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Tiermodell für implantatassoziierte Infektionen bei Mäusen

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DOI:

10.3791/68041

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27. Juni 2025

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1Department of Orthopedics, Centre for Leading Medicine and Advanced Technologies of IHM, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Mausmodell, das mittels subkutaner dorsaler Implantation implantatassoziierte Infektionen untersucht, was eine umfassende Untersuchung pathophysiologischer Mechanismen ermöglicht und die Entwicklung diagnostischer Kriterien mit gezielten therapeutischen Strategien unterstützt.

Zusammenfassung

Implantatassoziierte Infektionen stellen eine große klinische Herausforderung dar, da sie entstehen, wenn pathogene Mikroorganismen in medizinische Implantate wie Gelenkersatz, Katheter oder Herzschrittmacher eindringen. Diese Infektionen können zu schweren Komplikationen führen, einschließlich Implantatversagen, längerem Krankenhausaufenthalt und der Notwendigkeit zusätzlicher chirurgischer Eingriffe. Um diese kritischen Fragen zu untersuchen, bieten Mausmodelle eine unschätzbare Plattform für die Untersuchung implantatassoziierter Infektionen und die Bewertung therapeutischer Strategien gegen bakterielle Biofilme, die Erkenntnisse liefern, die letztendlich die klinischen Ergebnisse für Patienten verbessern können, die von infizierten Implantaten betroffen sind. Zu den in diesen Studien häufig verwendeten Materialien gehören Titan, Polyethylen und Edelstahl, die den in der klinischen Praxis verwendeten Materialien sehr ähnlich sind. Das Versuchsdesign beinhaltet in der Regel einen chirurgischen Eingriff zur Implantation des Geräts, der häufig subkutan durchgeführt wird, um Gelenk- oder Hautinfektionen zu simulieren. Nach der Implantation wird ein biofilmbildender Bakterienstamm wie Staphylococcus aureus oder Escherichia coli an der Stelle geimpft, um die Infektion auszulösen, wodurch ein Modell etabliert wird, das die Pathophysiologie menschlicher Infektionen widerspiegelt. Forscher haben die Wirksamkeit verschiedener Antibiotika gegen etablierte Biofilminfektionen rigoros bewertet, wobei sie sowohl systemische als auch lokalisierte Verabreichungsmethoden angewandt haben. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf neuartige antimikrobielle Wirkstoffe, biofilmzerstörende Verbindungen und innovative therapeutische Ansätze, die darauf abzielen, die Immunantwort des Wirts zu verstärken. Die Wirksamkeitsbewertung umfasst die Quantifizierung der bakteriellen Belastung des Implantats und des umgebenden Gewebes sowie die Bewertung der Verringerung der Biofilmdicke und -dichte nach der Behandlung. Die klinische Symptomatik, einschließlich Veränderungen der Schwellungen und Schmerzen, dient als zusätzlicher Indikator für den Therapieerfolg. Darüber hinaus geben die Gesamtüberlebens- und Morbiditätsraten bei murinen Probanden wichtige Einblicke in die Sicherheit und Wirksamkeit der evaluierten Behandlungen. Es ist zwingend erforderlich, dass alle Studien strenge ethische Richtlinien einhalten und die erforderlichen institutionellen Genehmigungen einholen, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse zuverlässig in verschiedenen Labors repliziert werden können. Diese methodische Strenge ist unerlässlich, um die Ergebnisse zu validieren und unser Verständnis wirksamer Behandlungen für implantatassoziierte Infektionen zu verbessern.

Einleitung

Tiermodelle implantatassoziierter Infektionen sind wesentliche Werkzeuge, die eine Brücke zwischen Grundlagenforschung und klinischer Anwendung schlagen 1,2. Diese Erkenntnisse bieten praktische Unterstützung für die wissenschaftliche Forschung und erleichtern die Entwicklung und Verfeinerung neuartiger therapeutischer und diagnostischer Ansätze, wodurch letztendlich die Ergebnisse und die Lebensqualität der Patienten verbessertwerden 3,4,5,6. Diese Modelle bieten eine Plattform für die Langzeitbeobachtung, die zum Verständnis der pathophysiologischen Veränderungen im Zusammenhang mit implantatassoziierten Infektionen beiträgt 7,8. Durch die Beobachtung der Auswirkungen von Infektionen auf umliegende Gewebe und Knochen können Forscher beispielsweise aufklären, wie Infektionen zu Gewebeschäden, Osteolyse und anderen Komplikationen führen, und so Verbesserungen in klinischen Behandlungsstrategien anleiten.

