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Verhaltenscharakterisierung von Pentylentetrazol-induzierten Anfällen: Über die Racine-Skala hinaus

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DOI:

10.3791/68112

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8. Juli 2025

 ,  , 
1Brain Institute, Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll stellt eine innovative Methode zur Analyse und Visualisierung von Verhaltensweisen vor, die mit Pentylentetrazol-induzierten Anfällen bei Mäusen verbunden sind. Dieser Ansatz geht über die traditionellen Racine-Scores hinaus und bietet eine umfassendere Bewertung der Diversität und zeitlichen Dynamik iktaler Verhaltensweisen.

Zusammenfassung

Eine detaillierte Verhaltenscharakterisierung von Anfällen ist in Tiermodellen der Epilepsie unerlässlich. Obwohl es verschiedene Protokolle zur Induktion von Anfällen gibt, ist die Racine-Skala nach wie vor die am weitesten verbreitete Methode zur Quantifizierung von Anfällen. Ursprünglich entwickelt, um die progressive Rekrutierung von Verhaltensweisen während des elektrischen Entzündens limbischer Strukturen zu bewerten, ist die Skala seitdem zum Standard für die Klassifizierung von Anfällen in Modellen mit unterschiedlichen Ätiologien geworden.

Eine sorgfältige Untersuchung des Verhaltens nach Verabreichung von Pentylentetrazol (PTZ), einem häufig verwendeten Anfallsmodell, zeigt jedoch, dass die Racine-Skala nicht das gesamte Spektrum der Verhaltensänderungen erfassen kann, die durch diesen GABAergen Antagonisten induziert werden. Nach einer einzigen subkutanen Hochdosis-PTZ-Injektion zeigen Mäuse zunächst nicht-konvulsive Verhaltensweisen wie Hypotonie, verminderte Gehfähigkeit, Verhaltensstillstand und Zittern. Diese werden durch iktale Verhaltensweisen wie Krämpfe, myoklonische Zuckungen und limbische Anfälle abgelöst, obwohl nur letztere durch die Racine-Skala quantifiziert werden.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, wird ein verfeinerter Ansatz verwendet, der Video-Tagging mit Tierverfolgung kombiniert, um Krämpfe und Myoklonus als unterschiedliche Verhaltensausdrücke von limbischen Anfällen zu unterscheiden. Diese frühen Verhaltensweisen können die Rekrutierung limbischer Strukturen erleichtern und schließlich limbische Anfälle auslösen. Die Methode ist einfach zu implementieren und ermöglicht eine umfassendere Beurteilung von PTZ-induzierten akuten Anfällen. Sein Nutzen zeigt sich auch im PTZ-Anzündprotokoll, bei dem wiederholte niedrige Dosen von PTZ zu zeitlichen Veränderungen der Krämpfe, des Myoklonus und der Schwere der limbischen Anfälle führen. Dieser Ansatz birgt das Potenzial, die Reproduzierbarkeit in der Anfalls- und Epilepsieforschung zu verbessern.

Einleitung

Die Verhaltenscharakterisierung von Anfällen ist die am häufigsten verwendete Methode in Studien zur Pathophysiologie von Epilepsie und Anfallsaktivität und wird häufig für das Screening neuer Medikamente gegen Krampfanfälle verwendet 1,2. Die meisten Arbeiten, die in den letzten 50 Jahren veröffentlicht wurden, verwendeten das von Ronald J. Racine entwickelte progressive Score-System, um den Schweregrad von Anfällen während der Amygdala und des Hippocampus zu beschreiben3. Die Racine-Skala zeigte eine starke Korrelation zwischen Verhalten und elektrophysiologischer paroxysmaler Aktivität bei Ratten3 und Katzen4. Sie klassifiziert den Verhaltensausdruck des Anfalls in fünf progressive Stadien: "(i) Mund- und Gesichtsbewegungen, (ii) Kopfnicken, (iii) Klonus der Vordergliedmaßen, (iv) Aufbäumen und (v) Aufbäumen und Fallen"3. Aufgrund ihrer Einfachheit, Benutzerfreundlichkeit und Interpretation, der Geschwindigkeit der Bewertung und der Reproduzierbarkeit nimmt die Verwendung der Racine-Skala in Epilepsie- und Anfallsstudien auch heute noch weiter zu (Abbildung 1).

