Bioreaktor-Assemblierung für die kontinuierliche Kultivierung komplexer Stuhlgemeinschaften

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den Zusammenbau von Mini-Bioreaktor-Arrays, die für die kontinuierliche Durchflusskultur komplexer Stuhlgemeinschaften unter anaeroben Bedingungen verwendet werden sollen. Wir besprechen auch die Methoden für den Zusammenbau, die Inokulation und die Probenahme der Reaktoren für die weitere Analyse.

Zusammenfassung

Die Mikrobiota, insbesondere Bakterien, reagieren auf verschiedene Umwelteinflüsse wie Mikro- und Makronährstoffe, pharmakologische Verbindungen und Entzündungsmediatoren, die die Zusammensetzung der Gemeinschaft und die mikrobielle Stoffwechselleistung dynamisch verändern. Das Verständnis, wie sich physiologische Kulturbedingungen auf mikrobielle Gemeinschaften und Diversität sowie ihre Stoffwechselkapazität auswirken, wird wichtige Erkenntnisse über ihre Auswirkungen auf Gesundheit und Krankheiten liefern. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das von der von Auchtung et al. veröffentlichten Vorlage adaptiert wurde, um Mini-Bioreaktor-Arrays zu erstellen, die komplexe Stuhlgemeinschaften kultivieren, Bakterienkonsortien oder einzelne Stämme unter präzisen Bedingungen definieren können, einschließlich Nährstoffverfügbarkeit, Temperatur, Durchflussrate, pH-Wert und Sauerstoffgehalt. Wir beschreiben den Prozess zum Aufbau des Mini-Bioreaktor-Systems, einschließlich Anpassungen zur Verbesserung der Einschränkungen im veröffentlichten Protokoll. Wir diskutieren auch den Aufbau des Mini-Bioreaktorsystems unter anaeroben Bedingungen unter Verwendung von MEGA-Medien (adaptiert von Han et al.), einem reichhaltigen Medium, das das Wachstum verschiedener Bakterien unterstützt. Wir beschreiben die Inokulation von darmhumanisierten Mauskotproben in das Mini-Bioreaktorsystem, gefolgt von der Etablierung komplexer Gemeinschaftskulturen innerhalb des Mini-Bioreaktorsystems, die unter kontinuierlichem Fluss mit aseptischen Probenahmen gezüchtet werden können, um die Zusammensetzung der Gemeinschaft zu überwachen. Dieses System ist anpassungsfähig an Ernährungsumstellungen und andere kulturelle Veränderungen. Die hier beschriebenen Techniken ermöglichen die Charakterisierung diverser, anspruchsvoller Stuhlgemeinschaften unter dynamischen Bedingungen oder als Reaktion auf Störungen isoliert von wirtsabgeleiteten Faktoren.

Einleitung

Die Darmmikrobiota ist ein riesiges Netzwerk von Mikroorganismen, darunter Bakterien, Pilze, Archaeen und Viren, die ein riesiges genetisches und metabolisches Repertoire enthalten, das das eines menschlichen Wirts bei weitem übertrifft¹. Die reichhaltige metabolische Kapazität des Mikrobioms umfasst Metaboliten, die aus der bakteriellen Verarbeitung von Nahrungsnährstoffen hergestellt werden, Wirtsmetaboliten, die von Bakterien chemisch modifiziert wurden, und Metaboliten, die einzigartig von der Mikrobiota synthetisiert werden². Die Mikrobiota ist an fast allen Bioprozessen des Wirts beteiligt, aber auch an Krankheitszuständen wie entzündlichen Darmerkrankungen, Krebs, Stoffwechselstörungen und sogar neurologischen Störungen ^2,3. Die Unterscheidung des Beitrags der Mikrobiota von dem des Wirts ist unerlässlich, um die Rolle bestimmter Mikroorganismen oder komplexer Gemeinschaften bei Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Ein Ansatz, der diese Dissektion ermöglicht, ist der Einsatz von mikrobiellen Bioreaktoren, die unter dynamischen Bedingungen verschiedene mikrobielle Gemeinschaften kultivieren. Es gibt viele kommerziell erhältliche Bioreaktoren, die das Wachstum von fäkalen Bakteriengemeinschaften für fast jeden Zweck ermöglichen, einschließlich des großflächigen Anbaus von Bioprodukten oder der präzisen Kontrolle spezifischer Nährstofffaktoren für die Untersuchung von Stoffwechselprozessen. Diese Systeme sind jedoch enorm kostspielig und erfordern eine aufwendige Vorbereitung und ermöglichen es nicht, verschiedene experimentelle Bedingungen parallel zu untersuchen. Für einen vereinfachten Ansatz, der kostengünstiger und anpassungsfähiger ist und viele parallele Bedingungen zulässt, stellen wir hier das Protokoll für den Aufbau und die Verwendung eines Mini-Bioreaktor-Arrays unter kontinuierlicher Strömung vor, das von Auchtung et ^al.4 adaptiert wurde.

Der vollständige Aufbau des Mini-Bioreaktorsystems ist in Abbildung 1A dargestellt. Dieses Mini-Bioreaktorsystem verwendet Arrays von 6 Reaktorvertiefungen, die völlig unabhängig voneinander sind und in einer anaeroben Kammer unter peristaltischer Strömung angeordnet sind, um eine kontinuierliche Medienzuführung und -entnahme zu ermöglichen (Abbildung 1A). Jedes Reaktorarray sitzt auf einer magnetischen Rührplatte mit 60 Positionen, mit zwei 48-Kassetten-Schlauchpumpen, die 2-Stopp-Schläuche für das Ausgangsmedium und den Abfallstrom halten (Abbildung 1A). Die anaerobe Kammer ist mit einem anaeroben Monitor CAM-12 für den Sauerstoffgehalt, einer Katalysatorbox zur Entfernung von Sauerstoff mit Heizkapazität und einer Schwefelwasserstoffentfernungssäule zur Aufnahme von überschüssigem Gas aus dem bakteriellen Stoffwechsel ausgestattet. Jede Reaktorvertiefung ist mit einem Einlass, einem Abfallauslass und einer Probenöffnung ausgestattet, die die Beimpfung oder Probenahme jeder einzelnen Reaktorvertiefung ermöglichen (Abbildung 1B).

