Method Article

Ein optimierter Ansatz für die massenspektrometrische Proteomik unter Verwendung ausgewählter Geweberegionen

DOI:

10.3791/68076

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April 18th, 2025

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1Department of Medical Science, School of Medicine, CHA University, 2Department of Proteomic Research, CHA Future Medicine Research Institute, 3Department of Pathology, Seoul National University Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier etablieren wir eine massenspektrometrische proteomische Methode unter Verwendung isolierter Regionen von Interesse in formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten. Dieses Protokoll wird verwendet, um Proteome aus bestimmten Gewebebereichen in archivierten formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten zu analysieren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die auf Massenspektrometrie (MS) basierende Proteomik ermöglicht eine umfassende Proteomanalyse für ein breites Spektrum biologischer Proben, einschließlich Zellen, Gewebe und Körperflüssigkeiten. Formalinfixierte, paraffineingebettete (FFPE) Gewebeschnitte, die häufig für die Langzeitarchivierung verwendet werden, haben sich als wertvolle Ressourcen für proteomische Studien erwiesen. Abgesehen von ihren Lagerungsvorteilen können Forscher durch Zusammenarbeit mit Pathologen interessante Regionen (ROIs) aus normalen Geweberegionen isolieren. Trotz dieses Potenzials fehlt nach wie vor ein optimierter Ansatz für proteomische Experimente, der ROI-Isolierung, proteomische Probenvorbereitung und MS-Analyse umfasst. In diesem Protokoll wird ein integrierter Workflow vorgestellt, der die Makrodissektion von ROIs, die Probenvorbereitung auf Basis von Suspensionsfallen und die Hochdurchsatz-MS-Analyse kombiniert. Durch diesen Ansatz wurden die ROIs der FFPE-Gewebe der Patienten, bestehend aus gutartigen serösen zystischen Neoplasien (SCN) und präkanzerösen intraduktalen papillären muzinösen Neoplasien (IPMN), die von Pathologen diagnostiziert wurden, makroseziert, gesammelt und analysiert, was zu einer hohen Proteomabdeckung führte. Darüber hinaus konnten molekulare Unterschiede zwischen den beiden unterschiedlichen zystischen Neoplasien der Bauchspeicheldrüse identifiziert werden, was die Anwendbarkeit dieses Ansatzes für die Weiterentwicklung der proteomischen Forschung mit FFPE-Geweben demonstriert.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jahrzehntelang wurden chirurgisch exzidierte menschliche Gewebe als formalinfixierte, paraffineingebettete (FFPE) Blöcke archiviert. Diese Gewebeblöcke bewahren zunächst die dreidimensionale (3D) Struktur, die in Paraffin eingebettet ist. Die Gewebe werden anschließend mit Mikrotomen in Scheiben geschnitten, auf Objektträger montiert und gefärbt - häufig mit Hämatoxylin und Eosin (HE) oder Immunhistochemie (IHC) -, um die histopathologische Diagnose durch erfahrene Pathologen zu erleichtern 1,2. FFPE-Gewebe bieten aufgrund der durch Formalin induzierten Proteinvernetzung, die die enzymatische und proteolytische Aktivität stoppt, deutliche Vorteile für die Langzeitlagerung3. Da sie den Aufbau großer, gut archivierter Probensätze unterstützen, gelten FFPE-Gewebe als Eckpfeiler für die Entdeckung von Biomarkern in verschiedenen Bereichen, einschließlich der Genomik 4,5,6,7.

Ihre Anwendung in der auf Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie (LC-MS) basierenden Proteomik hat jedoch in der Vergangenheit Herausforderungen mit sich gebracht. Eine wesentliche Einschränkung ist die Formalin-induzierte Proteinvernetzung, die die tryptische Verdauung stört - ein kritischer Schritt in der globalen Proteomanalyse8. Darüber hinaus macht die geringe Menge an Protein, die aus Gewebeobjektträgern gewonnen werden kann, herkömmliche Methoden der Probenvorbereitung oft ungeeignet. Trotz dieser Herausforderungen haben Fortschritte gezeigt, dass Proteinvernetzungen durch eine längere Hochtemperaturbehandlung rückgängig gemacht werden können 9,10,11. Gleichzeitig haben Probenvorbereitungsmethoden, die für geringe Mengen an Proteinproben optimiert sind, die Verwendung von FFPE-Geweben in der Proteomikforschung erweitert 12,13,14,15.

