Method Article

Generierung und Charakterisierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Astrozyten, denen das fragile X-Boten-Ribonukleoprotein fehlt

DOI:

10.3791/68081

⸱

June 6th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Centre for High Impact Neuroscience and Translational Applications, TCG Centres for Research and Education in Science and Technology, 2Centre for Brain Development and Repair, 3National Centre for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research, 4Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen in funktionelle Vorderhirn-spezifische Astrozyten erleichtert. Dies ermöglicht die Untersuchung der Rolle von Gliazellen bei der Pathogenese von neurologischen Entwicklungsstörungen, wie dem Fragile-X-Syndrom, und die Modellierung anderer Hirnerkrankungen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Fragile-X-Syndrom (FXS), eine der Hauptursachen für Autismus-Spektrum-Störungen und geistige Behinderungen, wurde ausgiebig anhand von Nagetiermodellen untersucht. In jüngerer Zeit wurden auch von menschlichen Stammzellen abgeleitete Modellsysteme verwendet, um mechanistische Einblicke in die Pathophysiologie des FXS zu gewinnen. Diese Studien haben sich jedoch fast ausschließlich auf Neuronen konzentriert. Trotz zunehmender Beweise für eine Schlüsselrolle von Gliazellen bei der neuronalen Funktion bei Gesundheit und Krankheit ist wenig darüber bekannt, wie menschliche Astrozyten von FXS beeinflusst werden.

Aus diesem Grund haben wir in dieser Studie erfolgreich ein Protokoll entwickelt, das wichtige raumzeitliche Meilensteine der Gehirnentwicklung erfasst und auch mit dem Prozess der Gliogenese übereinstimmt. Zusammen bietet dies einen nützlichen Rahmen für die Untersuchung von neurologischen Entwicklungsstörungen. Zunächst haben wir die humanen induzierten pluripotenten Stammzellen in die neuroektodermale Linie mit dualem Suppressor of Mothers against Decapentaplegic (SMAD) Hemmung und kleinen Molekülen eingeordnet. Anschließend verwendeten wir spezifische Wachstumsfaktoren und Zytokine, um von Patienten stammende astrozytäre Vorläuferzellen (APCs) und FXS-Patienten zu erzeugen. Die Behandlung von APCs mit dem ziliären neurotrophen Faktor, einem differenzierenden Zytokin, regulierte und trieb die Vorläuferzellen zur astrozytären Reifung, was zu Vorderhirn-spezifischen Gliafibrillären, sauren Protein-exprimierenden Astrozyten führte.

Wir fanden heraus, dass diese Astrozyten funktionsfähig sind, was durch ihre Kalziumreaktionen auf die ATP-Anwendung belegt wird, und dass sie einen dysregulierten glykolytischen und mitochondrialen Stoffwechsel bei FXS aufweisen. Zusammengenommen bieten diese Ergebnisse eine nützliche experimentelle Plattform menschlichen Ursprungs für die Untersuchung zellautonomer und nicht-zellautonomer Folgen von Veränderungen der astrozytären Funktion, die durch neurologische Entwicklungsstörungen verursacht werden.

Introduction

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Das Fragile-X-Syndrom (FXS), eine häufige erbliche Form der geistigen Behinderung und der Autismus-Spektrum-Störung (ASS), wird durch den Mangel an fragilem X-Boten-Ribonukleoprotein (FMRP) verursacht, das vom fragilen X-Boten-Ribonukleoprotein 1 (FMR1)-Gen produziert wird (OMIM: #300624, https://www.omim.org/entry/300624). FMRP spielt eine Rolle bei der Regulation der mRNA-Translation, der mRNA-Granulierung und des mRNA-Transports sowie der microRNA-vermittelten Regulation der Genexpression1. Der Verlust von FMRP wirkt sich also nicht nur auf die Gehirnentwicklung, sondern auch auf die Gehirnfunktion von Erwachsenen aus. Sowohl die mRNA-Transkriptspiegel von FMR1 als auch die Immunfärbung für FMRP im Gehirn haben eine hohe neuronale Expression gezeigt, neben einer signifikanten Expression auch in Gliazellen2. Die überwiegende Mehrheit früherer Studien an Tiermodellen von FXS konzentrierte sich jedoch hauptsächlich auf Neuronen und Aberrationen in ihrer Funktion. Folglich ist wenig über die Rolle der Gliazellen bei FXS3 bekannt. Traditionellals "passive Unterstützungszellen" angesehen 4, gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass Astrozyten bei der Vermittlung einer Vielzahl von neuronalen Funktionen entscheidend sind 5,6, einschließlich der Förderung der Synaptogenese7, der Verfeinerung der Entwicklung neuronaler Schaltkreise8 und des Neurotransmitterrecyclings9. Parallel dazu gibt es immer mehr Beweise für die Rolle von Astrozyten bei der Pathogenese von Krankheiten, und viele neurologische Erkrankungen wurden mit astrozytärer Dysfunktion in Verbindung gebracht10.

