plastiktüte geschlossen und zwischen den Öffnungen mit Chlordioxid-Sterilisationsmittel getränkt ist.

4. Keimfreie Mausübertragung

  1. Vorbereitung der Isokäfige
    1. Um den hermetisch verschlossenen Isokäfig zu öffnen, heben Sie die weißen Laschen an den beiden Klemmen an den Seiten des Deckels an und ziehen Sie dann jede Klemme seitlich heraus. Der Deckel muss vom unteren Teil des Käfigs frei sein, um den Deckel vom Käfig abzuheben. Platzieren Sie den Deckel auf dem Kopf nach unten links vom Käfig und nutzen Sie diesen als sterilen Arbeitsplatz.
      HINWEIS: Eine Alternative zur Verwendung von Käfigdeckeln oder dem Inneren von autoklavierten Instrumentenbeuteln als sterile Arbeitsfläche ist die Verwendung von autoklavierten Abdeckungen, die eine größere Oberfläche bieten und eine unbeabsichtigte Kontamination des Käfigdeckels verhindern, wenn ein Fehler gemacht wird.
    2. Entfernen Sie mit der sterilen Pinzette, die sich im Käfig oben auf dem Gitterrost befindet, die leere Wasserflasche und setzen Sie sie auf die Innenseite des Deckels. Öffnen Sie die 1-Liter-Wasserflasche, indem Sie die Gummidichtung entfernen, und gießen Sie das Wasser in die Wasserflasche, um sie zu füllen. Setzen Sie die Düse mit der Pinzette auf die Wasserflasche und drücken Sie sie fest nach unten, um sie zu verschließen.
    3. Hebe das Gittergestell mit einer sterilen Pinzette an und setze es einige Zentimeter zurück, um eine Öffnung zum Käfigboden zu ermöglichen. Legen Sie die sterile Pinzette auf das Gitter und stellen Sie sicher, dass die Griffe nicht mit den Käfigoberflächen in Berührung kommen.
  2. Verwendung der Übertragungsdiskette
    HINWEIS: Für die Pflege und Wartung der Zuchtisolatoren ist geschultes keimfreies Personal zuständig. Angesichts der Risiken, die mit dem Öffnen von Zuchtisolatoren verbunden sind, führen diese Mitarbeiter die Sterilisation der Transferscheibe, die Vorbereitung und den Transfer von keimfreien Mäusen von Isolatoren in Isokäfige durch. Um den Prozess kurz zu beschreiben, werden die Transferscheiben in einem autoklavierbaren Zylinder vorbereitet, um die Sterilisation zu ermöglichen. Biologische Indikatoren werden verwendet, um ihre Sterilität zu überprüfen. Das Klebeband zum Abdichten der Übertragungsscheiben ist ebenfalls im Zylinder autoklaviert. Der sterilisierte Zylinder, der diese Materialien umschließt, wird über eine Transferhülse mit dem Isolator verbunden, und die Mäuse werden aus den Käfigen auf die Scheibe gebracht. Der Deckel wird dann auf die Scheibe gelegt, und mit autoklaviertem Klebeband wird der Umfang der Scheibe und die Luftlöcher luftdicht verschlossen. Die abgedichtete Scheibe wird sofort in die Ausgangsöffnung des Isolators eingesetzt. Die Anschlusskappe des Heimisolators wird dann geschlossen, und die Außenseite der Platte wird gründlich mit Sterilisationsmittel abgetupft und in einen mit Sterilisationsmittel getränkten Beutel gelegt, der 20 Minuten lang überwacht wird, um eine vollständige Dekontamination zu gewährleisten. Keimfreies Zuchtpersonal liefert diese Scheiben dann an das Studienpersonal ab. Mäuse dürfen nicht länger als 30 Minuten ab dem Zeitpunkt der Versiegelung der Übertragungsdiskette in der versiegelten Disk aufbewahrt werden, daher ist es wichtig, dass alle vorherigen Schritte in diesem Protokoll rechtzeitig vor dem Eintreffen der Transferdiskette abgeschlossen wurden.