Wie beschrieben, ermöglicht das Bioreaktorsystem eine dynamische Steuerung von Temperatur, Medienverbrauch und Nährstoffverfügbarkeit, um die Kultivierung und Erhaltung von Kotgemeinschaften zu unterstützen. Die Temperaturmodulation erfolgt über eine Katalysatorbox mit Heizleistung, so dass Temperaturänderungen in der gesamten anaeroben Kammer schnell umgesetzt werden können. Der Medienverbrauch wird durch die Durchflussmengen der Schlauchpumpen geregelt, die modifiziert werden können, um den Medienumsatz in den Reaktoren zu ändern. Der Medienumsatz kann an die in Reaktoren angebauten Gemeinschaftstypen angepasst werden, z. B. an langsam wachsende oder sehr schnell wachsende Zielstämme. Schließlich kann die Nährstoffverfügbarkeit dynamisch modifiziert werden, indem Komponenten über die einzelnen Probenöffnungen für jede Reaktorvertiefung hinzugefügt werden. Statische Bedingungen, die zu Beginn eines Experiments geändert werden können, aber keine dynamische Steuerung im System haben, sind der Medientyp, der Sauerstoffgehalt und die Anzahl der gleichzeitigen Reaktoren. Die Ermittler können wählen, ob sie jedes beliebige Ausgangsmedium implementieren möchten, und während ein Medium hier beschrieben wird, wurden unzählige andere Arten von Ausgangsmedien erfolgreich implementiert. Man kann die Reaktoren unter aeroben oder mikroaerophilen Bedingungen betreiben (abhängig von der Verfügbarkeit einer mikroaerophilen Kammer). Schließlich können so viele oder so wenige Reaktoren wie nötig aufgestellt werden, je nach den experimentellen Bedürfnissen des Forschers. Während Reaktoren in Sechsergruppen innerhalb eines Arrays angeordnet sind, arbeitet jeder Reaktor unabhängig von den anderen und kann auf Wunsch mit einer anderen Quelle verbunden werden.

Dieses modulare Bioreaktorsystem kann für rund 25.000 US-Dollar komplett eingerichtet werden (ohne die anaerobe Kammer oder kammerspezifische Komponenten), wobei das einzige nicht wiederverwendbare Teil die Schläuche sind, die für weniger als 100 US-Dollar pro Lauf des Systems ausgetauscht werden können. Das System ist größtenteils automatisiert, erfordert jedoch eine tägliche Überprüfung des Medienfüllstands, da die Flaschen der Medienquelle gewechselt werden müssen, wenn sie leer sind. Darüber hinaus muss jede Probenahme manuell abgeschlossen werden, und alle dynamischen bedingten Änderungen am System müssen manuell initiiert werden (z. B. Ändern der Temperatur). Gegenüber dem ursprünglichen Systemprotokoll, das von Auchtung et al. veröffentlicht wurde, wurden einige Änderungen vorgenommen, um die Gesamtleistung und den Nutzen zu verbessern⁴. Zunächst wird das Material für den 3D-Druck des Bioreaktorarrays so modifiziert, dass es ABS-ähnlicher durchscheinender Klarlack ist, um die strukturelle Integrität des Systems durch wiederholte Autoklavierrunden zu verbessern. Darüber hinaus wird anstelle des PTFE-Schlauchs mit einem Außendurchmesser von 1/8 Zoll (3,2 mm), E-LFL, 2,06 mm ID, stattdessen ein 100-Fuß-Schlauch verwendet, da das robustere Material widerstandsfähiger gegen Kollaps ist, was zu Verstopfungen des Durchflusses im System führen würde. Schließlich wird eine zusätzliche Armatur mit einem Gewinde von 1/4 -28 mm für männliche Adapter mit Widerhaken verwendet, um Änderungen des Röhrchenschlupfes von Medienquellenflaschen zu reduzieren. Die angepasste MEGA-Medienrezeptur von Han et al. liefert ein undefiniertes, komplexes, hochreichhaltiges Medium, das die Kultivierung anspruchsvoller anaerober Mikroorganismen ermöglicht⁵. Das Medium wird modifiziert, um eine alternative Präparation der Histidin-Hämatin-Komponente zu verwenden, da das Original nicht mehr im Handel erhältlich ist. Natriumhydroxid wird auch verwendet, um den pH-Wert des Mediums auf 7,0 oder einen beliebigen pH-Wert zu erhöhen. Insgesamt ist dieses System kostengünstig und benutzerfreundlich, optimiert und ein hervorragender Einstieg in kontinuierliche Durchflusskultursysteme.

