Abstimmung der Kontraktilität und des Verformungsmodus aktiver Aktin-basierter Anordnungen in vitro: Von zweidimensionalen aktiven Netzwerken bis hin zu Flüssigkristalltropfen

Summary

Hier stellen wir Methoden zur Herstellung quasi-zweidimensionaler (2D) verschränker, vernetzter und flüssigkristalliner Aktin-Anordnungen aus gereinigten Proteinen vor.

Abstract

Auf Aktin-Zytoskeletten basierende Materialien werden weithin als zelluläre Modellmaterialien untersucht, um physikalische Mechanismen der Zellmechanik, wie z. B. Formregulation und Krafterzeugung, aufzuklären, sowie faszinierende weiche polymere Materialien. In dieser Methode beschreiben wir die Herstellung von aktinbasierten Assemblierungen in vitro unter Verwendung von gereinigten Proteinen für fluoreszenzmikroskopische Studien. Wir polymerisieren lange Aktinfilamente in einer Probenkammer und verwenden ein Polymer-Depletants, um Filamente zu einem zweidimensionalen (2D)-verschränkten Netzwerk gegen eine mit einer Tensidschicht passivierte Oberfläche zu drängen. Die Zugabe von Myosin-II-Filamenten der Skelettmuskulatur in Gegenwart von Adenosintriphosphat (ATP) induziert eine Kontraktion des Aktinnetzwerks. Durch die Bündelung von Aktinfilamenten mit einem Vernetzer stimmen wir die Kontraktilität der Anordnung ab und gehen von einem Material, das sich einknickt, zu einem Material über, das auf der Mikroskala gleitet. Indem wir die Länge der Aktinfilamente durch Copolymerisation von Aktin in Gegenwart von Capping-Protein reduzieren, stimmen wir das Material von einem 2D-Netzwerk auf einen Flüssigkristall ab. Die Vernetzung von dispergierten kurzen Aktinfilamenten führt zu einer dreidimensionalen (3D) Flüssigkristalltröpfchenbildung.

Introduction

Aktive biologische Materialien unterliegen mechanischen Prozessen in einer Vielzahl physiologischer Prozesse, einschließlich intrazellulärem Transport, Zellmigration, Zellformregulation und biologischer Krafterzeugung ^1,2,3. In-vitro-Assemblierungen von Zytoskelettsystemen, die aus gereinigten und technisch hergestellten Proteinkomponenten bestehen, die in Puffern selbst angeordnet sind, sind ein etabliertes Werkzeug zur Charakterisierung grundlegender biophysikalischer und biochemischer Prozesse 4,5,6,7. Diese vereinfachten Modellsysteme ermöglichen es, Proteine ohne die Komplexität zellulärer Umgebungen zu untersuchen und die Rollen einzelner Komponenten zu identifizieren. Neben der Unterstützung grundlegender biologischer Studien werden in vitro Zytoskelett-Anordnungen auch als experimentelle Systeme zur Untersuchung von flüssigkristallinen und aktiven oder aus dem Gleichgewicht geratenen Materialien ^{8,9,10,11,12,13,14,15} entwickelt.

Aktin ist ein Schlüsselbiopolymer in Zytoskelett-Anordnungen, das die Zellmechanik und -dynamik durch motorische und polymerisationsgetriebene Kräfte reguliert ^3,16. Fluoreszenzmikroskopische Experimente ermöglichen die Visualisierung von strukturellen Veränderungen des Aktinnetzwerks bei Prozessen wie der motorischen Kontraktion und der Aktinbündelung durch Vernetzung von Proteinen. Die Abbildung dreidimensionaler Aktinnetzwerke, wie sie durch eingebettete Motorproteine umgebaut werden, hat die Rolle von Aktin-Vernetzern für die Netzwerkkontraktion und Musterbildung beleuchtet ^12,17,18,19. Quasi-zweidimensionale Aktinnetzwerke überwinden jedoch Herausforderungen bei der Bildgebung mit ausreichender raumzeitlicher Auflösung, um strukturelle Veränderungen des Netzwerks zu erfassen. Darüber hinaus ahmen hochdichte, quasi-zweidimensionale Aktinstrukturen zelluläre Anordnungen wie den dichten Aktinkortex einer Zelle^{näher nach 20}. Strategien zur Herstellung quasi-zweidimensionaler Aktinstrukturen umfassten das Anhängen von Aktin-nukleierenden Proteinen an ein Deckglas^21,22, das Koppeln von Aktin an eine Oberfläche durch Linkermoleküle 10,23,24, die Bildung von dichten Aktinbündeln, die an Kügelchen an einer Deckglasoberfläche^{gebunden sind 25,26} und die Konzentration von Aktinfilamenten an einer Deckglasoberfläche mit molekularen Crowdinging-Mitteln^10,27.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Erstellung reproduzierbarer Modell-Aktin-basierter Anordnungen und wie sie modifiziert werden kann, um Variationen von aktiven Netzwerken zu Quasi-2D-Flüssigkristallen und nematischen Tröpfchen vorzubereiten. Wir haben zuvor ähnliche Methoden verwendet, um die Bildung von phasengetrennten flüssigkristallinen Tröpfchen von kurzen Aktinfilamenten mit Vernetzerzusatz¹¹, Änderungen der Deformationsmoden des Myosin-II-generierten Aktinnetzwerks (z. B. Filamentknicken oder relatives Gleiten) mit Filamentvernetzung und Konnektivität²⁸, Unterschiede in den Myosin-II-erzeugten Kräften auf Aktinbündel mit unterschiedlichem Abstand und Nachgiebigkeit²⁹ zu untersuchen, und Myosin-II-Transport³⁰. Die Verwendung von vernetzenden Proteinen und Aktin-Capping-Proteinen ermöglicht eine systematische Variation der Länge des Aktinfilaments und der Assemblierungsarchitektur.