Ein wesentlicher Vorteil des Einsatzes von FFPE-Gewebeobjektträgern in der Proteomik liegt in ihrer Fähigkeit, eine regionenspezifische Analyse zu ermöglichen. FFPE-Objektträger enthalten in der Regel sowohl Läsionen als auch angrenzendes normales Gewebe (ANT). Die wahllose Analyse des gesamten Gewebes birgt die Gefahr, dass die Ergebnisse aufgrund gemischter molekularer Signaturen verfälscht werden. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Isolierung und Analyse von Regionen von Interesse (ROIs) -- Läsionen im Vergleich zu ANT -- eine genauere Charakterisierung molekularer Merkmale, die für pathologische Regionen spezifisch sind. Infolgedessen werden FFPE-basierte Ansätze in Proteomik-Studien immer beliebter 16,17,18,19,20. Trotz der wachsenden Anwendung ist ein optimierter Arbeitsablauf, der das gesamte Proteom-Experiment Schritt für Schritt beschreibt, immer noch rar. Insbesondere wurde kein videobasiertes Protokoll veröffentlicht.

In dieser Studie wurde ein robuster LC-MS-basierter Proteomik-Workflow etabliert, der auf die genaue Profilerstellung molekularer Veränderungen in läsionsspezifischen Regionen zugeschnitten ist. Unter Verwendung von FFPE-Geweben, die von zwei Pathologen diagnostiziert wurden, wurden die ROIs von gutartigen serösen zystischen Neoplasien (SCN) und präkanzerösen intraduktalen papillären muzinösen Neoplasien (IPMN) makroseziert, gesammelt und analysiert. Das Protokoll umfasst eine Makrodissektion von ROIs, eine Probenvorbereitung auf Basis von Suspensionsfallen, die für minimale Proteineinträge optimiert ist, und eine datenunabhängige Erfassung (DIA)-MS-Analyse mit engem Bereich. Diese Methode ermöglichte die Identifizierung von über 9.000 Proteinen aus Gewebebereichen von etwa 1 cm² und entschlüsselte unterschiedliche proteomische Signaturen, die mit SCN und IPMN assoziiert sind.

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Protocol

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Diese Studie wurde vom Institutional Review Board des Seoul National University Hospital (IRB Nr. 1904-114-1028) geprüft und genehmigt. Alle Teilnehmer gaben eine schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Studie ab. Detaillierte Informationen zu allen in diesem Protokoll verwendeten Materialien finden Sie in der Materialtabelle.

1. FFPE-Gewebeantigen-Entnahme für die Probenvorbereitung in der Proteomik

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Skalpelle und alle Materialien, wie z. B. das verwendete Röhrchen, steril sind, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Die Protokolle dieser Studie können mit geringfügigen Modifikationen auf der Grundlage des Laboraufbaus für jedes FFPE-Gewebe angepasst werden.

  1. Schneiden Sie 10-μm-FFPE-Gewebeschnitte aus FFPE-Gewebeblöcken und legen Sie sie auf Objektträger.
    HINWEIS: In dieser Studie wurde humanes FFPE-Gewebe aus Pankreaszysten (zwei verschiedene Arten von zystischem Gewebe - SCN und IPMN) für die Probenvorbereitung der Proteomik verwendet.
  2. Entfernen Sie das Paraffinwachs aus dem FFPE-Gewebe (entparaffinisieren) mit zwei Wäschen in Xylol mit Vorsicht: Eine für 5 min und eine weitere für 2 min.
  3. Rehydrieren Sie das Gewebe durch eine serielle Wäsche mit abgestufter Ethanolmischung: jeweils 3 Minuten in 100 %, 85 %, 70 % und 50 % Ethanol, gefolgt von einer Spülung in entionisiertem Wasser.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Xylol und Ethanol in einem chemischen Abzug gehandhabt werden.