In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert den Aufbau dieses Mini-Bioreaktor-Array-Systems, einschließlich der Materialien, der Sterilisation des Systems und der anschließenden Verwendung für die Kultivierung von darmhumanisierten Stuhlproben von Mäusen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein anpassungsfähiges und kostengünstiges Bioreaktorsystem zu bauen, das für die Kultivierung mikrobieller Gemeinschaften unter kontrollierten Bedingungen eingesetzt werden kann. Ein detailliertes Schema des Arbeitsablaufs für den Zusammenbau des Mini-Bioreaktorsystems ist in Abbildung 2 dargestellt und in den entsprechenden Schritten innerhalb des Protokolls referenziert. In unserem Beispiel inokulieren wir zwei Reaktoren mit der gleichen Stuhlprobe von humanisierten Darmmäusen und beschreiben die Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft unter einem kontinuierlichen Fluss von MEGA-Medien.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Aufbaus des Mini-Bioreaktor-Arrays in der anaeroben Kammer. (A) Vollständige Ansicht des fertiggestellten Aufbaus des Mini-Bioreaktor-Arrays in der anaeroben Kammer. Das 6-Well-Bioreaktor-Array befindet sich auf der magnetischen Rührplatte mit 60 Positionen. Das Quell-Luer-T-Stück wird auf der linken Seite durch den Zwei-Loch-Flaschenverschluss mit dem Quellmedium verbunden. Zwei Schlauchpumpen halten die 2-Stopp-Schläuche vom Quell- und Abfallnetz auf der linken bzw. rechten Seite. Das Abfall-Luer-T-Stück-Netz entleert sich in die Abfallflasche auf der rechten Seite. Die für den Betrieb der anaeroben Kammer erforderliche Ausrüstung, einschließlich des CAM-12-Monitors, der Katalysatorbox mit Heizleistung und der Schwefelwasserstoffentfernungssäule, sind in der Kammer um das Array-System angeordnet. (B) Draufsicht auf die Quellen-, Proben- und Abfallöffnungen, die an einer Reaktorvertiefung mit Medien in der entsprechenden Höhe im Reaktor angebracht sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs bei der Montage von Mini-Bioreaktorarrays. (A) Draufsicht auf das Mini-Bioreaktor-Array, die die Ausrichtung der Öffnungen für Quelle, Abfall und Probe zeigt. (B) Seitenansicht des Mini-Bioreaktor-Arrays mit einer Ansicht, die die Schritte 2.3-2.4 des Protokolls veranschaulicht. Der 1/8-Zoll-PTFE-Schlauch und die Armatur (1) werden angebracht und in die Abfall- und Probenanschlüsse eingeführt. Die Armatur (1) ohne PTFE wird in den Quellanschluss eingesetzt. (C) Seitenansicht des Mini-Bioreaktor-Arrays, das die Schritte 2.5-2.6 des Protokolls veranschaulicht. Die Armatur (2) wird an den Entnahme- und Ablassanschlüssen befestigt. Die Armatur (3) wird an der Probenöffnung befestigt, und an dieser wird die Armatur (4) oben eingesetzt. (D) Seitenansicht des Mini-Bioreaktor-Arrays, das die Schritte 2.9-2.11 veranschaulicht. Der E-LFL-Schlauch 2,06 mm wird mit den Quell- und Ablassanschlüssen verbunden, und das andere Ende wird mit den Anschlüssen (5) und dann (6) verbunden. Der 2-Stopp-Schlauch mit dem entsprechenden Durchmesser wird dann mit der Armatur (6) verbunden. Die umgekehrte Verbindung wird dann am Ende des 2-Stopp-Schlauchs wiederholt, wobei der Anschluss (6) mit dem 2-Stopp-Schlauch und der Anschluss (5) an diesen angeschlossen wird. Zuletzt wird der E-LFL 2,06 mm Schlauch an die Armatur (5) angeschlossen, um sie an das Luer-T-Stück anzuschließen. (E) Draufsicht auf das Mini-Bioreaktor-Array, das die in den Schritten 2.12-2.15 beschriebene Einrichtung des Quell- und Abfall-Luer-T-Netzes zeigt. Ein E-LFL 2,06 mm Schlauch, der auf eine Armatur (5) endet, wird verwendet, um jeden Reaktor mit mehreren Armaturen (7) zu verbinden, deren letzte Öffnung mit dem Deckel der Quellen- oder Abfallflasche verbunden ist. (F) Seitenansicht der in den Schritten 2.16-2.17 beschriebenen Zweiloch-Flaschenverschlussanordnung. Eine Öffnung in der Kappe ist mit einem PTFE-Schlauch verbunden, der sich im Inneren der Flasche befindet. In diese Öffnung wird die Armatur (1) eingeführt, gefolgt von der Armatur (2) und dem E-LFL 2,06 mm Schlauch, der mit der Armatur (5) verbunden ist. Diese Armatur wird an das Quell- oder Abfallluernetz angeschlossen. In die Öffnung, die nicht mit einem PTFE-Schlauch verbunden ist, wird die Armatur (1) eingeführt, gefolgt von der Armatur (2) und der Schlauch E-LFL 2,06 mm mit einer anderen Armatur (5). Dieses Ende wird während der Autoklavensterilisation mit einer Folie verschlossen, die später an einem sterilen 0,22-μM-Spritzenvorsatzfilter befestigt werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten Kotproben stammen aus Experimenten, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Florida (UF) genehmigt und in UF Animal Care Facilities (IACUC Protocol #IACUC202300000005) durchgeführt wurden. Kurz gesagt, gemischtgeschlechtlicher keimfreier Wildtyp (GF WT; C57BL/6) Mäuse (gezüchtet und in Isolatoren gehalten von UF Animal Care Services Germ-free Division) wurden aus Zuchtisolatoren übernommen und in das ISOcage P Bioexclusion-System gebracht, um eine mikrobielle Manipulation zu ermöglichen. Gleiche koloniebildende Einheiten (KBE) aus humanem Spenderkot wurden für die Sonde in Mäuse gepoolt. Zwei Wochen nach der Inokulation wurden aseptisch Kotproben von diesen Mäusen zur Lagerung und anschließenden Verwendung in diesem Protokoll entnommen.

HINWEIS: Die hier beschriebene Entnahme und Aufbereitung von Stuhlproben ist nur als Beispiel für ein ordnungsgemäßes Verfahren gedacht, da dieses Verfahren je nach Art der entnommenen Proben (Mensch, Maus, anderes Tier) und der Lagerung dieser Proben stark variieren kann. Einzelpersonen sollten sich auf die entsprechende Literatur beziehen, um ein Protokoll für die Entnahme und Konservierung von Stuhlproben zu entwerfen, das auf den Bedürfnissen des einzelnen Forschers basiert.

1. Typische Vorbereitung von Stuhlproben für die Lagerung bei -80 °C

1. Wählen Sie ein Medium zur Erhaltung der anaeroben Lebensfähigkeit aus (hier haben wir Cary Blair verwendet). Aliquotieren Sie 1 ml Konservierungsmedium in sterile Röhrchen mit Schraubverschluss in einer Biosicherheitswerkbank und überführen Sie sie dann in die anaerobe Kammer.
2. Stellen Sie vor der Annahme von Stuhlproben sicher, dass alle Vorräte (autoklavierte Spatel, sterile Kochsalzlösung und Kryofläschchen mit Schraubverschluss mit Konservierungsmedium) 24 Stunden lang in der anaeroben Kammer vorreduziert sind.
3. Sammeln Sie Kotproben von Mäusen aseptisch mit sterilen Schnappverschlussröhrchen in einer Biosicherheitswerkbank unter Verwendung von autoklavierten Stuhlauffangbechern und Pinzetten. Sofort nach der Entnahme die Röhrchen in flüssigem Stickstoff einfrieren.
4. Bringen Sie die Proben sofort in eine anaerobe Kammer zusammen mit einer tragbaren Waage zum Wiegen. Wiegen Sie jedes Röhrchen vor. Für Stuhlproben von Mäusen können separate Kotpellets pro Röhrchen aliquotiert werden. Wenn Sie menschliche Proben verwenden, verwenden Sie die sterilen Spatel, um jede Probe zu rühren und sie gleichmäßig in kryogene Fläschchen aufzuteilen. Nachdem Sie jedes Röhrchen erneut gewogen haben, geben Sie Medien in einem geschätzten Verhältnis von 1:10 Kotmedien (Masse: Masse) zu jedem Röhrchen, um eine optimale Konservierung zu gewährleisten.
   HINWEIS: Nach der Entnahme wird eine sofortige anaerobe Konservierung von Stuhlproben empfohlen. Proben, die nicht sofort konserviert werden, können im Vergleich zu frisch konservierten Proben eine verringerte Lebensfähigkeit, Veränderungen der Zusammensetzung usw. aufweisen ^6,7,8. Cary Blair Konservierungsmedien erhalten die Lebensfähigkeit der Bakteriengemeinschaften, hemmen gleichzeitig das weitere Wachstum und können bei -80 °C gelagert werden. Für das geschätzte Verhältnis von Konservierungsmedien zu Kot ist dies die beste verfügbare Schätzung, obwohl das Nassgewicht der Stuhlprobe stark variiert.
5. Beschriften, verschließen, Fläschchen aus der anaeroben Kammer nehmen, Grate mit flüssigem Stickstoff einfrieren und bis zu einem Jahr oder länger bei -80 °C lagern.