    1. Lassen Sie den Assistenten nach Erhalt der Übertragungsdiskette die Kunststoffabdeckung festhalten und teilweise auswickeln, so dass die durchnässte Oberfläche der Übertragungsdiskette freigelegt, aber nicht vom Assistenten berührt wird.
    2. Lassen Sie den Assistenten nach Erhalt der Übertragungsdiskette die Kunststoffabdeckung festhalten und teilweise auswickeln, so dass die durchnässte Oberfläche der Übertragungsdiskette freigelegt, aber nicht vom Assistenten berührt wird.
    3. Nehmen Sie die mit Chlordioxid getränkten chemikalienbeständigen Handschuhe aus der Plastikverpackung und achten Sie darauf, keine nicht mit Sterilisationsmittel getränkte Oberfläche zu berühren. Legen Sie dann die Transferscheibe auf die ebene Oberfläche der sterilisierten Biosicherheitswerkbank.
    4. Um die Übertragungsscheibe zu öffnen, ziehen Sie das Klebeband ab, versiegeln Sie den Umfang der Festplatte und entsorgen Sie sie außerhalb der Biosicherheitswerkbank. Entfernen Sie den Deckel der Transferscheibe und entsorgen Sie sie außerhalb der Biosicherheitswerkbank.
    5. Im Inneren der Transferscheibe befindet sich ein drehbarer Fachdeckel mit einer einzigen Öffnung. Verwenden Sie die sterile Pinzette, die zuvor auf dem Drahtgestell des Käfigs ruhte, um diesen Fachdeckel zu manipulieren und die Öffnung zur Maus zu bewegen, die für den Transfer benötigt wird.
  3. Transfer von Mäusen von der Scheibe in den Isokäfig
    1. Fassen Sie mit der Pinzette die Basis des Schwanzes der Maus durch die Öffnung in der Kunststoffscheibenabdeckung und heben Sie die Maus an und befördern Sie sie durch den zuvor geöffneten Raum zwischen dem Drahtgestell und dem Käfig in den Isokäfig. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Mäuse, die für diesen Käfig bestimmt sind.
    2. Sobald alle Mäuse in diesen Isokäfig umgesiedelt wurden, setzen Sie das Drahtgestell mit der Pinzette wieder auf. Hebe dann den Käfigdeckel an und setze ihn mit der Pinzette wieder auf den Käfig.
    3. Heben Sie jede Klemme des Käfigdeckels an und senken Sie sie vorsichtig über die Seiten des Käfigs, dann drücken Sie die weißen Laschen nach unten, um den Käfigdeckel abzudichten.
    4. Sobald der Käfig versiegelt ist, lassen Sie den Assistenten jede Düse der Andockstelle auf dem Käfiggestell mit Chlordioxid-Sterilisationsmittel besprühen. Entfernen Sie dann den Käfig von der Haube und übergeben Sie ihn an den Assistenten, der den Käfig dann an das Gestell andocken kann.
    5. Wiederholen Sie diese Schritte für jede Maus auf der Übertragungsdiskette.
  4. Aufräumarbeiten in der Biosicherheitswerkbank
    1. Wenn alle Mäuse in den Isokäfig übertragen wurden, entleeren Sie die Haube von Schmutz und wischen Sie sie vollständig mit Chlordioxid-Sterilisationstüchern ab.
    2. Wischen Sie die Dunstabzugshaube mit Isopropylalkohol ab, um Reste des Chlordioxid-Sterilisationsmittels zu entfernen. Der Raum unter der Arbeitsfläche der Haube sammelt eine große Menge an Sterilisationsmittel aus dem Sterilisationsprozess. Entfernen Sie dies durch Absorption mit trockenen Tüchern und wischen Sie es mit Isopropylalkohol ab.