Erfolgreiche Tiermodellstudien liefern grundlegende Daten für klinische Studien und helfen bei der Optimierung therapeutischer Strategien 9,10. Durch diese Experimente können Forscher die effektivste Dosierung, die Behandlungsdauer und den Verabreichungsweg bestimmen, was in die klinische Forschung einfließen kann11,12. Darüber hinaus ermöglichen Tiermodelle die Bewertung von Behandlungseinschränkungen, so dass notwendige Anpassungen vor dem Übergang zu Studien am Menschen möglich sind. Tiermodelle von implantatassoziierten Infektionen, auch als geräteassoziierte Infektionen bezeichnet, sind von unschätzbarem Wert für die Untersuchung der Mechanismen, Nachweismethoden und Behandlungsansätze für diese Infektionen13,14. Implantatinfektionen treten häufig in Bereichen wie der Orthopädie und Zahnmedizin auf, in denen häufig Geräte wie Gelenkersatz oder Frakturfixierungen verwendet werden 15,16,17,18. Aufgrund des Vorhandenseins von Implantaten sind Infektionen schwer zu beseitigen und führen oft zu chronischen Entzündungen und Gewebeschäden, die die Genesung des Patienten behindern und die Entfernung von Implantaten für die weitere Behandlung erforderlich machen können.

Der Zweck der Etablierung von Tiermodellen besteht darin, das Auftreten und den Verlauf implantatassoziierter Infektionen unter kontrollierten Bedingungen zu simulieren und so eine eingehende Erforschung pathophysiologischer Prozesse, die Entwicklung neuartiger diagnostischer Methoden und die Evaluierung potenzieller therapeutischer Strategien zu ermöglichen 19,20,21,22,23. Ein ideales Tiermodell sollte die pathologischen Merkmale und Immunreaktionen, die bei menschlichen Infektionen beobachtet werden, genau nachahmen, mit konsistenter Reproduzierbarkeit in Experimenten 24,25,26. Zu den häufig verwendeten Tieren gehören Ratten, Mäuse und Kaninchen, wobei jedes Modell auf bestimmte Forschungsziele zugeschnitten ist, wie z. B. die Wahl des Implantattyps, der Bakterienstämme und der Infektionsmethoden. Mit diesen Modellen können Forscher die Ausbreitung von Infektionen, Immunreaktionen und das Besiedlungsverhalten von Krankheitserregern überwachen, einschließlich der Biofilmbildung auf dem Implantat 11,23,27. Darüber hinaus sind diese Modelle maßgeblich daran beteiligt, die Wirksamkeit antimikrobieller Therapien wie Antibiotika, antimikrobieller Beschichtungen und photodynamischer Therapien bei der Kontrolle von Infektionen zu testen 4,12,28. Die Anwendung neuer diagnostischer Methoden und bildgebender Technologien im Tiermodell erhöht auch das Potenzial für die Früherkennung und das effektive Management von implantatassoziierten Infektionen im klinischen Umfeld.

Langfristiges Ziel ist es, ein Tiermodell zu etablieren, das die physikalischen und physiologischen Mikroumgebungen von implantatassoziierten Infektionen beim Menschen genau nachbildet. Obwohl dieses Unterfangen mit hoher Komplexität, erheblichen Kosten und anhaltenden Herausforderungen verbunden ist, bietet die Entwicklung eines hochrealistischen Tiermodells für implantatassoziierte Infektionen eine wichtige Testplattform für Therapeutika und Strategien im Frühstadium. In dieser Studie wurden ein Mausimplantat-assoziiertes Infektionsmodell und ein subkutanes Infektionsmodell der Maus konstruiert. Durch den Vergleich relevanter Indikatoren wurde der Grad der Übereinstimmung zwischen dem Tiermodell und klinischen periprothetischen Infektionen untersucht.

Protokoll

Alle tierexperimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Institute of Health and Medicine, Hefei Comprehensive National Science Center, genehmigt (Zulassungsnummer: IHM-AP-2024-080). Bei allen verwendeten Mäusen handelte es sich um männliche C57BL/6J-Mäuse mit spezifischem Krankheitserreger-freiem (LSF) Gehalt im Alter von 6 Wochen und einem Körpergewicht von 20-30 g. Die Tiere wurden in fünf Mäusen pro Käfig untergebracht und erhielten freien Zugang zu Futter und Wasser. Die Umgebung wurde bei 22-26 °C mit 50-60 % relativer Luftfeuchtigkeit unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten (Licht: 7:00-19:00 Uhr; Dunkelheit: 19:00-07:00 Uhr). Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Bakterielle Vorbereitung für eine subkutane Implantat-Biofilm-Infektion