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Abbildung 1: Anzahl der jährlichen Zitate, die in Racines Studie von 1972 eingegangen sind. Beachten Sie den stetigen Anstieg der Anzahl der Zitate in den letzten 50 Jahren. Eine am 27. November 2024 durchgeführte Suche im Web of Science ergab 6.040 Zitate, und 91 Datensätze enthielten keine Informationen im Feld "Erscheinungsjahr". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Skala wurde dann auf andere Tiermodelle für Epilepsie und Krampfanfälle angewendet, einschließlich solcher, die Medikamente zur Auslösung von Anfällen verwendeten. Die frühen Beschreibungen der Kainsäure-induzierten Anfälle5 und des Status epilepticus (SE)6 sowie der lokalen7 und der systemischen Pilocarpin-induzierten SE8 verwendeten die Racine-Skala, um sowohl induzierte als auch spontane Anfälle zu quantifizieren. Interessanterweise induzierten diese Medikamente nicht nur limbische Anfälle, wie sie bei den elektrisch stimulierten Tieren beobachtet und von Racine beschrieben wurden, sondern sie lösten auch eine Reihe anderer Verhaltensweisen aus, die schlecht oder seltener beschrieben wurden9.

Die Grenzen der Racine-Skala, um die Vielfalt der iktalen Verhaltensweisen zu erfassen, wurden früh von Forschern identifiziert, die Anfallsmodelle verwendeten, in denen der Anfallsfokus in anderen Gehirnregionen als dem limbischen System liegt. Zum Beispiel war Garcia-Cairasco einer der ersten, der ethologische Werkzeuge zur Bewertung des Verhaltens bei audiogenen Anfälleneinsetzte 10 und die Komplexität und den zeitlichen Verlauf des iktalen Verhaltens aufdeckte10,11. Kürzlich nutzte Ivan Soltesz eine ausgeklügelte Videotiefenanalyse und eine detaillierte zeitliche Kodierung, um "versteckte Verhaltensfingerabdrücke" bei elektrisch entzündeten Ratten aufzudecken12. Aufbauend auf diesen Ansätzen wird hier ein neuartiges Codierungssystem für Pentylentetrazol-induzierte akute Anfälle bei Mäusen vorgestellt.

Pentylentetrazol (PTZ) führt zu Krampfanfällen, indem es die GABAerge Neurotransmissionhemmt 13, was zu einer erhöhten neuronalen Erregbarkeit und einer synchronen Aktivierung der neuronalen Populationen führt14,15. Nach einer einmaligen hohen Dosis (40-80 mg/kg) systemischer PTZ zeigen Nagetiere eine eingeschränkte Mobilität, unspezifische Schnurrhaarbewegungen, Ganzkörperkrämpfe und myoklonische Zuckungen, orofazialen und Pfotenklonus sowie ausgewachsene limbische Anfälle16. Im Gegensatz zu den Status epilepticus-Modellen dauert das abnormale Verhalten nach PTZ bis zu 1 h und lässt spontan nach 16,17,18 zurück. Frühere Autoren haben eine überarbeitete Version der Racine-Skala für Ratten17 und Mäuse18 vorgeschlagen. Trotz ihres Versuchs, neue Einblicke in die Vielfalt iktaler Verhaltensweisen zu geben, enthält ihre neue Skala ein oder zwei neue Ebenen, die mit wildem Laufen und/oder Springen (Stufe 6, van Erum et al.18) und tonischer Ausdehnung, die zu Atemstillstand führt (Stufe 7, van Erum et al.18), verbunden sind.

