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Methodenartikel

Okuläre therapeutische Verabreichung und fortgeschrittene Gewebeentnahme bei erwachsenen Ratten

1.3K Aufrufe

DOI:

10.3791/68049

23. Mai 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie stellt eine Methodik für die Verabreichung von Therapeutika in die Netzhaut und die Sehnerven der erwachsenen Ratte vor. Darüber hinaus wird eine einzigartige Gewebeentnahmemethode für eine Top-Down-Entnahme des Sehnervs und der Netzhaut bei einer erwachsenen Ratte eingeführt.

Zusammenfassung

Die therapeutische Verabreichung an den hinteren Augenabschnitt, einschließlich der Netzhaut und des Sehnervs, wird durch das Vorhandensein von Blut-Hirn- und Blut-Netzhaut-Schranken erschwert. Kleintiermodelle, wie z. B. Ratten, werden zur Untersuchung verschiedener Augenerkrankungen verwendet. Während die therapeutische Verabreichung an das hintere Auge eine Herausforderung darstellt, ist dies für die Behandlung von Augenerkrankungen unerlässlich, von denen viele eine Validierung in Kleintiermodellen erfordern, um ihre translationale Relevanz zu gewährleisten. Daher werden zwei posteriore therapeutische Verabreichungstechniken vorgestellt: die intravitreale Injektion (IVI) und die retrobulbäre Injektion (RBI) zur Anwendung bei erwachsenen Ratten. Zusätzlich wird ein Verfahren zur en bloc Entfernung der Augen und Sehnerven für verschiedene histologische und molekulare Analysetechniken vorgestellt. Das Dissektionsprotokoll ermöglicht eine vollständige Beobachtung des neurovisuellen Systems bei gleichzeitiger Minimierung der postmortalen Verletzungen des Netzhaut- und Sehnervengewebes. Die erfolgreiche Verabreichung des therapeutischen Cyclosporins an die Netzhaut und den Sehnerv wurde erreicht, wobei vierundzwanzig Stunden nach der Injektion sowohl mit IVI als auch mit RBI nachweisbare Konzentrationen beobachtet wurden. Darüber hinaus wurden erfolgreich En-bloc-Netzhaut- und Nervenproben für die vollständige histologische Gewebeanalyse des Auges extrahiert, was eine umfassende Beobachtung der Netzhaut und des weiteren neurovisuellen Systems ermöglicht.

Einleitung

Die Verabreichung von Therapeutika an die Netzhaut und den Sehnerv ist aufgrund der komplexen Anatomie des Auges 1,2, insbesondere des Vorhandenseins der Blut-Netzhaut-Schranke (BRB)3,4,5, unglaublich schwierig. Der BRB dient dem Schutz der Netzhaut vor einer systemischen Durchblutungsinvasion, ist aber ein schwieriger Gegner der therapeutischen Verabreichung, da der systemische therapeutische Kreislauf häufig durch den BRB blockiert wird 6,7

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Protokoll

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der ophthalmischen und visuellen Forschung durchgeführt und vom institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung an der Ohio State University genehmigt. Für diese Studie wurden männliche Sprague Dawley-Ratten mit einem Gewicht von ~200 g und einem Alter von etwa 2 Monaten verwendet25. Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Intravitreale Injektion (IVI)

  1. Befestige....

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Ergebnisse

Vorläufige Pilotversuche wurden an Leichentieren mit Injektionsfarbstoff (Evans Blue Farbstoff) und Tätowierfarbe (Abbildung 2B) durchgeführt, um die Platzierung und Größe der Nadel sowohl für RBI als auch für IVI zu optimieren. Tätowierfarbe war unverdünnt, und dann wurde Evans Blue Pulver in PBS gemischt, bis die Flüssigkeit undurchsichtig wurde. Wir kamen zu dem Schluss, dass die ideale RBI aus einer 28-G-Nadel bestand, die in einem Winkel auf halbem Weg zwischen 6 und 7 Uhr entlang des u.......

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Diskussion

Die komplizierten Herausforderungen, die mit der Verabreichung von Therapeutika an die Netzhaut und den Sehnerv verbunden sind, vor allem aufgrund der undurchlässigen Barriere, die von der BRB ausgeht, unterstreichen die Bedeutung dieser Studie 3,4. Die Erforschung von IVI- und RBI-Techniken zeigt nicht nur innovative Ansätze zur Überwindung dieser Hindernisse auf, sondern unterstreicht auch die breiteren Auswirkungen auf die Aug.......