2. FFPE-Gewebeprotein-Extraktion

  1. Bereiten Sie einen HE- oder IHC-gefärbten Gewebeobjektträger vor, auf dem der ROI von Pathologen angegeben wird.
  2. Legen Sie den ungefärbten Objektträger und den gefärbten Gewebeobjektträger mit der Rückseite zueinander und richten Sie sie aneinander aus. Stellen Sie sicher, dass der ROI durch den Objektträger beobachtet wird.
  3. Entfernen Sie nicht interessierende Geweberegionen mit dem Skalpell.
    HINWEIS: Wenn das angrenzende normale Gewebe analysiert werden soll, sammeln Sie es in den anderen Röhrchen.
  4. Kratzen Sie die ROIs des Gewebes mit dem Skalpell in die Mitte des Objektträgers und übertragen Sie sie in die sauberen 1,5-ml-Röhrchen mit geringer Proteinbindung.
  5. Geben Sie 180 μl Natriumdodecylsulfat (SDS)-Lysepuffer (5 % SDS, 2 mM Tris (2-Carboxyethyl)phosphin) [TCEP], 300 mM pH 8,5 Tris-HCl in deionisiertem Wasser) in jedes Röhrchen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Volumen des Lysepuffers ausreicht, um das Gewebe während der Beschallung zu lösen und die extrahierten Proteine zu suspendieren. Ein unzureichender Puffer kann zu einer unvollständigen Gewebelyse führen, während ein übermäßiger Puffer das Proteinlysat verdünnen kann.
  6. Führen Sie die Sondenbeschallung mit einer Amplitude von 20 % durch und wenden Sie 10 Zyklen von 5 s an und 5 s aus an.
  7. Inkubieren Sie die Proben bei 100 °C für 3,5 h mit 1.000 x g.
    HINWEIS: Führen Sie während der Inkubation stündlich 1 Minute lang eine Wasserbeschallung der Proben durch, um eine effiziente Proteinextraktion zu gewährleisten.
  8. Nach der Inkubation die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) abkühlen lassen. Die Proben werden bei 16.000 x g für 10 min bei RT zentrifugiert, um Gewebereste vom Überstand zu trennen.
  9. Den Überstand in ein sauberes, beschriftetes Röhrchen füllen und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern.

3. Proteinquantifizierung von FFPE-Gewebelysat

HINWEIS: Die meisten Bicinchoninsäure-Assay-Schritte zur Proteinquantifizierung basieren auf den Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Änderungen. Es wird empfohlen, die Reagenzien gemäß den Richtlinien des Herstellers herzustellen.

  1. Bereiten Sie Rinderserumalbumin (BSA)-Standards unterschiedlicher Konzentration vor, indem Sie die Stammlösung (2 mg/ml BSA) seriell verdünnen. Falls erforderlich, verdünnen Sie die Proben mit einem Verdünnungsfaktor von 20 oder 40.
  2. Bereiten Sie das deionisierte Wasser als Blindwert und den SDS-Lysepuffer als Probenkontrolle vor.
  3. Pipettieren Sie 9 μl Standards, Blind-, Probenkontroll- und Probenmaterial in die Mitte der Mikrotiterplatten-Vertiefung.
  4. Geben Sie 4 μl Kompatibilitätsreagenzlösung in jede Vertiefung in die Probe.
  5. Den Teller abdecken und auf einem Plattenschüttler bei mittlerer Geschwindigkeit 1 Min. mixen. Danach die Platte bei 37 °C 15 min inkubieren.
  6. Geben Sie 260 μl des BCA-Arbeitsreagenzes in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte dann 30 Minuten lang bei 37 °C.
  7. Die Platte 3 Min. bei RT abkühlen lassen.
  8. Messen Sie die Absorption der Vertiefungen bei 562 nm mit einem Plattenlesegerät.
  9. Subtrahieren Sie den Absorptionswert von 562 nm des Blindwerts von dem aller Proben und der Probenkontrolle.
  10. Subtrahieren Sie ferner den Absorptionswert von 562 nm der Blindstichprobenkontrolle von dem aller Proben.
  11. Erstellen Sie ein Diagramm und verwenden Sie die Standardkurve, um die Proteinkonzentration jeder Probe zu bestimmen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die geschätzten 200-250 μg Proteine aus drei Glasobjektträgern mit FFPE-Geweben mit einer Fläche von jeweils ca. 1 cm2 extrahiert werden.

