Method Article

Abstimmung der Kontraktilität und des Verformungsmodus aktiver Aktin-basierter Anordnungen in vitro: Von zweidimensionalen aktiven Netzwerken bis hin zu Flüssigkristalltropfen

DOI:

10.3791/68127

⸱

July 11th, 2025

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1Institute of Biophysical Dynamics, University of Chicago, 2Department of Materials Science & Engineering, Clemson University

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops
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Summary

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Hier stellen wir Methoden zur Herstellung quasi-zweidimensionaler (2D) verschränker, vernetzter und flüssigkristalliner Aktin-Anordnungen aus gereinigten Proteinen vor.

Abstract

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Auf Aktin-Zytoskeletten basierende Materialien werden weithin als zelluläre Modellmaterialien untersucht, um physikalische Mechanismen der Zellmechanik, wie z. B. Formregulation und Krafterzeugung, aufzuklären, sowie faszinierende weiche polymere Materialien. In dieser Methode beschreiben wir die Herstellung von aktinbasierten Assemblierungen in vitro unter Verwendung von gereinigten Proteinen für fluoreszenzmikroskopische Studien. Wir polymerisieren lange Aktinfilamente in einer Probenkammer und verwenden ein Polymer-Depletants, um Filamente zu einem zweidimensionalen (2D)-verschränkten Netzwerk gegen eine mit einer Tensidschicht passivierte Oberfläche zu drängen. Die Zugabe von Myosin-II-Filamenten der Skelettmuskulatur in Gegenwart von Adenosintriphosphat (ATP) induziert eine Kontraktion des Aktinnetzwerks. Durch die Bündelung von Aktinfilamenten mit einem Vernetzer stimmen wir die Kontraktilität der Anordnung ab und gehen von einem Material, das sich einknickt, zu einem Material über, das auf der Mikroskala gleitet. Indem wir die Länge der Aktinfilamente durch Copolymerisation von Aktin in Gegenwart von Capping-Protein reduzieren, stimmen wir das Material von einem 2D-Netzwerk auf einen Flüssigkristall ab. Die Vernetzung von dispergierten kurzen Aktinfilamenten führt zu einer dreidimensionalen (3D) Flüssigkristalltröpfchenbildung.

Introduction

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Aktive biologische Materialien unterliegen mechanischen Prozessen in einer Vielzahl physiologischer Prozesse, einschließlich intrazellulärem Transport, Zellmigration, Zellformregulation und biologischer Krafterzeugung 1,2,3. In-vitro-Assemblierungen von Zytoskelettsystemen, die aus gereinigten und technisch hergestellten Proteinkomponenten bestehen, die in Puffern selbst angeordnet sind, sind ein etabliertes Werkzeug zur Charakterisierung grundlegender biophysikalischer und biochemischer Prozesse 4,....

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Protocol

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HINWEIS: Proteine und Markierung: Für die Zwecke dieses Protokolls wird davon ausgegangen, dass der Forscher mit Vorräten an gereinigten Proteinen beginnt, die fluoreszenzmarkiert werden, wenn dies für die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung erforderlich ist. Diese Proteine können gekauft oder in den Laboren 31,32,33,34,35,36,37 gereinigt und fluoreszierend markiert werden. In diesem Protokoll wurden B....

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Results

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Ein breites Spektrum von Aktin-Anordnungen kann in Modellsystemen mit gereinigten Proteinen gebildet werden, indem die in diesen Methoden beschriebene allgemeine Strategie verfolgt wird, bei der Aktin in Gegenwart von akzessorischen Proteinen, die die Assemblierungsarchitektur modifizieren, zu Filamenten polymerisiert wird (Abbildung 1). Wenn Aktin zu Filamenten ohne Vernetzer oder Capping-Protein polymerisiert wird, bildet es verschränkte Filamentnetzwerke (Abbildung 1A.......

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Discussion

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Es gibt viele Überlegungen zur Herstellung reproduzierbarer Aktin-Anordnungen. Eine der wichtigsten für die Erzeugung reproduzierbarer, analysierbarer Daten ist die Deckglasoberfläche der Probenkammer. Die Proteine in In-vitro-Aktinproben, insbesondere Myosin, sind extrem klebrig und haften an unbehandelten oder schlecht behandelten Glasoberflächen, wodurch eine Probe unbrauchbar wird (Abbildung 5A). Wir haben eine Standardmethode zur Vorbereitung d.......