Während sich ein Großteil der früheren Arbeiten mit Tiermodellen von FXS auf die Identifizierung und Validierung verschiedener molekularer Ziele in Neuronen zur Behandlung von FXS konzentrierte, haben diese präklinischen Befunde nicht immer zu erfolgreichen klinischen Ergebnissen geführt. Darüber hinaus unterstreichen auch Rückschläge in den jüngsten klinischen Studien die Notwendigkeit von humanbasierten Modellsystemen. Modelle neurologischer Erkrankungen, die auf aus menschlichen Stammzellen gewonnenen Gehirnzellen basieren, bieten eine leistungsstarke Strategie, um diese Lücke zwischen mechanistischen Erkenntnissen aus Tierversuchen und begrenztem Erfolg mit klinischen Ergebnissen für Patienten zu schließen. Allerdings hat sich nur eine Handvoll dieser Studien auf Astrozyten konzentriert, und zwar hauptsächlich auf Astrozyten, die spinalen Ursprungs sind. Dies wiederum ist relevant im Lichte von Studien, die zeigen, dass die Struktur und Funktion von Astrozyten zwischen den Hirnregionen variiert11,12. Um krankheitsinduzierte Veränderungen in menschlichen Astrozyten besser zu verstehen, müssen daher auch diese hirnregionenspezifischen Unterschiede in Astrozyten berücksichtigt werden. Modelle für neurologische Entwicklungsstörungen mit aus menschlichen Stammzellen gewonnenen Astrozyten, die spezifisch für das Vorderhirn sind, sind jedoch noch vergleichsweise wenig erforscht13. Um diese Lücken zu schließen, beschreiben wir daher Protokolle zur Generierung von Vorderhirn-spezifischen Astrozyten aus patienteneigenen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), die FXS-Mutationen tragen; Darüber hinaus zeigen wir, dass Astrozyten funktionsfähig sind und einen veränderten Stoffwechsel aufweisen.

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Protocol

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Alle Experimente mit humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) (Tabelle 1) wurden nach Erhalt der entsprechenden institutionellen behördlichen Genehmigungen durchgeführt. Abbildung 1A zeigt das vollständige Differenzierungsprotokoll von hiPSCs zu reifen Vorderhirn-spezifischen Astrozyten.