  1. Entnehmen Sie eine Schlaufe (10 μl) der Kultur Staphylococcus aureus (S. aureus, ATCC 43300) aus dem -80 °C-Stammröhrchen. Streichen Sie die Suspension mit der Streak-Platten-Technik auf eine Blutagarplatte. Bei 37 °C für 24 h unter aeroben Bedingungen ohne Schütteln inkubieren.
    HINWEIS: Es sind entweder Drei-Sektoren- oder Vier-Sektoren-Streifenplattenverfahren zulässig, vorausgesetzt, der Anfangs- und der Endsektor bleiben nicht konfluent. Die sektorübergreifende Schlierenbildung erfordert die Verwendung einer neuen Impfschlaufe. Parallele, äquidistante Streifen sollten ausgeführt werden, um eine gleichmäßige mikrobielle Verteilung zu ermöglichen. Die strikte Einhaltung aseptischer Protokolle ist zwingend erforderlich, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
  2. Untersuchen Sie die Morphologie typischer S. aureus-Kolonien und das Vorhandensein klarer hämolytischer Zonen.
    HINWEIS: Die typische Morphologie der Kolonie umfasst eine goldgelbe Pigmentierung, eine runde Form und eine glatte Oberfläche. Eine klare Zone mit einem Durchmesser von mindestens 2 mm gilt als positiv für die β-Hämolyse.
  3. Führen Sie eine Gram-Färbung und eine mikrobielle Massenspektrometrie-Analyse durch, um die Identität von S. aureus zu bestätigen.
    HINWEIS: Die Stammidentifizierung sollte von Prüfärzten unter Verwendung festgelegter Auswahlkriterien durchgeführt werden.
  4. Wählen Sie eine eigenständige typische Kolonie aus (wie in Schritt 1.2 beschrieben). Impfen Sie es in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen, das 5 ml sterile tryptische Sojabrühe (TSB) enthält. Inkubieren Sie bei 37 °C für 12 h und schütteln Sie bei 200 U/min.
  5. Die Bakteriensuspension aus Schritt 1.4 mit TSB im Verhältnis 1:50 verdünnen. Inkubieren bei 37 °C und Schütteln bei 200 U/min.
  6. Überwachen und erfassen Sie die optische Dichte (OD) bei 600 nm mit einem Spektralphotometer, um die logarithmische Wachstumsphase zu identifizieren.
  7. Stellen Sie eine Korrelation zwischen OD600-Werten und koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/ml) mit der Spreizplattenmethode her (siehe Schritt 4.1.7-4.1.10).
    HINWEIS: In diesem Experiment beträgt der ideale OD600 0,700-0,750, was ungefähr 4 × 105 KBE/ml entspricht. Die Bestimmung des Verhältnisses zwischen OD600 und KBE/ml gewährleistet die experimentelle Genauigkeit.
  8. 3 ml bakterielle Suspension (aus Schritt 1.7, 4 × 105 KBE/ml) mit 3 ml kalter, steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnen. Bei 3.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und das Pellet resuspendieren. Endgültige Bakterienkonzentration: 2 × 105 KBE/ml.
    HINWEIS: Das Verhältnis von 1:1 gleicht die effektive Verdünnung von Verunreinigungen des Kulturmediums mit der Aufrechterhaltung der Zellintegrität und osmotischen Stabilität aus. Es sorgt für eine effiziente Reinigung bei gleichzeitiger Minimierung von Zellschäden durch osmotischen Stress und fördert die gleichmäßige Bildung von Zellpellets während der Zentrifugation, was für die nachgelagerte Verarbeitung von entscheidender Bedeutung ist.
  9. Wiederholen Sie Schritt 1.8 in Duplikat.
  10. Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in PBS für weitere Experimente.

2. Maus- und Implantatvorbereitung

  1. 20 C57BL/6J-Wildtyp-Mäuse werden nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen (10 Mäuse/Gruppe) aufgeteilt: die Gruppe der implantatassoziierten Infektionen und die Gruppe mit subkutanem Abszess29.
    HINWEIS: Jede Gruppe sollte in zwei individuell belüfteten Käfigen (IVCs) mit fünf Mäusen pro Käfig untergebracht werden.
  2. Bringen Sie zur Identifizierung Schwanzmarkierungen auf jeder Maus an.
  3. Sterilisieren Sie kreisförmige Titanplatten (TA1, 1 cm Durchmesser, 0,5 mm Dicke) durch Autoklavieren bei 121 °C, 0,1 MPa für 30 Minuten.