Dieses Protokoll stellt einen neuen Ansatz zur Quantifizierung und Darstellung von PTZ-induzierten iktalen Verhaltensweisen dar, mit besonderem Fokus auf Spasmen und Myoklonus. Diese Verhaltensweisen gehören zu den am weitesten verbreiteten nach systemischer PTZ-Verabreichung, werden jedoch in Anfalls- und Epilepsiestudien oft übersehen. Dieser Ansatz schließt somit eine kritische methodische Lücke, indem er spezifische Kriterien zur Identifizierung von Spasmen und Myoklonus bereitstellt und sie verhaltensmäßig von limbischen Anfällen unterscheidet. Es zeigt, dass Spasmen und Myoklonus sowohl nach einmaliger als auch nach wiederholter PTZ-Verabreichung eine ausgeprägte zeitliche Dynamik aufweisen. Dieses Codierungssystem ist einfach zu implementieren, integriert neuartige Parameter abnormaler Aktivität in bestehende Methoden und bietet neue Einblicke in die Mechanismen der Anfallsentstehung. Schließlich hat diese neue Strategie das Potenzial, die Quantifizierung des iktalen Verhaltens in allen Laboren zu standardisieren, die Reproduzierbarkeit zu verbessern und die Perspektiven auf Anfallsmechanismen zu erweitern.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden von der lokalen Ethikkommission der Bundesuniversität von Rio Grande do Norte genehmigt (Protokollnummer 043/2022, Lizenznummer 307.043/2022). In diesem Protokoll wurden männliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 3 bis 4 Monaten verwendet, mit einer empfohlenen Probengröße von 6-10 Tieren gemäß den etablierten PTZ-Induktionsprotokollen16.

1. Vorbereitung der Aussichtsarena

  1. Verwenden Sie eine quadratische oder kreisförmige Arena mit einer Grundfläche von mindestens 10 x 10 cm und einer Wandhöhe von 30 cm. Stellen Sie sicher, dass die Arena gut beleuchtet ist. Verwenden Sie bei Bedarf Infrarotlicht, um eine gesättigte Bildaufnahme zu gewährleisten (Abbildung 2A).
  2. Platzieren Sie mindestens eine Videokamera über der Arena, mit einer Draufsicht auf den gesamten Boden der Arena und mindestens 10 cm der Wand (um das Aufbäumen zu erfassen, ohne den Mauskopf zu beschneiden, Abbildung 2B).
  3. Platzieren Sie auf Wunsch eine zweite Videokamera mit Frontalansicht der Arena. Stellen Sie in diesem Fall sicher, dass eine der Arenawände transparent ist.
  4. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur (21-24 °C) und die Luftfeuchtigkeit (50-70 %) den Bedingungen der Tierhaltung entsprechen, indem Sie sie mit einem Thermo-Hygrometer überwachen und bei Bedarf anpassen.
  5. Platzieren Sie die notwendige Einstreu, um den Boden der Arena abzudecken, und stellen Sie sicher, dass das Tier vom Hintergrund aus sichtbar ist. Stellen Sie während der gesamten Versuchsdauer Wasser und Futterpellets frei zur Verfügung.
  6. Beginnen Sie die Experimente vorzugsweise zu Beginn der Lichtphase (z.B. zwischen 7:00 und 10:00 Uhr). Sorgen Sie für eine gleichmäßige Beleuchtung im Experimentierraum (900-1.100 Lux) mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12/12 Stunden, wobei das Licht um 6 Uhr morgens eingeschaltet wird. Verwenden Sie ein Luxmeter, um die Lichtverhältnisse in der Nähe der Aufnahmearena zu überprüfen und so eine einheitliche Videoaufnahmequalität zu gewährleisten.
  7. Schließen Sie die Kamera an das Videoaufnahmegerät an, um das Video mit mindestens 24 Bildern pro Sekunde (fps) aufzunehmen.

2. Vorbereitung der PTZ-Lösung

HINWEIS: Iktale Verhaltensweisen (d. h. Krämpfe) können mit Dosen ab 40 mg/kg induziert werden. Limbische Anfälle werden bei 60 mg/kg und höheren Dosen beobachtet. Tonische Anfälle, die mit Atemstillstand und Tod verbunden sind, werden häufig ab einer Dosis von 80 mg/kg oder höher beobachtet. Für das Anzündprotokoll wurde eine Dosierung von 40 mg/kg verwendet.

