Orthotope Transplantation von Vordergliedmaßen der Ratte

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die mikrochirurgische Machbarkeit der Transplantation von Vordergliedmaßen von Ratten zu demonstrieren. Dieses Modell kann als wichtige translationale Plattform für die VCA-Forschung dienen.

Zusammenfassung

Bei der vaskularisierten Komposit-Allotransplantation (VCA) werden mehrere Gewebetypen transplantiert, darunter Haut, Muskeln, Knochen und Nerven, die eine vielversprechende rekonstruktive Option für Patienten mit schweren traumatischen Verletzungen oder Entstellungen darstellen. Trotz ihres transformativen Potenzials ist VCA auf erhebliche Herausforderungen gestoßen, wie z. B. die Abstoßung von Transplantaten, chronische Immunsuppressionskomplikationen und die Feinheiten der neuromuskulären Erholung.

Wir verwenden ein Modell der Vordergliedmaßen von Ratten als kostengünstige und anatomisch relevante Plattform, um diese Herausforderungen zu bewältigen. Die Vordergliedmaßen der Ratte spiegeln die Anatomie der menschlichen Gliedmaßen genau wider, was die translationale Wirkung unserer Ergebnisse verstärkt. Frühere Studien haben dieses Modell für die zuverlässige und reproduzierbare Messung der funktionellen Wiederherstellung validiert und es damit als Schlüsselinstrument für die Beurteilung der Abstoßungsbahn von Transplantaten der Vordergliedmaßen etabliert.

Darüber hinaus bietet das Modell eine wertvolle Möglichkeit, innovative therapeutische Ansätze zu erforschen und dient als gute translationale Plattform für neuartige Konservierungstechniken. Durch die weitere Untersuchung dieses Modells wollen wir unser Verständnis der Mechanismen hinter der Transplantatabstoßung und der neuromuskulären Wiederherstellung vertiefen. Letztendlich zielt diese Arbeit darauf ab, den Weg für die Verbesserung der klinischen Ergebnisse der VCA zu ebnen, indem sowohl die aktuellen Einschränkungen als auch zukünftige Herausforderungen in der Transplantationsmedizin berücksichtigt werden.

Einleitung

Die vaskularisierte Komposit-Allotransplantation (VCA) ist ein lebensveränderndes Verfahren zur Rekonstruktion schwerer Gewebedefekte. VCA bezieht sich auf die Transplantation eines Verbundgewebes, das aus Haut, Muskeln, Knochen, Bindegewebe, Blutgefäßen und Nerven besteht. Eine weitere Verfeinerung und Erforschung von VCA-Techniken würde Patienten, die traumatische Verletzungen oder Entstellungen erleiden, zutiefst zugute kommen¹. Seine breitere Anwendung wird jedoch durch anhaltende Hürden wie die Abstoßung von Transplantaten, Komplikationen durch langfristige Immunsuppression, die neuromuskuläre Genesung und die Logistik während der Transplantation erschwert.

Das Modell der Vordergliedmaßen der Ratte hat sich aufgrund seiner Kosteneffizienz und seiner großen Ähnlichkeit mit den anatomischen und neuromuskulären Merkmalen des Menschen als bevorzugte Wahl für VCA-Studien erwiesen ^2,3. Unsere früheren Arbeiten haben gezeigt, dass dieses Modell ein zuverlässiges und reproduzierbares Mittel zur Bewertung der verhaltensfunktionellen Erholung darstellt⁴. In dieser Studie präsentieren wir eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung zu den wesentlichen mikrochirurgischen Techniken, die für dieses Modell erforderlich sind.

Im Zuge der Weiterentwicklung der VCA-Forschung wird das Modell der Vordergliedmaßen der Ratte eine mechanistische Untersuchung des Abstoßungsprozesses, der Nervenregeneration und der neuromuskulären Funktionswiederherstellung ermöglichen. Die Forscher könnten neue Konservierungstechniken erforschen, die Wirksamkeit von maschinellen Perfusionsmethoden bewerten und neue immunmodulatorische Therapien testen, die dazu beitragen könnten, die derzeitige Abhängigkeit von langfristiger Immunsuppression zu verringern.

Protokoll

Chirurgische Eingriffe wurden gemäß den vom Animal Care and Use Committee (RA18M74) der Johns Hopkins University genehmigten Protokollen gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health und der American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care durchgeführt.