3. Tierchirurgie

  1. Legen Sie die Mäuse für ca. 5 Minuten in eine Isofluran (2%) Gasinduktionskammer mit allgemeiner Tiergasanästhesie, um eine Anästhesie einzuleiten (gemäß institutionell anerkannten Protokollen).
  2. Überwachen Sie die Atmung, um eine angemessene Anästhesietiefe zu gewährleisten.
    HINWEIS: Die Atmung sollte regelmäßig und langsamer als im Wachzustand erfolgen und sich nicht als Reaktion auf schädliche Reize wie chirurgische Eingriffe oder Zehenkneifen verändern.
  3. Halten Sie die Anästhesie mit dem Nasalkegel-Verabreichungssystem unter kontinuierlicher Inhalation von 2 % Isofluran und 2 l/min Sauerstofffluss aufrecht (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Führen Sie alle Eingriffe unter Narkose durch, um stressbedingte Kämpfe zu vermeiden und die Einhaltung der Tierschutzbestimmungen sicherzustellen.
  4. Bringen Sie die anästhesierten Mäuse in die Vorbereitungszone der Biosicherheitswerkbank.
    HINWEIS: Unterteilen Sie die Biosicherheitswerkbank in drei Fächer: Vorbereitungs-, Desinfektions- und Operationsbereich. Legen Sie sterile Einwegmatten in jedes Fach. Führen Sie alle Verfahren innerhalb des Schranks durch, um aseptische Bedingungen aufrechtzuerhalten.
  5. Rasieren Sie die Haare auf dem Rücken (3 cm × 4 cm Bereich) und tragen Sie ca. 1 Minute lang Enthaarungscreme auf.
  6. Desinfizieren Sie die Haut dreimal mit Jodlösung und 75%igem Ethanol (Abbildung 1B).
  7. Machen Sie mit sterilen chirurgischen Klingen einen ca. 1 cm langen Schnitt im dorsalen Bereich. Setzen Sie die sterilen Titanimplantate (die in Schritt 2.3 vorbereitet wurden) in die Unterhauttasche ein (Abbildung 1D).
    HINWEIS: Heben Sie die distale Haut des Schnittes mit einer sterilen Pinzette an, um die subkutane Tasche zu bilden.
  8. Injizieren Sie 100 μl S. aureus-Bakteriensuspension (2 × 105 KBE/ml) mit einer sterilen 1-ml-Spritze direkt auf die Titanoberfläche (Abbildung 1E).
  9. Desinfizieren Sie die Haut mit 75%igem Ethanol und legen Sie 3-0 nicht resorbierbare Nähte an, um den Schnitt zu schließen (Abbildung 1F).
  10. Für die subkutane Abszessgruppe erstellen, desinfizieren und vernähen Sie den Schnitt direkt, ohne ein Implantat einzusetzen.
  11. Injizieren Sie 100 μl S. aureus-Suspension (2 × 105 KBE/ml) über den Schnitt mit einer sterilen 1-ml-Spritze.
    HINWEIS: Während der gesamten Verabreichung wurde eine kontinuierliche Injektion mit langsamer Geschwindigkeit beibehalten, um eine schnelle Flüssigkeitsansammlung zu mildern und ein Austreten der Bakteriensuspension zu verhindern.
  12. Überwachen Sie die Atmungsfunktion, bis die Spontanatmung wieder aufgenommen wird, bevor Sie die Tiere in neue IVCs überführen.
  13. Verabreichen Sie Meloxicam (0,02 ml/10 g/Tag) subkutan an drei aufeinanderfolgenden Tagen, um postoperative Schmerzen zu behandeln.
  14. Stellen Sie sicher, dass alle Mäuse ihr volles Gewicht auf ihren Gliedmaßen tragen können, sich uneingeschränkt bewegen und freien Zugang zu Nahrung und Wasser haben.
    HINWEIS: Halten Sie alle behandelten Mäuse in neuen IVCs, um eine Kreuzkontamination mit unbehandelten Mäusen oder alten IVCs zu vermeiden.

