Methodenartikel

Eine feinmotorische Aufgabe zur Untersuchung der Gelenkkinematik in einem präklinischen Modell neurodegenerativer Erkrankungen

DOI:

10.3791/68128

⸱

13. Juni 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychology, Arizona State University, 2Phoenix Country Day School, 3School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die vorliegende Studie beschreibt einen feinmotorischen Verhaltenstest zur Untersuchung motorischer Defizite in Nagetiermodellen, einschließlich der Ratte TgF344-AD, mittels maschinellem Lernen.

Zusammenfassung

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Motorische Dysfunktion ist eine kritische, aber oft unterschätzte Komponente von neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit (AD) und verwandten Demenzerkrankungen. Neue Forschungsergebnisse haben gezeigt, dass Aufgaben, die Feinmotorik, visuell-räumliche Fähigkeiten und exekutive Funktionen beim Menschen betreffen, Potenzial für die Früherkennung von Krankheiten haben können. Es ist jedoch wenig über die genauen Mechanismen bekannt, durch die diese Aufgaben den kognitiven und funktionellen Verfall im Zusammenhang mit AD vorhersagen. In der aktuellen Methode wurde eine feinmotorische Aufgabe, Kinematic Motor Ability Task (KINEMAT), entwickelt, um Veränderungen der motorischen Fähigkeiten im Laufe des Krankheitsverlaufs in präklinischen Modellen der AD im Vergleich zu anderen neurodegenerativen Erkrankungen und normalem Altern unter Verwendung von kostenloser, quelloffener Software für maschinelles Lernen zu untersuchen. Hier wurde der Proof-of-Concept mit dem Design, der Erprobung und der Implementierung der feinmotorischen Aufgabe in einer Pilotstudie an Fisher 344 CDF-Ratten mit und ohne Harmalin-induzierte motorische Beeinträchtigungen etabliert. Eine zusätzliche Validierung mit einem Rattenmodell für die Alzheimer-Krankheit (TgF344-AD) demonstrierte die Machbarkeit des Modells und die Sensitivität der Aufgaben. Ratten wurden darauf trainiert, durch einen kleinen Schlitz an der Vorderseite der Kammer zu greifen, um ein Zuckerpellet aus einer von drei Schüsseln zu holen, wobei der Schwierigkeitsgrad variierte. Die Pellet-Entnahme wurde anhand einer von drei Klassifizierungen bewertet: Erfolg (erfolgreiches Greifen und Fressen des Zuckerpellets), Fallen (Greifen, aber Leckerli beim Greifen fallen lassen) oder Misserfolg (Reichweite, bei der kein Pellet beschafft wird oder Pellets beim Versuch des Greifens aus der Schüssel geschlagen werden). Es wurden signifikante Unterschiede in der motorischen Fähigkeit zwischen Kontroll- und Harmalin-behandelten Ratten beobachtet, die sich in einer verringerten Gesamtreichweite und einer erhöhten Variabilität der Pfotenhaltung zeigten. TgF344-AD-Ratten zeigten auch eine verringerte Gesamtreichweite sowie geringere Erfolge in allen Schalen. Durch die Validierung als feinmotorische Aufgabe bei Nagetieren hat es zukünftiges Potenzial, das normale Altern und präklinische Modelle neurodegenerativer Erkrankungen, einschließlich AD, zu untersuchen, wenn Pathologien und Symptome im Laufe der Zeit auftreten.

Einleitung

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Es hat sich gezeigt, dass die motorische Funktion bei Menschen mit Demenz aufgrund der Alzheimer-Krankheit (AD) oder anderer Subtypen (z. B. Demenz mit Lewy-Körpern) beeinträchtigt ist. Greifkraft und Ganggeschwindigkeit können zwischen kognitiv beeinträchtigten und nicht beeinträchtigten älteren Erwachsenen unterscheiden 1,2, aber nicht unbedingt zwischen verschiedenen Subtypen von Demenzerkrankungen (d. h. geringer Spezifität)1,2. Daher besteht weiterhin ein Bedarf an neuen diagnostischen Instrumenten für frühe Demenz, möglicherweise gepaart mit maschinellem Lernen, um komplexe Muster und Zusammenhänge zwischen Verhalten und Krankheitszustand zu bewerten 3,4. Tiermodelle sind wertvoll für die Untersuchung des Fortschreitens neurodegenerativer Erkrankungen, um Einblicke in den frühen Krankheitsausbruch, Verhaltenskorrelate und die Integration von maschinellem Lernen in Analysepipelines zu bieten, um zwischen Schweregrad und Präsentation zu unterscheiden 5,6,7.