1. Erhaltung und Ausbau von hiPSCs

  1. Einen Tag vor dem Plattieren der iPSCs eine 6-Well-Schale mit 1:60 verdünntem Matrigel (einer extrazellulären Matrix [ECM]) in Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) beschichten und bei 2-8 °C lagern.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, mit Matrigel beschichtete Gerichte >5 Tage bei 2-8 °C zu lagern, da dies im Laufe der Zeit zu einem Proteinabbau in der EZM führen kann. Um ein Austrocknen der Schüssel zu vermeiden, beschichten Sie mindestens 1 ml 1:60 verdünntes Matrigel pro Mulde einer 6-Well-Schale und verteilen Sie sie gleichmäßig auf der Schüssel. Wenn Sie die Platte am selben Tag verwenden, bewahren Sie sie 1 h lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 auf.
  2. Am Tag der Kultivierung der hiPSCs entfernen Sie das Beschichtungsmaterial und fügen Sie 1 ml vollständiges Essential 8 Medium (E8 Basalmedium mit Essential 8 Supplement) zusammen mit dem ROCK Inhibitorat 1x Endkonzentration hinzu und bewahren Sie die Schale in einem 37 °C und 5 % CO2 -Inkubator auf, bevor Sie die hiPSCs hinzufügen.
  3. Resuspendieren Sie die hiPSCs in vollständigem E8-Medium zusammen mit dem ROCK-Inhibitor in 1x Endkonzentration, um eine bessere Adhärenz der Kolonien zu gewährleisten.
    HINWEIS: Bereiten Sie keine großen Mengen an Nährmedium vor. Nur maximal 3-4 Tage zubereiten und bei 2-8 °C lagern.
  4. Am nächsten Tag füllen Sie das gesamte E8-Medium ohne den ROCK-Inhibitor auf, bis die Zellen zu 80 % konfluent sind (ca. 4-5 Tage).
  5. Wenn sie eine Konfluenz von 80 % erreichen, lösen Sie die Kolonien enzymatisch ab.
    1. Um die iPS-Zellen zu passieren, nehmen Sie das verbrauchte Medium aus der Schale und fügen Sie 1 ml pro Vertiefung einer vorgewärmten (37 °C) Mischung aus Kollagenase (2 mg/ml) und Dispase (1 mg/ml) in einem Verhältnis von 1:1 hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für mehr als 20-30 Minuten, damit sich die iPS-Kolonien anheben können.
      HINWEIS: Lassen Sie das Geschirr nicht länger als 20-30 Minuten bei 37 °C stehen; Nach dieser Zeit werden sich die Kolonien auflösen und die Zellen sterben ab.
  6. Wenn sich die Bienenvölker zu heben beginnen, nehmen Sie die Schalen aus dem Inkubator und neutralisieren Sie die Enzymaktivität, indem Sie 2 ml Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) hinzufügen.
  7. Kratzen Sie die Kolonien mit DPBS ab und sammeln Sie die Suspension in einem konischen 15-ml-Röhrchen mit einer serologischen 10-ml-Pipette mit breiter Bohrung.
  8. Zerreiben Sie die Suspension vorsichtig 2-3x, um die Kolonien mit einer serologischen 10-ml-Pipette aufzubrechen, und lassen Sie die Völker sich setzen.
    HINWEIS: Machen Sie die Kolonien nicht zu einzelnen Zellen; Dies kann dazu führen, dass die Zellen nicht an der Schale haften und mehr Zelltod verursachen. Lasst sie ferner nicht als große Völker zurück; Dies wird später zu differenzierteren Kolonien führen.