Protocol

HINWEIS: Proteine und Markierung: Für die Zwecke dieses Protokolls wird davon ausgegangen, dass der Forscher mit Vorräten an gereinigten Proteinen beginnt, die fluoreszenzmarkiert werden, wenn dies für die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung erforderlich ist. Diese Proteine können gekauft oder in den Laboren 31,32,33,34,35,36,37 gereinigt und fluoreszierend markiert werden. In diesem Protokoll wurden Bestände von Proteinen verwendet, die in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert wurden. Die Proteine können in der Regel mit ähnlichen Methoden markiert werden. Das Protein kann als Reinigungsschritt oder aus einer gefrorenen Brühe markiert werden. Tauen Sie gefrorene Proteinbestände auf Eis auf, bevor Sie mit der Etikettierung fortfahren. Im Folgenden finden Sie eine Methode zur fluoreszierenden Markierung von Skelettmuskelmyosin II (Myosin) mit einem Maleimid-funktionalisierten Fluorophor (adaptiert von³⁸).

1. Bereiten Sie fluoreszenzmarkiertes Myosin vor

1. Beginnen Sie mit ~2 ml Myosin in einer Konzentration von 5-10 mg/ml.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wurde Skelettmuskelmyosin II verwendet, das mit den veröffentlichten Methoden³⁵ aus Hühnermuskeln gereinigt wurde. Das Myosin wird entweder direkt nach der Reinigung oder aus gefrorenem Bestand in Myosin-Lagerpuffer (25 mM KPO₄, 0,6 M KCl, 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1 mM Dithiothreitol (DTT), pH 6,6) gelagert. Es ist wichtig, das Myosin immer kalt zu halten, um einen Verlust der motorischen Aktivität zu vermeiden.
2. Geben Sie DTT in die aufgetaute Myosinlösung bis zu einer Endkonzentration von 10 mM. Verwenden Sie eine 1 M DTT-Stammlösung, um das Volumen zu begrenzen.
   HINWEIS: Das DTT reduziert die Thiolgruppe auf Cysteinen im Myosinprotein und bereitet sie darauf vor, mit dem Maleimid zur Markierung zu reagieren.
3. Um eine Interferenz mit der Markierungsreaktion zu vermeiden, entfernen Sie das DTT durch Dialysieren über Nacht in 50 mM HEPES, 500 mM KCl, 1 mM EDTA, pH 7,6, bei 4 °C.
4. Nach der Dialyse zentrifugieren Sie die Myosinlösung bei 100.000 x g bei 4 °C für 15 Minuten, um etwaige Aggregate zu pelletieren. Sammelt den Überstand ein.
5. Bestimmen Sie die Myosinkonzentration im Überstand mit einem Spektralphotometer. Schätzen Sie die Myosinkonzentration unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten bei 280 nm von ~148.000 ^{M-1 cm-1} für Skelettmuskelmyosin³⁸. Dieser Extinktionskoeffizient geht davon aus, dass ein "Monomer" aus einer schweren Kette, einer essentiellen leichten Kette und einer regulatorischen leichten Kette besteht.
6. Bereiten Sie das Fluorophor für die Markierungsreaktion vor, indem Sie pulverförmiges Fluorophor in trockenem Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Konzentration von 5 mM Fluorophor resuspendieren.
   HINWEIS: Jedes Fluorophor mit einer Maleimid-reaktiven Gruppe sollte funktionieren. Es wurde Alexa 647 Maleimid verwendet. DMSO ist hygroskopisch und sammelt Wasser. "Trockenes" DMSO bezieht sich auf DMSO, das in einer Umgebung gelagert wurde, um eine Wasseransammlung zu verhindern. Um sicherzustellen, dass es sich bei dem Lösungsmittel um trockenes DMSO handelt, wurde für diesen Schritt eine frisch geöffnete Ampulle DMSO verwendet. Legen Sie DMSO-Lösungen nicht auf Eis. DMSO hat einen Schmelzpunkt von 19 °C, daher muss es Raumtemperatur (oder etwas wärmer) haben, um³⁹ zu pipettieren.
   ACHTUNG: DMSO kann in Handschuhe eindringen, daher ist es eine gute Praxis, doppelte Nitrilhandschuhe zu tragen und darauf zu achten, dass kein Verschütten entsteht.
7. Um das Myosin für die Zugabe von Fluorophor vorzubereiten, nehmen Sie die Myosinlösung kurz vom Eis und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (RT) erwärmen.
   HINWEIS: Lassen Sie Myosin nicht länger als nötig bei RT. Führen Sie diesen Schritt aus, nachdem das Fluorophor in DMSO suspendiert wurde.
8. Sobald sich die Myosinlösung in der Nähe der RT befindet, fügen Sie die Fluorophorlösung zum Myosin hinzu und mischen Sie schnell, so dass ein molares Verhältnis von 5:1 von Fluorophor zu Myosin entsteht. Geben Sie die Myosinlösung auf Eis, sobald sie mit dem Fluorophor vermischt ist.
9. 1 h auf Eis vor Licht geschützt inkubieren und dann die Reaktion durch Zugabe von DTT bis zu einer Konzentration von 1 mM stoppen. Verwenden Sie ein 1-M-DVB-T-Material, um das hinzugefügte Volumen zu minimieren.
10. Nicht umgesetzte Fluorophore entfernen. Verwenden Sie eine der beiden unten beschriebenen Methoden:
    1. Möglichkeit 1:
       1. Polymerisieren Sie Myosin, indem Sie es langsam zu einem F-Puffer verdünnen (10 mM Imidazol, 50 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM EGTA, 4 mM ATP, pH 7,5). Dies entspricht etwa einer 10-fachen Verdünnung, abhängig von dem in Schritt 1.8 zugegebenen Farbstoffvolumen.
       2. 20 min auf Eis inkubieren. Bei 8.000 x g in einer gekühlten Zentrifuge bei 4 °C für 10 min zum Pelletieren schleudern.
       3. Den Überstand mit freiem Farbstoff verwerfen und Myosin mit Myosin-Speicherpuffer (aus Schritt 1) resuspendieren/depolymerisieren. Um den restlichen Farbstoff zu entfernen, dialysieren Sie dreimal für jeweils 15 min in 5 mM 2-[4-(2-sulfoethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonsäure (PIPES), 0,45 M KCl, pH 7,0 (>100-facher Volumenüberschuss) unter Verwendung eines Dialysebechers mit 10 kD-Cutoff.
    2. Möglichkeit 2:
       1. Verwenden Sie eine Entsalzungssäule für den Pufferaustausch in 5 mM PIPES, 0,45 M KCl, pH 7,0, mit dem Standardprotokoll des Säulenherstellers.
11. Schätzen Sie das Fluorophor-zu-Protein-Verhältnis, indem Sie die Konzentration von Myosin und Fluorophor mit einem Spektralphotometer messen, wobei Extinktionskoeffizienten für Myosin bei 280 nm und für das Fluorophor gemäß den Angaben des Herstellers verwendet werden. Typisch ist ein Verhältnis von 2-4.
    HINWEIS: Das markierte Myosin ist nun bereit für das Schockgefrieren von Aliquoten in flüssigem Stickstoff. Aliquots werden für die Langzeitlagerung bei -80 °C gelagert.