2. Aufbau eines 6-Well-Reaktorarrays

1. Verwenden Sie die CAD-Datei (Ergänzungsdatei 1) für den 3D-Druck des 6-Well-Reaktors. Diese Datei kann bei jedem 3D-Druckunternehmen zur Produktion eingereicht werden. Verwenden Sie ABS-Like Translucent Clear Kunststoff als Druckmaterial, um die Visualisierung durch die Reaktoren zu ermöglichen und gleichzeitig resistent gegen wiederholte Autoklavierzyklen zu sein.
   HINWEIS: Wir haben die Herstellung der 6-Well-Reaktorarrays aus ABs-ähnlichem, durchscheinendem klarem Kunststoff durch Stereolithographie in Auftrag gegeben. Wir empfehlen, das Array in der Produktion zu kippen (d. h. das Teil in einem Winkel von 30 % bis 45 % in 3D drucken zu lassen), um Maßungenauigkeiten zu reduzieren. Diese Korrektur führt dazu, dass sichtbare Schichtlinien diagonal über das Array verlaufen, was sich jedoch nicht auf die Leistung der Reaktoren auswirkt.
2. Führen Sie mit einem 25-28-mm-Gewindebohrwerkzeug Schraubengewinde in jede Öffnung des Reaktorarrays ein.
3. Schneiden Sie 12 25-mm-Streifen aus dem 1/8-Zoll-PTFE-Schlauch ab und führen Sie ein Ende jedes Schlauchsegments in die Schraubgewindeöffnung eines Luer-Außengewindes auf 25-28-Gewindeverschraubung ein. Schrauben Sie die Fittings sicher in die dafür vorgesehenen Abfall- und Probenöffnungen des Arrays (Abbildung 2B).
   HINWEIS: Mit einer Rasierklinge können die Enden des Schlauchs leicht in eine kegelförmige Konfiguration gehobelt werden, damit der Schlauch besser für das Einführen passt.
4. Führen Sie einen Mikrorührstab in jede Reaktorvertiefung des Reaktors ein und schrauben Sie dann ein 1/4-28-Außengewinde in die Quelllöcher jeder Reaktorvertiefung (Abbildung 2B).
5. Schrauben Sie die weiblichen Luer-x 1/8-Zoll-Schlauchtüllen in die 1/4-28-Gewindeanschlüsse für den Abfall und die Quelle für jede Reaktorvertiefung (Abbildung 2C).
6. Schrauben Sie die weiblichen Luer-x 3/32-Zoll-Schlauchtüllen in die 1/4-28-Gewindeanschlüsse für den Probenanschluss. Platzieren Sie ein Gummiseptum über den 3/32-Zoll-Schlauchtüllenadapter, und klappen Sie die Oberseite um (Abbildung 2C).
7. Schneiden Sie zwei Sätze E-LFL-Schläuche mit 2,06 mm in den folgenden Längen für die Ablauf- und Quellleitungen: 14 cm, 15,25 cm, 16,5 cm, 17,75 cm, 19 cm und 20,25 cm.
   HINWEIS: Farbiges Etikettenband, das um den Mittelteil gewickelt ist, kann verwendet werden, um jede Schlauchlänge zu identifizieren.
8. Befestigen Sie den E-LFL 2,06-mm-Schlauch an den weiblichen Luer-1/8-Zoll-Schlauchtüllen für die Quell- und Abflussanschlüsse (Abbildung 2D). Verwende heißes Wasser, um den Schlauch formbarer zu machen. Auf diese Weise passt der Schlauch problemlos auf die Adapter.
9. Befestigen Sie einen männlichen Luer mit einem Sicherungsring x 1/8 Zoll Schlauchtüllenadapter, der am anderen Ende des Schlauchs angebracht ist. Schrauben Sie eine Luer-Buchse x 1/16 Zoll Schlauchtülle hinein (Abbildung 2D).
10. Verbinden Sie den entsprechenden 2-Stopp-Schlauch mit den entsprechenden Abfall- und Quellenanschlüssen. Die Ablaufleitungen verwenden Rohre mit einem Durchmesser von 1,14 mm und 2 Stopps, während in den Quellleitungen Schläuche mit einem Durchmesser von 1,02 mm und 2 Stopps verwendet werden. Befestigen Sie am anderen Ende des 2-Stopp-Schlauchs eine weitere weibliche Luer-x 1/16-Zoll-Schlauchtülle (Abbildung 2D).
11. Schneiden Sie 20 5 cm lange Stücke E-LFL, 2,06 mm Schlauch ab und setzen Sie den männlichen Luer mit Sicherungsring x 1/8 Zoll Schlauch-Widerhaken-Adapteranschlüssen an beide Enden jedes Schlauchs ein. Befestigen Sie ein Ende des 5-cm-Schlauchs mit dem männlichen Luer mit Sicherungsring x 1/8-Zoll-Schlauchtülle an der unbesetzten weiblichen Luer x 1/16 Zoll Schlauchtülle am Ende jedes 2-Stopp-Schlauchabschnitts. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen 19 Schlauchstücke (Abbildung 2D).
12. Verbinden Sie den E-LFL, 2,06 mm Schlauch für die Quellleitungen der Reaktorvertiefungen 1 und 2 mit den gegenüberliegenden Enden eines weiblichen Luer-T-Stücks. Befestigen Sie eines der 5 cm langen Schlauchstücke mit männlichem Luer mit Sicherungsring x 1/8 Zoll Adapteranschlüssen an jedem Ende am mittleren Auslass des T-Stücks, was zu einer zweiten T-Verbindung führt (Abbildung 2E).
13. Verbinden Sie den E-LFL, 2,06 mm Quellschlauch für den dritten Reaktor, mit der gegenüberliegenden Seite des zweiten T-Stücks. Ein weiterer 5-cm-Schlauch mit einem männlichen Luer mit einem Sicherungsring x 1/8-Zoll-Adapter sollte an einem Ende angebracht werden, während am anderen Ende ein weiblicher Luer mit einem Sicherungsring x 1/8-Zoll-Adapter angebracht sein sollte. Befolgen Sie das gleiche Muster für die Reaktoren 4, 5 und 6 (Abbildung 2E).
14. Schneiden Sie ein 25 cm langes Stück E-LFL, 2,06 mm Schlauch ab und befestigen Sie an einem Ende des Schlauchs einen männlichen Luer mit Sicherungsring x 1/8 Zoll Schlauchtülle Adapter, der an der letzten verbleibenden weiblichen Luer-T-Verbindung befestigt wird, und befestigen Sie am anderen Ende eine weibliche Luer x 1/8 Zoll Schlauchtülle Adapter Adapter. Verschließen Sie dieses Ende mit Aluminiumfolie (Abbildung 2E).
    HINWEIS: Während der Operation ist es wichtig, die offenen Enden steril zu halten, daher empfehlen wir, sie während des Autoklavierens in Folie zu halten und mit Klebeband zu sichern.
15. Bereiten Sie die Abfallleitungen vor, indem Sie das gleiche Verfahren wie die in den Schritten 2.12 bis 2.14 beschriebenen Quellleitungen wiederholen (Abbildung 2E).
16. Um eine Abfallsammelflasche zusammenzubauen, befestigen Sie einen Flaschenverschluss mit zwei Löchern locker an einer 2-Liter-Flasche. Setzen Sie die Außengewindeanschlüsse mit 1/4-28 Gewinde in beide Löcher der Kappe ein. Befestigen Sie eine Luer-Buchse mit 1/8-Zoll-Schlauchtüllen an der Außengewindeverschraubung, die nicht mit dem vormontierten PTFE-Schlauch in der Kappe verbunden ist (Abbildung 2F).
17. Schneiden Sie anschließend ein 5 cm langes Stück E-LFL 2,06 mm Schlauch ab und verbinden Sie es mit dem Schlauchtüllenadapter an der Flasche. Befestigen Sie einen männlichen Luer mit Sicherungsring x 1/8 Zoll Schlauchtülle Adapter am anderen Ende des 5 cm langen Schlauchs und decken Sie ihn mit Folie ab (dieser Schlauch dient als Entlüftung; nach dem Autoklavieren wird ein 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter hinzugefügt, um eine Kontamination zu verhindern; Abbildung 2F).
18. Decken Sie die gesamte Kappe mit Alufolie ab. Autoklavieren Sie die Reaktoren und die Abfallflasche 45 Minuten lang bei 121 °C und mindestens 15 psi mit dem für Flüssigkeiten üblichen langsamen Abluftprogramm. Sobald die Reaktoren abgekühlt sind, ziehen Sie die Armaturen und die Dichtungen aus Aluminiumfolie fest und legen Sie sie vor dem Gebrauch 48 h lang in die anaerobe Kammer.

