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Methodenartikel

Inselartige Zellen aus duktaler Zelltransplantation in Ratten

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DOI:

10.3791/68066

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1. August 2025

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1Department of Physiology, Ankara Medipol University Faculty of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Inselähnliche Zellen, die aus duktalen Zellen gewonnen werden, zeigen Potenzial für die Behandlung von Diabetes, indem sie den Blutzuckerspiegel senken und die Insulinproduktion bei diabetischen Ratten erhöhen. Dennoch gibt es nach wie vor Herausforderungen bei der Gewährleistung einer ausreichenden Zellfunktion, der immunologischen Abwehr und der Sicherheit. Zusätzliche Untersuchungen sind erforderlich, um die therapeutische Kapazität dieser Substanzen zu verbessern.

Zusammenfassung

Die Verwendung von inselartigen Zellen, die aus duktalen Zellen gewonnen werden, hat sich als potenzieller Ansatz für die Behandlung von Typ-1-Diabetes herausgestellt. Diabetiker haben eine unzureichende Insulinsynthese in ihrem Körper aufgrund der autoimmunen Zerstörung von Betazellen der Bauchspeicheldrüse, die für die Insulinproduktion verantwortlich sind. In diesem Rahmen besteht das Ziel der Inselzelltransplantation darin, die Fähigkeit der Patienten, Insulin zu produzieren, wiederherzustellen. Hindernisse wie die unzureichende Gewinnung von Inselzellen aus der Spenderbauchspeicheldrüse und Immunreaktionen behindern jedoch eine breite Anwendung dieser Therapiemethode. Unter bestimmten Umständen besitzen duktale Zellen der Bauchspeicheldrüse die Fähigkeit, sich in Zellen zu verwandeln, die Insulin produzieren. Diese Zellen könnten in einer kontrollierten Umgebung kultiviert und in inselartige Zellen umgewandelt werden, die die Fähigkeit haben, Insulin freizusetzen, was sie für eine Transplantation geeignet macht. Diese innovative Strategie bietet das Potenzial, das Fortschreiten von Typ-1-Diabetes zu stoppen und die Abhängigkeit von Insulininjektionen zu verringern. In dieser Studie wurden inselähnliche Zellen, die von duktalen Zellen abgeleitet wurden, durch die Pfortader der Leber bei Streptozotocin-induzierten diabetischen Ratten in die Leber transplantiert. Nach der Transplantation stellten wir eine erhebliche Senkung des Blutzuckerspiegels der Ratten ab Tag 5 fest, die 15 Tage lang anhielt. Darüber hinaus zeigte ein intraperitonealer Glukosetoleranztest (IPGTT), dass diabetische Ratten, die die inselartigen Zelltransplantate erhielten, signifikant mehr Insulin produzierten als die Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass inselartige Zellen, die aus duktalen Zellen gewonnen werden, ein vielversprechender Therapieansatz für Diabetes sein könnten. Zu den Haupthindernissen in diesem Forschungsgebiet gehören das Erreichen einer ausreichenden Funktionsfähigkeit der Zellen, die Abschirmung vor dem Immunsystem und die Gewährleistung ihrer Sicherheit für die therapeutische Anwendung. Zukünftige Studien haben das Potenzial, entscheidende Erkenntnisse für die Optimierung des Einsatzes dieser Zellen in therapeutischen Umgebungen zu liefern, wobei der Schwerpunkt auf der Verbesserung der Wirksamkeit und Sicherheit liegt.

Einleitung

Typ-1-Diabetes ist eine anhaltende Autoimmunerkrankung, die durch die Zerstörung von Betazellen in der Bauchspeicheldrüse gekennzeichnet ist, die Insulin produzieren. Die derzeitigen Behandlungen umfassen meist eine langfristige Insulintherapie, die zwar den Blutzuckerspiegel erfolgreich kontrolliert, aber keine Heilung für die Erkrankung darstellt oder ihr Fortschreiten aufhält1. Die Erforschung alternativer Therapien für Typ-1-Diabetes ist motiviert durch die Notwendigkeit wirksamerer Alternativen als die bisherige Schwerpunktsetzung auf die Insulinbehandlung. Daraus wurde die laufende Forschung angeregt, die sich auf alternative Behandlungen wie die Inselzelltransplantation konzentriert, die darauf abzielt, die körpereigene Fähigkeit, Insulin zu produzieren, wiederherzustellen. Die Tatsache, dass gespendete Inselzellen schwer zu bekommen sind und die Möglichkeit einer immunologischen Abstoßung besteht, hat es jedoch schwierig gemacht, dass diese Behandlung in großem Umfang eingesetzt wird. Infolgedessen ist die wissenschaftliche Gemeinschaft zunehmend daran interessiert, alternative Quellen für Zellen zu finden, die Insulin produzieren 1,2,3.

Mit dieser Methode soll das Regenerationspotenzial dieser Zellen genutzt werden, um eine nachhaltige Versorgung mit insulinsekretierenden Zellenzu etablieren 4. In-vitro-Untersuchungen haben gezeigt, dass diese duktalen Zellen in der Lage sind, sich in funktionelle Beta-ähnliche Zellen umzuwandeln, die in der Lage sind, als Reaktion auf Glukosestimulation Insulin zu sekretieren5. Diese Fragestellung ist besonders wichtig, wenn man bedenkt, dass die Ergebnisse der konventionellen Inseltransplantation aufgrund der komplizierten Immunreaktionen ungünstig sind. Zahlreiche Studien deuten darauf hin, dass duktale Zellen nicht nur die intrinsische Fähigkeit haben, Insulin zu erzeugen, sondern auch Eigenschaften aufweisen können, die die Immuntoleranz fördern könnten, wodurch einige Herausforderungen im Zusammenhang mit traditionellen Transplantationstechniken gemildert werden 5,6,7,8. Diese Zellen können außerhalb des Körpers kultiviert, in Zellen umgewandelt werden, die Inselzellen ähneln, die Insulin freisetzen können, und anschließend in Menschen mit Diabetes implantiert werden. Präklinische Untersuchungen, die Experimente mit Streptozotocin-induzierten diabetischen Ratten umfassten, haben gezeigt, dass die Transplantation dieser Zellen den Blutzuckerspiegel effektiv senken und die Insulinsekretion verbessern kann9.

Unser Ansatz konzentrierte sich auf die Beschleunigung des Differenzierungsprozesses und die Verbesserung der Funktionalität insulinproduzierender Zellen durch die Erweiterung des Standard-Zellkulturmediums mit Insulin-Transferrin-Selen (ITS)10,11,12, Isoxazol 9 (ISX-9)13,14 und GLP-115. Es wird berichtet, dass diese Faktoren wesentlich für die Erleichterung der Pankreasdifferenzierung und die Verbesserung der Insulinsekretion sind. Die Integration dieser Komponenten zielte darauf ab, funktionsfähige inselartige Zellen effizienter zu erreichen und ihre Fähigkeit zur Produktion und Freisetzung von Insulin als Reaktion auf die Glukosestimulation sicherzustellen 9,10,11,12,13,14.