2. Optional: Verfahren zur Entfernung von inaktivem Myosin

HINWEIS: Myosin kann in Experimenten direkt aus einem aufgetauten Aliquot verwendet werden, aber ein Teil des Myosins ist inaktiv. Im folgenden Verfahren wird beschrieben, wie inaktives Myosin entfernt wird. Dies ist ein optionaler Schritt, der jedoch für die Reproduzierbarkeit entscheidend sein kann. Myosin-Aliquots werden nach dem Auftauen ca. 3 Tage lang bei 4 °C oder auf Eis gelagert.

1. Polymerisieren Sie unmarkiertes, Phalloidin-stabilisiertes Aktin:
   1. 10 μl 10x F-Puffer, 1 μl 100 mM ATP und ddH₂O werden in einem Mikrozentrifugenröhrchen so gemischt, dass das endgültige Volumen (einschließlich Aktin in Schritt 2.1.2) 100 μl beträgt.
   2. Aktinmonomer bis zu einer Endkonzentration von 20 μM zugeben und pipettieren.
   3. Um Aktinfilamente zu stabilisieren, fügen Sie Phalloidin bis zu einer Endkonzentration von 6,7 μM unter Verwendung eines Bestands von 100 μM Phalloidin in Methanol und Pipettenmischung hinzu.
      ACHTUNG: Phalloidin ist ein Toxin⁴⁰. Vermeiden Sie Verschüttungen und Verunreinigungen.
   4. 20 Minuten auf Eis inkubieren, damit das Aktin polymerisieren kann. Nach der Polymerisation lagern Sie das Aktin bei 4 °C für zukünftige Spin-Downs.
2. Mischen Sie 10 μl Phalloidin-stabilisiertes Aktin, 3 μl 10x F-Puffer, 0,3 μl 100 mM ATP, 6 μl 2 M KCl und ddH₂O auf ein Endvolumen von 30 μl (einschließlich des Volumens, das mit der Zugabe von Myosin im nächsten Schritt verbunden ist) in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis.
3. Geben Sie dimermarkiertes Myosin aus der vorbereiteten Brühe in die gewünschte Konzentration und halten Sie ein molares Verhältnis von Myosin zu Aktin von ≤ 1:6 aufrecht.
4. Die resultierende Lösung kalt (4 °C) bei 100.000 x g für 30 min zentrifugieren. Inaktives Myosin bindet an Aktinfilamente und bleibt gebunden. Die inaktiven Myosin- und Aktinfilamente bilden während der Zentrifugation ein Pellet.
5. Der Überstand (der aktives Myosin enthält) wird entfernt und zur Verwendung in Versuchen bei 4 °C gelagert.
6. Schätzen Sie die Myosinkonzentration mit der gleichen spektrophotometrischen Methode zur Messung der Myosinkonzentration nach der Markierung.
   HINWEIS: Bei den Protein- und ATP-Konzentrationen, die im Überstand verbleiben, wird der Absorptionspeak von 280 nm durch den 260 nm ATP-Absorptionspeak verdeckt, so dass die Messung der Konzentration durch die mit dem Fluorophor verbundene Extinktion oder eine relative Fluoreszenzmessung genauer ist.