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Disclosures

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Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Acknowledgements

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Wir danken Todd Thorenson, Mike Murrell, Jennifer Ross, Patrick McCall und anderen Mitgliedern der Gardel- und Kovar-Labore (University of Chicago) für die nützlichen Diskussionen bei der Entwicklung der Methoden. M.A.C. und S.R. wurden teilweise durch die Undergraduate Research Opportunity Grants des College of Engineering Computing and Applied Sciences der Clemson University unterstützt, und V.J.A. wurde von der Clemson Biophysics REU im Rahmen des NSF Award #2349368 mit Mitteln aus den Programmen DBI und EPSCoR unterstützt. Diese Arbeit wurde auch teilweise durch das EPSCoR-Programm der National Science Foundation im Rahmen des NSF....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,6 mL MikrozentrifugenröhrchenFisher Scientific05-408-123
008-FluortensidRAN Biotechnologies00115081361-6525Alternative zu vorgemischter Lösung
008-FluorTensid in HFE7500RAN Biotechnologies008-FluorTensid-2wtH-50GVorgemischte Lösung
2-Mercaptoethanol (β-Mercaptoethanol)Sigma Aldrich63689CAS-Nummer: 60-24-2
Stammlösung: 25 mM in MilliQ-Wasser, gelagert bei 4 Grad; C
4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethan-sulfonsäure (HEPES)Sigma AldrichH3375CAS-Nummer: 7365-45-9
5 min EpoxyDevcon14250
ActinCytoskeleton, Inc.AKL99-A>99% reine Kaninchenskelettmuskulatur
(alternativ zur Reinigung)
Aktin (mit Rhodamin markiert)Cytoskeleton, Inc.AR05-AKaninchen-Skelettmuskel
(alternativ zur Reinigung)
Adenosin 5′-triphosphat (ATP)Sigma AldrichA6419CAS-Nummer: 34369-07-8
Stammlösung: 25 mM in MilliQ-Wasser, lagern bei -20 &de; C
eingefroren aufbewahren, um Hydrolyse zu vermeiden
Calciumchlorid (CaCl2)Sigma AldrichC5670CAS-Nummer: 10043-52-4
Capping Protein (Maus)Gereinigt von Überexpression in E.coli mit einem HisTag
Stammlösung: 20 mM in Capping Protein Puffer bei -80 &de;
C-Katalase aus RinderleberSigma AldrichC9322CAS-Nummer: 9001-05-2
Stammlösung: 85 ku/ml, aliquotiert mit Glukoseoxidase bei -20 μg lagern; C
DeckglasFisherbrand12544CBorosilikat, #1,5, 24 mm x 40 mm
Fisherbrand nicht Fisher Finest
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG8270CAS-Nummer: 50-99-7
Stammlösung: 225 mg/mL in MilliQ Wasser, lagern bei -20 &de; C
Dithiothreitol (DTT)Sigma Aldrich3860-OPCAS-Nummer: 3483-12-3
Stammlösung: 1 M in MilliQ Wasser, lagern bei -20 μg; C
Doppelseitiges Klebeband3M3136
Ethylalkohol 200 ProofPHARMCO111000200CAS-Nummer: 64-17-5
200
Proof Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraessigsäure (EGTA)Sigma AldrichE3889CAS-Nummer: 67-42-5
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Sigma AldrichE9884CAS-Nummer: 60-00-4
GlukoseoxidaseSigma Aldrich345386CAS-Nummer: 9001-37-0
Stammlösung: 135 mg/ml in MilliQ-Wasser, aliquotiert mit Katalase bei -20 & deg lagern; C
GlycerinSigma Aldrich356352MCAS-Nummer: 56-81-5
ImidazolFisher Bioreagenzien BP305-50CAS-Nummer: 288-32-4
Magnesiumchlorid (MgCl2)Fisher Bioreagenzien BP214CAS-Nummer: 7786-30-3, 7791-18-6
MethylcelluloseSigma AldrichM0512CAS-Nummer: 9004-67-5
15 Centipoise
Objektträger PlainElectron Microscopy Sciences/Gold Seal63710-05  3"x1", 1 mm dickes
MilliQ WasserMilliporeCUFBI001Reinstwasser
Novec-7500 Engineered Fluid3M7100134816Alternative zu vorgemischter Lösung
Kaliumchlorid (KCl)Sigma AldrichP3911CAS-Nummer: 7447-40-7
Kaliumphosphat (KPO4)Sigma AldrichP3786CAS-Nummer: 7758-11-4
Kaninchen-Skelettmuskel-Aceton-PulverPel-Freez Biologicals41995-1Wird bei der Reinigung von Aktin verwendet (alternativ zum Einkauf)
Lagern Sie ca. 30 mM in Aktinpuffer G bei -80 & deg; C
NatriumazidSigma Aldrich71289CAS-Nummer: 26626-22-8
Tetramethylrhodamin-C6-maleimidAnaSpecAS-81445CAS-Nummer: 174568-68-4 Wird bei der Reinigung von Aktin verwendet (alternativ zum Einkauf)
Lagern Sie ca. 30 mM in Aktinpuffer G bei -80 μC. Wird bei der Markierung von Aktin verwendet (alternativ zum Einkauf)
Tris-Salzsäure (Tris HCl)Sigma Aldrich648317CAS-Nummer: 1185-53-1
UltraschallbadEmerson Branson 
CPX2800H

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marchetti, M. C., et al. Hydrodynamics of soft active matter. Rev Mod Phys. 85 (3), 1143-1189 (2013).
  2. Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nat Rev Mater. 2 (9), 17048(2017).
  3. Murrell, M., Oakes, P. ....

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Actin Based AssembliesActin PolymerizationMyosin II FilamentsFluorescence MicroscopyLiquid Crystal DropsCrosslinked Actin NetworksTwo Dimensional NetworksNetwork ContractilityCapping ProteinTime Lapse Imaging

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