Die Dosis kann je nach Mausstamm variieren. Es wird empfohlen, einen Pilotversuch durchzuführen, um die PTZ-Dosis zu definieren, die für die Forschungsfrage am besten geeignet ist.

  1. Verabreichen Sie den Mäusen 10 ml/kg über systemische Injektionen. Lösen Sie daher das PTZ-Pulver in deionisiertem Wasser auf, um die Endkonzentration von 4 oder 6 mg/ml (für die Dosen von 40 bzw. 60 mg/kg) zu erreichen.
    HINWEIS: Um die Variabilität zu reduzieren, bereiten Sie eine einzelne PTZ-Lösung für die gesamte Versuchscharge vor.

3. Verwaltung von PTZ

  1. Bevor Sie das Tier in die Arena setzen, messen Sie sein Körpergewicht mit einer Waage.
  2. Berechnen Sie das Volumen der PTZ-Lösung, das für jedes Tier auf der Grundlage seines Körpergewichts erforderlich ist.
    HINWEIS: Bei einer Dosis von 60 mg/kg und einem Körpergewicht von 30 g injizieren Sie dem Tier 0,3 ml einer PTZ-Lösung in einer Dosis von 6 mg/ml.
  3. Zeichnen Sie das Verhalten mindestens 1 Stunde vor der PTZ-Injektion auf.
    HINWEIS: Diese Gewöhnungsphase verringert die durch Neues verursachte Gehfähigkeit und Angstzustände, während sie auch zur Extraktion der Ausgangsaktivität verwendet werden kann.
  4. Verabreichen Sie PTZ entweder intraperitoneal (i.p.) oder subkutan (s.c.)15,16. Für die s.c.-Verabreichung fixieren Sie das Tier mit einer Hand und kneifen Sie die Haut vorsichtig zwischen den Schulterblättern ein (Abbildung 2C).
  5. Führen Sie die Nadel mit einer 1-ml-Spritze, die an einer 26 1/2 G-Nadel befestigt ist, in den Unterhautraum ein, parallel zur Ausrichtung des Körpers, und injizieren Sie die Lösung langsam in den Unterhautraum. Entfernen Sie die Nadel vorsichtig, wenn die Injektion abgeschlossen ist, und halten Sie die Haut am Nadelausgang, um zu vermeiden, dass die Lösung aufgrund des Hohlraumdrucks verschüttet wird (Abbildung 2C).
    HINWEIS: Injektionen dürfen nicht zu schnell verabreicht werden, da eine schnelle Ansammlung der Lösung zum Verschütten von der Injektionsstelle oder zum Auslaufen bei der Nadelentfernung führen kann.
  6. Notieren Sie sich jede Leckage, da sie die Ausprägung des iktalen Verhaltens beeinflusst. Ziehen Sie die Möglichkeit einer sofortigen Injektion von zusätzlichen 50 μl derselben PTZ-Lösung in Betracht.
  7. Positionieren Sie das Tier für 1 Stunde ununterbrochene Videoaufzeichnung wieder in der Arena.
  8. Stoppen Sie die Aufzeichnungen eine Stunde nach der PTZ-Injektion (oder länger) und kopieren Sie die Datei zur Nachbearbeitung (Videoverfolgung und Verhaltenscodierung).