3. Herstellen der Tensidlösung

HINWEIS: Die Tensidlösung kann auch vorgemischt und gebrauchsfertig erworben werden.

1. Beginnen Sie mit einem sauberen Glasfläschchen. Spülen Sie die Durchstechflasche mit Wasser und Ethanol aus, um mögliche Verunreinigungen im Öl zu entfernen, das ein Lösungsmittel für das Tensid ist. Verwenden Sie Fläschchen aus Borosilikatglas mit einer mit Polytetrafluorethylen (PTFE) ausgekleideten Kappe.
2. Nehmen Sie 5-20 mg Fluortensid mit einer Pipettenspitze auf und geben Sie es in der Nähe des Bodens eines Glasfläschchens ab. Messen Sie die Tensidmenge nach Gewicht mit einer Waage mit einer Genauigkeit von unter Milligramm.
3. Pipettieren Sie die entsprechende Menge fluoriertes Öl, um eine 2 Gew.-% Lösung herzustellen, und verschließen Sie die Durchstechflasche.
   HINWEIS: Das Öl ist flüchtig, verschließen Sie das Fläschchen daher sofort nach der Messung.
4. Vortexen Sie bei niedriger Geschwindigkeit zum Mischen.
   HINWEIS: Die Lösung kann nun einige Wochen lang bei 4 °C gelagert werden. Das Alter und die Qualität des Tensids können sowohl die Überfüllung als auch das Aussehen des Aktins beeinflussen. Aktin, das gesprenkelt erscheint, an der Oberfläche haftet oder sich nicht an der Oberfläche drängt, kann darauf hinweisen, dass eine frische Tensidlösung erforderlich ist. Die Lagerung unter Stickstoffgas kann die Haltbarkeit verbessern.

4. Probenkammer vorbereiten (drei Optionen)

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird ein Verfahren zum Aufbau von drei Standardprobenkammern beschrieben, die zur Vorbereitung von Proben für die Mikroskopie verwendet werden. Die folgenden zwei Abschnitte behandeln die Vorbereitung der eigentlichen Probe und die Passivierung der Probenkammer für die Probenbeladung.