  9. Sobald sich die Kolonien beruhigt haben (ca. nach 2 Minuten), aspirieren Sie das DPBS-Enzymgemisch und lassen Sie etwa 1 ml im Röhrchen.
  10. Geben Sie 2 ml DPBS in das Röhrchen, mischen Sie die Kolonien durch Klopfen und lassen Sie sie absetzen. Wiederholen Sie dies 2x, um alle Enzymreste aus den Kolonien zu entfernen. Entfernen Sie nach der 2. Wäsche so viel Überstand wie möglich, resuspendieren Sie die Kolonien in 1 ml vollständigem E8-Medium und geben Sie es in eine frisch zubereitete Schüssel, wie in den Schritten 1.2-1.3 beschrieben.
  11. Alternativ können Sie einen Teil der Kolonien mit 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) als Kryoprotektivum für die zukünftige Expansion und Verwendung kryokonservieren.
    1. Bereiten Sie das Kryokonservierungsmedium frisch vor, indem Sie 90 % vollständiges E8-Medium und 10 % DMSO als Kryoprotektivlösung mischen und bis zur Verwendung bei 2-8 °C erhitzen.
  12. Um Kryokonservierung durchzuführen, befolgen Sie die Schritte 1.5-1.10.
  13. Lassen Sie die Völker in Schritt 1.10 nach dem 2. Waschen absetzen und entfernen Sie den Überstand. Zu den Kolonien 1 ml frisch zubereitetes kaltes Kryokonservierungsmedium geben und in Kryoröhrchen umfüllen.
    HINWEIS: Nachdem Sie das Kryokonservierungsmedium zu den Kolonien hinzugefügt haben, füllen Sie den Inhalt schnell in Kryoröhrchen um. Eine Verzögerung kann zu einer geringeren Wiederbelebungsrate führen, da DMSO ein Kryoprotektivum ist, das Zellen schädigen kann.
  14. Stellen Sie die Kryofläschchen sofort in eine Kryobox und bewahren Sie sie über Nacht in einem -80 °C Gefrierschrank auf.
  15. Lagern Sie am nächsten Tag alle Kryoröhrchen für die zukünftige Verwendung in einen Flüssigstickstofftank (LN2-Tank ).
    HINWEIS: hiPS-Zellen sollten routinemäßig mittels G-Banding (Ergänzende Abbildung S1) auf Anomalien karyotypisiert, mittels Immunzytochemie auf Pluripotenz charakterisiert (Abbildung 1B) und auf Mykoplasmen getestet werden.
    1. Um hiPSCs mittels Immunzytochemie zu charakterisieren, plattieren Sie die Kolonien auf 1:60 Matrigel-beschichteten, autoklavierten 13-mm-Glasdeckgläsern. Sobald sie zu 40 % konfluent sind, waschen Sie die Zellen mit PBS-T (PBS-0,1 % Tween 20), fixieren Sie sie 10 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd, permeabilisieren Sie 10 Minuten lang mit 0,3 % Triton X-100 in PBS und blockieren Sie 1 h lang mit 3 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS, um eine unspezifische Bindung zu verhindern.
    2. Nach dem Blocken die Kulturen mit Primärantikörpern für 1 h inkubieren und anschließend 3x mit PBS-T für jeweils 5 min waschen, anschließend entsprechende Sekundärantikörper (Table of Materials) im Dunkeln für 1 h waschen.
    3. Montieren Sie die Deckgläser mit Eindeckmedium auf Objektträger und nehmen Sie Bilder durch konfokales Laserscanning bei 405 nm, 488 nm, 561 nm und 633 nm auf. Nehmen Sie Bilder mit 512 x 512 Pixeln auf; Stellen Sie die Z-Schrittweite auf 0,5 μm mit 1 luftigen Einheit Lochblendendurchmesser ein.