4. Postoperative Beobachtungen und Bewertung

  1. Bewertung von Infektionen im peripheren Gewebe
    1. Beobachten Sie täglich den Zustand des dorsalen Schnitts bei jeder Maus und notieren Sie die Beobachtungen an den Tagen 1, 3, 5, 7, 10 und 14.
      HINWEIS: Überwachen Sie die Implantatdislokation; Wenn das Implantat erkannt wird, holen Sie es umgehend für die anschließende Rasterelektronenmikroskopie (REM) heraus.
    2. Euthanasieren Sie die Mäuse durch CO2 -Erstickung, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation an den Tagen 3, 7 und 14. Entnehmen Sie die Implantate und das periphere Gewebe für die weitere Analyse (Abbildung 2).
    3. Rasieren Sie das Rückenhaar und desinfizieren Sie die Haut dreimal mit Jodophor und 75% Ethanol, bevor Sie Gewebe entnehmen.
      HINWEIS: Das Rasieren der Rückenhaare und das Desinfizieren der Wundoberfläche minimiert die Kontamination durch Oberflächenbakterien.
    4. Schneiden Sie die Haut, das Unterhautgewebe und die Muskeln in einem Abstand von 0,5 cm um das Implantat oder die Wunde mit einer sterilen chirurgischen Schere heraus.
      HINWEIS: Sammeln Sie Gewebeproben ohne Größenbeschränkungen, um die Ausbeute zu maximieren. Wiegen und homogenisieren Sie jede Probe mit der gleichen Masse an sterilem PBS, um konsistente g/ml-Einheiten zu erhalten. Unterteilen Sie jede Gewebeprobe längs und gleichmäßig in proximale und distale Segmente für die bakterielle Quantifizierung (proximal) und histopathologische Bewertung (distal).
    5. Geben Sie das entnommene Gewebe in sterile Röhrchen. Geben Sie eine gleiche Masse steriles PBS und drei sterile Mahlkugeln aus Stahl in jedes Röhrchen.
    6. Homogenisieren Sie das Gewebe in drei Zyklen (70 Hz, 60 s Mahlzeit, 20 s Pausenzeit), dann 5 Minuten lang vortexen.
    7. Es werden serielle Verdünnungen des Homogenats (aus Schritt 4.1.6) mit PBS von 101 bis 105 durchgeführt.
    8. 15 μl jedes verdünnten Homogenats auf die dafür vorgesehenen Bereiche der Blutagarplatten tropfen.
    9. Die Platten 24 h lang bei 37 °C ohne Schütteln inkubieren.
      HINWEIS: Teilen Sie jede Blutagarplatte in sechs gleiche Sektoren und wenden Sie serielle Verdünnungen auf die jeweiligen Bereiche an.
    10. Erfassen Sie Bakterienkolonien mit einer Digitalkamera und zählen Sie sie manuell.
  2. Beobachtung von S. aureus auf den Implantaten
    1. An den Tagen 3, 7 und 14 werden die Implantate mit einer sterilen Schere und Pinzette entnommen.
    2. Tauchen Sie die Implantate zur Fixierung 48 h lang in 2,5 % Glutaraldehyd bei 4 °C.
    3. Spülen Sie die Implantate dreimal mit sterilem PBS und dehydrieren Sie sie dann jeweils 10 Minuten lang mit Ethanollösungen (50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 100 %).
    4. Gefriertrocknen Sie die Implantate in einem Gefriertrockner bei -85 °C und einem Vakuumdruck von unter 20 Pa.
    5. Montieren Sie die Implantate mit leitfähigem Klebeband auf einem Probentisch und beschichten Sie sie mit einer 10 nm dicken Goldschicht.
    6. Beobachten Sie die Proben unter REM im Hochvakuum und 1,5 kV. Passen Sie die Vergrößerung nach Bedarf auf mindestens 2500 × an.
  3. Pathologische Analyse des peripheren Gewebes
    1. Entnehmen Sie an den Tagen 3, 7 und 14 nach der Desinfektion der Haut peripheres Gewebe oder wichtige Organe mit einer sterilen Schere.
    2. Tauchen Sie das gesammelte Gewebe 48 h lang in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C zur Fixierung.
    3. Dehydrieren Sie das Gewebe, indem Sie es jeweils 15 Minuten lang in abgestufte Ethanollösungen (50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %) tauchen.
    4. Betten Sie das dehydrierte Gewebe in Paraffin ein und schneiden Sie es mit einem Mikrotom in 4 μm große Scheiben.
    5. Die Schnitte werden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) oder Giemsa unter Verwendung von Standardprotokollen30 gefärbt.
    6. Beobachten Sie die gefärbten Scheiben mit dem quantitativen Analysesystem für Gewebezellen.

Ergebnisse

Ein Modell für subkutane implantatassoziierte Infektionen der Maus wurde mit Hilfe der in dieser Studie beschriebenen Methodik etabliert (Abbildung 1). Alle Mäuse waren innerhalb von 3 Stunden nach dem chirurgischen Eingriff in gutem Zustand, während sich ihre Ernährung, ihr Schlaf und ihre Aktivität am selben Tag wieder normalisierten.