1. Option 1: Durchflusszelle
   HINWEIS: Eine einfache Durchflusszelle ist in vielen Labors eine Standardmethode zur Herstellung von Mikroskopproben. Für dieses Protokoll eignet es sich besonders für die Proben, die in Emulsionstropfen eingeschlossen sind. Es kann schwierig sein, mit der in diesem Protokoll beschriebenen Tensidoberflächenbeschichtung große, flache Sichtfelder zu erzielen, so dass für 2D-Proben die Optionen 2 und 3 oft reproduzierbarer sind. Die Kanalgeometrie kann auch zu einer ungleichmäßigen Vermischung von Komponenten führen, die zu einem späteren Zeitpunkt hinzugefügt wurden, wie z. B. Myosin.
   1. Legen Sie 2 Stücke doppelseitiges Klebeband parallel zueinander über die Breite des Objektträgers, um die Grenzen des Durchflusszellenkanals zu bilden. Der zwischen den beiden Klebebandstücken gebildete Kanal sollte eine Breite von ca. 2 mm haben.
      HINWEIS: Kleinere Kanäle verhindern, dass Emulsionen im Anfangsteil des Kanals stecken bleiben. Um eine gute Abdichtung zu erzielen, verwenden Sie Klebebandstücke, die nur länger als die Breite des Objektträgers sind, und schneiden Sie sie nach dem Bau der Durchflusszelle ab.
   2. Legen Sie das Deckglas über den Bandkanal. Stellen Sie sicher, dass das Deckglas senkrecht zum Objektträger steht. Verwenden Sie zu diesem Zweck ein Deckglas von 30 mm x 40 mm, da es einen kleinen Überhang bietet, wenn es auf eine Folie gelegt wird.
   3. Um eine gute Abdichtung zu erzielen und Lufteinschlüsse zwischen dem Klebeband und dem Deckglas zu vermeiden, drücken Sie auf den Bereich des Deckglases, der mit doppelseitigem Klebeband in Kontakt kommt.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass das Deckglas beim Andrücken an den Rändern nicht zerbricht. Das Reiben des Bereichs mit einem abgerundeten Gegenstand, z. B. dem Ende eines Markierungen mit Kappe, eignet sich gut, um das Klebeband nach unten zu drücken.
   4. Schneiden Sie mit einer Rasierklinge überschüssiges Klebeband vom Objektträger und Deckglas ab, so dass sich das einzige sichtbare Klebeband innerhalb des Probenkanals befindet.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie diesen Schritt ausführen, da es leicht passieren kann, dass das Deckglas versehentlich beschädigt wird, wenn Sie versuchen, das Klebeband zu entfernen.
2. Option 2: Zylinder auf unbehandeltem Deckglas
   HINWEIS: Diese Option eignet sich für planare 2D-Proben. Es ist praktisch, Komponenten zu verschiedenen Zeitpunkten während Mikroskopie-Experimenten hinzuzufügen. Diese Probenkammer sollte nicht für Emulsionen verwendet werden, die eher cremen als sedimentieren, was die Bildgebung erschwert.
   1. Spülen Sie das Deckglas und den Glasklonzylinder mit Wasser, Ethanol und Wasser ab. An der Luft trocknen.
   2. Kleben Sie den Glasklonzylinder mit einer dünnen Schicht 5-minütigem Epoxidharz auf das Deckglas.
      HINWEIS: Es ist hilfreich, während des Trocknens des Epoxidharzes Kraft auf den Zylinder auszuüben, indem Sie einen sauberen Gegenstand auf den Zylinder legen. Ein kleiner Petrischalendeckel oder die Deckglasdose können gut funktionieren.
3. Option 3: Zylinder auf silanbeschichtetem Deckglas
   HINWEIS: Diese Option führt reproduzierbar zu einem großen, planaren Bereich in der Mitte der Kammer und reduziert den Massenfluss der Probe. Um dies zu erreichen, wurde eine hydrophobe Region geschaffen, die von einer hydrophilen Region auf dem Deckglas umgeben ist, was zu einer endgültigen Probe führt, die ein Aktinnetzwerk auf einer passivierten, geschlossenen Region aufweist, in der das Aktin an den hydrophilen Bereichen am Rand der Kammer verankert ist. Diese Probenkammer sollte nicht für Emulsionen verwendet werden, die im Puffer eher cremen als sedimentieren, was die Bildgebung erschwert.
   1. Bereiten Sie Deckgläser mit einer Silanbeschichtung vor, um sie hydrophob zu machen.
      1. Laden Sie saubere Glasdeckgläser in ein Edelstahlgestell. Auf Wunsch das Glas durch Beschallung in Reinigungsmittel oder Ethanol vorreinigen.
      2. In einer Glasfärbeschale trimethoxy(octyl)silan zu einer 2%igen Lösung in Isopropanol verdünnen.
      3. Tauchen Sie die Deckgläser 10 Minuten lang in die Lösung.
      4. Ersetzen Sie zum Spülen die Lösung durch Wasser. Heben Sie die Deckglasgestelle sechsmal an und tauchen Sie sie wieder ein. Wiederholen Sie den Vorgang vier weitere Male mit Wasserwechsel dazwischen.
      5. Decken Sie die Gestelle mit Alufolie ab, um die Deckgläser vor Staub zu schützen, und trocknen Sie sie bei 25-30 °C.
   2. Legen Sie ein mit Oktylsilan behandeltes Deckglas in den Boden einer Petrischale aus Glas oder einem anderen offenen Glasbehälter, der in den UV-Ozonreiniger passt.
   3. Legen Sie mit einer Pinzette ein 2 mm x 2 mm großes PTFE-Quadrat (aus einem Blatt geschnitten) auf das Deckglas, das als Maske für die folgende UV-Ozon-Behandlung dient.
   4. Behandeln Sie das Deckglas 10 min lang mit UV-Ozon. Dieser Prozess macht das Glas in den freiliegenden Bereichen, die nicht von der PTFE-Maske bedeckt sind, hydrophil.
   5. Nehmen Sie die Schale vorsichtig heraus, ohne das Deckglas oder das PTFE-Quadrat zu beschädigen. Kleben Sie einen Glasklonzylinder mit 5-minütigem Epoxidharz auf das Deckglas. Stellen Sie sicher, dass der Zylinder das PTFE-Quadrat umschließt, das nach dem Trocknen des Epoxidharzes mit einer Pinzette entfernt werden kann.
      HINWEIS: Das PTFE-Quadrat kann in zukünftigen Experimenten wiederverwendet werden.

5. Aufbau des Aktin-Netzwerks

HINWEIS: Das Folgende gilt für die Vorbereitung einer 50-μl-Probe. Bei Zylinderproben kann ein größeres Volumen die Auswirkungen des Meniskus verringern und die Probenstabilität erhöhen.