2. Erzeugung und Charakterisierung astrozytärer Vorläuferzellen (APCs)

  1. Heben Sie die hiPSCs enzymatisch an, wie in den Schritten 1.5-1.10 erwähnt, und geben Sie sie auf eine nicht adhärente Suspensionskulturschale (100 mm) mit chemisch definiertem Medium14, das 50 % Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), 50 % Ham's F-12 Nutrient Mix (F12), 5 mg/mL BSA, 1 % chemisch definiertes Lipidkonzentrat (CD-Lipid), 450 μM Monothioglycerin, 7 μg/mL Insulin, 15 μg/mL Transferrin enthält. 1% Penicillin-Streptomycin, ergänzt mit den Mitogenen N-Acetylcystein (1 mM), LDN 193189 (0,1 μM) und SB431542 (10 μM) für 7 Tage.
    HINWEIS: Die niedermolekularen Inhibitoren SB431542 und LDN-193189 (LDN) sind Inhibitoren des knochenmorphogenetischen Proteins und der transformierenden Wachstumsfaktor-beta-Signalwege.
    Von diesem Zeitpunkt an wurde das Medium einmal in 2 Tagen oder nach dem Montag/Mittwoch/Freitag-Protokoll aufgefüllt.
  2. Legen Sie die Zellsuspension 7 Tage lang unter normoxischen Bedingungen bei 40 U/min auf einen Orbitalschüttler, um die Entwicklung von Kortikosphären zu unterstützen (Abbildung 1A).
  3. Übertragen Sie die Kortikosphären an Tag 8 7 Tage lang in ein Zellproliferationsmedium, das Advanced DMEM/F12 mit 1 % Antibiotikum-Antimykotikum, 1 % N2-Supplement, 1 % Glutaminersatz, 0,1 % B27-Supplement und 2,5 ng/ml basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) enthält.
  4. Induzieren Sie die Kugeln für die Gliaspezifikation, indem Sie sie 2 Wochen lang einem Gliaanreicherungsmedium aussetzen, das Advanced DMEM/F12 mit 1 % Antibiotikum-Antimykotikum, 1 % N2, 1 % Glutaminersatz, 0,1 % B27-Supplement, 20 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), bFGF-H (20 ng/ml bFGF-5 mg/ml Heparin) enthält, um frühe Gliosphären zu erhalten (Abbildung 1A).
  5. Für die Reifung der frühen Gliosphären ersetzen Sie bFGF-H durch 20 ng/ml Leukämie-Hemmfaktor (LIF) und halten Sie die Kugeln 4 Wochen lang.
  6. Nach 4 Wochen im Reifemedium halten Sie die Kugeln über einen längeren Zeitraum im Gliaanreicherungsmedium. Um eine Aggregation und einen Verlust der Lebensfähigkeit zu verhindern, werden die Gliosphären alle 2 Wochen mit einer sterilen Industrieklinge mechanisch zerkleinert und das gesamte Medium durch DNase I ersetzt, um DNA-Fragmente zu entfernen, die beim Zerkleinern entstehen.
  7. Dissoziieren Sie die Gliosphären mit einem Papain-Dissoziationskit in Monoschichten von APCs und plattieren Sie sie mit einer 1:80-Verdünnung der Matrigel-Beschichtung auf eine mit Zellkulturen behandelte Adhärentschale.
  8. Vermehren Sie die APCs in glialem Anreicherungsmedium, bis sie zu 80 % konfluiert sind, und passagen Sie sie enzymatisch mit dem Enzymzellablösemedium (siehe Materialtabelle).
  9. Zur Passage:
    1. Entfernen Sie das verbrauchte Medium und sammeln Sie es in einem konischen Rohr. Geben Sie das Enzym Zellablösungsmedium in die Zellen und warten Sie 1-2 min. Sobald sich die Zellen abzulösen beginnen, fügen Sie das verbrauchte Medium hinzu, um die Enzymaktivität zu neutralisieren.
    2. Sammeln Sie die Zellsuspension und zentrifugieren Sie sie 2 Minuten lang bei 800 x ɡ .
    3. Aspirieren Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in glialem Anreicherungsmedium und geben Sie ca. 1 x 106 Zellen/Vertiefung in eine 1:80 Matrigel-beschichtete 6-Well-Schale.
  10. Für die Kryokonservierung:
    1. Resuspendieren Sie die Zellen in einer kalten Mischung aus 90 % Kortikosphären-Proliferationsmedium (ohne bFGF) und 10 % Kryoprotektivum. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in Kryofläschchen.
    2. Stellen Sie die Kryofläschchen sofort in eine Kryobox und bewahren Sie sie über Nacht im -80 °C Gefrierschrank auf.
    3. Lagern Sie am nächsten Tag alle Kryoröhrchen für die zukünftige Verwendung in einen Flüssigstickstofftank (LN2-Tank ).
      HINWEIS: APCs wurden mit 10 % DMSO bis zur Passage Nummer 6 kryokonserviert.
  11. Charakterisieren Sie die dissoziierten APCs durch Immunfärbung (wie in den Schritten 1.15.1-1.15.3 beschrieben) mit Vimentin- und Nuclear Factor IA (NFIA)-Markern (Abbildung 1C,D) (siehe Materialtabelle für Verdünnungen).
  12. Um die regionale Spezifität von hiPSC-abgeleiteten APCs im Vorderhirn zu bestätigen, testen Sie die Zellen mittels Echtzeit-qPCR auf einen Vorderhirnmarker wie die humane Forkhead-Box G1 (hFOXG1) (positiv) und einen Hinterhirnmarker wie die humane Homeobox B4 (hHOXB4) (negativ) (Abbildung 1E,F).
    HINWEIS: Die für diese Experimente verwendeten Primersequenzen sind in der ergänzenden Tabelle S1 aufgeführt.