1. Verfahren für Spender (Abbildung 1)

1. Führen Sie die Einleitung der Anästhesie durch Inhalation von Isofluran in einer Konzentration von 5 % durch und halten Sie sie während des gesamten Eingriffs bei 1 %. Starten Sie den Eingriff, nachdem Sie die genaue Anästhesiestufe durch Zehenkneifen bestätigt haben.
2. Machen Sie einen umlaufenden Schnitt ca. 1 cm über dem Ellenbogen. Teilen Sie die Haut und legen Sie das darunter liegende oberflächliche Unterhautgewebe frei, ohne es zu beschädigen (Abbildung 1A).
3. Präparieren Sie das Unterhautgewebe/die Faszie, kauterisieren Sie alle oberflächlichen Gefäße und transektieren Sie. Anschließend werden der Deltamuskel, ein Teil des großen Brustmuskels und der Trizeps brachii freigelegt.
4. Präparieren Sie stumpf unter dem Musculus pectoralis major und legen Sie die brachialen Gefäße sowie den Nervus medianus und den Nervus ulnaris frei (Abbildung 1B).
5. Verätzen Sie die oberflächliche Vene am Deltamuskel und transektieren Sie proximal, dann durchschneiden Sie den Deltamuskel senkrecht zur Ausrichtung der Muskelfaser. Präparieren und durchtrennen Sie anschließend den Pectoralis major und minor, wobei die Achselarterie, die Vene und der Nerv zum Vorschein kommen. (Abbildung 1C).
6. Durchschneiden Sie den Nervus medianus, den Nervus ulnaris und den Nervus radialis an ihrem proximalen Ende (direkt nach dem Spalt) und bewahren Sie dabei so viel Länge wie möglich.
7. Präparieren und befreien Sie die Arteria brachialis und die Vene.
8. Durchschneiden Sie den Bizeps brachii, den triceps brachii und den Musculus latissimus dorsi. Stellen Sie sicher, dass der Humerus nach Abschluss der Dissektion ordnungsgemäß freigelegt ist.
9. Verwenden Sie eine Rongeurzange, um den Knochen distal zum Tuberositas deltoideus des Humerus zu durchtrennen.
10. Untersuchen Sie vorsichtig das Lumen der Arteria brachialis und der Vene (Abbildung 1C). Spülen Sie das Transplantat mit 6 ml heparinisierter Kochsalzlösung.
11. Montieren Sie die Polyimidmanschette sowohl an der Arteria brachialis als auch an der Vene (Abbildung 1D).
12. Wickeln Sie das Transplantat mit nasser Baumwollgaze ein und lagern Sie es bei 4 °C.
13. Euthanieren Sie die Spenderratte durch eine Überdosis Inhalationsanästhetikum (Isofluran). Sobald Sie nicht mehr auf ein Zehenklemmen reagieren, führen Sie eine Thorakotomie durch und entfernen Sie das Herz.

2. Verfahren für den Empfänger (Abbildung 2)

1. Führen Sie die Einleitung der Anästhesie durch Inhalation von Isofluran in einer Konzentration von 5 % durch und halten Sie sie während des gesamten Eingriffs bei 1 %. Bestätigen Sie den Status der Narkose durch Zehenkneifen.
2. Machen Sie einen umlaufenden Schnitt ca. 1-2 cm über dem Ellenbogen.
3. Präparieren Sie die subkutanen Gefäße und kauterisieren Sie größere Gefäße, um den Deltamuskel, einen Teil des großen Brustmuskels und den Musculus triceps brachii freizulegen.
4. Führen Sie eine stumpfe Dissektion unterhalb des Musculus pectoralis major durch, um die brachialen Gefäße sowie den Nervus medianus und den Nervus ulnaris freizulegen.
5. Der Deltamuskel und ein Teil des Musculus pectoralis major und minor werden an ihrem distalen Ende durchtrennt, wobei die Brachialgefäße, der Nervus medianus und der Nervus ulnaris freigelegt werden (Abbildung 2A).
6. Präparieren und durchtrennen Sie den Nervus medianus und den Nervus ulnaris an ihrem distalen Ende. Ligate alle Gefäßäste (Abbildung 2B).
7. Durchschneiden Sie den Musculus bizeps brachii, den triceps brachii und den Musculus latissimus dorsi, um den Humerus freizulegen. Kauterisieren Sie vorsichtig alle Blutungen aus den durchtrennten Muskeln.
8. Durchschneiden Sie den Humerus an der Tuberositas deltoideus. Verwenden Sie Knochenwachs, um die Markhöhle zu versiegeln.
9. Verwenden Sie einen Markstab, um die Knochenmarkhöhle des Spenders und des Empfängers wieder zu verbinden, und verwenden Sie dann Knochenwachs, um die Verbindung zu versiegeln. Vernähen Sie den Musculus triceps brachii mit einer resorbierbaren Naht 6-0 und schaffen Sie so eine Plattform für die Gefäßanastomose.
10. Führen Sie eine epiperineurale Neurorrhaphie mit unterbrochener 10-0-Naht des Nervus radialis durch.
11. Die Gefäßanastomose wird mit einer nicht nahtbaren Manschettentechnik durchgeführt (Abbildung 2C).
12. Führen Sie eine epiperineurale Neurorrhaphie mit unterbrochenen 10-0-Nähten durch, um den Nervus medianus und den Nervus ulnaris wieder zu verbinden (Abbildung 2D).
13. Verbinden Sie den Deltamuskel und den Musculus pectoralis major mit unterbrochenen Nähten.
14. Verschließen Sie die Wunde mit 4-0 nicht resorbierbarem Nahtmaterial.
15. Verabreichen Sie am Ende der Operation eine warme, sterile Kochsalzlösung in einer Menge von 2 % des Körpergewichts subkutan.
16. Beobachten Sie das Tier mindestens 4 Stunden lang unter einer Wärmelampe, um sich zu erholen. Bringen Sie es in die Tierhaltung zurück, sobald es wach ist, sich aufrichten kann, koordinierte Bewegungen demonstriert und selbstständig Wasser und Futter beschafft.