Postoperativ setzten wir die Beobachtung der Wundbereiche auf dem Rücken der beiden Gruppen fort und stellten fest, dass die Bandbreite der subkutanen Abszesse in der implantatassoziierten Infektionsgruppe bis zum Ende des Experiments größer war als in der subkutanen Abszessgruppe (Abbildung 3). Im Vergleich zur Gruppe mit subkutanen Abszessen kam es in der Gruppe der implantatassoziierten Infektionen an Tag 3 zu einer Ruptur, die 4 Tage zuvor aufgetreten war. An Tag 10 zeigten beide Gruppen von Mäusen Anzeichen einer Wundheilung, wobei die Gruppe mit dem subkutanen Abszess an Tag 14 eine ausgeprägtere Erholung zeigte. Im Gegensatz dazu ist die Wunde in der implantatassoziierten Infektionsgruppe, in der einige Mäuse innerhalb von 14 Tagen Titanplatten abgestoßen hatten, noch nicht verheilt, was auf einen schwereren Infektionsgrad hindeutet.

Um den Unterschied im Ausmaß der Infektion zwischen den beiden Gruppen visueller zu unterscheiden, haben wir bei jeder Maus Gewebe von der Infektionsstelle gesammelt. Gewebehomogenatverdünnungen der Infektionsstelle aus beiden Gruppen wurden auf bakterielle Belastung der Blutagarplatten analysiert (Abbildung 4A). Auffällig ist, dass die Menge an infiziertem Gewebe in der implantatassoziierten Infektionsgruppe an den Tagen 7 und 14 nicht tendenziell abnahm, während die Menge an infizierten Gewebebakterien in der Gruppe mit subkutanen Abszessen an den Tagen 3, 7 und 14 sukzessive abnahm (Abbildung 4B). REM-Beobachtungen von Titanplatten, die von Mäusen der implantatassoziierten Infektionsgruppe entfernt wurden, bestätigten die oben genannten Befunde, nämlich dass es bei den Mäusen über einen Zeitraum von 14 Tagen zu einem allmählichen Anstieg der Bakterienzahlen auf den Titanplatten kam (Abbildung 5). Die Giemsa-Färbung zeigte auch, dass die Keimzahlen des infizierten Gewebes in der subkutanen Abszessgruppe an Tag 7 im Vergleich zu Tag 3 signifikant niedriger waren und an Tag 14 weiter abnahmen, wobei es keine Anzeichen für eine Abnahme der Bakterienzahlen in der implantatassoziierten Infektionsgruppe gab (Abbildung 6). So zeigte das implantatassoziierte Infektionsmodell unter einer äquivalenten Infektionsdosis eine schwerere und persistierendere Infektion als das Modell des subkutanen Abszesses.

Eine weitere Analyse der Intensität der Infiltration von Entzündungszellen in das infizierte Gewebe der Mäuse mittels H&E-Färbung zeigte, dass die Gruppe mit subkutanen Abszessen an Tag 7 im Vergleich zu Tag 3 einen geringeren Grad an entzündlicher zellulärer Infiltration und an Tag 14 eine bemerkenswerte Abnahme aufwies (Abbildung 7). Die Infiltration von Entzündungszellen in der Gruppe der implantatassoziierten Infektionen war während des gesamten Zeitraums von 14 Tagen weiterhin hoch. Schließlich ergab die histopathologische Analyse der wichtigsten Organe in der implantatassoziierten Infektionsgruppe, dass alle wichtigen Organe mit unserer Modellierungsmethode im Wesentlichen normal waren und dass es im Vergleich zu normalen Mäusen keine offensichtliche Manifestation von Läsionen im Ergebnis gab (Abbildung 8). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass unsere Modellierungsmethode sehr sicher und zuverlässig ist und sich für die Untersuchung implantatassoziierter Infektionen eignet.