Bei der Inseltransplantation stellt die Immunabstoßung ein erhebliches Hindernis für erfolgreiche Ergebnisse dar. Allogen transplantierte Inselzellen sind anfällig für Immunangriffe, so dass immunsuppressive Therapien erforderlich sind, um eine Abstoßung abzuwenden16,17. Die Beteiligung von duktalen Zellen der Bauchspeicheldrüse an der Immunabstoßung während der Inseltransplantation stellt ein sich entwickelndes Forschungsgebiet dar. Es wird angenommen, dass duktale Zellen Eigenschaften haben könnten, die die Immunabstoßung verringern könnten, was das Überleben und die ordnungsgemäße Funktion transplantierter Inselzellen wahrscheinlicher machen würde. Ilieva et al. zeigten, dass Inselzellen, die mit duktalen Zellen kokultiviert wurden, eine reduzierte zentrale Nekrose und Apoptose aufwiesen, was auf eine schützende Wirkung gegen immunvermittelte Schäden hinweist. Dieser Effekt kann durch Faktoren wie den insulinähnlichen Wachstumsfaktor 2 (IGF-2) vermittelt werden, der von duktalen Zellen sezerniert wird, wie Marín-Cañas et al. (2019)18 festgestellt haben. Die protektive Wirkung ist essentiell, da die Immunabstoßung eine erhebliche Herausforderung für den Erfolg der Inseltransplantation darstellt, insbesondere bei Typ-1-Diabetes. Duktale Zellen in Inseltransplantaten wurden mit einer verbesserten Transplantatfunktion und einem verbesserten Überleben in Verbindung gebracht, was wahrscheinlich auf ihre Fähigkeit zurückzuführen ist, immunmodulatorische Faktoren zu sezernieren, die die Immunantwort abschwächen19.

Trotz der vielversprechenden Fortschritte müssen einige Hürden genommen werden, um die operative Wirksamkeit und Sicherheit dieser zellbasierten Therapien für den klinischen Einsatz zu gewährleisten. Es ist wichtig, zu überprüfen, ob die induzierten Zellen funktionelle Eigenschaften aufweisen, die mit nativen Betazellen vergleichbar sind, und wirksame Techniken zum Schutz dieser Zellen vor Angriffen des Immunsystems zu entwickeln, um ihr längeres Überleben und ihre Funktionalität zu gewährleisten20,21. Im weiteren Verlauf dieses Forschungsbereichs werden umfassende Kenntnisse und die Beseitigung dieser Hindernisse unerlässlich sein, um das Versprechen von insulinproduzierenden Zellen aus duktalen Zellen bei der Behandlung von Typ-1-Diabetes zu nutzen 22,23,24.

Ziel dieser Studie ist es, die in vivo Wirksamkeit von aus duktalen Zellen gewonnenen inselartigen Zellen, die unter optimalen Bedingungen entwickelt wurden, für die Wiederherstellung der glykämischen Kontrolle in einem Streptozotocin-induzierten diabetischen Rattenmodell zu bewerten.

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Protokoll

Diese Studie entsprach den ARRIVE-Empfehlungen und stellte sicher, dass das Design, die Durchführung und die Berichterstattung der Forschung hohen Standards für Tierschutz und experimentelle Integrität (https://arriveguidelines.org) entsprachen. Die Medipol-Universität Ankara erhielt die Genehmigung der Ethikkommission (AMUHADYEK-12- 09.05.2025) und die institutionelle Genehmigung. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den geltenden Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Es wurden alle Maßnahmen ergriffen, um das Leiden der Tiere zu minimieren und die Mindestanzahl von Tieren zu beschäftigen, die zur Erreichung der wissenschaftlichen Ziele erforderlich ist.

1. Herstellung von Lösungen

  1. Enzymlösung: Bereiten Sie eine Kollagenaselösung mit 50 mg pulverisierter Clostridium histolyticum-Kollagenase Typ V vor. Bereiten Sie eine 50-ml-Lösung vor, indem Sie Kollagenase mit HBSS (Ca-Mg-haltig) kombinieren, um eine Konzentration von 1 mg/ml zu erreichen. Verwenden Sie 7 mL der Lösung pro Probe und stellen Sie den Rest bei -20 °C in den Gefrierschrank.
    HINWEIS: Die empfohlene Konzentration der Kollagenase beträgt 1 mg/1 ml. Bevor die Kollagenase in die Spritzen gezogen wird, muss sie mit der vorgefertigten HBSS-Lösung bis zu einer Konzentration von 1 mg/ml gemischt werden.
  2. Waschlösung 1: Entnehmen Sie 62,5 mL aus 500 mL phenolrotfreiem HBSS. Geben Sie sehr vorsichtig 50 mL FBS zu den verbleibenden HBSS. Fügen Sie 5 ml Penicillin/Streptomycin (P/S), 5 ml L-Glutamin (L-Gln) und 2,5 ml 1 M HEPES hinzu. Bringen Sie das Volumen auf 500 ml.
    HINWEIS: Unter Zusatz von Phenolrot besteht das Endvolumen aus 88 % HBSS, 10 % FBS, 1 % P/S und 1 % l-Gln. Um Schaumbildung zu verhindern und die Genauigkeit zu gewährleisten, arbeiten Sie das fötale Rinderserum Schritt für Schritt vorsichtig ein.
  3. Nährmedium für Zellen und Waschlösung 2: Entnehmen Sie 62,5 mL aus 500 mL Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI w/L-Gln). Seien Sie vorsichtig, um zu verhindern, dass das FBS während der allmählichen Zugabe von 50 ml zum verbleibenden RPMI schäumt. Fügen Sie 2,5 ml 1 M HEPES, 5 ml P/S und 5 ml L-Gln hinzu und stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 500 ml beträgt. Bei 4 °C lagern.
  4. Dichtegradientenlösungen: Bereiten Sie die endgültigen Dichtelösungen vor, indem Sie die Dichtelösung mit 1100 mg/ml mit HBSS-Lösung verdünnen, um einen mittleren Dichtebereich von 1062-1096 mg/ml zu erhalten. Um die Genauigkeit zu gewährleisten, überprüfen Sie mit einem Densitometer die Dichte jeder vorbereiteten Lösung. Verwenden Sie die Konzentrationslösung 1077 als Referenz. Sobald die gewünschten Konzentrationen (1062-1096 mg/ml) erreicht sind, werden die Lösungen in luftdichte Behälter umgefüllt und an einem dunklen Ort bei 4 °C gelagert, um ihre Stabilität zu erhalten.
  5. Bereiten Sie eine 0,4%ige Trypanblau-Lösung vor. Die Zellentwicklung wird durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) gefördert, die einen pH-Wert von 7,4 hat.
  6. Zellkulturwachstumsmedium: Kombinieren Sie jeweils 43,4 ml Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM-niedriger Glukosegehalt). Fügen Sie 10 % fötales Kälberserum (FCS), 1 % Insulin-Transferrin-Selen (ITS), 1 % L-Glutamin (L-Gln), 1 % Penicillin-Streptomycin (P/S) und 0,2 ml 1 M HEPES hinzu. Füllen Sie das endgültige Volumen auf 100 ml auf. Bei 4 °C lagern.
  7. Zellkultur-Differenzierungsmedium: Fügen Sie 43,4 mL RPMI mit 43,4 mL DMEM-niedriger Glukose hinzu. Fügen Sie der Mischung 10 % FCS, 1 % Insulin-Transferrin-Selen (ITS), 1 % L-Gln, 1 % P/S und 0,2 ml 1 M HEPES hinzu. Des Weiteren wird dem Differenzierungsmedium 1 μl Isoxazol 9 (ISX-9) zugesetzt, verdünnt in 4 ml Ethanol. Geben Sie abschließend 24 μl einer Glucagon-like Peptide 1 (GLP-1)-Lösung in einer Konzentration von 50 nM in das Zellkulturmedium.
    HINWEIS: ISX-9 und GLP-1 werden nur bei Kulturänderungen frisch hinzugefügt. Sie sind vorbereitet. Für jegliches Kulturmaterial ist eine frische Zubereitung erforderlich.
  8. Dithizon (DTZ)-Lösung: 100 mg Dithizon in 20 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen und gut mischen. Geben Sie 30 ml HBSS in die resultierende Lösung und rühren Sie, bis eine homogene Mischung entsteht. Filtern Sie die Lösung mit 0,2- oder 0,4-μm-Filtern. Geben Sie 50 ml HBSS in die gefilterte Lösung. Beschriften Sie die Lösung mit dem Datum der Zubereitung. Sobald die Feststoffe vollständig abgebaut sind, wird die Lösung durch eine 0,4-μm-Filtervorrichtung geleitet. Geben Sie die gefilterte Lösung in 2-ml-Röhrchen und verwenden Sie sie sofort, nachdem sie aufgetaut sind. Bewahren Sie die hergestellte Lösung bei -20 °C auf.
  9. Krebslösung: In einem 250-ml-Behälter 1,68 g Natriumchlorid (für 115 mM), 0,50 g Natriumbicarbonat (für 24 mM), 0,09 g Kaliumchlorid (für 5 mM), 0,05 g Magnesiumchlorid (für 1 mM), 0,09 g Calciumchlorid (für 2,5 mM) und 0,25 g Rinderserumalbumin (für 0,1%) hinzufügen. Fügen Sie 6,25 ml 1 M HEPES hinzu. Stellen Sie das Volumen auf 250 mL ein, indem Sie entionisiertes Wasser hinzufügen und rühren, bis alles vermischt ist. Stellen Sie den pH-Wert auf einen Bereich von 7,3 bis 7,5 ein, indem Sie entweder 1 M NaOH oder 1 M HCl verwenden. Filtrieren Sie durch einen 0,22 μm Filter. Lagern Sie die Lösungen bei Raumtemperatur. In einem Wasserbad bei 37 °C die Lösungen zugeben, wenn sie gebrauchsfertig sind.
  10. Lösung mit hoher Glukosekonzentration: Messen Sie 149,1 mg D-(+)-Glukose und geben Sie sie in ein Röhrchen. Geben Sie 50 mL Krebslösung in das Röhrchen und mischen Sie es gründlich durch Schütteln. Filtern Sie durch einen 0,22 μm Filter.
  11. Lösung mit niedriger Glukosekonzentration: Kombinieren Sie 1 ml 16,7 mM Lösung mit hoher Glukosekonzentration mit 9 ml Krebslösung.