3. Langfristiges Management nach der Transplantation

1. Überwachen Sie die Tiere täglich auf Anzeichen von Schmerzen und Beschwerden, wie unten definiert.
   1. Überprüfen Sie, ob Magersucht durch das Fehlen von Kot im Käfig angezeigt wird.
   2. Prüfen Sie, ob das Tier kein Wasser trinkt, was zu einer Dehydrierung führt, die sich in der Zeltbildung der Haut zeigt.
   3. Prüfen Sie, ob das Tier gebeugt ist, sich nicht bewegen will, ein Glied bevorzugt oder die Schnittstelle bewacht.
   4. Prüfen Sie, ob das Tier nicht gepflegt wird, was sich in einem zerzausten oder schmutzigen Fell widerspiegelt.
   5. Prüfen Sie, ob das Tier übermäßig leckt/kratzt. Überprüfen Sie die Inzisionsstelle auf Rötungen und Schwellungen und Selbstverstümmelung.
   6. Achten Sie auf aggressives Verhalten, insbesondere wenn Sie versuchen, das Tier hochzuheben.
   7. Prüfen Sie, ob das Tier hechelt, Atembeschwerden hat und rötlich-braunen Nasen-/Augenausfluss hat.
   8. Prüfen Sie, ob es sich um eine Sepsis handelt.
2. Entfernen Sie die Nähte 14 Tage nach der Operation.
3. Verabreichen Sie eine zweite Dosis Buprenorphin SR (Rattendosis: 1,0 mg/kg SC) am postoperativen Tag 2 (POD2; 48 h nach der Anfangsdosis).
4. Beginnen Sie mit einer wöchentlichen Funktionsbewertung in Woche 4 nach der Transplantation.
   1. Fixieren Sie kurz unter Vollnarkose die Vordergliedmaße des Tieres in einer 90°-Abduktion. Platzieren Sie zwei Nadelelektroden im Abstand von 1 mm in der Achselhöhle in der Nähe des Ansatzes des großen Brustmuskels auf dem Oberarmknochen.
   2. Stimulieren Sie den proximalen Nervus medianus perkutan bei 10 V, um eine maximale tetanische Kontraktion der Flexoren zu induzieren.
   3. Sobald die vollständige digitale Beugung einen Griff bildet, platzieren Sie eine Metallschlaufe, die mit einem Kraftmesser verbunden ist, auf der Handfläche und befestigen Sie sie in den gebeugten Fingern. Ziehen Sie dann am Kraftmesser, bis der Griff verloren geht, und zeichnen Sie die maximale Kraft (in Newton) auf.

Ergebnisse

Das Überleben des Transplantats kann durch makroskopische Beobachtung überwacht und bestimmt werden. Repräsentative Bilder sowohl der kurzfristigen (POD7) als auch der langfristigen Nachbeobachtung (POD120) sind in Abbildung 3 dargestellt. Das Transplantat konnte sich ohne erkennbare Anzeichen einer Nekrose erholen. Die Überlebensdaten sind in Abbildung 4 dargestellt. Sowohl Haut- als auch Muskelproben werden am vorgesehenen Endpunkt entnommen. Repräsentative hi...

Diskussion

Die orthotope Transplantation der Vordergliedmaßen bei Ratten ist ein häufig verwendetes Modell in der experimentellen rekonstruktiven Transplantation, da es nicht nur vaskularisiertes Kompositgewebe enthält, sondern auch die Beurteilung der funktionellen Wiederherstellung ermöglicht. Eine konventionelle Nahttechnik zur Gefäßanastomose ist hochkomplex und erfordert fortgeschrittene mikrochirurgische Fähigkeiten, die eine jahrelange mikrochirurgische Ausbildung erfordern. Um den Zeit- und...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10-0 Unsterile Mikronaht	AROSurgical	TK-107038
4-0 Sharpoint Nylon Schwarze	Proben	A1667N
4-0 Sharpoint Polysyn Taper	Spiralen	G214N
5 mL Spritzen	MDC	2045
6-0 Seide	Fisher Scientific	NC9742105
ABB-22 V Doppel-Mikrogefäß	S& T	00480
B-1 V Einzel-Mikrogefäßklemme	S& T	00462
BD Quincke Spinal	Nadelaufsätze	405073
Castroviejo Micro Nadelhalter	F.S.T	12061-02
Chatilon DFE II Kraftmessgerät	Ametek	DFE II Serie
Baumwollspitze	JH Supply Store	100252
Feine Schere - Wolframkarbid	F.S.T	14569-09
Pinzette	S & T	FRS-15 RM-8
Mullschwämme	Fisher Scientific	22-362178
Halsted-Mosquito Hämostaten	F.S.T	13009-12
Heparin	JHH Apotheke	NDC 63323-540-05
I.V. Katheter röntgendicht 24 G	Eutungen	SMTH5053
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