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch die Vision Research Program Awards W81XWH-15-1-0074 und W81XWH-22-1-0989 des US-Verteidigungsministeriums finanziert. Die hierin enthaltenen Meinungen oder Behauptungen sind die privaten Ansichten der Autoren und sind nicht als offiziell auszulegen oder als Ausdruck der Ansichten des Armeeministeriums oder des Verteidigungsministeriums auszulegen. Dieses Forschungsstipendium wurde teilweise von der Ohio Affiliate of Prevent Blindness Young Investigator Student Fellowship Award for Females Scholars in Vision Research unterstützt. Wir danken der Ross Foundation für die Unterstützung. Die Dienstleistung....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anakinra 100 mg/0,67 ml SobiNDC: 66658-0234-07
Antipamezolhydrochlorid (Antisedan) 5,0 mg/mlZoetisNADA #141-033 | 107204-8
Bakteriostatisches Natriumchlorid (0,9%)Hospira Inc.NDC: 0409-1966-02
KryoröhrchenVWR76417-258  https://us.vwr.com/store/product?keyword=76417-258
Gebogene PinzetteFischer Scientific 08-953F
Cyclosporin-Injektion 250 mg/ml PerrigoNDC: 00574-0866-10
Cyclosporin, topisch, 0,05% (Restasis) AbbVie (Vizient)NDC: 00023-9163-30
Cyotube KappeThermo Scientific3471BLKhttps://www.fishersci.com/shop/products/screw-cap-microcentrifuge-tube-caps/14755237?searchHijack=true&searchTerm=
Schraubverschluss-Mikrozentrifugen-Röhrchen-Kappen& searchType=Schnell&
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Evans Blue Sigma-AldrichE2129-10G
Eye SpearsFischer Scientific NC0972725https://www.fishersci.com/shop/products/ultracell-pva-eye-spears-100-p/NC0972725
Feine Pinzetten Fischer Scientific 08-953Ehttps://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-dissecting-jewelers-microforceps-2/08953E?gclid=Cj0KCQiAkJO8BhCGARIsAM
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Feine Augenzange mit Zähnen Fisher Scientific50-253-8287https://www.fishersci.com/shop/products/bonn-suturing-forceps-7-5-cm/502538287
Flacher Spatel Fischer Scientific 14-375-100https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-spoonula-lab-spoon/1437510#?keyword=
Heißperlen-Sterilisator Fine Science Tools18000-45https://www.finescience.com/en-US/Products/Instrument-Care-Accessories/Sterilization/Hot-Bead-Sterilizers
Hypromellose 0,3% (GenTeal Tears Severe Dry Eye Gel)  Alcon Laboratories Inc.https://www.amazon.com/GenTeal-Tears-Lubricant-Ointment-Night-Time/dp/B01IN5G1L0/ref=sr_1_4?dib=eyJ2IjoiMSJ9.DxYpqjIIBNO
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ibudilast Millipore SigmaI0157-10MG
Insulinspritze 0,5 ml mit einer 28 Gauge Micro-Fine IV NadelBecton, Dickinson and Company (BD)14-826-79
Isofluran CovetrusNDC: 11695-6777-2
Ketamin CovetrusNDC: 11695-0703-1
Long Evans RatCharles River Laboratories International, Inc.https://www.criver.com/products-services/find-model/long-evans-rat?region=3611
Mayo Schere Elektronenmikroskopie72968-03
Mittlere Mikroskopschere Amazonhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z168866#product-documentation
Medium gerade Hämostaten oder Nadeltreiber Sigma-AldrichZ168866-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z168866#product-documentation
Nadel 33 G mit einer Style 4 Spitze bei einer Länge von 10 mm und einem Winkel von 15 Grad Hamilton7803-05
Paraformaldehyd 4 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (4 % PFA)Thermo Fischer Nr. J61899.
Petrischale Millipore SigmaP5606-400EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5606?utm_source=google&utm_medium=
cpc& utm_campaign=8674694095
& utm_content=105162454052&
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NJQDaI80Yi4FO-iahCsPcaAp9E
EALw_wcB
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Sigma-AldrichP3813-10PAKhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p3813
Povidon-Iod (Betadin) 5% Alcon Laboratories Inc.NDC: 0065-0411-30
Schüttler Modell 3500 VWR89032-092
Kleine Irisschere Sigma-AldrichZ265977-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z265977&
kleine Mikroschere Fisher Scientific17-456-004https://www.fishersci.com/shop/products/self-opening-scissors-2/17456004?keyword=true
Sprague Dawley RatCharles River Laboratories International, Inc.SAS 400https://emodels.criver.com/product/400
Saccharose Millipore Sigma57-50-1https://www.sigmaaldrich.com/US/en/substance/sucrose3423057501
Spritze 10 & Mikro; L (Modell 701 RN)Hamilton80330
Tattoo Tinte (Intenze Tattoo Ink True Black 1 oz)Amazonhttps://www.amazon.com/Intenze-Tattoo-Ink-True-Black/dp/B01GW747L2
Tauuroursodeoxycholsäure (TUDCA) Milipore Sigma580549-1GM
Tetracainhydrochlorid Ophthalmische Lösung 0,5%Bausch & Lomb Inc.NDC: 68682-920-64
Xylazin (Rompun) 100 mg/mlDechraNADA #047-956 |
AK

Referenzen

  1. Nguyen, D. D., Lai, J. -Y. Advancing the stimuli response of polymer-based drug delivery systems for ocular disease treatment. Polym Chem. 11 (44), 6988-7008 (2020).
  2. Tsai, C. -H., et al. Ocular drug delivery: Role of de....

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Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Retrobulb re Injektionintravitreale Injektionposteriore Applikation im AugeSehnervdissektionEn bloc GewebegewinnungKleintiermodellevisuell evoziertes PotenzialImmunfluoreszenzf rbungneuroprotektive Therapeutika