2. Isolierung der Bauchspeicheldrüse von Ratten

  1. Beginnen Sie mit einer Kohorte von drei Wistar Albino-Laborratten (3 Monate alt/männlich) mit einem Gewicht zwischen 220 g und 280 g. Betäuben Sie die Tiere mit einer Kombination aus Ketamin (35-50 mg/kg) und Xylazin (5-10 mg/kg). Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie anhand des Fehlens der Pedalentzugsreaktion. Tragen Sie Tiersalbe auf die Augen auf, damit sie nicht austrocknen.
  2. Beginnen Sie den chirurgischen Prozess mit einem 3-4 cm langen Bauchschnitt entlang der Linea alba mit einer Schere. (Abbildung 1A). Führen Sie eine vorsichtige Manipulation der Leber durch, indem Sie mit den Fingern sanften physischen Druck auf den Brustkorb ausüben, um das Zwerchfell anzuheben. Äußere die Leber und positionieren Sie sie zur Stabilität auf steriler Gaze.
  3. Bereiten Sie eine standardisierte Kollagenaselösung in einer Dosierung von 28 mg/g Körpergewicht vor und ziehen Sie 7 ml (ca. 7 g) in die Spritze für Ratten mit einem Gewicht zwischen 250 und 300 g. Ändern Sie das Lösungsvolumen basierend auf dem Körpergewicht jedes Tieres.
  4. Schneiden Sie den Pankreasgang ein. Schneiden Sie mit einer feinen Gefäßschere den Kanal in der Nähe der Leber durch. Verwenden Sie anatomische Positionen relativ zur Bauchspeicheldrüse und den umgebenden Gefäßen, um den Gang zu identifizieren. Verwenden Sie Standorthinweise wie nahe gelegene Blutgefäße und Gewebemerkmale, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Machen Sie an dieser Stelle einen perfekten Schnitt für die Okklusion.
    HINWEIS: Der Schnitt war minimal - zu klein, um genau gemessen zu werden - aber breit genug, um das Einführen des Katheters zu ermöglichen. Der Schnitt ermöglicht eine reibungslose und effiziente Platzierung des Katheters und gewährleistet ein minimales Trauma für das umgebende Gewebe.
  5. Legen Sie einen Katheter mit integrierter Schiene in die generierte Kanalöffnung ein (Abbildung 1B). Befestigen Sie den Katheter nach korrekter Platzierung mit einer chirurgischen Klemme (z. B. Mikrozange), um ein Verschieben zu vermeiden.
  6. Verabreichen Sie die enzymatische Kollagenaselösung durch kontrollierte Infusion durch allmähliche, absichtliche Kolbensenkung.
  7. Trennen Sie nach dem Aufblasen das Bauchspeicheldrüsengewebe mit feinen chirurgischen Instrumenten vorsichtig von den umgebenden Strukturen. Führen Sie die Exzision schnell und mit präzisen und sanften Manövern durch, um Gewebeschäden zu minimieren. Legen Sie die Bauchspeicheldrüse unmittelbar nach der Entnahme in ein 50-ml-Röhrchen auf Eis, um jegliche Enzymaktivität zu stoppen.
  8. Der gesamte Prozess sollte für eine Bauchspeicheldrüse etwa 60 s dauern25. Bewahren Sie außerdem die Kollagenase und die entfernten Bauchspeicheldrüse auf Eis auf, bis alle Bauchspeicheldrüsen angeschwollen sind.