    3. Entsorgen Sie das flüssige Chlordioxid-Sterilisationsmittel 24 h nach der Aktivierung über den Spülbeckenablauf. Mit Sterilisationsmittel verunreinigte feste Materialien als Normalabfall entsorgen.
      HINWEIS: Keimfreie Mäuse, die in Isokäfigbedingungen überführt werden, werden 1 Woche lang belassen, um sich an ihre neue Umgebung zu gewöhnen, bevor sie eingegriffen werden. Dadurch wird der Stress der Tiere reduziert, der die Studienergebnisse beeinträchtigen könnte. Am Ende dieser 1-wöchigen Eingewöhnungsphase sammeln Sie Kot, wie in Schritt 6 beschrieben, um den keimfreien Status vor jedem Eingriff zu bestätigen.

5. Orale Sonde von menschlicher Fäkaliengülle in keimfreie Mäuse

  1. Vorbereitung von autoklavierten Sondenzubehör
    1. Legen Sie die Nadeln der oralen Sonde in selbstverschließende Sterilisationsbeutel (1 pro Maus) und sterile 1-ml-Spritzen in selbstverschließende Sterilisationsbeutel (1 pro Maus) 1 Tag vor dem oralen Sondeneingriff. Legen Sie diese und 600 mL Polypropylen-Becher (1 pro Maus) und eine lange Pinzette in einen autoklavensicheren Beutel und sterilisieren Sie sie im Autoklaven.
    2. Verschließen Sie den Beutel sofort nach der Entnahme aus dem Autoklaven mit Klebeband und lagern Sie ihn bis zum nächsten Tag.
  2. Aufbereitung von menschlicher Fäkaliengülle
    1. Am Tag der Sonde wird der humane Kot homogenisiert und in anaeroben Konservierungsmedien (in diesem Fall Liquid Dental Transport Media) aus dem -80 °C warmen Gefrierschrank in die anaerobe Kammer übertragen. Verdünnen Sie homogenisiertes Fäkalien ca. 1:10 in steriler, anaerober Kochsalzlösung in einem konischen 10-ml-Röhrchen.
    2. Das Röhrchen mit dem menschlichen Stuhl mit Parafilm verschließen, durch Vortex homogenisieren und dann 5 Minuten lang bei 200 g zentrifugieren, um Partikel abzusetzen.
    3. Setzen Sie das Röhrchen wieder in die anaerobe Kammer ein und übertragen Sie den Überstand in ein weiteres konisches 10-ml-Röhrchen. Verschließen Sie das Röhrchen mit dem menschlichen Fäkalienüberstand mit Parafilm, nehmen Sie es aus der anaeroben Kammer und legen Sie es in einen zweiten auslaufsicheren Behälter. Transportieren Sie den Behälter zusammen mit dem autoklavierten Beutel mit den Sondenzubehör zum Standort der Tierhaltung.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Gesamt-KBE/ml des menschlichen Kots, der für die Sonde bestimmt ist, für Berichtszwecke zu schätzen. Es ist unklar, wie hoch die minimale KBE-Belastung ist, um eine adäquate Besiedlung zu gewährleisten, aber höhere KBEs führen zu einer besseren Transplantation des Spenderstuhls13. Wenn die KBE-Belastung von menschlichem Stuhlmaterial zu niedrigen Transplantationsraten führt, sammeln Sie menschliche Stuhlproben zurück. Die Verwendung eines Viabilitätskonservierungsmediums wird die KBE-Rückgewinnung aus gesammelten Stuhlproben verbessern. Um die anaerobe/aerobe KBE-Zahl des Spenderkots zu bestimmen, verdünnen Sie die Probe seriell auf 1 x 10-5 und platten Sie 10 μl jeder Verdünnung in doppelter Ausführung auf aerobe und anaerobe BHI- und LB-Agarplatten. Nach 24 h (aerob) und 48 h (anaerob) zählen Sie die KBE pro Gramm Stuhl.