4. Acetonfällung von Protein

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass insgesamt 100-300 μg Protein für die Acetonfällung und den Proteinverdau auf der Grundlage von Suspensionseinschlüssen verwendet werden.

  1. Geben Sie die Proteinprobe (entsprechend 100-300 μg) in ein acetonverträgliches Röhrchen.
  2. Geben Sie -20 °C Aceton in einem Volumen, das das Fünffache des Probenvolumens beträgt, in das Röhrchen.
  3. Die Mischung bei -20 °C 18 h inkubieren.
  4. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 16.000 x g für 15 min.
  5. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Proteinpellet zu stören.
  6. 500 μl -20 °C Aceton zugeben und die Schritte 4.4-4.5 wiederholen.
  7. Trocknen Sie die Probe an der Luft.

5. Proteinverdauung auf der Grundlage von Suspensionseinträgen

HINWEIS: Das auf dem Suspensionsfilter basierende Proteinaufschlussverfahren wurde mit geringfügigen Änderungen an die Anweisungen des Herstellers angepasst.

  1. Bereiten Sie einen Suspensionspuffer vor (5 % SDS, 5 mM TCEP, 50 mM pH 8,5 TEAB in deionisiertem Wasser).
  2. Geben Sie 40 μl des Puffers in das Probenröhrchen und wirbeln Sie gründlich vortexen, um das luftgetrocknete Proteinpellet aufzulösen.
  3. Inkubieren Sie die Probe bei 100 °C und schütteln Sie sie bei 1.000 x g für 35 min.
  4. Geben Sie 10 μl des alkylierenden Reagenzes (100 mM Chloracetamid [CAA] in 100 mM pH 8,5 Tetraethylammoniumbromid [TEAB]) in die Probe.
  5. Inkubieren Sie bei RT unter Schütteln bei 300 x g für 1 h.
  6. Bereiten Sie ein Säuerungsmittel (10% Trifluoressigsäure [TFA] in entionisiertem Wasser) mit Vorsicht vor. Stellen Sie sicher, dass TFA, eine starke Säure, in einem chemischen Abzug gehandhabt wird.
  7. Geben Sie 5 μl Säuerungsmittel in die Probe, um eine Endkonzentration von 1 % TFA zu erreichen (endgültiges Probenvolumen: 55 μl).
  8. Überprüfen Sie den pH-Wert der Probe mit pH-Papier. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert kleiner als 1 ist.
  9. Geben Sie 350 μl Bindungs-/Waschpuffer-1 (0,1 M pH 8,5 TEAB in 90 % MeOH) in die Probe, um Proteine einzufangen.
    HINWEIS: Vermeiden Sie Vortexen und Zentrifugieren während des Proteineinfangs (Schritt 5.9), um Probenverluste zu vermeiden. Ausreichende Mengen an Protein sorgen für die Bildung von sichtbaren kolloidalen Proteinpartikeln mit einem durchscheinenden Aussehen.
  10. Setzen Sie die Suspensionsauffangsäule in ein 2-ml-Röhrchen ein und überführen Sie die gesamte Probe, einschließlich aller unlöslichen Materialien, in die Suspensionsauffangsäule.
  11. Zentrifugieren Sie die Säule bei 4.000 x g für 50 s, um Proteine einzufangen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Proben die Säule durchlaufen. Wenn nicht, wiederholen Sie die Zentrifugation bis zur vollständigen Filtration.
  12. 400 μl des Waschpuffers-2 (50 % CHCl3/50 % MeOH) in die Säule geben, bei 4000 x g für 50 s zentrifugieren und den Durchfluss verwerfen.
  13. Wiederholen Sie Schritt 5.12 dreimal.
  14. Fügen Sie 400 μl des Puffers-1 hinzu, zentrifugieren Sie 50 s lang bei 4000 x g und verwerfen Sie den Durchfluss.
  15. Wiederholen Sie Schritt 5.14 dreimal.
  16. Zentrifugieren Sie bei 4000 x g für 1,25 min, um den gesamten Durchgang von Puffer-1 zu gewährleisten.
  17. Übertragen Sie die Suspensionsauffangsäule für den enzymatischen Aufschluss in ein neues Probenröhrchen.
  18. Geben Sie 125 μl Aufschlusspuffer (0,16 μg/μl Trypsin/Lys-C in 50 mM pH 8,5 TEAB) in die Suspensionsauffangsäule und verschließen Sie sie, um eine Verdunstung zu verhindern.
    HINWEIS: Das Trypsin/Lys-C-Verhältnis sollte 1:10 (Gewicht/Gewicht) betragen. Stellen Sie sicher, dass mindestens 10 μg Trypsin/Lys-C für einen effektiven Aufschluss vorhanden sind.
  19. Bei 37 °C 18 h ohne Schütteln inkubieren.
  20. Bereiten Sie die folgenden Elutionspuffer vor: Puffer-1 (50 mM pH 8,5 TEAB in deionisiertem Wasser), Puffer-2 (0,2 % FA in deionisiertem Wasser) und Puffer-3 (50 % Acetonitril [ACN] in deionisiertem Wasser).
  21. 80 μl Elutionspuffer-1 in die Suspensionsfangsäule geben und 1,25 min bei 4000 x g zentrifugieren.
  22. Wiederholen Sie Schritt 5.20 mit 80 μl Elutionspuffer-2 und Puffer-3.
  23. Poolen Sie eluierte Peptide und übertragen Sie sie in ein sauberes, neues Röhrchen.