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Abbildung 1: Pankreasverarbeitung. (A) Durch Einklemmen der Pankreasgangöffnung in den Zwölffingerdarm und (B) Kollagenase Typ 5 führt das Aufblasen eines Bildes der Bauchspeicheldrüse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3 Isolierung duktaler Zellen aus Pankreasgewebe

  1. Nach der chirurgischen Extraktion wird die Bauchspeicheldrüse in einem 37 °C warmen Wasserbad für 12 Minuten inkubiert.
  2. Geben Sie 25 ml Waschlösung 1 in das Röhrchen, um die Kollagenaseaktivität zu neutralisieren. Schütteln Sie das Röhrchen manuell, um den Abbau von Bauchspeicheldrüsengewebe zu fördern. Führen Sie alle nachfolgenden Eingriffe unter einem sterilen Feld mit laminarer Strömung durch.
  3. Bewahren Sie alle Medien auf Eis auf. Zentrifugieren Sie die Proben bei 4 °C bei 100 x g für 1 min und stellen Sie die Bremse auf die maximale Stufe. Entsorgen Sie den Überstand. Geben Sie 25 mL Waschlösung 1 in das Zellpellet und resuspendieren Sie die Mischung.
  4. Die Zentrifugation wird erneut durchgeführt und der Überstand entsorgt. Geben Sie 25 mL Waschlösung 1 in das Pellet und resuspendieren Sie es. Das aufbereitete Pankreasgewebe wird durch ein 425 μm dickes Stahlnetz gesiebt, um alle verbleibenden vaskulären oder unverdauten Gewebefragmente zu entfernen.
  5. Nach der Filtration das Volumen mit Waschlösung 1 auf 25 mL erhöhen. 1x bei 100 x g für 1 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand.
  6. Übertragen Sie das Pellet mit einer sterilen Kunststoffpipette in ein neues Röhrchen, nachdem Sie 50 mL RPMI-Medium hinzugefügt haben. Die Probe erneut bei 100 x g für 1 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie das Pellet für die weitere Analyse.
    HINWEIS: Alle übrigen Schritte wurden in Laminar-Flow-Werkbänken unter sterilen Bedingungen durchgeführt, die für Zellkulturexperimente geeignet sind.
  7. 10 mL Dichtelösung 1.077 zu dem nach dem letzten gewonnenen Pellet geben, gefolgt von einem sanften Aufbrechen und Homogenisieren des Pellets, indem das Granulat mit dem Finger auf den Rand des Röhrchens geklopft wird.
    HINWEIS: Der Dichtebereich für die Isolierung von Inselzellen aus dem umgebenden Pankreasgewebe beträgt etwa 1,077, im Gegensatz zur Dichte des Mediums, die etwa 1,00126 beträgt. Daher haben wir für dieses Ziel die Dichtelösung 1,077 verwendet.
  8. 10 mL RPMI zugeben und bei 600 x g für 12 min bei 4 °C bei ausgeschalteten Bremsen zentrifugieren. Dieses Verfahren etablierte eine dichtebasierte Teilung innerhalb der Röhren, was zu einer Ansammlung von Inselzellen in einer Schicht direkt unter der RPMI-Schicht führte, die direkt unter der RPMI-Schicht positioniert war.
  9. Entfernen Sie sowohl die Inselzellen als auch das RPMI. Das Ziel dieses Schritts war es, Inselzellen zu reinigen, um ihre Entfernung aus dem Pankreasgewebe zu verbessern, was zu einem reineren Isolierungsprozess der duktalen Zellen führt.
  10. Entfernen Sie überschüssiges Pankreasgewebe mit einer Pipette in ein neues 50-ml-Röhrchen. Geben Sie 10 ml Lösung mit einer Dichte von 1,096 zu dem Gewebepellet.
  11. Geben Sie anschließend langsam 10 ml 1,062 Dichtelösung gradient mit einer Spritze hinzu. Achten Sie auf eine homogene Verteilung der Komponenten. Erstellen Sie einen Gradienten, indem Sie Lösungen in der Reihenfolge von der dichtesten zur geringsten Dichte stapeln.
  12. Fügen Sie 10 mL RPMI hinzu. Zentrifugenröhrchen bei 600 x g für 12 min bei 4 °C ohne Bremsen. Nach dem Schleudern sind unterschiedliche Dichteschichten zu sehen. Die duktalen Zellen befinden sich in der mittleren Schicht, unterhalb der RPMI-Schicht.
  13. Entfernen Sie die duktalen Zellen vorsichtig mit einer Wegwerfpipette von Pasteur und geben Sie sie in ein separates 50-ml-Röhrchen. Fügen Sie 25 mL Waschlösung 2 hinzu und mischen Sie die Suspension vorsichtig, indem Sie mit einem Finger auf das Röhrchen klopfen.
  14. Drehen Sie das Röhrchen bei 100 x g für 1 min und entsorgen Sie den Überstand. Führen Sie zwei weitere Zentrifugationsrunden mit dem Pellet durch. Nach der letzten Wäsche 2 ml Waschlösung 2 zum Pellet27 hinzufügen.

4. Isolierung und Kultivierung duktaler Zellen

  1. Die geernteten Zellen werden in einen T25-Kolben geimpft und 5 ml vorgewärmte Zellkulturflüssigkeiten hinzugefügt. Halten Sie den Inkubator bei 5 % CO2und 37 °C.
    HINWEIS: Für das Funktionieren der Zellkultur ist es wichtig, die physiologischen Temperaturen stabil zu halten, daher wurden alle Lösungen vor ihrer Verwendung auf etwa 37 °C erhitzt.
  2. Nach 24 Stunden das Medium vorsichtig ansaugen. Spülen Sie die Zellen zweimal mit Waschlösung 2 aus. Frisches Zellkulturmedium zugeben und den Kolben wieder in den Inkubator stellen. Diejenigen Zellen, die an der Kolbenoberfläche hafteten, wurden als duktale Zellen bezeichnet.
  3. Tauschen Sie das Wachstumsmedium alle 3 Tage aus. Wenn sich die Farbe des Mediums sehr schnell ändert, bedeutet dies, dass es Nährstoffe verliert und saurer wird, was darauf hindeutet, dass das Medium häufiger gewechselt werden sollte.
  4. Passagezellen, sobald die Zellen in den Kolben eine Konfluenz von 80 % erreicht haben. Waschen Sie mit 1-2 mL PBS 2x und entfernen Sie alle überschüssigen Medien.
  5. Fügen Sie 2 ml enzymatische Dissoziationslösung (ohne Phenolrot) hinzu, um den enzymatischen Abbauprozess zu starten und die Zellen von der Kolbenoberfläche zu trennen.
  6. 2-3 Minuten inkubieren und die Zellablösung unter einem 10-fachen Mikroskop beurteilen. Wenn die Zellen teilweise anhaften, bei 37 °C für weitere 2 Minuten erneut inkubieren.
  7. Nachdem die Zellen vollständig von der Kolbenoberfläche gelöst wurden, stoppen Sie den Enzymverdau, indem Sie etwa 8 ml Zellwachstumsmedium hinzufügen, was dem 4-fachen Volumen der enzymatischen Dissoziationslösung entspricht. Klopfen Sie vorsichtig auf die Wände des Kolbens.
    HINWEIS: Das Klopfen, das bei der Trennung der Zellen helfen kann, verkürzt die Gesamtinkubationszeit und verhindert, dass die Enzyme die Zellmembran schädigen, wodurch sichergestellt wird, dass dies nach längerem Kontakt mit der enzymatischen Dissoziationslösung geschieht.
  8. Nach Zugabe von Zellkulturmedien die Zellsuspension in 15-ml-Röhrchen überführen und 10 Minuten lang bei 25 °C bei 150 x g mit einer leichten Verzögerungseinstellung (Stufe 9 Pause) zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren.
  9. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 6-8 mL Waschlösung 2. Wiederholen Sie das Zentrifugieren wie oben. Entsorgen Sie den Überstand. Das Verfahren wurde wiederholt, um die gründliche Ausscheidung der enzymatischen Dissoziationslösung zu gewährleisten.
  10. Resuspendieren Sie das Pellet durch vorsichtiges Pipettieren in 5 ml frischem Zellkulturmedium, um eine gleichmäßige Zellsuspension herzustellen. Führen Sie in dieser Phase eine Zellzählung durch.
  11. Mischen Sie 10 μl der Zellsuspension mit 10 μl Trypanblau und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
  12. 1 × 106 Zellen pro T25-Kolben mit der gezählten Suspension ausstechen.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt waren die meisten Zellen als duktale Zellen identifiziert worden. Eine gute Anzahl von Zellen wurde in jede Schale ausgesät, basierend auf der Zellzahl, die durchgeführt wurde. Basierend auf dem, was wir in den Experimenten gesehen haben, wurden die Zellen auf zwei verschiedene T25-Kolben verteilt, sobald sie den besten Konfluenzgrad in einem Kolben erreicht hatten. Dies geschah, um die Proliferationseffizienz hoch zu halten. Mit dieser Methode konnten wir erfolgreich duktale Zellen aus dem Bauchspeicheldrüsengewebe der Ratte trennen. Nach erfolgreicher Trennung wurden die Zellen gemäß dem Studienplan für weitere Experimente vorbereitet.
  13. Kultivieren Sie bis zum Durchgang 4. Passagezellen bei Bedarf, um optimale Wachstumsbedingungen aufrechtzuerhalten.
    HINWEIS: Ab Durchgang 4 gab es einen merklichen Anstieg der Zellzahl zwischen Tag 3 und 9. Da Zellen nach mehr Zyklen tendenziell weniger in der Lage sind, sich zu teilen, stellte diese Methode sicher, dass genügend lebensfähige Zellen vorhanden waren. Nachdem die duktalen Zellen ausreichend gewachsen waren, begannen sie, sich in inselartige Zellen zu verwandeln. Basierend auf dem, was wir herausgefunden haben, haben Zellen zwischen den Stadien 3 und 6 die schnellsten Proliferationsraten. Passage 4 zeigt einen besonders deutlichen Anstieg der Anzahl der duktalen Zellen. Nach Passage 6 kam es jedoch zu einem Rückgang der Proliferationsfähigkeit. Das Protokoll wurde auf der Grundlage dieser Ergebnisse optimiert, um die richtige Anzahl von Zellen zu erhalten und gleichzeitig ihre Lebensfähigkeit und Nützlichkeit zu erhalten28.