3. Vorbereitung der MEGA-Medien

1. Bereiten Sie alle Stammlösungen gemäß Ergänzende Tabelle 1, Ergänzende Tabelle 2, Ergänzende Tabelle 3, Ergänzende Tabelle 4, Ergänzende Tabelle 5, Ergänzende Tabelle 6, Ergänzende Tabelle 7, Ergänzende Tabelle 8 vor.
2. In eine 2-l-Glasflasche alle trockenen Zutaten aus der Zusatztabelle 9 geben, gefolgt von 1640 ml Reinstwasser und dann den Rest der flüssigen Zutaten der Zusatztabelle 10 . Einen Rührstab dazugeben und bei mittlerer Hitze (90 °C) auf einer Rührplatte vollständig auflösen. Das Medium ist blassblau bis violett gefärbt und nicht vollständig klar, hat aber keine offensichtlichen ungelösten Klumpen.
   HINWEIS: Das Autoklavieren von Glukose und anderen Zuckern in Gegenwart von Peptiden kann zu Modifikationen führen und den verfügbaren Zucker in den Medien verringern. Falls gewünscht, können alle Zuckerlösungen steril filtriert und mit den Bestandteilen der Ergänzungstabelle 10 zugegeben werden, wie in Schritt 3.7 beschrieben.
3. Sobald es vollständig gemischt ist, stellen Sie den pH-Wert des Mediums auf 7,0 ein, indem Sie 10 N Natriumhydroxid (NaOH) hinzufügen und genau messen, wie viel Volumen hinzugefügt wird. Nach der pH-Messung fügen Sie 14,4 ml Wasser abzüglich des hinzugefügten Volumens an Natriumhydroxid hinzu, um das Volumen auf genau 2 l zu bringen.
4. Bereiten Sie einen Flaschenverschluss mit zwei Löchern vor, indem Sie in beide Öffnungen ein männliches Luergewinde von 1/4-28 mm einführen.
5. Schneiden Sie in das Loch der Kappe, die nicht vormontiert ist, ein 5 cm langes Stück C-Flex-Schlauch ab und verbinden Sie es mit der 1/8-Zoll-Schlauchtülle der weiblichen Luer-Armatur. Führen Sie am anderen Ende des 5-cm-Schlauchs einen weiteren männlichen Luer mit einem Sicherungsring und einem 1/8-Zoll-Schlauchtüllenadapter ein und decken Sie ihn mit Folie ab (dieser wird ebenfalls an einen 0,22-μM-Spritzenvorsatzfilter angeschlossen).
6. Decken Sie den gesamten Verschluss mit Alufolie ab und schrauben Sie die 2 L MEGA Medienflasche auf. Autoklavieren Sie 45 Minuten lang bei 121 °C und mindestens 15 psi mit dem langsamen Absaugprogramm für Flüssigkeiten.
7. Nehmen Sie das Medium aus dem Autoklaven und lassen Sie es unter Rühren lauwarm abkühlen. Geben Sie die Komponenten aus der Ergänzungstabelle 10 in die 2-l-Medienflasche in einer Biosicherheitswerkbank, verschließen Sie den Deckel und stellen Sie sie dann zum Homogenisieren auf eine Rührplatte. Sobald das Medium abgekühlt ist, ziehen Sie die Armaturen und die Dichtungen aus Aluminiumfolie fest und legen Sie sie vor dem Gebrauch 48 h lang in die anaerobe Kammer.
   HINWEIS: Wir empfehlen, die Quellpumpe mit 16 μl/min (0,94 mL/h) für eine Verweilzeit von 16 h zu betreiben. Für diese Durchflussrate verbraucht ein 6-Well-Reaktor etwa 0,135 l Medien pro Tag. Wir empfehlen außerdem, die Abwasserpumpe mit 40 μL/min zu betreiben, um Verstopfungen in den Abfallschläuchen zu vermeiden. Überwachen Sie die Schläuche und den Durchfluss und beachten Sie, dass der Abwasserfluss bei Bedarf erhöht werden kann, wenn Verstopfungen auftreten. Sowohl die Quellen- als auch die Abfallflussraten sind veränderbar, aber die Forscher sollten die Zusammensetzung und die Wachstumsraten ihrer Gemeinschaft sorgfältig überwachen, da sich diese auch bei schnellerem oder langsamerem Fluss ändern können. Um einen 6-Well-Reaktor eine Woche lang zu betreiben, empfehlen wir, mindestens 2 l Medium herzustellen (es wird etwas mehr als 1 l verbraucht).