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Abbildung 1: Protokoll des implantatassoziierten Infektionsmodells. (A) Die Anästhesie wurde unter Verwendung eines Inhalationsanästhesiesystems mit Nasenkonusverabreichung aufrechterhalten; Einschub: Induktionsanästhesie über eine Gasinduktionskammer. (B) Die Hautvorbereitung erfolgte durch Rasieren und Desinfizieren der Operationsstelle. (C) Es wurde ein quer verlaufender dorsaler Schnitt mit einer sterilen Klinge vorgenommen. (D) Ein steriles Titanimplantat wurde subkutan durch den Schnitt eingeführt. (E) Eine bakterielle Suspension (2 × 105 KBE/ml) wurde auf die Titanoberfläche aufgetragen, um eine Infektion auszulösen. (F) Die Inzisionsstelle wurde sterilisiert und vernäht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Schematische Darstellung der experimentellen Gruppierung, der Probenentnahme und der Analyseverfahren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Repräsentative Bilder der Inzisionsstellen in beiden Modellen an den Tagen 1, 3, 5, 7, 10 und 14. Maßstab: 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Analyse der Bakterienlast aus peripherem Gewebe. (A) Repräsentative Bilder von Bakterienkolonien aus Spread-Plate-Kulturen an den Tagen 3, 7 und 14. Obere Reihe: Modell des subkutanen Abszesses; Untere Reihe: Modell der implantatassoziierten Infektion. (B) Quantitative Veränderungen der Bakterienlast im Laufe der Zeit in beiden Gruppen. (C) Schematische Darstellung der seriellen Verdünnungsmethode, die für die bakterielle Quantifizierung verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahmen der Titanimplantatoberfläche an den Tagen 3, 7 und 14. Gelbe Kugeln deuten auf S. aureus hin; Der blaue Hintergrund stellt die Titanoberfläche dar. Maßstab: 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Giemsa-Färbung von peripherem Gewebe an den Tagen 3, 7 und 14 in beiden Modellen. Rote Pfeile zeigen Bakterienkolonien an. Maßstab: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) von peripherem Gewebe an den Tagen 3, 7 und 14 in beiden Modellen. Maßstab: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 8: H&E-Färbung wichtiger Organe am Tag 14 im implantatassoziierten Infektionsmodell und an gesunden Kontrollmäusen. Maßstab: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Wie bei allen Tiermodellen erfordern intrinsische immunologische Divergenzen zwischen murinen und menschlichen Reaktionen31 eine vorsichtige Interpretation der Befunde in Bezug auf die klinische Translation. Das Implantatinfektionsmodell stellt eine kontrollierte Simulation dar, die die Komplexität klinischer Szenarien nicht vollständig rekapituliert. Darüber hinaus kann die klinische Heterogenität des Biomaterials (z. B. die Varianz der Zusammensetzung) die bakterielle Pathogenese signifikant modulieren, ein Parameter, der in diesem experimentellen Setting standardisiert ist32.

Während das Mausmodell praktische Vorteile für Voruntersuchungen bietet, müssen seine translationalen Grenzen anerkannt werden. Die Einbeziehung von gealterten (18 Monate alten) oder genetisch adipösen Tieren würde die metabolischen und immunologischen Bedingungen von Patienten, die am anfälligsten für implantatassoziierte Infektionen sind, besser rekapitulieren33,34. Darüber hinaus könnten kontrollierte mechanische Belastungsparadigmen die Lücke zwischen statischen Implantatmodellen und der dynamischen Gelenkumgebung schließen35.

Das derzeitige Modell der subkutanen implantatassoziierten Infektionen erweist sich zwar als nützlich für die Untersuchung der frühen Biofilmbildung, stellt aber mehrere technische Herausforderungen dar, die eine Diskussion rechtfertigen. Was die Variabilität der Infektionsrate betrifft, so spiegelt das beobachtete Spektrum von spontaner Clearance bis hin zu unkontrollierter Ausbreitung wahrscheinlich eine Heterogenität in den Immunantworten des Wirts wider. Um dies zu beheben, könnte eine immunsuppressive Vorbehandlung (z. B. Dexamethason oder Cyclophosphamid) die geschwächte Immunität besser simulieren, die für typische Patienten mit implantatassoziierten Infektionencharakteristisch ist 36, insbesondere für Patienten mit Diabetes oder fortgeschrittenem Alter. Darüber hinaus kann die Implementierung lokaler ischämischer Bedingungen während der Operation durch kurze Gefäßverschlüsse eine konsistentere bakterielle Besiedlung fördern, indem eine vorübergehende hypoxische Mikroumgebung geschaffen wird, die für die mikrobielle Adhärenz günstig ist.

Technische Herausforderungen bei der Visualisierung von Biofilmen, insbesondere das Aufbrechen empfindlicher extrazellulärer Matrizen während der konventionellen REM-Verarbeitung, erfordern methodische Verfeinerungen. Die Einführung von Trocknungstechniken für kritische Punkte stellt eine überlegene Alternative zur Standard-Gefriertrocknung zur strukturellen Erhaltung dar. Komplementäre Ansätze wie die konfokale Mikroskopie mit fluoreszierender Lektinfärbung ermöglichen eine dreidimensionale Biofilmcharakterisierung ohne die Artefakte, die durch Dehydratisierungsprotokolle eingeführt werden37.