3. Generierung und Charakterisierung einer homogenen Population von Vorderhirn-spezifischen Astrozyten

  1. Unterscheidung von Astrozyten von APCs
    1. Verwenden Sie 14 Tage lang das astrozytäre Differenzierungsmedium (ADM), um APCs in Astrozyten zu differenzieren. Das astrozytäre Differenzierungsmedium enthält Neurobasal, 1 % Antibiotikum-Antimykotikum, 1 % Glutaminersatz, 1 % N2-Supplement, 0,2 % B27-Supplement, 1 % nicht-essentielles Aminosäuremedium (NEAA) und 10 ng/ml ziliärer neurotropher Faktor (CNTF).
    2. Bestätigung der astrozytären Identität durch Immunfärbung (wie in den Schritten 1.15.1-1.15.3 erwähnt) mit saurem Gliafibrillärprotein (GFAP) und S100β-Expressionsmarkern (Abbildung 2A,B).
  2. De-novo-Proteinsynthese in APCs und Astrozyten
    1. Bewahren Sie hiPSC-abgeleitete APCs und Astrozyten des Vorderhirns auf sterilen 13-mm-Glasdeckgläsern auf und färben Sie sie immunfärblich, wie in den Schritten 1.15.1-1.15.3 beschrieben.
    2. Für die De-novo-Proteinsynthese verwenden Sie die FUNCAT-Methode (Fluoreszierendes nicht-kanonisches Aminosäure-Tagging), die in den Schritten 3.2.3 bis 3.2.6 kurz erläutert wird (Abbildung 3A).
    3. Um einen Mangel an Methionin zu gewährleisten, entfernen Sie das Wachstumsmedium aus den Kulturen und ersetzen Sie es durch methionin- und cysteinfreies Medium, gemischt mit 1 mM L-Azidohomoalanin (AHA) für 30 min bei 37 °C und 5 % CO2.
    4. Waschen Sie die Kulturen mit PBS-T, fixieren Sie sie 10 min lang mit 4 % Paraformaldehyd, permeabilisieren Sie sie 10 min lang mit 0,3 % Triton X-100 in PBS und blockieren Sie sie 1 h lang mit 3 % BSA in PBS, um eine unspezifische Bindung zu verhindern.
    5. Inkubieren Sie die Kulturen 1 h lang im Dunkeln bei Raumtemperatur mit Click-Zellchemie-Reaktionsmix und Alkin-Alexa-Fluor 647, gefolgt von Primärantikörpern für 1 h und entsprechenden Sekundärantikörpern (Materialtabelle) für 1 h (Abbildung 3B).
    6. Montieren Sie die Deckgläser mit Montagemedium auf Objektträger und verwenden Sie diese für die weitere Bildanalyse.
      1. Erfassen Sie Bilder durch konfokales Laserscanning bei 405 nm, 488 nm, 561 nm und 633 nm.
      2. Nehmen Sie Bilder mit 512 x 512 Pixeln auf; Stellen Sie die Z-Schrittweite auf 0,5 μm mit 1 luftigen Einheit Lochblendendurchmesser ein.
      3. Halten Sie die Mikroskopie- und Bildgebungsparameter für alle Zelltypen auf einer konstanten Einstellung. Erfassen Sie Bilder für jedes biologische Replikat in derselben Sitzung.
      4. Führen Sie Intensitätsmessungen mit einer beliebigen Standard-Bildanalysesoftware (z. B. Fiji oder Imaris) durch. Verwenden Sie in Imaris das SURFACES-Modul, um volumetrische Messungen von Zellkörpern zu erhalten, die positiv für das FUNCAT-Signal (Fluoresscent non-canonical Amino Acid Tagging) mit Vimentin (APCs) und GFAP (Astrozyten) sind, wodurch der Voxelbereich (250-350) begrenzt wird, um Ablagerungen zu entfernen.
        HINWEIS: Behalten Sie die Parameter für alle biologischen Replikate für beide Zelltypen bei.
  3. Adenosin-5'-Triphosphat (ATP)-induzierte oszillatorische Calciumwellen
    1. Teller Astrozyten auf einer Glasbodenschale (35 mm) bei 5 × 103 Zellen/Schale, um die zelluläre Reaktion auf ATP zu messen.
    2. Lassen Sie die Zellen 24 h am Glasboden haften, waschen Sie sie 3x mit HBSS (20 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glucose, 1 mM MgCl2, pH = 7,3) ohne Calcium und inkubieren Sie in Kulturmedium mit dem metrischen Farbstoff Fura-2AM mit einem Verhältnis von 5 μM und 0,02 % Pluronics F127 für 1 h bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Fura-2AM ist eine licht- und temperaturempfindliche Chemikalie; Bei -20 °C lagern.
    3. Nach der Inkubation 2x mit Kulturmedium waschen und durch 2 mM Ca2+ ersetzen, das HBSS enthält, und die Zellen mit einer Geschwindigkeit von 2 FPS unter Verwendung eines 60-fachen Ölobjektivs (1,35 NA) in einem inversen Mikroskop mit Fokusdrift-Kompensation abbilden.