  3. Vorbereitung der Isokäfige
    1. Wiederholen Sie die Schritte 2 und 3, mit dem einzigen Unterschied, dass in diesen Käfigen Mäuse untergebracht sind, und es sollte darauf geachtet werden, dass innerhalb von 30 Minuten nach dem Entfernen des Racks jeder Isokäfig in die sterilisierte Haube gelegt und der Deckel entlüftet wird, um einen Luftstrom zu den Mäusen zu ermöglichen.
    2. Sterilisieren Sie den autoklavierten Sondenmaterialbeutel und das menschliche Fäkalienröhrchen aus den Schritten 5.1 und 5.2 über die Chlordioxid-Sterilisationsmittelsättigung auf ähnliche Weise wie die Wasserflaschen (d. h. tauchen Sie sie in Sterilisationsmittel und legen Sie sie dann in einen mit Sterilisationsmittel getränkten Beutel).
    3. Übertragen Sie die Isokäfige und die Vorräte an die Mundsonde nach Abschluss der 20-minütigen Sterilisationszeit in die Biosicherheitswerkbank. Durchstechen Sie den autoklavierten Versorgungsbeutel, indem Sie den Beutel gegen die darin enthaltene lange Pinzette drücken, entfernen Sie dann die Vorräte und entsorgen Sie den Beutel außerhalb der Haube.
  4. Zwangsernährung
    1. Ziehen Sie anstelle der chemikalienbeständigen Handschuhe einen neuen sterilen OP-Kittel und sterile OP-Handschuhe an, um zu verhindern, dass restliches Chlordioxid-Sterilisationsmittel mit Mäusen in Kontakt kommt. Lassen Sie sich bei Bedarf vom Assistenten bei diesem Vorgang helfen.
    2. Bereiten Sie die Sondennadeln vor, indem Sie jeden Sterilisationsbeutel auspacken und das Innere des Beutels als trockene, sterile Ruhefläche verwenden. Verbinden Sie die Sondennadel mit jeder Spritze, öffnen Sie das Stuhlaufschlagröhrchen und ziehen Sie 200 μl Stuhlaufschlämmung in jede Spritze auf.
    3. Fassen Sie mit einer Pinzette die Basis des Schwanzes einer einzelnen Maus im Käfig und legen Sie sie auf das Drahtgestell. Halten Sie die Maus vorsichtig durch Abreiben fest, und halten Sie die Maus in einer aufrechten vertikalen Position, führen Sie die Nadel ein und injizieren Sie vorsichtig den Stuhlschlamm, gefolgt von sofortigem Entfernen der Nadel.
    4. Legen Sie die Maus zur Beobachtung direkt in einen der sterilisierten Becher. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Maus im Käfig. Nachdem alle Mäuse die Sonde erhalten haben, bewegen Sie jede Maus mit der Pinzette zurück in das Käfigbett und verschließen Sie den Käfig, wie in den Schritten 4.3.2-4.3.4 beschrieben.
      HINWEIS: In Fällen, in denen zwei oder mehr separate Fäkalienschlämme verwendet werden, ist eine vollständige erneute Sterilisation der Biosicherheitswerkbank und der erforderlichen Käfige und Materialien erforderlich. In Fällen, in denen eine Gruppe von Mäusen keimfrei bleibt, wird empfohlen, dass diese Mäuse ihre Kontrollsonden erhalten, bevor eine andere Gruppe behandelt wird.
    5. Befolgen Sie das Verfahren in Schritt 4.4, um Chlordioxid-Sterilisationsmittel und sterilmittelgetränkte Materialien zu entsorgen. Behandeln Sie alle Materialien, die mit menschlicher Fäkalien kontaminiert sind, als biomedizinische Abfälle und entsorgen Sie sie gemäß den Umwelt-, Gesundheits- und Sicherheitsverfahren.