6. Quantifizierung von Peptiden

HINWEIS: Die meisten Schritte des quantitativen kolorimetrischen Peptidassays werden mit geringfügigen Änderungen an die Anweisungen des Herstellers angepasst. Es wird empfohlen, die Reagenzien gemäß den Richtlinien des Herstellers herzustellen.

  1. Bereiten Sie eine Reihe von Standards vor, indem Sie die Stammlösung des Standards (1 mg/ml) seriell verdünnen. Bei Bedarf sind die Proben mit einem Verdünnungsfaktor von 4 oder 5 zu verdünnen.
  2. Bereiten Sie das deionisierte Wasser als Blindwert und eine Mischung aus Elutionspuffer-1, Puffer-2 und Puffer-3 zu gleichen Anteilen als Probenkontrolle vor.
  3. Platzieren Sie 20 μl Standards, Blind-, Probenkontroll- und Probenmaterial in der Mitte jeder Mikrotiterplatten-Vertiefung.
  4. Geben Sie 180 μl des Arbeitsreagenzes in jede Vertiefung und mischen Sie die Platte 1 Minute lang gründlich auf einem Plattenschüttler.
  5. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 20 Minuten.
  6. Die Platte 3 min bei RT abkühlen lassen.
  7. Messen Sie die Extinktion der Vertiefungen bei 480 nm mit einem Plattenleser.
  8. Subtrahieren Sie den Absorptionswert von 480 nm des Blindwerts von dem aller Proben und der Probenkontrolle.
  9. Des Weiteren subtrahieren Sie den 480-nm-Absorptionswert der Blindprobenkontrolle von dem aller Proben.
  10. Plotten Sie die Standardkurve und verwenden Sie sie, um die Peptidkonzentration für jede Probe zu berechnen.

7. Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-Analyse

  1. Nach der Peptidquantifizierung werden 20 μg Peptide lyophilisiert.
  2. Peptide in 40 μl wässrigem Puffer (3 % ACN in 0,1 % Ameisensäure [FA]-Wasser) für 10 min in einem Ultraschallbad auflösen. Die resultierende Peptidkonzentration beträgt 0,5 μg/μl.
  3. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 60 min und überführen Sie die Proben in Fläschchen für die MS-Analyse.
  4. Injizieren Sie 2 μl jeder Probe mit dem Autosampler des nano LC-MS/MS-Systems.
  5. Trennen Sie die Peptide auf einer Umkehrphasensäule (0,075 mm ID x 150 mm Säule, gefüllt mit 3 μm C18-Material, unter Verwendung eines 127-minütigen Gradienten von 5 % bis 35 % Acetonitril bei 100 nL/min. Ionisieren Sie die Peptide über eine Nanospray-Ionenquelle und übertragen Sie sie in ein orbitrap-basiertes Massenspektrometer.
  6. Analysieren Sie Peptide unter Verwendung einer datenunabhängigen Erfassungsmethode mit engem Bereich21.
  7. Wenden Sie die folgende MS-Parametereinstellung an: MS m/z-Bereich: 495-745, Auflösungsziel: 15000, AGC-Ziel: 3 x 10E6, maximale Injektionszeit: automatisch, MS/MS-Fenster: Benutzerdefiniert (Ergänzende Datei 1), Auflösungsziel: 45000, AGC-Ziel 3 x 10E6, maximale Injektionszeit: automatisch, HCD-Kollisionsenergie: 22%, 26%, 30%.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, vor der Analyse eine erste Qualitätsprüfung des Geräts durchzuführen, indem Standardproben analysiert werden. Verwenden Sie die Datenerfassungssoftware MS, um die Parameter zu konfigurieren (siehe Materialtabelle).

