Lebendzell-Förster-Resonanz-Energietransfer-Bildgebung der metabolisch regulierten Akt-Aktivierungsdynamik in HepG2-Zellen

Javed Akhtar; Muhammad Imran; Jiahe Wang; Gang Ma; Guanyu Wang

doi:10.3791/68075

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Methodenartikel

Lebendzell-Förster-Resonanz-Energietransfer-Bildgebung der metabolisch regulierten Akt-Aktivierungsdynamik in HepG2-Zellen

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DOI:

10.3791/68075

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23. Mai 2025

Javed Akhtar¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Muhammad Imran⁶ , Jiahe Wang¹^,²^,³ , Gang Ma⁵ , Guanyu Wang¹^,²^,³

¹Laboratory of Biocomplexity and Engineering Biology, School of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, ²Futian Biomedical Innovation R&D Center, The Chinese University of Hong Kong, ³Ciechanover Institute of Precision and Regenerative Medicine, School of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, ⁴Department of Immunology and Microbiology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology, ⁵Department of Biology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology, ⁶Department of Computer Science and IT, University of Southern Punjab

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die räumlich-zeitliche Dynamik der Akt-Aktivierung und Phosphorylierung in lebenden HepG2-Zellen zu quantifizieren. Die Förster-Resonanzenergietransfer-Bildgebung (FRET) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das wertvolle Einblicke in die Insulinsignalwege und die Stoffwechselregulation in Krebszellen liefert.

Zusammenfassung

Die metabolisch regulierte Akt-Aktivierung ist ein kritischer Knotenpunkt in der Insulinsignalkaskade und liefert wertvolle Einblicke in die Beziehung zwischen Diabetes und Krebs. Um die Akt-Aktivität in HepG2-Zellen genau zu quantifizieren, haben wir ein robustes, reproduzierbares Protokoll entwickelt, das den Förster Resonance Energy Transfer (FRET) mit genetisch kodierten Akt-spezifischen Biosensoren verwendet. Dieses Protokoll beschreibt detaillierte Schritte für die Zellkultur, die Vorbereitung der Bildgebungsschale und die Transfektion von HepG2-Zellen zur Expression von FRET-basierten Biosensoren sowie spezifische Richtlinien für die Hardware- und Softwarekonfiguration von konfokalen Laserscanning-Mikroskopen. Die Ergebnisse zeigten einzigartige Muster der Insulinsignalübertragung in HepG2-Zellen, die einen irreversiblen Schalter aufweisen, der durch eine konstitutive Akt-Aktivierung mit einer definierten Einschaltschwelle, aber ohne Abschaltschwelle gekennzeichnet ist. Im Gegensatz dazu weisen Myotuben einen reversiblen Schalter auf. Die anhaltende Akt-Aktivierung in HepG2-Zellen deutet auf Mechanismen hin, die der Insulinresistenz und der metabolischen Dysregulation in Leberzellen zugrunde liegen, mit breiteren Implikationen für das Verständnis des Fortschreitens von Stoffwechselstörungen und Krebs. Dieses Protokoll bietet einen wertvollen Rahmen für die Erforschung von Akt-bezogenen Signalwegen und zellulären Verhaltensweisen in verschiedenen Krankheitskontexten.

Einleitung

Diabetes mellitus stellt eine große globale gesundheitliche Herausforderung dar, die durch Insulinresistenz und eine gestörte Glukosehomöostase gekennzeichnet^{ist 1}. Ein umfassendes Verständnis der Insulin-Signalwege ist entscheidend für die Aufklärung der Pathophysiologie dieser Krankheit, da Insulin eine zentrale Rolle für den Glukosestoffwechsel, das Zellwachstum und das Überleben spielt². Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die Insulinsignalisierung verschiedene Krebsarten signifikant beeinflusst, was die Insulinresistenz mit dem Fortschreiten des Tumors und schlechten Patientenerg....