6. Stuhlsammlung von humanisierten Mäusen zur Erhaltung der Lebensfähigkeit

  1. Vorbereiten von autoklavierten Verbrauchsmaterialien
    1. Legen Sie eine kurze Pinzette mit breiter Spitze in selbstverschließende Sterilisationsbeutel (1 pro Maus), 600-ml-Becher aus Polypropylen (1 pro Maus) und eine lange Pinzette in einen autoklavensicheren Beutel und sterilisieren Sie sie 1 Tag vor der Stuhlentnahme im Autoklaven.
    2. Verschließen Sie den Beutel sofort nach der Entnahme aus dem Autoklaven mit Klebeband und lagern Sie ihn bis zum nächsten Tag.
  2. Vorbereitung von Konservierungsmedien
    1. Wählen Sie ein Medium zur Erhaltung der anaeroben Lebensfähigkeit (hier wurde Cary Blair verwendet). Aliquotieren Sie 1 mL Konservierungsmedium in sterile 2 ml-Röhrchen mit Schraubverschluss in einer Biosicherheitswerkbank. Für eine optimale Konservierung wird ein Verhältnis von 1:10 Kot:Medien empfohlen.
    2. Beschriften Sie jedes Röhrchen mit einem Permanentmarker, aber beachten Sie, dass der Kontakt mit Chlordioxid-Sterilisationsmittel Permanentmarker-Etiketten von Kunststoffoberflächen entfernen kann. Eine andere Methode besteht darin, die Röhrchen unbeschriftet zu lassen und den Assistenten die Röhrchen unmittelbar nach der Entnahme beschriften zu lassen, bevor sie einfrieren.
    3. Legen Sie diese Röhrchen in ein Standard-Röhrchengestell aus Polypropylen, damit die Röhrchen aufrecht gelagert werden können und gleichzeitig eine Sterilisation durch Kontakt mit Chlordioxid-Sterilisationsmittel möglich ist.
  3. Sterilisationskäfige und Biosicherheitswerkbank
    1. Wiederholen Sie die Schritte 2 und 3, um die Isokäfige und die Biosicherheitswerkbank zu sterilisieren. Achten Sie auch hier darauf, dass innerhalb von 30 Minuten nach dem Entfernen des Racks jeder Isokäfig in die sterilisierte Haube eingesetzt und der Deckel belüftet wird, um einen Luftstrom zu den Mäusen zu ermöglichen.
    2. Sterilisieren Sie zusätzlich den autoklavierten Vorratsbeutel und das Gestell mit den vorbereiteten Röhrchen durch Chlordioxid-Sterilisationssättigung und legen Sie sie in den getränkten Plastikbeutel mit den Käfigen. Das Ziel ist ein vollständiger Flüssigkeitskontakt mit allen Oberflächen jedes Rohrs und dem Gestell selbst.
  4. Entnahme und Lagerung von Kotproben
    1. Übertragen Sie die Isokäfige, die autoklavierten Verbrauchsmaterialien und das Röhrchengestell nach Abschluss der 20-minütigen Sterilisationszeit in die Biosicherheitswerkbank. Durchstechen Sie den autoklavierten Versorgungsbeutel, indem Sie den Beutel gegen die darin enthaltene lange Pinzette drücken, entfernen Sie die Vorräte und entsorgen Sie den Beutel außerhalb der Haube.
    2. Ziehen Sie anstelle der chemikalienbeständigen Handschuhe einen neuen sterilen OP-Kittel und sterile OP-Handschuhe an, um zu verhindern, dass restliches Chlordioxid-Sterilisationsmittel mit Mäusen in Kontakt kommt. Lassen Sie den Assistenten bei diesem Vorgang behilflich sein, falls gewünscht.
    3. Bereiten Sie die Pinzette mit stumpfer Spitze vor, indem Sie die Beutel auswickeln und die innere Oberfläche des Beutels als sterilen Bereich verwenden. Stellen Sie das Röhrchengestell auf die Oberfläche der Biosicherheitshaube.