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Abbildung 2: Versuchsaufbau und Injektionsverfahren. (A) Vier transparente quadratische Arenen mit Top-Down-Kameras, die über dem Zentrum platziert waren, wurden verwendet, um das Verhalten aufzuzeichnen und die Positionen der Tiere vor und nach der PTZ-Verabreichung zu verfolgen. (B) Schnappschuss eines repräsentativen Videos, das mit dem unter A beschriebenen Setup aufgenommen wurde. (C) Beispiel für die subkutane Injektion von PTZ. Die Nadel wird zwischen den Schulterblättern des Tieres im Unterhautraum platziert. (D) Schematische Darstellung der in der vorliegenden Studie verwendeten Verhaltensdatenerfassung und -analysen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Tierschutz

  1. Entfernen und euthanasieren Sie Tiere, wenn ein Anfall länger als 5 Minuten andauert, um Zelltod und Hirngewebeschäden zu verhindern, insbesondere bei Protokollen mit wiederholten Injektionen.
  2. Überwachen Sie das Gewicht der Tiere täglich während des gesamten Versuchszeitraums.
  3. Überwachen Sie den Allgemeinzustand der Tiere, einschließlich Futteraufnahme, Fortbewegung, Haltung, Fellpflege und Anzeichen von Schmerzen oder Beschwerden.
  4. Verabreichen Sie bei Bedarf eine entzündungshemmende Behandlung (Ibuprofen, 5 mg/kg) und eine Schmerzbehandlung. Stellen Sie bei Bedarf zusätzliches Futter oder Wasser bereit.
  5. Tiere sind zu entfernen, wenn sie einen Gewichtsverlust von mehr als 20 % aufweisen, der nicht innerhalb von 2 Tagen nach individueller Supplementierung, epidermalen Läsionen oder Anzeichen von chronischen Schmerzen oder Beschwerden behoben werden kann, die auf eine pharmakologische Behandlung nicht ansprechen.
  6. Euthanasieren Sie alle Tiere gemäß den internationalen und institutionellen ethischen Richtlinien.

5. Installation, Konfiguration und Verwendung der Software

  1. Verwenden Sie für die in dieser Studie beschriebene Analyse MouseLabTrack19 und Solomon Coder. Laden Sie sie herunter und befolgen Sie die Installationsprozedur (siehe Zusatzdatei 1 und Zusatzdatei 2).
    HINWEIS: Während MouseLabTrack unter dem MATLAB-Framework ausgeführt wird, ist Solomon Coder eine ausführbare Datei für das Windows-Betriebssystem. Beide Software ist Open Source.
  2. Klicken Sie im Windows-Startmenü auf Solomon oder suchen Sie nach Solomon Coder und öffnen Sie die Software.
    1. Wenn eine Konfigurationsdatei verfügbar ist (siehe Ergänzende Datei 3), gehen Sie zu Datei | Konfiguration laden. Auf dem Bildschirm werden die vordefinierten Einstellungen geladen.
    2. Wenn keine Konfigurationsdatei verfügbar ist,
      1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den freien Bereich, um eine neue Schaltfläche zu erstellen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die neu erstellte Schaltfläche, um den Konfigurationsbildschirm zu öffnen.
      2. Benennen Sie die Schaltfläche im Feld Schaltflächenname um, um das gewünschte Verhalten darzustellen.
      3. Wählen Sie im Feld Farbe der Tastenfläche eine Farbe aus.
      4. Benennen Sie im Feld "Kategorien " "Standard" in "Verhalten" um (dies ist der Spaltenname).
      5. Weisen Sie im Feld Hotkey eine Tastaturtaste zu, um das Verhalten während der Videoanalyse zu markieren (z. B. Taste "1").
      6. (Fakultativ) Aktivieren Sie das Kontrollkästchen über Hotkey, wenn das Ereignis sofort eintritt, d. h. es wird ein einzelnes Ereignis registriert, wenn die Taste gedrückt und losgelassen wird. Wenn diese Option deaktiviert ist, bleibt das Verhalten aufgezeichnet, bis die Taste losgelassen wird.
    3. Um ein Video zu öffnen, gehen Sie zu Datei | Video öffnen.
    4. Drücken Sie Play , um das Video zu starten.
    5. Wenn Verhaltensweisen beobachtet werden, klicken Sie mit der linken Maustaste oder drücken Sie die zugewiesene Tastaturtaste, um sie zu markieren.
    6. Um die Daten als Datei mit kommagetrennten Werten (.csv) zu speichern, gehen Sie zu Analysieren | Ausgabe speichern unter. Um das Solomon-Codierungsblatt (.arch) zu speichern, gehen Sie zu Datei | Codierblatt speichern.
  3. Um MouseLabTracker zu öffnen und zu laden.
    1. Öffnen Sie MATLAB, geben Sie in der Konsole "main()" ein und drücken Sie die Eingabetaste.
    2. Um das Video zu laden, klicken Sie auf die Schaltfläche Öffnen. Nach dem Laden wird auf dem angrenzenden Bildschirm das Video mit grünem Hintergrund und das Tier in Weiß angezeigt.
    3. Geben Sie das Zeitintervall an, das im Video analysiert werden soll. Klicken Sie auf Start , um den Beginn der Analyse festzulegen. Klicken Sie auf Ende , um das Ende der Analyse festzulegen.
      HINWEIS: Wenn kein Intervall eingestellt ist, analysiert die Software das gesamte Video.
    4. Um die Tracking-Einstellungen zu konfigurieren, gehen Sie zur Registerkarte Tracking-Einstellungen .
      1. Wählen Sie Dunkle Objekte / Heller Hintergrund , um anzuzeigen, dass das Tier dunkler als der Hintergrund ist.
      2. Um die Anzahl der Tiere anzupassen, gehen Sie zu Motive und ändern Sie die Anzahl auf 1.
      3. Um die Erkennungsparameter anzupassen, ändern Sie die Parametereinstellung Schwellenwert so, dass die Radiuswerte zwischen 30 und 40 liegen.
      4. Definieren Sie die Farbe des Tieres, indem Sie auf Farbe klicken und die entsprechende Farbe auswählen.
      5. Um die Arena zu definieren, klicken Sie auf Arena definieren, wählen Sie dann die obere linke Ecke der Arena und dann die untere rechte Ecke der Arena aus.
    5. Um den Tracking-Prozess zu starten, klicken Sie auf Verfolgen. Warten Sie, bis der Fortschrittsbalken 100 % erreicht.
    6. Sobald die Nachverfolgung abgeschlossen ist, speichern Sie die Ausgabedatei der Analyse, indem Sie auf Ergebnisse speichern klicken.