8. Datenanalyse für die Proteomik-Suche

HINWEIS: Für die proteomische Suche von MS-Rohdaten wurden Open-Source-Tools verwendet, um das LC-MS-Datenformat zu konvertieren und eine Proteomsuche durchzuführen (siehe Materialtabelle). Die Parameter, die für die Datenanalyse verwendet werden, sind in der Zusatzdatei 2 aufgeführt. Grundlegende Anweisungen zur Verwendung von Open-Source-Tools finden Sie unter dem Link in der Materialtabelle.

  1. Konvertieren Sie die von der LC-MS erhaltenen Rohdateien des MS/MS-Spektrums (*.raw) mit Open-Source-Software in das *.mzML-Format.
  2. Verwenden Sie die formatkonvertierten Rohdateien (*.mzML) als Eingabe für eine Open-Source-Suchmaschine, um die Proteomsuche durchzuführen.
  3. Starten Sie die Proteomsuche basierend auf den Parametern, die in der Zusatzdatei 2 angegeben sind.

9. Statistische Auswertung

HINWEIS: Für die statistische Analyse zur Identifizierung differentiell exprimierter Proteine wurde ein Open-Source-Tool verwendet, um eine univariate Analyse durchzuführen (z. B. Student's t-Test; siehe Materialtabelle). Es wird empfohlen, sich über den Link in der Materialtabelle über die grundlegenden Nutzungsanweisungen für das Open-Source-Tool zu informieren.

  1. Importieren Sie die Liste der identifizierten Proteine (*.txt) in das Open-Source-Tool.
  2. Kategorisieren Sie Stichproben in Gruppen. Für diese Studie wurden zwei Gruppen benannt: SCN und IPMN.
  3. Führen Sie eine Log2-Transformation der Häufigkeitswerte durch, um die Datenverteilung an die annähernde Normalverteilung anzupassen.
  4. Wenden Sie einen Filterschritt an, um Proteine mit fehlenden Werten zu entfernen. In dieser Studie waren mindestens zwei gültige Werte in jeder Gruppe für die Aufnahme erforderlich.
  5. Imputieren Sie fehlende Werte mit einem auf Normalverteilung basierenden Ansatz, um eine umfassende Liste quantifizierter Proteine für die anschließende univariate Analyse zu erstellen.
  6. Führen Sie einen Student's t-Test durch, um differentiell exprimierte Proteine zwischen den beiden Gruppen zu identifizieren. In dieser Studie wurde die Benjamini-Hochberg-Korrektur der False Discovery Rate (FDR) angewendet.
  7. Extrahieren Sie die differentiell exprimierten Proteine, die die folgenden Kriterien erfüllen: Benjamini-Hochberg FDR < 0,05 und |fold- change| ≥ 2.

10. Bioinformatische Analyse

HINWEIS: Für die Überrepräsentationsanalyse wurde ein kommerzielles Bioinformatik-Tool verwendet (z. B. Ingenuity-Signalweganalyse, siehe Materialtabelle). Bevor Sie dieses Tool verwenden, wird empfohlen, die Anweisungen des Herstellers zu lesen.