    4. Aufzeichnung von ATP-induzierten Calciumreaktionen durch Badapplikation von ATP in der Endkonzentration von 5 mM bei 25μs (Abbildung 4A).
    5. Zeichnen Sie mit Fiji/ImageJ interessante Bereiche um jede Zelle und berechnen Sie das Verhältnis F340/F380 über alle Zeitpunkte (Abbildung 4B).
  4. Assays für den Zellstoffwechsel
    HINWEIS: Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und die extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) lebender Zellen wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen (siehe Materialtabelle).
    1. Lassen Sie die Astrozyten einen Tag vor dem Assay an der Mikroplatte (1,5 × 104 Aussaatdichte) in CNTF-Medium haften und inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO2.
    2. Für den Glykolyse-Stress-Assay:
      1. Ersetzen Sie das Zellkulturmedium durch ein Basismedium, das mit 2 mM Glutamin (pH-Wert auf 7,4 eingestellt) ergänzt wurde, und inkubieren Sie in einer Nicht-CO2 -Kammer bei 37 °C für 1 h.
        HINWEIS: Der pH-Wert muss in einem 37 °C warmen Wasserbad eingestellt werden.
      2. Setzen Sie die Patronenplatte in das Gerät ein, um den Sensor zu kalibrieren. Ersetzen Sie nach der Kalibrierung die Kartuschenplatte durch die Zellkulturplatte mit einer Endkonzentration der folgenden Kit-Komponenten: 10 mM Glukose, 1 μM Oligomycin und 50 mM 2-Desoxyglukose (2-DG) (Abbildung 5A).
      3. Am Ende des Tests lysieren Sie die Zellen und schätzen Sie den Gesamtproteingehalt.
    3. Für den Mitochondrien-Stress-Assay:
      1. Ersetzen Sie das CNTF-Medium durch ein Basismedium, das mit 2 mM Glutamin, 1 mM Pyruvat und 10 mM Glukose (pH-Wert auf 7,4 eingestellt) in einem Wasserbad bei 37 °C ergänzt wird.
      2. Die Platte wird in einer Nicht-CO2 -Kammer bei 37 °C 1 h lang inkubiert. Setzen Sie in der Zwischenzeit die Patronenplatte in das Gerät ein, um den Sensor zu kalibrieren.
      3. Ersetzen Sie nach der Kalibrierung die Kartuschenplatte durch die Zellkulturplatte mit einer Endkonzentration der folgenden Kit-Komponenten: 1,5 μM Oligomycin, 1 μM Carbonylcyanid-4 (Trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP) und 0,5 μM Rotenon/Antimycin A (Abbildung 5C).
      4. Am Ende des Tests lysieren Sie die Zellen und schätzen Sie den Gesamtproteingehalt.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Kolonien humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSC) wurden unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen definierten Mediums gehalten und mit den Pluripotenzmarkern Oct4 und Nanog immungefärbt (Abbildung 1B). FXS- und CTRL-APCs zeigten vergleichbare hochangereicherte Anteile von Zellen, die immunpositiv für Vimentin und NFIA waren (Abbildung 1C,D). Wir fanden heraus, dass APCs, die von gesunden u...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir eine Methode zur Generierung humaner iPSC-abgeleiteter Astrozyten, die als Assay-Plattform zur Charakterisierung funktioneller Veränderungen dienen, die durch FXS induziert werden. Diese Astrozyten sind in Kultur funktionell lebensfähig und weisen verschiedene Eigenschaften auf, wie eine Reihe von Messungen in der vorliegenden Studie zeigt. Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die anfängliche Umwandlung von iPSCs in Kortikosphären mit der enzymatischen Lift...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Prof. Sumantra Chattarji für die internen Fonds. Wir danken Prof. Gaiti Hasan für den Zugang zum Calcium-Imaging-Setup, der Central Imaging and Flow Facility - National Centre for Biological Sciences, Padmanabh Singh und Prangya Hota für das Korrekturlesen und die Vorschläge und dem Team von Labmate Asia für ihre Unterstützung bei der Durchführung von Seahorse XF-Assays.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-ThioglycerolSigma-AldrichM6145
Accutase  LösungSigma-AldrichA6964Medium zur Ablösung von Enzymzellen 
Adenosin 5′-triphosphat MagnesiumsalzSigma-AldrichA9187