6. Codierungsverhalten

  1. Markieren Sie zunächst die PTZ-Verabreichungszeit, wenn die Maus wieder im Videobild erscheint, nachdem sie in der Beobachtungsarena platziert wurde. Dieser Moment dient als Zeitpunkt Null und dient als zeitliche Referenz für alle anderen Verhaltensweisen, einschließlich Latenzberechnungen.
  2. Beobachten Sie Krämpfe und Myoklonus einige Minuten nach der PTZ-Injektion (Abbildung 3), gefolgt von möglichen limbischen Anfällen. Krämpfe sind kurze, vorübergehende und schnelle Kontraktionen der axialen Muskeln, einschließlich beidseitiger Ohrbeugung, Rückenmuskelkontraktion, Schwanzheben (Straub-Schwanz) und selten einer Schrecksprungreaktion (Abbildung 3A). Codieren Sie Spasmen als diskrete Ereignisse, indem Sie sie mit einem einzelnen Videoframe ohne Dauer verknüpfen.
    HINWEIS: Quantifizieren Sie die Diversität und Kombination verschiedener Körperteile bei der Ausprägung von Krämpfen (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse).
  3. Um Myoklonus zu kodieren, beobachten Sie Ereignisse, die länger als 200 ms sind. Sie zeichnen sich durch einen abrupten, starken myoklonischen Ruck aus, der Kopf, Hals und Pfoten betrifft. Es kann mit Zittern und Verlust der Körperhaltung einhergehen (Abbildung 3B). Die Subklassifikation umfasst Myoklonus mit Zittern oder mit Verlust der Haltung nach vorne, links oder rechts. Die Dauer liegt in der Regel zwischen 1 und 2 s. Aufgrund ihrer Länge erfordert der Myoklonus eine Kodierung über mehrere Zeiteinheiten für ein einzelnes Ereignis.
  4. Um limbische Anfälle zu kodieren, beobachten Sie Ereignisse, die dem von Racine beschriebenen ähneln und mit der Racine-Skala kodiert werden können. Sie beginnt typischerweise mit einem Verhaltensstillstand oder einem Anstarren, gefolgt von olfaktorischen und gustatorischen Automatismen, orofazialen Bewegungen, Myoklonus der Vordergliedmaßen und/oder des Kopfes, Aufbäumen mit oder ohne Sturz, wildem Laufen oder Springen und tonischen Anfällen mit Atemstillstand. Verwenden Sie die modifizierte Racine-Skala18 , um limbische Anfälle zu unterklassifizieren, die länger als 10-15 s andauern und von Spasmen und Myoklonus unterschieden werden können.
  5. Fügen Sie zusätzliche Verhaltensklassen hinzu, die auf dem experimentellen Protokoll basieren, um ein umfassenderes Screening von Verhaltensweisen zu ermöglichen.
  6. Markieren Sie das Ende der Aufnahmesitzung zu einem einzigen Zeitpunkt (1 Stunde nach der PTZ-Injektion). Wenn das Tier nach einem tonischen Anfall stirbt, geben Sie den Todeszeitpunkt mit der Endmarkierung an.
    HINWEIS: Das Codierblatt kann jederzeit während des Codierungsvorgangs gespeichert und bei Bedarf in der Software für weitere Codierung oder Änderungen erneut geöffnet werden.