  1. Importieren Sie die Liste der DEPs (*.txt) in das kommerzielle Tool.
  2. Initiieren Sie eine Kernanalyse, um eine Überrepräsentationsanalyse durchzuführen.
  3. Exportieren Sie signifikante kanonische Signalwege, die aus den DEPs angereichert sind, unter Verwendung des exakten Fisher-Tests (angepasster p-Wert < 0,05). Identifizieren Sie interessante Pfade, die für die Forschung relevant sind.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die etablierte Proteomik-Probenvorbereitung auf Basis von Suspensionsfallenfiltern, kombiniert mit markierungsfreier Quantifizierung mittels datenunabhängiger Single-Shot-Erfassung, wurde auf pankreaszystische FFPE-Gewebe angewendet (Abbildung 1). Eine präzise ROI-Isolierung während der FFPE-Gewebeaufbereitung wurde über verschiedene pankreaszystische FFPE-Gewebe hinweg erreicht (Abbildung 2A), was zur Aufnahme reproduzierbarer Gesamtionenchromatogramme zwischen...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und effiziente Proteomik-Methode, die ROIs verwendet, die aus FFPE-Gewebeschnitten isoliert wurden, die auf Glasobjektträgern montiert sind, um die pathologische Diagnose zu ermöglichen. Wenn ein chirurgischer Eingriff vorteilhaft ist, werden solide Neubildungen wie Krebs und Zysten chirurgisch reseziert und für die pathologische Beurteilung konserviert. Für die Langzeitlagerung werden Gewebe in Formalin fixiert und in Paraffin (FFPE) eingebettet...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Abbildungen in diesem Artikel wurden mit BioRender (http://www.biorender.com) erstellt. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt (Förder-Nr. RS-2023-00253403 und RS-2024-00454407).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1 % FA in ACN (LC-MS-Qualität)Fisher ChemicalLS120-212
0,1 % FA in Wasser (LC-MS-Qualität)Fisher ChemicalLS118-4
0,5 M TCEPThermo Scientific77720
10 % SDSInvitrogen2679093
1 M TEAB (pH 8,5)Sigma-Aldrich102545001
1 M Tris-cl (pH 8,5)BIOSOLUTIONBTO21
A-14C ZentrifugeSatorious167709
Aceton (HPLC-Qualität)Fisher ScientificA949-4
ACN (HPLC-Qualität)J.T.Baker9017-88
CHCl3 (HPLC-Qualität)Thermo Scientific022920.k2
CR-PapierADVANTEC70406001
DIA-NN ver 1.9 Open Source https://github.com/vdemichev/DiaNNProteomik-Suchmaschine 
EPOCH2 Mikroplatten-ReaderAgilent 
EthanolMERCKK50505283 836
FA (LC-MS-Qualität)Fisher ChemicalA117-50
Ingenuity Pathway Analysis (IPA)QIAGEN830018Bioinformatik-Tool
Lyophilisierer (SRF110R+Vaper-Trap)Thermo ScientificSRF-110-115
MeOH (HPLC-Qualität)MERCKUN1230
Mikroplatte BCA-Protein-Assay-Kit – kompatibel mit ReduktionsmittelThermo Scientific23252
MSConvert Open Source http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtmlMS Datentransformationssoftware
Orbitrap Exploris 480Thermo ScientificMA10813CMS
PepMAP RSLC C18 Trennsäule Thermo ScientificES903
PerseusOpen Sourcehttps://cox-labs.github.io/coxdocs/perseus_instructions.htmlStatistisches Tool
PIERCE Chloracetamid No-Weigh FormatThermo ScientificA39270
PIERCE Quantitativer kolorimetrischer Peptid-AssayThermo Scientific23275
PlattenschüttlerGreen SSerikerVS-202D
Sonden-UltraschallgerätVibraCellTMVCX750
Protein LoBind Tube 1,5mL Eppendorf22431081
QSP 10 µ L PipettenspitzeThermoScientific TLR102RS-Q
QSP 300 & micro; L PipettenspitzeThermo ScientificTLR106RS-Q
SkalpellBard-Parker372615
S-Trap: Schnelle universelle MS-ProbenvorbereitungPROTIFICO2-mini-40
SureSTART Vial 0,2 mLThermo Scientific6pk1655
TFASigma-Aldrich102614284
ThermoMixer CEppendorf5382
Trypsin/Lys-C (LC-MS-Qualität)PromegaV5073
Vanquish NEOThermo Scientific8348249LC
Wasser (HPLC-Qualität)HoneywellAH365-4
Xcalibur ver 4.7Thermo Scientific30966MS Datenerfassungssoftware
XylolSigma-Aldrich102033629
2106208

References

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