    4. Fassen Sie mit einer langen Pinzette die Basis des Schwanzes einer einzelnen Maus im Käfig und legen Sie sie zur Beobachtung direkt in einen der sterilisierten Becher. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Maus im Käfig.
    5. Beobachten Sie die Mäuse, bis mindestens zwei frisch ausgeschiedene Kotpellets produziert wurden.
      1. Nehmen Sie mit der Zange mit der stumpfen Spitze die Kotpellets auf und legen Sie sie direkt in das Röhrchen. Verschließen Sie sofort den Schraubdeckel und übergeben Sie ihn dem Assistenten.
      2. Lassen Sie den Assistenten die Tube beschriften und homogenisieren Sie den Stuhl sofort durch Vortexen. Sobald das Röhrchen homogen ist, frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie es langfristig bei -80 °C.
    6. Wiederholen Sie den Stuhlentnahmevorgang für jede Maus im Käfig. Setzen Sie jede Maus nach der Kotsammlung wieder in den Heimkäfig ein und docken Sie die Käfige wieder an ihr Gestell an. Wiederholen Sie Schritt 4.4, um die Dunstabzugshaube zu reinigen und den Abfall zu entsorgen.

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Ergebnisse

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Humane Stuhlproben, gepoolt nach ICI-Responder- und Non-Responder-Phänotyp (zuvor im Protokoll beschrieben), wurden in gemischtgeschlechtliche GF-WT-Mäuse gegeben, die in 3 Isokäfigen pro Gruppe untergebracht waren (n = 1-2 Mäuse/Käfig, n = 6 für Responder und n = 5 für Non-Responder). Die Mäuse durften sich 1 Woche nach dem Transfer akklimatisieren. Von diesen Mäusen wurden dann Kotproben entnommen (keimfreie Bedingungen). Die Mäuse wurden dann mit 1 × 107 KBE gepooltem menschlichem Kot versorgt. Der Stuhl wu...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das hier beschriebene Protokoll stellt eine reproduzierbare, hochdetaillierte Methode zur Humanisierung von keimfreien Mäusen dar, die in experimentellen Isokäfigen untergebracht sind. Die Möglichkeit, ausschließlich Stuhlgemeinschaften von menschlichen Probanden in murine Wirte zu transplantieren, ist für die Mikrobiomforschung von unschätzbarem Wert. Ohne Kontamination durch mausspezifische kommensale Mikrobiota kann man den Einfluss von beim Menschen ansässigen Bakterien auf eine Viel...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken der Germ-Free Services Division von UF Animal Care Services für die Unterstützung bei der gnotobiotischen Haltung, Dr. Brooke Bloomberg und Dr. Laura Eurell für die tierärztliche und IACUC-Unterstützung und Josee Gauthier für die Unterstützung bei der 16S rRNA-Gensequenzierung. Diese Forschung wurde teilweise von den UF Health Cancer Center Funds (C.J.) und dem UF Department of Medicine Gatorade Fund (C.J.) unterstützt. R.Z.G. wurde aus Mitteln des UF Health Cancer Center unterstützt. R.C.N. wurde unterstützt durch das National Institutes of Health TL1 Training Grant an der University of Florida (TL1TR001428, UL1TR001427), das National Cancer Institute des National Institutes of Health Team-Based Interdisciplinary Research Training Program Award T32CA257923 und das UF Health Cancer Center. Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom UF Health Cancer Center unterstützt, teilweise unterstützt durch staatliche Mittel, die in Fla. Stat. § 381.915 bereitgestellt werden, und dem National Cancer Institute der National Institutes of Health unter der Fördernummer P30CA247796. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health oder des Bundesstaates Florida wieder. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL BD Slip Tip Spritze steril, EinwegFisher Scientific309659