5. Differenzierung duktaler Zellen in inselartige Cluster

  1. Entnahme des Durchgangs von 4 duktalen Zellen mit dem Standard-Passage-Verfahren. Zweimal mit 1-2 mL PBS waschen, um Medienreste und nicht gebundene Zellen zu entfernen.
  2. 2 ml enzymatische Dissoziationslösung (ohne Phenolrot) in den Kolben geben. Bei 37 °C 2-3 Minuten inkubieren und unter einem 10-fachen Mikroskop überwachen.
  3. Wenn die Zellen anhaften, inkubieren Sie weitere 2 Minuten. Stoppen Sie die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 8 ml Zellwachstumsmedium.
  4. Die Suspension in ein 15-ml-Röhrchen überführen und bei 150 × g 10 Minuten lang bei 25 °C zentrifugieren, Stufe 9 für Beschleunigung und Verlangsamung.
  5. Entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet in 6-8 ml Waschlösung resuspendieren 2. Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
  6. Resuspendieren Sie das fertige Pellet in 5 ml frischem Medium. Zählen Sie die Zellen wie zuvor beschrieben.
  7. 1 × 105 Zellen pro Vertiefung in eine Sechs-Well-Platte aussäen und 3 ml Medium pro Vertiefung hinzufügen. Inkubieren bei 37 °C, 5 % CO2.
  8. Ersetzen Sie das Medium in den ersten 7 Tagen alle 3 Tage. Passen Sie die Häufigkeit an, wenn sich die mittlere Farbe schnell ändert.
  9. Allmählich nach 7 Tagen auf Differenzierungsmedium umstellen. Kultivieren Sie insgesamt 15 Tage lang (7 Tage Wachstum + 8 Tage Differenzierung). Wechseln Sie während der Differenzierung alle 2 Tage das Medium.
  10. Beginnen Sie am 8. Tag mit der Differenzierungsphase. Waschen Sie die Zellen nach 4 Tagen zweimal mit PBS und fügen Sie 500 μl enzymatische Dissoziationslösung hinzu.
  11. Inkubieren Sie 2-3 Minuten und stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 2 mL Wachstumsmedium. Zentrifugieren Sie bei 150 x g für 10 min bei 25 °C. Resuspendieren und säen Sie 1 x 105 Zellen pro Well in Sechs-Well-Platten.
  12. Am 15. Tag wird eine vollständige mikroskopische Analyse durchgeführt, um die Bildung von inselartigen zellulären Aggregaten eindeutig zu charakterisieren und zu bestätigen24.

6. Quantifizierung der Zinkkonzentration in differenzierten duktalen Zellen durch Dithizon

  1. Tauen Sie die DTZ-Lösung auf und äquilibrieren Sie sie aus einer Lagerung von -20 °C. Geben Sie 3-4 Tropfen DTZ-Lösung in jede Vertiefung der 15-Tage-differenzierten Zellen. Unter dem Mikroskop beobachten. Identifizieren Sie insulinproduzierende Zellen durch Rotfärbung28 (Abbildung 2).

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Abbildung 2: Mikroskopische Aufnahmen von inselartigen duktalen Zellen. Bilder an (A) Tag 11 der Kultur (20x), (B) Tag 13 der Kultur (20x), (C, D) Tag 15 der Kultur (20x). Die Zellen wurden nach der Färbung mit Dithizon sichtbar gemacht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

7. Test auf Glukosestimulation

  1. 1 x 104 inselartige Cluster pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte mit 1 ml Differenzierungsmedium pro Vertiefung aussäen.
  2. Stimulieren Sie am 15. Tag die Zellen mit Glukose. Entfernen Sie das vorhandene Medium und fügen Sie 1 ml glukosearme Lösung (1,67 mM) hinzu. 1 h bei 37 °C inkubieren.
  3. Das Medium auffangen und in 2-ml-Röhrchen umfüllen. Fügen Sie 1 ml Lösung mit hohem Glukosegehalt (16,7 mM) hinzu. 1 h inkubieren. Sammeln Sie das Medium für die Analyse. Entnehmen Sie das Zellkulturmedium in einem Intervall von 1 h zwischen der Zugabe verschiedener Glukoselösungen.
  4. Führen Sie den Insulin-ELISA gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Lassen Sie die Mikroplatte nach dem Entfernen aus dem Folienbeutel auf Raumtemperatur äquilibrieren, bevor Sie mit dem ELISA-Verfahren beginnen.
  5. Geben Sie 10 μl Reagenz in die Proben-, Kontroll- und Standardvertiefungen. Fügen Sie 75 μl Arbeitskonjugatlösung hinzu. Die Platte selber nehmen und 2 h bei Raumtemperatur unter Schütteln (700-900 U/min) inkubieren.
  6. Waschen Sie die Wells 6x mit 350 μl Waschpuffer. Geben Sie 100 μl 3,3′,5,5,5,5-Tetramethylbenzidin (TMB)-Substrat pro Vertiefung hinzu. Die Platten verschließen und 15 min im Dunkeln unter Schütteln (700-900 U/min) bei Raumtemperatur inkubieren.
  7. Fügen Sie 100 μl Stopplösung pro Vertiefung hinzu und mischen Sie, indem Sie die Platte vorsichtig umrühren, um den Prozess zu stoppen. Entfernen Sie Blasen und lesen Sie die Absorption bei 450 nm ab. Nach Zugabe der Stopplösung27 30 min lang messen.