Die Vorteile der Beurteilung der implantatassoziierten Infektion sind die Einfachheit des Verfahrens, die hohe Erfolgsquote und die breite Anwendbarkeit. Im Vergleich dazu ist die von Ching-Wen Tseng et al. konstruierte Methode der subkutanen MRSA-Infektion einfacher, aber nicht auf implantatassoziierte Infektionsmodelle anwendbar38. Die von39 konstruierten periprothetischen Gelenkinfektionsmodelle der Maus und das von Benjamin V. Kelley et al. konstruierte Modell für spinale implantatassoziierte Infektionen sind näher an realen klinischen Situationen40. Das Verfahren zum Einsetzen des Implantats erfordert jedoch mehr Übung für einen unerfahrenen Forscher. Diese Modellierungsmethode ist sehr sicher und zuverlässig, ermöglicht eine umfassende Untersuchung pathophysiologischer Mechanismen und unterstützt die Entwicklung diagnostischer Kriterien mit gezielten Therapiestrategien.

Mit Blick auf die Zukunft bietet dieses Modellsystem spannende Möglichkeiten für technologische Innovationen. Die Integration von biolumineszierender bakterieller Verfolgung (über lux-markierte Stämme) würde eine longitudinale Überwachung des Infektionsverlaufs bei lebenden Tieren ermöglichen41. Die Plattform eignet sich besonders gut für die Evaluierung neuartiger antimikrobieller Strategien, einschließlich antibiotikafunktionalisierter Implantatbeschichtungen. Genetische Manipulationsansätze, wie z.B. der gezielte Knockout von Immunsignalwegen (z.B. MyD88-Mangel), könnten wichtige Einblicke in die Wirtsdeterminanten der Biofilmpersistenz liefern. Diese methodischen Fortschritte versprechen, sowohl die Zuverlässigkeit präklinischer implantatassoziierter Infektionsmodelle als auch ihren prädiktiven Wert für die klinische Translation zu verbessern.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Autoren möchten sich für die finanzielle Unterstützung durch die National Natural Science Foundation of China (82102586 bis Z.S., 82272512 to C.Z., 82472463 to C.Z.), das Anhui Provincial Health Research Program (AHWJ2024Aa20445 bis Z.S., AHWJ2024Aa10144 bis C.Z.), die Natural Science Foundation der Provinz Anhui, das Distinguishing Youth Project (2108085J40 bis C.Z.), das Anhui Provincial Key Research and Development Program - Clinical Medical Research Translation Specialization (202304295107020020 bis C.Z.), die China Postdoctoral Science Foundation (2020M671893 bis Z.S.), die Fundamental Research Funds for the Central Universities of China (WK9110000155 bis Z.S., YD9110002053 bis C.Z.), das Anhui Provincial Scientific Research Compilation Project (2022AH051251 bis Z.S., 2022AH010076 bis C.Z.), und die Forschungsfonds des Centre for Leading Medicine and Advanced Technologies des IHM (2023IHM01070 bis C.Z., 2023IHM01074 bis C.Z.). Wir sind auch dankbar für die Unterstützung durch das Core Facility Center for Medical Sciences, das erste angeschlossene Krankenhaus des USTC (Anhui Provincial Hospital). Diese Arbeit wurde teilweise am Instruments Center for Physical Science der University of Science and Technology of China durchgeführt. Wir sind auch dankbar für die Unterstützung des Biosafety Level-2 Laboratory der Core Facility, Institute of Health and Medicine, Hefei Comprehensive National Science Center.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
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1%ige Osmiumtetroxid-LösungBeliebige Fabrikate
2,5%ige Glutaraldehyd-LösungBeliebige Fabrikate
4%ige Paraformaldehyd-LösungBeliebige Fabrikate
75% EthanolBeliebige Fabrikate
Automatisiertes Gramm-FärbesystemBIOMERIEUXPrevi Farbgramm
BiosicherheitswerkbankThermo Fisher Scientific1500
Blut-Agar-PlatteSHIGOUYIKLCP002
EnthaarungscremeVeet
GefriertrocknerEYELAFDU-2110
IsofluranRingpuIsofluran
Niedertemperatur-HochgeschwindigkeitszentrifugeSCILOGEXCF1524R
Mikrobielle Massenspektrometrie-Analyse BIOMERIEUXVITEK MS
Nicht resorbierbare Nähte mit NadelnShanghai JinhuanNr. F308
Paraffi-Schnitte  SystemLeica
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)BioscharfBL302A
RasterelektronenmikroskopHITACHISU8010
Anästhesiegerät für KleintiereRWDR500
SpektralphotometerJINGHUA721
Tert-ButanolBeliebige Fabrikate
TG Panoramic Tissue Cell Quantitative AnalysesystemGewebeGnostikerTISSUEFAXE PLUS
Homogenisator für GewebeIKAT10 basic ULTRA-TURRAX
Tryptische Sojabrühe (TSB)Solarbio GmbHLA0110
Vertikaler eintüriger OszillationsinkubatorSakeziEsci-1020

Referenzen

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