2,0 mL Schraubverschluss Röhrchen, ohne Rändel, mit Rand, Natur, E-Beam Steriles Röhrchen mit angebrachter KappeFisher Scientific14-755-228
36 x 32 x 48" 3 Mil Faltened Poly BagsUlineS-13455
5 Gallonen Tank mit Exspor Chlordioxid-Sterilisationsaktivator  Ecolab6301680
5-Gallonen-Tank mit Exspor Chlordioxid-Sterilisationsmittelbasis Ecolab6301194
600 mL Polypropylen-BecherFisher ScientificS01914
ALPHA-dri EinstreuShepherd Spezialpapiere
Anaerobe KammerCoy Lab ProductsTyp B
Biosicherheitswerkbank Klasse 2Nuaire
Certified IsoCage autoklavierbarer HEPA-Filter XT Extreme TemperatureTecniplast1245ISOFHXT
Klare Scheibe LPX IQuity Schutzbrille Befestigungsmaterial922205455
DuPont  Tyvek  Hülse - 18"UlineS-13893E
DWK Life Sciences DURAN 45 mm Aufsteckkappe aus NaturkautschukFisher Scientific01-258-107Gummikappe für 1 L autclave Flaschen
Dynalon Quick Mist HDPE SprühflaschenFisher Scientific03-438-12B
Fisherbran Polypropylen MesszylinderFisher Scientific03-007-44
Fisherbran  Präparierzange mit stumpfer SpitzeFisher Scientific08-887
Fisherbrand Sterilisationsbeutel mit sofortiger VersiegelungFisher Scientific01-812-51
Fisherbrand Gerade Breite Starke Spitze Zange für allgemeine AnwendungenFisher Scientific16-100-107
Fisherbrand  bleifreies AutoklavenbandFisher Scientific15-901-110
Sondennadel, wiederverwendbarer Edelstahl. Gerade. 22 Gauge Nadel, Spitzendurchmesser 1,25 mm, Länge 38 mm oder 1,5 Zoll(doz)Braintree ScientificN-PK 020
H-B Instrument Durac TimerFisher Scientific13-202-015
IsoPositive Cages und Rack (d.h. Isocages)Tecniplast   ISO30P30 Käfige (6 B x 5 H), einseitige
chemikalienbeständige Nitrilhandschuhe Größe S (7), M (8) oder L (9) 18" lang, 22 mil, AnsellGrainger4T426
Nitril-Untersuchungshandschuhe, mittelgroß, unsteril, puderfreiMedSupply PartnersKG-1101M
Olive / Magenta Bajonettgas & Dampfpatronen / Partikelfilter 2Ct   3M/Befestigungsmaterial50051138541878
Polycarbonat RadDisk Mini für Mäuse 8-75 x 4Braintree ScientificIRD-P M
Polypropylen Bouffant Caps - 24", BlueUlineS-10480BLU
Puritan Cary-Blair Medium, 5 mLFisher Scientific22-029-646
S, M und L Blau Silikon Dual-Mode Kopfgurt Halbmaske Atemschutzmaske   3M/Fastenal50051131370826
Sgpf Series Sterile Puderfreie Latexhandschuhe, CT International, Dicke = 6,5 mm, Länge = 30,5 cm (12), Handschuhgröße = 8,5, Handschuhfarbe = WeißFisher Scientific18-999-102F
Rutschfester ÜberschuhUline  S-25639
OP-Kittel, Handtuch, steril, groß, 32/csThomas ScientificKIM 95111
Teklad Global 18% Protein extrudiertes Nagetierfutter (sterilisierbar) Inotiv2018SX
Thermo Scientific Nalgene Rechteckiger Hochleistungs-LLDPE-Tank mit Abdeckung (20 L Volumen)Thermo Scientific14-831-330J
VERIFY Dual Spezies Eigenständige biologische IndikatorenSteris HealthcareS3061
WypAll L40 1⁄ 4-fach ScheibenwischerUlineS-8490

Referenzen

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