4. Aufbau des Arrays in der anaeroben Kammer

HINWEIS: Es ist wichtig, das Innere der Haube und die Handschuhe der Haube mit 3 % Wasserstoffperoxid zu reinigen, gefolgt von einer dreifachen Spülung mit deionisiertem Wasser, um sicherzustellen, dass die Oberfläche vor der Montage nicht verunreinigt wird. Wenn die Verbindungen nach dem Entfernen der Folie schnell hergestellt werden und kein direkter Kontakt mit dem Inneren der Armaturen und den anaeroben Kammerhandschuhen hergestellt wird, besteht eine minimale Wahrscheinlichkeit einer Kontamination

1. Richten Sie das Array über einer magnetischen Rührplatte in der anaeroben Kammer aus. Stellen Sie sicher, dass die Anordnung korrekt ausgerichtet ist, indem Sie den Rührplattenregler auf maximale Drehzahl (1600 U/min) einstellen und beobachten, wie sich die Rührstäbe drehen.
2. Montieren Sie die 2-Stopp-Schläuche für die Quelle und den Abfall in den Klemmen der entsprechenden Schlauchpumpen. Wenn Sie dies weniger als 24 Stunden vor dem bestimmungsgemäßen Gebrauch tun, verriegeln Sie die Klemmen. Andernfalls lassen Sie es bis zur Verwendung locker, um den Verschleiß des Schlauchs zu reduzieren.
3. Entfernen Sie die Folienkappe an den weiblichen Luer- x 1/8-Zoll-Schlauchtüllenadapteranschlüssen an der Quelle und den Abwasserleitungen und schrauben Sie sie in den männlichen Luer auf 1/4 -28 Bedrohungsanschlüsse, die in die Kappen eingeschraubt sind (stellen Sie sicher, dass diese Öffnung mit dem internen PTFE-Schlauch verbunden ist).
4. Entfernen Sie die Folienkappen und befestigen Sie einen 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter an der 5 cm Entlüftungsleitung der Quellflasche und an der Entlüftungsleitung der Abfallflasche.
5. Beginnen Sie den Durchfluss mit einer moderaten Geschwindigkeit (1 ml/min an der Quellpumpe und 2 mL/min an der Abfallpumpe), um mit dem Befüllen der Reaktoren zu beginnen. Stellen Sie sicher, dass das Abwasserrohr in jeder Reaktorvertiefung niedriger ist als das der Quellrohre, um eine Überfüllung oder die Entleerung jeder Vertiefung zu verhindern.
6. Wenn sich die Reaktoren zu füllen beginnen, stellen Sie sicher, dass alle das gleiche Volumen erreichen und das Medium in die Abfallleitung fließt. Bei den hier beschriebenen Messungen beträgt das Arbeitsvolumen jedes Reaktors 15 mL.
   HINWEIS: Wenn einzelne Reaktoren nicht gefüllt sind, ziehen Sie alle losen Armaturen fest und untersuchen Sie die Quellleitungen auf Probleme, indem Sie sie bei Bedarf durch vorbereitete Extras ersetzen. Wenn das Problem weiterhin besteht, ersetzen Sie die Quellflasche, falls verfügbar. Wenn der mittlere Spiegel über die innere Abfallleitung in den Reaktoren steigt, überprüfen Sie, ob der PTFE-Schlauch an der Innenseite der Reaktorablassöffnung noch an Ort und Stelle ist.
7. Nachdem jeder Reaktor gefüllt ist, passen Sie die Pumpeneinstellungen auf die Durchflussrate von 16 μl/min an und schalten Sie dann die Pumpen aus.
8. Lassen Sie das Medium über Nacht in den Reaktoren und Abfallflasche(n) verbleiben, bevor Sie inokulieren. Dies ermöglicht eine weitere anaerobe Konditionierung des Mediums (für insgesamt ~72 h) und ermöglicht es dem Benutzer, die Sterilität des Systems zu bestätigen.
9. Um die Sterilität des Systems vor der Inokulation von Stuhlproben zu bestätigen, beproben Sie jeden Reaktor und das Ausgangsmedium direkt nach der Erstbefüllung (Schritt 4.7) und erneut nach Schritt 4.8. Befolgen Sie das in Schritt 6 beschriebene Verfahren für die aseptische Probenahme der Reaktoren.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Messung der optischen Dichte aller Proben mit der des Ausgangsmediums übereinstimmt. Wenn eine erhöhte optische Dichte beobachtet wird, besteht der Verdacht auf Kontamination, und alle Medien und das System sollten dekonstruiert, gereinigt und wieder zusammengebaut werden.