1. In ein Mikrozentrifugenröhrchen geben Sie 5 μl 10x F Puffer, ddH₂O erforderlich, um das Endvolumen auf 50 μl zu bringen, 1 μl 25 Vol.-% Beta-Mercaptoethanol, 1 μl 225 mg/ml Glukose, 1 μl einer Mischung aus Glukoseoxidase (135 mg/ml) und Katalase (85.000 Einheiten/ml), 1 μl 25 mM ATP, und 10 μl 2 Gew.-% 15 Centipoise Methylcellulose. Gründlich pipettieren.
   HINWEIS: Beta-Mercaptoethanol ist ein Toxin. Vermeiden Sie Verschüttungen und Verunreinigungen. Die Reagenzien Glukoseoxidase, Katalase, Glukose und Beta-Mercaptoethanol befinden sich in der Probe, um ein Sauerstofffängersystem zu schaffen. Die Methylcellulose-Stammlösung wird durch Rühren bei 4 °C hergestellt und kann bei 4 °C mehrere Wochen gelagert werden. Methylcellulose kann aus der Lösung ausfällt und sollte neu aufbereitet werden, wenn sichtbarer Niederschlag vorhanden ist oder wenn der Aktin-Crowding gering ist.
2. Optional: Fügen Sie ein vernetzendes Protein hinzu (0,1-1 Vernetzerprotein pro 1 Aktinmonomer). Pipetten-Mix.
   HINWEIS: Vernetzungsproteine können auch nach der Aktinpolymerisation hinzugefügt und 10-20 Minuten lang gebunden werden, bevor Myosin hinzugefügt wird. Dies ist vorzuziehen für Vernetzerkonzentrationen, die hoch genug sind, um Aktinfilamente zu bündeln - die Bündel sind gleichmäßiger und reproduzierbarer an der Tensid-Wasser-Grenzfläche verteilt. Die Zylinderprobenkammer ist für die Zugabe eines Vernetzers nach der Polymerisation des Aktins geeignet.
3. Fügen Sie Phalloidin hinzu (1 Phalloidin pro 1-3 Aktinmonomere), falls gewünscht. Pipetten-Mix.
4. Mischen Sie unmarkiertes und markiertes Aktin in einem separaten Röhrchen so, dass die Gesamtkonzentration 2,64 μM beträgt, wenn die gesamte Aktinmischung zur 50-μl-Probe hinzugefügt wird. Verwenden Sie ein Verhältnis von 1 markiertem Aktinmonomer für jeweils 9 unmarkierte Aktinmonomere. Pipetten-Mix.
   HINWEIS: Die Aktinmonomere beginnen nach Zugabe zur Probenlösung zu polymerisieren. Die getrennte Zugabe des aktinmarkierten und des unmarkierten Aktins kann zu Aktin führen, das entlang der Kontur eines einzelnen Filaments mit dunklen und fluoreszierenden Bereichen gesprenkelt erscheint. Die Aktinmonomer-Stämme werden gemischt, um eine gleichmäßig markierte Aktinfilamente zu gewährleisten. Die Reinigung und Markierung von Aktinen wird in^{Nummer 31} beschrieben.
5. Optional: Um Flüssigkristalle oder andere Experimente mit kurzen Aktinfilamenten herzustellen, fügen Sie dem Aktin-Mix aus Schritt 5.4 ein Capping-Protein hinzu. Die genaue Menge des Capping-Proteins hängt von der aktiven Fraktion des Proteins und der Länge der Ziel-Aktin-Filamente ab, aber typischerweise ist etwa 1-10 mol% Capping-Protein (in Bezug auf das Aktin) ausreichend, um kurze Filamente für Flüssigkristallexperimente zu erzeugen. Die Reinigung von Capping-Proteinen wird in³⁶ beschrieben.
6. Um mit der Polymerisation von Aktin zu beginnen, fügen Sie die Aktinmischung zur F-Pufferlösung hinzu und fügen Sie die Pipettenmischung hinzu.
7. Lassen Sie das Aktin im Mikrozentrifugenröhrchen bei RT polymerisieren und geben Sie es nach 10-30 Minuten in die Probenzelle.
8. Optional: Wenn Sie eine Zylinderprobe vorbereiten, ziehen Sie die gesamte Lösung in eine Pipettenspitze, so dass sie in Schritt 7.4 des Befüllens der Zylinderprobenkammer zum Pipettieren bereit ist.

6. Optional: Emulsionen vorbereiten

HINWEIS: Es ist manchmal zweckmäßig, diese Proben in Emulsionen vorzubereiten, die eine geschlossene Probenkammer bieten. Die Emulsionen werden unter Verwendung ähnlicher Reagenzien wie Chowdhury et al. hergestellt, was zu einer kontinuierlichen Ölphase führt, die tensidvermittelte wässrige Emulsionstropfen^{aufweist 41}. In Gegenwart eines Verarmungsmittels, wie z. B. Methylcellulose, das in diesem Protokoll verwendet wird, drängen sich die Aktinproben an die wässrige Grenzfläche dieser Emulsion. Bei Proben, auf denen dieses Protokoll basiert, ist kein Unterschied zwischen der Polymerisation des Aktins vor oder nach der Zugabe zu den Emulsionen zu erkennen; Es wurde jedoch berichtet, dass der Polymerisationsschritt in einigen Verkapselungsexperimenten wichtig ist⁴².

1. Geben Sie 3,5 μl Öltensid in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie für diesen Schritt ein transparentes, helles oder klares Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Geben Sie ohne Mischen 5 μl der Aktinlösung auf die Oberseite der Öl-Tensid-Schicht. Schließen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Halten Sie die Oberseite des Mikrozentrifugenröhrchens fest und schnippen Sie mit der Unterkante des Röhrchens, um zunächst einen Schaum mit sichtbaren Emulsionen zu erzeugen. Bewegen Sie die Tube so lange, bis der Schaum bei Hintergrundbeleuchtung keine erkennbaren Merkmale mehr aufweist, die auf Mikroemulsionen hinweisen.
   HINWEIS: Bei der Vorbereitung einer Probe in Emulsionen sollte eine Durchflusszelle oder eine andere Probenkammer bereit sein, bevor die Aktinprobe entnommen wird. Die Glaszylinder-Probenkammer eignet sich nicht gut für Emulsionen, da sie an der Luftgrenzfläche anliegen und nicht an der Deckglasoberfläche ablagern.