8. Inselzellen und inselartige duktale Zelltransplantation

  1. Betäuben Sie Ratten mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg). Desinfizieren und drapieren Sie die Operationsstelle. Machen Sie einen Schnitt von 2-3 cm in der Mittellinie.
  2. Den Darm verlagern und die Pfortader mit Retraktoren freilegen. Führen Sie eine Venotomie durch und legen Sie einen mit Kochsalzlösung vorgefüllten Katheter an (Abbildung 3A).
  3. Infusion von 100-500 μl Zellsuspension in die Pfortader. Entfernen Sie den Katheter und verschließen Sie die Venotomie mit Nähten oder Kleber. Schließen Sie den Bauch und überwachen Sie die Genesung, indem Sie bei Bedarf eine Analgesie durchführen (Abbildung 3B).

figure-protocol-3
Abbildung 3: Transplantation von Inselzellen und inselähnlichen Zellen. (A) Steriler intravenöser Intrakath zur Transplantation von Inselzellen und inselähnlichen Zellen. (B) Transplantation von Inselzellen und inselartigen Zellen in eine sterile Spritze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

9. Streptozotocin (STZ) induzierte diabetische Ratten

  1. Schnelle Ratten 12 h. 45 mg/kg STZ intraperitoneal verabreichen, gelöst in kaltem Citratpuffer (pH 4,5).
    HINWEIS: 12 Stunden Fasten vor der STZ-Injektion erhöht die GLUT2-Expression, was den Glukosetransport in den Betazellen der Bauchspeicheldrüse erleichtert. Dieser Prozess erhöht die Aufnahme von STZ in die Zellen, was zu einer stärkeren Schädigung der Betazellen führt. Dieser Mechanismus erleichtert das Fortschreiten einer stärkeren Hyperglykämie und erhöht die Wirksamkeit des Diabetesmodells.
  2. Bestätigen Sie Diabetes 48-72 Stunden nach der Injektion mit Blutzucker >250 mg/dl. Ratten, die in der Regel Blutzuckerwerte über 250 mg/dl erreichten, als Diabetiker einstufen und in das Experiment einbeziehen29.

10. Vorbereitung von Inselzellen und inselähnlichen Zellen für die Transplantation

  1. Ernten Sie die Zellen nach der Behandlung mit der enzymatischen Dissoziationslösung für 1 min. Kratzen Sie Zellen ab, die an der Oberfläche haften. Durch frisches Medium ersetzen und Zellen sammeln.
  2. Bei 300 x g 5 min zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet in 100-150 μl Kochsalzlösung. Führen Sie eine Zellzählung durch und stellen Sie die Zellzahl auf 1000 IEQ oder 800 Inselzellen pro Ratte oder 1 x 105 inselähnliche Zellen pro Ratte ein.

11. Pfortadertransplantation

  1. Betäubung der Tiere durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg).
  2. Desinfizieren Sie die Bauchregion des Tieres mit einer sterilen Lösung (Betadin oder 70% Ethanol). Umhüllen Sie den Operationsbereich mit einem sterilen Tuch.
  3. Mache einen Schnitt in der Mittellinie, etwa 2-3 cm lang, um Zugang zur Bauchhöhle zu erhalten.
  4. Verlagern Sie den Darm, um die Leber freizulegen. Sichern Sie den linken und rechten Leberlappen mit sterilen Retraktoren. Legen Sie die ventrale Oberfläche der Leber frei, um die Pfortader zu lokalisieren.
  5. Spülen Sie den Polyethylen-Katheter (PE-10 oder PE-50) mit Kochsalzlösung vor und füllen Sie ihn vollständig. Verwenden Sie eine mikrochirurgische Pinzette, um einen Ast der Pfortader zu halten - typischerweise den linken oder rechten Seitenast.
  6. Führen Sie eine kleine Venotomie (ca. 1-2 mm) durch. Führen Sie den Katheter vorsichtig in die Venotomiestelle ein. Um eine Verschiebung zu vermeiden, verwenden Sie Nahtmaterial oder eine Pinzette, um den Katheter zu verankern, in der Regel mit einem 6-0-Nahtfaden.
  7. Überprüfen Sie die genaue Positionierung des Katheters, indem Sie nach und nach sterile Kochsalzlösungen verabreichen. Der Katheter führte die präparierte Inselzelle und die inselähnliche Zellsuspension nach und nach in die Pfortader ein. Das Gesamtvolumen beträgt 100-500 μL.
  8. Entfernen Sie nach Abschluss der Infusion den Katheter und verwenden Sie sterilen Gewebekleber oder resorbierbare Nähte, um die Venotomiestelle zu versiegeln.
  9. Führen Sie ein Blutungsmanagement durch. Positionieren Sie das gesamte Gewebe um die Leber herum neu und vernähen Sie die Bauchmuskeln mit resorbierbarem Faden. Sichern Sie die Haut mit Nähten oder Clips.
  10. Überwachen Sie das Tier in einer warmen Umgebung. Stellen Sie geeignete Analgetika für die Schmerzbehandlung während des Entlasses aus der Narkose bereit (z. B. Buprenorphin 0,1 mg/kg). Tiere 48 h beobachten. Auf Anzeichen einer Infektion, eines Ödems an der Operationsstelle oder einer Blutunguntersuchen 30.

12. Blutzuckermessung

  1. Beurteilen Sie den anfänglichen Blutzuckerspiegel. Halten Sie die Ratte vorsichtig fest und verwenden Sie eine Lanzette, um einen kleinen Schnitt an der Spitze des Schwanzes zu erzeugen. Entfernen Sie vorsichtig den ersten Blutstropfen mit einem sterilen Wattestäbchen.
  2. Tragen Sie den zweiten Tropfen Blut auf den Glukoseteststreifen auf und dokumentieren Sie den Ausgangsglukosewertvon 31.

13. Intraperitonealer Glukosetoleranztest

HINWEIS: Ratten unterziehen sich dem Intraperitonealen Glukosetoleranztest (IPGTT), um die Effizienz der Glukosebeseitigung in ihrem Blutkreislauf zu bewerten. Dieser Test bietet Einblicke in den Glukosestoffwechsel, die Insulinsensitivität und mögliche diabetische Erkrankungen. Der intraperitoneale Glukosetoleranztest wurde am 15. Tag nach der Transplantation am 15. Tag durchgeführt. Der Hauptgrund für die Einführung einer festgelegten Fastendauer vor dem IPGTT besteht darin, den Basalglukosespiegel zu stabilisieren und einen konsistenten Stoffwechselzustand zu gewährleisten. Die Fastenzeit erleichtert die Erschöpfung der Glykogenspeicher in der Leber und ermöglicht eine zuverlässigere Bewertung der Glukosetoleranzreaktion. 6 Stunden Fasten reduziert die postprandialen Effekte, während das Fasten über Nacht (ca. 12-16 Stunden) deutliche Auswirkungen haben kann, die möglicherweise die Insulinsensitivität und den Glukosestoffwechsel beeinflussen.