5. Inokulation der Stuhlprobe

1. Legen Sie sterile Pipettenspitzen mit breitem Durchmesser, sterile Kochsalzlösung, konische 50-ml-Röhrchen, sterile serologische Pipetten mit 25 mL, 5-ml-Spritzen und 16-Gauge-Nadeln in die anaerobe Kammer, um sie mindestens 24 Stunden lang in der anaeroben Umgebung zu konditionieren.
2. Berechnen Sie die Menge an Fäkalien, die erforderlich ist, um die gewünschte Anzahl von Reaktoren zu beimpfen. Jede Reaktorvertiefung benötigt 3,8 ml Überstand in einer Fäkalaufschlämmung von 25 % m/v. Für sechs Reaktorvertiefungen sollten insgesamt 22,8 ml 25 % m/v Fäkalschlamm genügend Überstand für die Inokulation liefern, für die 5,7 g feste Fäkalien erforderlich sind.
3. Übertragen Sie die konservierten Stuhlproben in kryogenen Fläschchen in die anaerobe Kammer und lassen Sie sie 15 Minuten auftauen.
4. Verwenden Sie eine Pipettenspitze mit breiter Bohrung, um Fäkalien aus den Kryofläschchen in ein konisches 50-ml-Röhrchen zu übertragen, verschließen Sie es fest und zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 200 x g , um Partikel abzusetzen.
5. Wieder in eine anaerobe Kammer geben und Überstand entfernen. Übertragen Sie die Fäkalien mit einem autoklavierten Laborspatel in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen, um eine Gesamtmasse von 5,7 g zu erreichen. Geben Sie 17,1 mL anaerobe sterile Kochsalzlösung in das Röhrchen und verschließen Sie es fest.
6. Die konischen Röhrchen aus der Kammer nehmen, 5 Minuten lang durch Vortex homogenisieren und dann 5 Minuten lang bei 200 x g zentrifugieren, um die Partikel abzusetzen.
7. Sterilisieren Sie die Septen auf jedem Reaktor mit einem Labortuch mit 10 % Bleiche für mindestens 2 Minuten, während die Proben in die Zentrifuge gegeben werden.
8. Die Proben werden in die anaerobe Kammer zurückgeführt und mit sterilen serologischen Pipetten die Überstände in neue konische 50-ml-Röhrchen überführt.
9. Laden Sie 3,8 ml Fäkalschlammüberstand in sechs separate 5-ml-Spritzen mit 16 G 1,5-Zoll-Nadeln.
10. Entfernen Sie das Tuch, stechen Sie die Nadel durch das Septum und injizieren Sie den Stuhlschlamm langsam in den Reaktor.
11. Lassen Sie die Stuhlgemeinschaften in jedem Reaktor etwa 16-18 Stunden lang entstehen, bevor Sie den Fluss zum Reaktor starten. Stellen Sie die magnetische Rührplatte ab dem Zeitpunkt der Injektion der Fäkaliengülle (1600 U/min) auf maximale Drehzahl ein.

6. Aseptische Entnahme von Proben aus Reaktorschächten

1. Durchstechen Sie die Verpackung von sechs sterilen 1-ml-Spritzen und sechs sterilen 22G 3-Zoll-Nadeln und legen Sie sie in die anaerobe Kammer, um sie 24 Stunden lang zu entgasen.
2. Unmittelbar vor der Probenahme die Septen auf jedem Reaktor mit einem Labortuch mit 10 % Bleiche für mindestens 2 Minuten sterilisieren.
3. Entfernen Sie das Bleichmittel-Labortuch und befestigen Sie sofort eine Nadel an einer Spritze und führen Sie die Nadel in die Mitte der Septen der ersten Reaktorvertiefung ein.
4. Ziehen Sie 1 ml der Probe heraus, entfernen Sie die Nadel aus den Septen und übertragen Sie die Probe aus der Spritze in ein mit 1,7 ml beschriftetes Röhrchen zur späteren Verwendung. Die Gummisepten verschließen sich wieder, wenn die Nadel entfernt wird. Verwenden Sie für jede Reaktorvertiefung eine neue Nadel und Spritze, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
5. Wenn der Überstand gewünscht ist, nehmen Sie die Röhrchen aus der anaeroben Kammer und zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 20.000 x g , um Bakterienzellen zu pelletieren.
6. Den Überstand in ein separat beschriftetes 1,7-ml-Röhrchen umfüllen und bei -80 °C lagern.

7. Demontage und Reinigung des Mini-Bioreaktorsystems

1. Trennen Sie die Quellflasche vom Luer-T-Stück der Quelle und erhöhen Sie die Durchflussrate (1 ml/min an der Quellpumpe und 2 mL/min an der Abwasserpumpe), um mit der Entleerung des Schlauchs zu beginnen. Lassen Sie den Schlauch vollständig entleeren. Schalten Sie die Rührplatte aus.
2. Sobald der Schlauch leer ist, trennen Sie die Abfallflasche vom Abfall-Luer-T-Stück. Setzen Sie dann die Reaktorbaugruppe in die Luftschleuse der anaeroben Kammer ein und entfernen Sie sie aus der Kammer.
3. Trennen Sie alle E-LFL 2,06 mm Schlauchsegmente und PTFE-Schlauchsegmente und entsorgen Sie diese. Trennen Sie alle Beschläge und legen Sie sie in eine 10%ige Bleichlösung.
4. Entfernen Sie die Mini-Rührstäbchen aus jeder Vertiefung und legen Sie sie in die Bleichlösung. Drehen Sie die Reaktoranordnung um, um das Medium zur Desinfektion in eine separate 10%ige Bleichlösung zu entleeren. Tauchen Sie dann das leere Array in eine frische Bleichlösung.
5. Lassen Sie alle Armaturen und das Reaktorarray 30 Minuten lang in der 10%igen Bleichlösung einweichen (längeres Einweichen führt zu Verfärbungen).
6. Spülen Sie die Armaturen und das Reaktorarray mit entionisiertem Wasser und tauchen Sie es dann über Nacht in enzymatische Reinigungsmittellösung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
7. Spülen Sie die Armaturen und das Reaktorarray dreimal mit entionisiertem Wasser ab und lassen Sie sie dann mindestens 3 Tage lang vollständig an der Luft trocknen. Nach dem Trocknen können das Reaktorarray und die Armaturen wieder für die Montage verwendet werden.

Ergebnisse

Kotproben wurden von Mäusen entnommen, die 2 Wochen nach der Inokulation mit menschlicher Kotgülle besiedelt waren, und bei -80 °C gelagert. Das Bioreaktorsystem wurde mit kontinuierlichem MEGA-Medienfluss für zwei Replikatreaktorvertiefungen aufgebaut (Abbildung 3A). Die Stuhlaufschlämmung wurde aus den Kotpellets der Maus gemäß dem in Schritt 6 beschriebenen Protokoll hergestellt, und beide Reaktoren wurden durch eine Probenöffnung mit der Responder-Maus-K...