7. Laden Sie die Probenkammer (Zylinderkammern)

1. Pipettieren Sie 5 μl Öl-Tensid-Lösung in den Boden der Glaszylinderkammer
   HINWEIS: Alternativ können Proben hergestellt werden, indem die Oberfläche mit einer gestützten Lipiddoppelschicht 11,29,30 passiviert wird.
2. Kippen Sie das Deckglas und drehen Sie es langsam, sodass die Deckglasoberfläche und der untere Zylinder mit der Tensidlösung beschichtet sind.
3. Entfernen Sie überschüssige Öl-Tensid-Lösung mit einer Pipette, um eine möglichst dünne Ölschicht zu erhalten, ohne das flüchtige Öl vollständig verdampfen zu lassen.
4. Die Probenlösung aus Schritt 5.7 wird sofort in die Kammer gegeben.
5. Decken Sie die Kammer mit einem kleinen Stück PTFE-Klebeband ab, um Verdunstung und Durchfluss zu verhindern.

8. Alternativ: Laden Sie die Probenkammer (Durchflusszelle)

1. Um die Beladung der Durchflusszelle vorzubereiten, mischen Sie eine kleine Menge 5 min Epoxidharz. Ein Tropfen mit einer Fläche von weniger als 0,5 cm² ist in der Regel ausreichend.
2. Um die Probe in die Durchflusszelle zu geben, pipettieren Sie zunächst 1-3 μl Öl-Tensid-Lösung in den Probenkanal der Durchflusszelle, um einen kleinen Stopfen der Lösung zu erzeugen, der den Kanal benetzt.
3. Pipettieren Sie sofort ein Volumen der Probenlösung oder Emulsionssuspension langsam in den Eingang der Durchflusszelle, um den Kanal zu füllen. Typischerweise beträgt das Volumen für einen Kanal mit einer Länge von etwa 2 mm etwa 8 μl. Der Eingang ist die Seite, auf der die Öl-Tensid-Lösung zugegeben wurde.
   1. Wenn das Probenvolumen das Volumen der Durchflusszelle überschreitet, leiten Sie die Probe durch die Durchflusszelle, indem Sie ein fusselfreies Tuch oder Filterpapier an das andere Ende des Kanals legen.
   2. Wenn sich der Meniskus der Öl-Tensid-Lösung zurückgebildet hat, was zu einem Luftspalt geführt hat, kippen Sie zuerst die Durchflusszelle, um den Luftspalt am Eingang zu entfernen, bevor Sie die Probe hinzufügen.
4. Falls erforderlich, zusätzliche Öl-Tensid-Lösung hinzufügen, bis keine Luft mehr im Kanal sichtbar ist, oder um die Probe (insbesondere bei Emulsionen) weiter in den Kanal zu drücken.
5. Versiegeln Sie jede Seite des Kanals mit 5-minütigem Epoxidharz (das direkt vor dem Laden der Durchflusszelle gemischt wird).

9. Myosin abbilden und hinzufügen

1. Montieren Sie die Probe am Mikroskop und starten Sie die Zeitraffer-Bildgebung von Aktin mit einem 20x-, 40x-, 60x- oder 100x-Objektiv mit Öl- oder Wasserimmersion, um eine ausreichend große numerische Apertur für hochauflösende Bildgebung zu erhalten. Wenn Sie in der Probenkammer polymerisieren, lassen Sie die Polymerisation für ~30 min oder bis keine sichtbare Filamentverlängerung oder Bewegung mehr sichtbar ist.
2. Optional: Fügen Sie einen Crosslinker hinzu.
3. Fügen Sie Myosin über die Optionen 1 oder 2 unten hinzu.
   1. Geben Sie Myosin als Dimer hinzu, das an die Oberseite der Probe pipettiert wird (es ist kein Mischen erforderlich, da das Myosin-Dimer diffundiert).
   2. Fügen Sie Myosin als vorpolymerisierte Filamente hinzu. Mischen Sie etwa die Hälfte des Gesamtvolumens sehr langsam, um das überfüllte Aktin nicht zu stören.
      HINWEIS: Die ideale Methode für Myosin, um die gewünschte Filamentdichte oder -größe an der Deckglasoberfläche zu erhalten, kann für verschiedene Aktinarchitekturen variieren und muss experimentell bestimmt werden.
4. Starten Sie das Zeitraffer-Imaging.

Results

Ein breites Spektrum von Aktin-Anordnungen kann in Modellsystemen mit gereinigten Proteinen gebildet werden, indem die in diesen Methoden beschriebene allgemeine Strategie verfolgt wird, bei der Aktin in Gegenwart von akzessorischen Proteinen, die die Assemblierungsarchitektur modifizieren, zu Filamenten polymerisiert wird (Abbildung 1). Wenn Aktin zu Filamenten ohne Vernetzer oder Capping-Protein polymerisiert wird, bildet es verschränkte Filamentnetzwerke (Abbildung 1A...