  1. Unterziehen Sie die Ratten einer 6-stündigen Fastenperiode, wobei über Nacht nur der Zugang zu Wasser erlaubt ist, wobei sichergestellt wird, dass die Fastendauer 12 Stunden nicht überschreitet. Stellen Sie eine einheitliche Fastenzeit für alle Probanden sicher, um die Variabilität der Glukosemessungen zu reduzieren.
  2. Bevor Glukose verabreicht wird, wiegen Sie die Ratten. Um eine sterile Lösung herzustellen, lösen Sie 20 g Glukose in 100 ml steriler Kochsalzlösung.
    HINWEIS: Die Standarddosis beträgt in der Regel 2 g Glukose/kg Körpergewicht (2 g/kg). Das angegebene Gesamtvolumen wird durch das Körpergewicht des Tieres bestimmt.
  3. Beurteilen Sie den Blutzuckerspiegel zu Studienbeginn. Halten Sie die Ratte fest und machen Sie mit einer Lanzette einen kleinen Schnitt an der Schwanzspitze. Entfernen Sie vorsichtig den ersten Tropfen Blut mit einem sterilen Wattestäbchen.
  4. Geben Sie den zweiten Tropfen Blut auf den Glukoseteststreifen und notieren Sie den Glukoseausgangswert.
  5. Basierend auf dem Körpergewicht der Ratte die entsprechende Menge Glukoselösung in einer Menge von 2 g/kg verabreichen.
  6. Vor der intraperitonealen (IP) Verabreichung der Glukoselösung vorsichtig mit der Ratte umgehen. Injizieren Sie Glukose in die Bauchhöhle, nicht in das Unterhautgewebe oder ein Organ, und stellen Sie sicher, dass es sich um eine korrekte Verabreichung handelt.
  7. Entnehmen Sie nach der Glukoseinjektion in bestimmten Abständen Blutproben, um den Glukosespiegel zu überwachen. Typische Zeitintervalle sind 15, 30, 60, 90 und 120 Minuten nach der Injektion.
  8. Sammle an jedem Punkt Blut, indem du die Schwanzvene durchtrennst. Achten Sie vor jeder Blutentnahme darauf, dass der Schwanz mit einem Alkoholtupfer abgewischt wird.
  9. Messen Sie zu jedem angegebenen Zeitpunkt den Glukosespiegel und dokumentieren Sie ihn mit einem Glukosemessgerät.
  10. Überwachen Sie die Ratten während des Tests auf Anzeichen von Unwohlsein oder Nebenwirkungen. Um den Stress für die Tiere zwischen den Messungen zu minimieren, sorgen Sie für eine warme und ruhige Umgebung.
  11. Nach der letzten Blutzuckermessung Schwanzwunden reinigen und die Tiere trösten29.

14. Analyse des Insulins mittels ELISA nach Blutentnahme

HINWEIS: Die Schritte in diesem Protokoll dienen der Entnahme von Blut aus der Bauchaorta einer Ratte und der anschließenden Verwendung der ELISA-Methode (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) zum Testen auf Insulin.

  1. Betäuben Sie die Ratte vor der Blutentnahme, wie zuvor beschrieben. Platzieren Sie die anästhesierte Ratte in Rückenlage auf einer sterilen Operationsplattform.
  2. Rasieren Sie den Bauchbereich und desinfizieren Sie den Bereich mit 70%iger Ethanol- oder Jodlösung, um die Sterilität zu gewährleisten.
  3. Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt in der Mittellinie, um in die Haut- und Muskelschichten einzudringen und die Bauchhöhle freizulegen.
  4. Ziehen Sie den Darm zurück, um Zugang zu der an die Wirbelsäule angrenzenden Bauchschlagader zu erhalten. Verwenden Sie eine heparinisierte Spritze, um die Nadel in einem leichten Winkel in die Bauchschlagader einzuführen.
  5. Sammeln Sie Blut (normalerweise 1-3 ml, abhängig von der Größe der Ratte) in die Spritze. Wenden Sie eine allmähliche und gleichmäßige Absaugung an, um einen Gefäßkollaps oder eine Hämolyse des Blutes zu vermeiden.
  6. Geben Sie das gesammelte Blut in ein Zentrifugenröhrchen und halten Sie es auf Eis.
  7. Wenn das Tier nach dem Eingriff eingeschläfert werden soll, führen Sie die Euthanasie in Übereinstimmung mit den institutionellen ethischen Richtlinien durch.
  8. Zentrifugieren Sie das gesammelte Blut bei 300 x g für 10-15 min bei 4 °C, um die Trennung von Plasma oder Serum zu gewährleisten. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen und für die anschließende Insulinanalyse bei -80 °C lagern.
    HINWEIS: Es ist wichtig, eine Hämolyse während der Blutentnahme zu vermeiden, da dies die Genauigkeit der ELISA-Ergebnisse beeinträchtigen kann (Abbildung 4)29.

figure-protocol-4
Abbildung 4: Blutproben wurden aus der Schwanzvene von Ratten in Blutröhrchen für die Insulinanalyse am 15. Tag nach der Transplantation entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

15. Insulinmessung mittels ELISA

  1. Bereiten Sie das Insulin-ELISA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Lassen Sie alle Reagenzien, Standards und Proben Raumtemperatur erreichen, bevor Sie mit dem Assay beginnen.
  2. Bestimmen Sie die erforderliche Anzahl von Wells auf der ELISA-Platte für Standards, Kontrollen und Rattenserumproben.
  3. Bereiten Sie die Rattenserumproben für die Analyse vor, indem Sie sie wie im ELISA-Kit-Protokoll angegeben verdünnen, z. B. 1:10-Verdünnung in PBS.
  4. Bereiten Sie Insulinstandards durch serielle Verdünnung vor, um eine Standardkurve zu erzeugen, z. B. im Bereich von 0 bis 10 ng/ml.
  5. Dosieren Sie Standards, Kontrollen und verdünnte Rattenserumproben (in der Regel 50-100 μl pro Well) in die angezeigten Vertiefungen der ELISA-Platte. Geben Sie die mit dem Kit gelieferte Nachweisantikörperlösung in jede Vertiefung, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.
  6. Inkubieren Sie die Platte für die angegebene Zeit (typischerweise 1-2 h) bei Raumtemperatur oder gemäß den angegebenen Anweisungen.
  7. Stellen Sie nach der Inkubation sicher, dass die Vertiefungen mit dem dafür vorgesehenen Waschpuffer gewaschen werden, in der Regel PBS mit 0,05 % Tween-20, um ungebundene Substanzen zu entfernen. Führen Sie den Waschschritt 3x bis 5x gemäß den Anweisungen des Kits durch und stellen Sie sicher, dass die verbleibende Flüssigkeit nach jedem Waschen vollständig entfernt wird.
  8. Geben Sie die Substratlösung in jede Vertiefung. Das Substrat interagiert mit dem an das Enzym gebundenen Antikörper, was zu einer Farbänderung führt. Die Intensität der Farbe hängt mit der Menge an Insulin ab, die in der Probe vorhanden ist. Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln für die vom Kit angegebene Dauer, in der Regel zwischen 15 und 30 Minuten.
  9. Geben Sie die Stopplösung in jede Vertiefung, um die kolorimetrische Reaktion zu beenden. Die Farbänderung stabilisiert sich nach der Zugabe der Stopplösung, die typischerweise gelb ist.
  10. Messen Sie sofort die optische Dichte (OD) jedes Wells mit einem Plattenlesegerät, das auf 450 nm eingestellt ist (oder wie im Kit angegeben).
  11. Erstellen Sie eine Standardkurve, indem Sie die bekannten Konzentrationen von Insulinstandards mit den entsprechenden Werten für die optische Dichte (OD) vergleichen.
  12. Berechnen Sie die Insulinkonzentration in Rattenserumproben unter Verwendung der Standardkurve und der entsprechenden OD-Werte. Die Insulinspiegel sollten in ng/ml oder anderen geeigneten Einheiten angegeben werden29.