Advanced DMEM/F-12ThermoFisher Scientific12634010
Antibiotikum-Antimykotikum (100x)ThermoFisher Scientific15240062
B-27 Supplement (50x), serumfreiThermoFisher Scientific17504044
RinderserumalbuminSigma-AldrichA9418
Chemisch definiertes LipidkonzentratThermoFisher Scientific11905031
Kollagenase, Typ IV, PulverThermoFisher Scientific17104019
Desoxyribonuklease IWorthington Biochemical CorporationLK003170
DimethylsulfoxidSigma-AldrichD2650
Dispase II, PulverThermoFisher Scientific17105041
DPBS, kein Kalzium, kein MagnesiumThermoFisher Scientific14190144
Essential 8 MediumThermoFisher ScientificA1517001
FXS1, FXS2 Coriell Institut für medizinische Forschung GM07072, GM05848FXS-Patientenzellen
GlutaMAX SupplementThermoFisher Scientific35050061Glutaminersatz
Ham's F-12 NährstoffmischungThermoFisher Scientific11765054
Gesunde Kontrollzellen Cedars-Sinai Medizinisches Zentrum ND30625gesunde Kontrollzellen 
Heparin-Natriumsalz aus der Darmschleimhaut des SchweinsSigma-AldrichH3149
IMDMThermoFisher Scientific12440053
Insulin, humanesRoche 11376497001
LDN 193189 StratechScientific S2618-SEL
Leukämie-Hemmfaktor humanerSigma-AldrichL5283
Matrigel  Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Basalmembran-MatrixCorning354230
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)ThermoFisher Scientific11140050
Maus FGF-basisch (FGF-2/bFGF) Rekombinantes ProteinPeprotech450-33
Mr. Frosty GefrierbehälterThermoFisher Scientific5100-0001Kryobox
N-2 Ergänzung (100x)ThermoFisher Scientific17502048
N-Acetyl-L-CysteinSigma-AldrichA9165
Neurobasales MediumThermoFisher Scientific21103049
Nunc Biobank- und Zellkultur-KryoröhrchenThermoFisher Scientific377267
Nunc Zellkulturbehandelte 6-Well-SchaleThermoFisher Scientific140675
Papain-DissoziationssystemWorthington Biochemical CorporationLK003150
Penicillin-StreptomycinThermoFisher Scientific15140122
rekombinantes humanes CNTF-Protein, CF Forschung & Forschung D Systems257-NT-010
Rekombinantes humanes EGF-Protein, CFF& D Systems236-EG-01M
RevitaCell Supplement (100x)ThermoFisher ScientificA2644501
SB431542Tocris1614
Seahorse XFe24 Analysator Agilent Technologies
Seahorse XF Cell Mito Stresstest-KitAgilent Technologies103015-100
Seahorse XF Glykolyse-Stresstest-KitAgilent Technologies103020-100
Gewebekulturschalen-100 cmBiostar LifetechTCD000100
TransferrinRoche10652202001
VWR Rasierer KlingenVWR International55411-050
Antikörper 
Primärer AntikörperCompanyKatalognummer<strong>Verdünnung
Oct4 (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279Verdünnung: 1:250
Sekundärer Antikörper: Ziegen-Anti-Maus-IgG, Alexa Fluor 568
NanogR & D SystemsAF1997Verdünnung: 1:100
Sekundärer Antikörper: Esel Anti-Ziegen IgG, Alexa Fluor 488
VimentinAbcamAb5733Verdünnung: 1:500
Sekundärer Antikörper: Ziege Anti-Chicken IgY, Alexa Fluor 488
NFIAAbcamAb41851Verdünnung: 1:500
Sekundärer Antikörper: Ziege anti-Kaninchen IgG, Alexa Fluor 568
GFAP-cy3SigmaC9205Verdünnung: 1:500
Sekundärer Antikörper: NA
GFAPDAKOZ0334Verdünnung: 1:500
Sekundärer Antikörper: Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, Alexa Fluor 568
S100βDAKOIR504Verdünnung: 1:500
Sekundärer Antikörper: Ziege Anti-Kaninchen IgG, Alexa Fluor 488
Anti-Nuklei Antikörper, Klon 235-1Merck MilliporeMAB1281Verdünnung: 1:1000
Sekundärer Antikörper: Ziege Anti-Maus IgG1, Alexa Fluor 555
Sekundäre Antikörper  Verdünnung
Ziege Anti-Maus-IgG, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientsp;A110041:1000
Esel Anti-Ziegen IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110551:1000
Anti-Hühner-IgY, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110391:1000
Ziege Anti-Kaninchen IgG, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific A110111:1000
Ziege Anti-Kaninchen IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scient A110341:1000
Ziege Anti-Maus IgG1, Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific A211271:1000

References

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