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Abbildung 3: Schnappschüsse des iktalen Verhaltens, das nach der PTZ-Verabreichung beobachtet wurde. (A) Dies ist ein repräsentatives Beispiel für einen der ersten Krämpfe, die nach der PTZ-Injektion beobachtet wurden. Es werden alle Frames angezeigt (Sampling 30 fps). Beachten Sie, dass der Krampf weniger als 200 ms dauert und sich in rostrocaudale Richtung bewegt. In diesem Beispiel trat kein offenkundiges Anheben des Hecks auf. (B) Ein repräsentatives Beispiel für Myoklonus im Zusammenhang mit Vorwärtslehnen. In diesem Beispiel dauerte der Myoklonus mehr als 1 s, wobei ein multipler Schwanz- und Vordergliedmaßenklonus auftrat. (C) Repräsentatives Beispiel für einen limbischen Anfall. Vor Racine Stadium 1 zeigte die Maus einen anhaltenden Myoklonus der Gliedmaßen, einschließlich Verlust der Körperhaltung. Die Sequenz zeigt alle fünf traditionellen Stufen der konventionellen Racine-Skala. In diesem Fall würde die Maus eine Punktzahl von 5 erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

7. Datenanalyse und Visualisierung

  1. Berechnen Sie die Latenz des ersten Auftretens jeder der Verhaltenskategorien (z. B. Krampf, Myoklonus, Krampfanfälle usw.), indem Sie die PTZ-Injektionszeit von der im Codierungsblatt aufgezeichneten Zeit abziehen.
  2. Berechnen Sie die Dauer jedes Myoklonus und jedes Anfallsereignisses und addieren Sie sie dann, um die Gesamtdauer für jede Kategorie zu erhalten.
  3. Berechnen Sie die Häufigkeit des Auftretens für jedes Verhalten, indem Sie die Gesamtzahl der Ereignisse durch die Aufzeichnungsdauer dividieren.
  4. Berechnen Sie das Intervall zwischen den Ereignissen für jedes Verhalten, indem Sie den Zeitunterschied zwischen aufeinanderfolgenden Ereignissen ermitteln.
  5. Definieren Sie die Episoden entsprechend der zeitlichen Verteilung des iktalen Verhaltens in jeder Aufnahmesitzung, falls zutreffend. Berechnen Sie die oben genannten Parameter für jede Episode.
    HINWEIS: Das Ende der Anfälle führt zu einer postiktalen Suppressionsperiode, die den Abschluss einer Episode für dieses Protokoll markiert. Das Wiederauftauchen iktaler Verhaltensweisen markiert den Beginn einer neuen Episode.
    HINWEIS: Wenn keine Anfälle auftreten, klassifizieren Sie die Aufnahmesitzung basierend auf der zeitlichen Verteilung von Krämpfen und Myoklonus.
  6. Testen Sie die Normalität mit dem Shapiro-Wilk-Test für jede Gruppe.
  7. Verwenden Sie für parametrische Vergleiche zwischen mehreren Gruppen den Test der unidirektionalen Varianzanalyse (ANOVA). Verwenden Sie für gekoppelte Daten je nach Datenstruktur einen gepaarten t-Test oder eine ANOVA mit wiederholten Messungen.
  8. Legen Sie die statistische Signifikanz auf einen p-Wert von < 0,05 fest. Runden Sie außerdem p-Werte unter 0,0001 und melden Sie sie als <0,0001.