Diskussion

Das in diesem Protokoll beschriebene Mini-Bioreaktorsystem ermöglicht die Kultivierung unabhängiger Stuhlgemeinschaften für parallele Experimente. Diese Fähigkeit, mikrobielle Gemeinschaften isoliert von Wirtsfaktoren zu untersuchen, ist ein wesentlicher Ansatz, um die intrinsische Fähigkeit von Mikroorganismen zur Anpassung an ihre Umwelt zu verstehen. Dieses Protokoll kann auf Wunsch leicht für die Kultivierung definierter Bakterienkonsortien oder sogar einzelner Isolatkulturen angepas...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 mL BD Slip Tip Spritze steril, Einmalgebrauch	Fisher Scientific	309659
1/4-28 mm Gewinde auf Widerhakenadapter (3,2 mm), 5/Packung	Cole-Parmer	008NB32-KD5L	Um 1 6-Well-Array zu bauen, benötigen Sie 2 Packungen
10M NaOH (Natriumhydroxid)	Sigma	72068-100ML
2,0ml Schraubverschlussröhrchen, ohne Rändelung, mit Rand, Natur, E-Beam Steriles Röhrchen mit aufgesetzter Kappe	Fisher Scientific	14-755-228
2mag MIXdrive 60 Rührantrieb	2mag	40060	Magnetrührplatte mit 60 Positionen (optionale Zusatzheizung - Kat # 40260)
6-Well-Reaktorarrray, ABS-Like Translucent Klarer Kunststoff	Protolabs	Custom	Siehe ergänzende Dateien für .stl-Datei für den 3D-Druck
Absolutes Ethanol (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818
Essigsäure, eiskalt	Sigma	A6283
Adapter, Nylon, männlicher Luer auf 1/4-28 Gewinde, 25/Pack	Cole-Parmer	EW-45505-82	Um 1 6-Well-Array zu bauen, benötigen Sie 6 (1 Packung)
Aluminiumfolie	Fisher Scientific	01-213-100
Anaerobe Kammer	Coy Lab Produkte	Typ B
Bel-Art  SP Scienceware Floh Micro Spinbar Magnetrührstäbchen (1/pk)	Fisher Scientific	22-261679	Um 1 6-Well-Array zu bauen, benötigen Sie 6
Biosicherheitswerkbank Klasse 2	Nuaire
Buttersäure	Sigma	B103500
CaCl2 & middot; 2H2O (Calciumchlorid-Dihydrat)	Sigma	C7902
Clorox Keimtötende Tücher für das Gesundheitswesen mit Bleichmittel, unparfümiert, 6" x 5", Packung mit 150 Tüchern	Office Depot	129202
D-(-)-Fructose	Sigma	F0127-100G
D-(+)-Cellobiose	Sigma	C7252-100G
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270-100G
D-(+)-Maltose Monohydrat	Sigma	M5885-100G
Drill America Plug Hand Tap DWTP1/4-28	Home Depot	305699489
Dulbecco's Phosphate Buffered Kochsalzlösung, 1X ohne Ca und Mg, Sterile	Genesee	25-508
Female Luer × 1/16″ Schlauchtülle Adapter, Nylon, 25/Pack	Cole-Parmer	EW-45502-00	Um 1 6-Well-Array zu bauen, benötigen Sie 24 (1 Packung)
Weiblicher Luer &mal; 1/8″ Schlauchtüllenadapter, Nylon 25/Pack	Cole-Parmer	EW-45502-04	Um 1 6-Well-Array zu bauen, benötigen Sie 6 (1 Packung)
Weiblicher Luer &mal; 3/32″ Schlauchtüllenadapter, Nylon, 25/ Pack	Cole-Parmer	EW-45502-02	Um 1 6-Well-Array zu bauen, benötigt 6 (1 Packung)
Weibliches Luer-T-Stück, Nylon, 25/Packung	Cole-Parmer	EW-45502-56	Um 1 6-Well-Array zu bauen, benötigen Sie 10 (1 Packung)
FeSO4 & Middot; 7H2O (Eisen [II]-Sulfat-Heptahydrat)	Sigma	F8633
Hämatin	Sigma	H3281
Histidin	Sigma	H7750
Isovaleriansäure	Sigma	129542
K2HPO4 zweibasisch (Dikaliumhydrogenphosphat)	Sigma	P2222-1KG
KH2PO4 monobasisch (Kaliumdihydrogenphosphat)	Sigma	P0662-500G
Pipettenspitzen mit großer Öffnung	Fisher Scientific	02-707-134
L-Cysteinhydrochlorid	Sigma	C1276-10G
Luer für Männer mit Sicherungsring × 1/8″ Schlauchtülle Adapter, Nylon, 25/Packung	Cole-Parmer	EW-45505-04	Für den Bau von 1 6-Well-Array benötigen Sie 42 (2 Packungen)
Fleischextrakt	Sigma	70164-500G
Med Vet International  Exel-Nadel, 20G x 1", Unterkiefer, 100/Box, 26417	Fisher Scientific	50-209-2532
Menadion (Vitamin K3)	Sigma	M5625
MgSO4  · 7H2O (Magnesiumsulfat-Heptahydrat)	Sigma	M1880-500G
Milli-Q Wasser
NaCl (Natriumchlorid)	Sigma	S9888-500G
NaHCO3 (Natriumbicarbonat)	Sigma	S5761-500G
Omnifi t Q-Serie Zweiloch-Flaschenverschluss	Cole-Parmer	00945Q-2	Um 1 6-Well-Array zu bauen, benötigen Sie 1
PMP IPC-N L 24CHNL 8RLR 115V	MasterFlex	ISM939C-115V	24-Kanal-Schlauchpumpe, benötigt 1 für die Quelle und 1 für den Abfall
Präzisionsdichtung & Gummisepten, weiß, 7 mm Außendurchmesser Glasschlauch (100/pk)	Millipore Sigma	Z553905-100EA	Für den Bau von 1 6-Well-Array benötigen Sie 6 Septen
Propionsäure	Sigma	P5561
Pumpenschläuche, 2 Stopps, Tygon S3 E-Lab, 1,02 mm ID; 12/PK	VWR	MFLX96460-28	Für den Bau von 1 6-Well-Array werden 6 Stationen benötigt. (1 Packung)
Pumpenschlauch, 2 Stopps, Tygon S3 E-Lab, 1,14 mm ID; 12/PK	VWR	MFLX96460-30	Für den Bau von 1 6-Well-Array benötigen Sie 6 (1 Packung)
Puritan Cary-Blair Medium, 5 ml	Fisher Scientific	22-029-646
PYREX 2L Vorratsflaschen für runde Medien, mit GL45-Schraubverschluss	Fisher Scientific	06-414-1E
Rasierklingen	Genesee	12-640
Resazurin, Natriumsalz	ACROS Organics from ThermoFisher	AC41890-0010
Lösliche Stärke	Sigma	S9765-100G
Mikrospatel aus Edelstahl, löffelartige	Klinge Fisher	Scientific S50823
TBNG TYGON ELFL 2.06MMID 100'VWR		MFLX06449-42	Für den Bau von 1 6-Well-Array benötigen Sie 205,5 cm
Spurenelementergänzung	ATCC	MD-TMS
Trypticase-Pepton (BBL)	Fisher Scientific	B11921
Schlauch, PTFE, 1/8″ (3,2 mm) OD & mal; 1,5 mm ID, 10 M	Cole-Parmer	008 T32-150-10	Für den Bau von 1 6-Well-Array benötigen Sie 300 mm
Tween 80	Sigma	P1754
Nahrungsergänzungsmittel	ATCC	MD-VS
Hefeextrakt (Bacto)	Fisher Scientific	DF0127-17-9