Discussion

Es gibt viele Überlegungen zur Herstellung reproduzierbarer Aktin-Anordnungen. Eine der wichtigsten für die Erzeugung reproduzierbarer, analysierbarer Daten ist die Deckglasoberfläche der Probenkammer. Die Proteine in In-vitro-Aktinproben, insbesondere Myosin, sind extrem klebrig und haften an unbehandelten oder schlecht behandelten Glasoberflächen, wodurch eine Probe unbrauchbar wird (Abbildung 5A). Wir haben eine Standardmethode zur Vorbereitung d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,6 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	05-408-123
008-Fluortensid	RAN Biotechnologies	00115081361-6525	Alternative zu vorgemischter Lösung
008-FluorTensid in HFE7500	RAN Biotechnologies	008-FluorTensid-2wtH-50G	Vorgemischte Lösung
2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol)	Sigma Aldrich	63689	CAS-Nummer: 60-24-2 Stammlösung: 25 mM in MilliQ-Wasser, gelagert bei 4 Grad; C
4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethan-sulfonsäure (HEPES)	Sigma Aldrich	H3375	CAS-Nummer: 7365-45-9
5 min Epoxy	Devcon	14250
Actin	Cytoskeleton, Inc.	AKL99-A	>99% reine Kaninchenskelettmuskulatur (alternativ zur Reinigung)
Aktin (mit Rhodamin markiert)	Cytoskeleton, Inc.	AR05-A	Kaninchen-Skelettmuskel (alternativ zur Reinigung)
Adenosin 5′-triphosphat (ATP)	Sigma Aldrich	A6419	CAS-Nummer: 34369-07-8 Stammlösung: 25 mM in MilliQ-Wasser, lagern bei -20 &de; C eingefroren aufbewahren, um Hydrolyse zu vermeiden
Calciumchlorid (CaCl2)	Sigma Aldrich	C5670	CAS-Nummer: 10043-52-4
Capping Protein (Maus)			Gereinigt von Überexpression in E.coli mit einem HisTag Stammlösung: 20 mM in Capping Protein Puffer bei -80 &de;
C-Katalase aus Rinderleber	Sigma Aldrich	C9322	CAS-Nummer: 9001-05-2 Stammlösung: 85 ku/ml, aliquotiert mit Glukoseoxidase bei -20 μg lagern; C
Deckglas	Fisherbrand	12544C	Borosilikat, #1,5, 24 mm x 40 mm Fisherbrand nicht Fisher Finest
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G8270	CAS-Nummer: 50-99-7 Stammlösung: 225 mg/mL in MilliQ Wasser, lagern bei -20 &de; C
Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	3860-OP	CAS-Nummer: 3483-12-3 Stammlösung: 1 M in MilliQ Wasser, lagern bei -20 μg; C
Doppelseitiges Klebeband	3M	3136
Ethylalkohol 200 Proof	PHARMCO	111000200	CAS-Nummer: 64-17-5 200
Proof Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraessigsäure (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889	CAS-Nummer: 67-42-5
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884	CAS-Nummer: 60-00-4
Glukoseoxidase	Sigma Aldrich	345386	CAS-Nummer: 9001-37-0 Stammlösung: 135 mg/ml in MilliQ-Wasser, aliquotiert mit Katalase bei -20 & deg lagern; C
Glycerin	Sigma Aldrich	356352M	CAS-Nummer: 56-81-5
Imidazol	Fisher Bioreagenzien	BP305-50	CAS-Nummer: 288-32-4
Magnesiumchlorid (MgCl2)	Fisher Bioreagenzien	BP214	CAS-Nummer: 7786-30-3, 7791-18-6
Methylcellulose	Sigma Aldrich	M0512	CAS-Nummer: 9004-67-5 15 Centipoise
Objektträger Plain	Electron Microscopy Sciences/Gold Seal	63710-05	3"x1", 1 mm dickes
MilliQ Wasser	Millipore	CUFBI001	Reinstwasser
Novec-7500 Engineered Fluid	3M	7100134816	Alternative zu vorgemischter Lösung
Kaliumchlorid (KCl)	Sigma Aldrich	P3911	CAS-Nummer: 7447-40-7
Kaliumphosphat (KPO4)	Sigma Aldrich	P3786	CAS-Nummer: 7758-11-4
Kaninchen-Skelettmuskel-Aceton-Pulver	Pel-Freez Biologicals	41995-1	Wird bei der Reinigung von Aktin verwendet (alternativ zum Einkauf) Lagern Sie ca. 30 mM in Aktinpuffer G bei -80 & deg; C
Natriumazid	Sigma Aldrich	71289	CAS-Nummer: 26626-22-8
Tetramethylrhodamin-C6-maleimid	AnaSpec	AS-81445	CAS-Nummer: 174568-68-4 Wird bei der Reinigung von Aktin verwendet (alternativ zum Einkauf) Lagern Sie ca. 30 mM in Aktinpuffer G bei -80 μC. Wird bei der Markierung von Aktin verwendet (alternativ zum Einkauf)
Tris-Salzsäure (Tris HCl)	Sigma Aldrich	648317	CAS-Nummer: 1185-53-1
Ultraschallbad	Emerson Branson