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Ergebnisse

Lichtmikroskopische Analyse

Während der Untersuchungen der duktalen Zellen am 14. Tag zeigte die lichtmikroskopische Analyse, dass sich die Zellen gruppierten und eine inselartige Struktur bildeten. Diese strukturelle Veränderung deutet darauf hin, dass duktale Zellen nach einer bestimmten Zeit ihre morphologischen Eigenschaften ändern, indem sie eine organisatorische Ordnung eingehen und ein inselartiges Aussehen erhalten. Die Tendenz der Zellen zur Clusterbildung ...

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Diskussion

Die Untersuchung der Funktionsfähigkeit inselartiger Zellen aus verschiedenen Quellen hat in der Diabetesforschung großes Interesse geweckt. Erste Forschungen zeigen, dass diese Zellen Insulin freisetzen können, wenn der Glukosespiegel erhöht wird, was darauf hindeutet, dass sie in der Lage sein könnten, die Funktionen natürlicher Pankreasinseln nachzuahmen. Forscher haben die Dithizon-Färbung verwendet, um die phänotypische Ähnlichkeit von inselartigen Zellen mit Pankreas-Inselzellen zu überprüfen, wie die charakteristi...

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Offenlegungen

Der/die Autor(en) hat keinen potenziellen Interessenkonflikt gemeldet.

Danksagungen

Die Autoren danken dem Laborteam für ihre Beiträge zur Studie.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9 % NatriumchloridSahar PharmaZur Entfernung von Bauchspeicheldrüse und Zelltransplantation
10 mL serologische Pipette - sterilCorning4488Zur Isolierung
24-Well-PlatteCorning353047Für GSIS 
25 mL serologische Pipette - sterilCorning4489Zur Isolierung
70% Ethanol ISOLAB64-17-5Zur Desinfektion von Ratten
BetadinBaticonol  1186Zur Desinfektion von Ratten
Biocholl 1077SigmaL6715-BCZur Reinigung der Bauchspeicheldrüse
Biocoll, Dichte 1,10 g/mLSigmaL6155-BCZur Reinigung der Bauchspeicheldrüse
Blutzuckermessgeräte und GlukoseteststreifenOn Call PlusZur Messung des Blutzuckers
BSASigmaA9418Zur Vorbereitung von Krebs
CaCl2Sigma57647902Zur Vorbereitung von Krebs
Katheterzusammensetzung: Polyethylen-Katheter (intravenös intrakathet)  Bicakcilar24G  und 14GFür Bauchspeicheldrüse und Leber 
ZentrifugeThermoST1R PlusZur Isolierung 
Kollagenase Typ V, ≥ 1 FALGPA Einheiten/mg Feststoff,
>125 CDU/mg Feststoff 		SigmaC9263- 1GFür die Verdauung der Bauchspeicheldrüse
D-(+)-Glukose Sigma50-99-7Für GSIS und IPGTT
Dithizone (DTZ)SigmaD5130Für Inselbestimmung
DMSOSigmaD8779Für die Lösung nach DTZ
Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM– niedrige Glukose) Gibco11885084Für Zellkulturen
Eppendorf RöhrchenISOLABFür die Zellwäsche
Falcon Röhrchen (50 mL)ISOLABLB. IS.078.02.009Zur Isolierung
fötalem Rinderserum (FBS)SigmaN4637Zur Isolierung und Kultur der Bauchspeicheldrüse
Feines Nadel- und Nahtmaterial (Größe 6-0 oder 7-0)PROLENE Blue 18" P-1 Nadel | 8697GZur Entfernung der Bauchspeicheldrüse und zur Zelltransplantation
Glucagon-like Peptide 1 (GLP-1)Aladdinrp174144Für die Zellkultur
Hank's ausgewogene Salzlösung (HBSS mit Ca-Mg) SteinbockHBSS-1AZur Enzymvorbereitung
HBSS kein Kalzium, kein Magnesium, kein PhenolrotBIOCHROM  L2015Für die Isolierung der Bauchspeicheldrüse
HEPESLonzaFür die Zellkultur
Insulin ElisaAlpco80-INSRT-E01Für Insulin Elisa
Insulin-Transferrin-Selen (ITS)GibcoITS -GFür die Zellkultur
Isoxazol 9 (ISX-9) AladdinI304735-10mgFür die Zellkultur
KClSigma329820207Zur Vorbereitung von Krebs
Ketamin HCl 200 mg/mLNexGenFür Ratten Anästesie
Laminar Flow CabinetsLaborIldam BSC-1100IIA2-XFür die Isolierung und Kulturperiode
LanzettenAyset28 GZur Messung des Blutzuckerspiegels
L-Glutamin Sigma59202cFür die Isolierung und Kultur der Bauchspeicheldrüse
MgCl2Sigma329759772Für die Vorbereitung von
Krebs-Mikroplatten-ReadernBioTek SynergyH1 Multimode ReaderFür Insulin-Elisa-Mikrotiterplatten-Schüttler
VWR  444-0270Für Insulin elisa
Mikrochirurgisches MikroskopEMZ-200TR3.9X Zur Entnahme von Bauchspeicheldrüse und Zelltransplantation
Mikrochirurgische Schere und PinzetteAesculapZur Entnahme von Bauchspeicheldrüse und Zelltransplantation
Millicell Hanging Cell Culture Insert, Polyethylenterephthalat 8.0µ M MILLIPOREPIEP30R48 Für GSIS 
NaClSigma7647-14-5Zur Vorbereitung von Krebs
NaHCO3Sigma144-55-8Zur Vorbereitung von Krebs
Pasteur Pipette 3 MlBIOSIGMAZur Isolierung
von Penicillin/Streptomycin SigmaFür die Isolierung und Kultur der Bauchspeicheldrüse
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)BIOCHROM  L1815Zur Zellpassage
Retraktor (zur Stabilisierung der Leber und des Bindegewebes)AesculapZur Entfernung der Bauchspeicheldrüse und Zelltransplantation
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI w/L-Gln)CapricornRPMI-AZur Isolierung und Kultur der Bauchspeicheldrüse
Steril CottonTiped DynarexZur Entfernung der Bauchspeicheldrüse und Zelltransplantation
Sterile Spritze (10 mL)Ayset32MM 22GFür Collegenase Reaktion
StoppuhrKenkoKK613DFür IPGTT
Streptozotocin (STZ) Sigma18883-66-4Für auftretende diabetische Ratten
Spritzentreiber-Filtereinheit (GP-0,22 µ m-3 mm)MillexSLGP033RSFür die Sterilisation von Zellkulturmedien
T25 KolbenThermo130189Für die Kultur
TrypLE Express ReagenzienGibcoFür die Zellpassage
Wasserbad Labor IldamALB128Für die Collegenase-Reaktion
Xylazin 2% w/v InjektionslösungRompunFür Rattenanästhesie
von von

Referenzen

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