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Ergebnisse

Um die Kodierungsstrategie und ihre Fähigkeit, iktales Verhalten während PTZ-induzierter Anfälle zu beschreiben, zu bewerten, wurden zunächst drei Dosen PTZ getestet und ihre Auswirkungen auf C57BL/6-Mäuse beobachtet (40, 60 und 80 mg/kg, N = 7, 5 bzw. 5). Die Verhaltensergebnisse, die bei drei PTZ-Dosen beobachtet wurden, zeigten deutliche dosisabhängige Unterschiede nach einer einzigen Injektion. Tiere, die mit 40 mg/kg PTZ behandelt wurden, zeigten Krämpfe, aber keine limbischen Anfälle oder Myoklonus. Im Gegensatz da...

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Diskussion

In dieser Studie wurde eine Kategorisierung von Verhaltensweisen auf der Grundlage motorischer Ausdrücke verwendet, um einen umfassenderen Rahmen für die Analyse der Anfallsdynamik zu schaffen. Dieser Ansatz ermöglicht die Quantifizierung wichtiger Parameter, einschließlich Latenz, Dauer und Häufigkeit von Krämpfen, Myoklonus und limbischen Anfällen. Die Ergebnisse der wöchentlichen PTZ-Injektionen zeigten, dass eine wiederholte Exposition den Zeitpunkt und die Häufigkeit von limbischen ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch den Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Fördernummern 308110/2020-0 und 316441/2023-6), Fundação de Amparo e Promoção da Ciência, Tecnologia e Inovação do Rio Grande de Norte (FAPERN, Fördernummer 042/2022) und Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Fördernummer #385/2019) und Propesq-UFRN (Fördernummer PVP18039-2020).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9% ige Natriumchlorid-LösungFresenius Kabi Brasil LtdaArtikel-Nr.: 74MK3168Geschlossenes System für die intravenöse Anwendung; injizierbare Lösung, 250 mL.
Analytische SkalaShimadzuATY224Maximale Kapazität: 220 g, Minimale Kapazität: 10 mg, Ablesbarkeit: 0,1 mg. Seriennummer: 1311070096
KameraJortanJortan-8816AHDIR-CCD-Kamera, NTSC-System, 2,0 MP Auflösung, 3,6 mm Objektiv, DC 12 V Netzteil.
Digitales LuxmeterMinipaMLM-1011Misst die Lichtintensität in Lux-Einheiten.
InjektionsnadelDescarpack353101Größe 26,5 g.
Mäuse--Männliche C57BL/6 Wildtyp-Mäuse. Zwei bis drei Monate alt.
PentylentetrazolSigma-Aldrich (Merck)Nr. P6500-25GPulver, ZNS-Stimulans. Gekauft: 25 g. Lagerung: -25 °C.
Software: MouseLabTracker  Giuliano Vilela-Open-Source-Software, Referenzpapier: DOI: 10.1016/j.jneumeth.2006.04.005.
Seite: https://neuro.ufrn.br/softwares/mouselabtracker
Software: Solomon CoderAndrá s Pé Ter-Open-Source-Software, v.19.08.02.
Seite:  https://solomon.andraspeter.com/
Thermo-HygrometerHikariHK-T240Misst Temperatur und Luftfeuchtigkeit.

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