Neue Verhaltensmethoden beim Menschen haben Aufgaben identifiziert, die neben der kognitiven Verarbeitung auch feinmotorische Fähigkeiten erfordern, wie z. B. visuell-räumliche Fähigkeiten und exekutive Funktionen 8,9,10. Zum Beispiel kann eine funktionelle Aufgabe der oberen Extremitäten Muster der Neurodegeneration verfolgen und leichte kognitive Beeinträchtigungen (MCI) von AD unterscheiden. Bei dieser Aufgabe bewegt der Mensch rohe Kidneybohnen (jeweils zwei) mit einem Löffel von einer zentralen Haustasse in eine Zieltasse. Die Phase der Aufgabe, in der die Bohnen mit dem Löffel erfasst werden, zeigt stärkere Assoziationen mit der Kognition (insbesondere dem visuell-räumlichen Gedächtnis) als die Phase, in der die Bohnen zur Zieltasse transportiert werden11,12. Wenn der Löffel in die Tasse eindringt, kann er die Bohnen in der Tasse durcheinanderbringen, was bedeutet, dass die Bewegungen des Teilnehmers die Aufgabe erschweren können. Wenn der Versuch fortschreitet und die Anzahl der Bohnen in der Heimtasse abnimmt, wird die Aufgabe schwieriger (d. h. die Zeit, die Bohnen mit dem Löffel zu beschaffen, nimmt zu)13. Es wurde gezeigt, dass diese Aufgabe mit der AD-spezifischen Pathologie (Amyloid)9,14 und der Neurodegeneration (Hippocampusatrophie)10,15 korreliert, was darauf hindeutet, dass ihre Leistung von neuronalen Schaltkreisen und Verhaltensprozessen abhängen könnte, die früh im Krankheitsprozess beeinflusst werden. Es ist bekannt, dass die Initiierung, Planung, Ausführung und Korrektur von Bewegungen durch ein vielfältiges Netzwerk gesteuert wird, das das Gehirn durchquert, einschließlich des motorischen Kortex, wobei die Zellkörper der oberen Motoneuronen in der Großhirnrinde mit den unteren Motoneuronen im Rückenmark synapsieren16. Diese unteren Motoneuronen kommunizieren direkt mit den Muskeln, um die Bewegung an der neuromuskulären Verbindung zu steuern. Aufsteigende Bahnen transportieren sensorische Informationen von der Peripherie zum Rückenmark, während absteigende Bahnen innerhalb des Gehirns Richtungsinformationen darüber übermitteln, wie und wo sie zu den Muskeln zurückkehren sollen 17,18. Zu verstehen, wie diese Signalwege selektiv von der AD-Pathologie beeinflusst werden, ist entscheidend für das Verständnis des Krankheitsverlaufs, zumal genetische Tiermodelle, einschließlich der 3xTg-AD-Maus und der TgF344-AD-Ratte, zuvor verwendet wurden, um zu untersuchen, wie AD-Gene die Fortbewegung, Koordination und andere motorische Beeinträchtigungen beeinflussen 19,20,21. Typischerweise konzentrieren sich diese Aufgaben auf grobmotorische Beeinträchtigungen im Zusammenhang mit Ganzkörperbewegungen, aber motorische Defizite beim Menschen sind viel variabler, was bei Nagetieren schwer zu erkennen sein kann22. Daher sind neue Aufgaben erforderlich, um die Lücke zwischen Mensch- und Tiermodellen zu schließen und diese Variabilität zu erfassen.

Eine Gehirnregion, die häufig mit motorischen Beeinträchtigungen und Zittern in Verbindung gebracht wird, ist das Kleinhirn23. Das Kleinhirn ist ein wichtiger Regulator präziser und koordinierter Bewegungen und fungiert als Verarbeiter sensorischer Informationen, um über absteigende Bahnen Rückmeldung zu geben, um diese willkürliche Bewegung zu korrigieren und anzupassen24,25. Es ist wichtig zu beachten, dass die Kleinhirnatrophie bei Personen mit AD erkannt wurde, aber im Gegensatz zu anderen Regionen wie dem Hippocampus korreliert eine erhöhte Amyloidablagerung im Kleinhirn nicht mit einer erhöhten Atrophie26. Während das Fortschreiten der AD-Pathologie im Kleinhirn unterschiedlich ist, gibt es multisynaptische bidirektionale Verbindungen zwischen dem Kleinhirn und dem Hippocampus, die wahrscheinlich inden Jahren 27,28,29 n. Chr. gestört sind. Bemerkenswert ist, dass es funktionelle Verbindungen zwischen dem Kleinhirn und dem Hippocampus gibt, da Gedächtnisdefizite nach einer Kleinhirntumorresektion dokumentiert wurden 30,31,32,33,34,35,36,37. Bei Nagetieren werden die Ortszellen des Hippocampus durch eine Kleinhirnstörung gestört38. Diese sich überschneidenden Defizite im Gedächtnis, in der Geselligkeit und in der motorischen Kontrolle unterstreichen, wie wichtig es ist, mögliche frühe Veränderungen in den motorischen Bahnen aufzudecken, die vor dem kognitiven Verfall auftreten 30,31,38,39. Mit der Implementierung feinmotorischer Aufgaben in der frühen Alzheimer-Forschung könnten wir beginnen, das traditionelle Verständnis von Alzheimer als einfache kognitive Störung neu zu gestalten und die diagnostischen Bemühungen auf frühe motorische Veränderungen umzulenken, die das Fortschreiten der Krankheit vorhersagen können und stärker zwischen kognitiv beeinträchtigten und nicht beeinträchtigten alternden Personen unterscheidbar sind.

Um zu verstehen, wie feinmotorisches Verhalten auf Veränderungen in der Gehirnstruktur hinweisen kann, wurde eine Nagetierversion der oben beschriebenen menschlichen Aufgabe erstellt und getestet. Diese Nagetieraufgabe wurde KINEMAT (KINEmatic Motor Ability Task) genannt und weicht von früheren Greifaufgaben ab, die das Abrufen eines einzelnen Pellets von einem Sockel oder einer Treppe erfordern, und der einfacheren Bewertung als Ergebnis einer konsistenten Pelletplatzierung in allen Phasen der Aufgabe 40,41,42,43,44,45,46, 47,48. Diese feinmotorische Greifaufgabe umfasst neue Bewertungsmethoden, Schalen mit verschiedenen Schwierigkeitsgraden und selbststörende Funktionen, um das menschliche Gegenstück nachzuahmen, wobei die Bewegung der Kugeln und die anschließenden Anpassungen der Teilnehmerstrategie im Mittelpunkt des Designs stehen. Diese Aufgabe verwendet die maschinellen Lernwerkzeuge Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP) und keypoint-MoSeq49,50, die eine unvoreingenommene und quantitative Messung der Feinmotorik und des Reichweitenverhaltens ermöglichen. Während andere bemerkenswerte Rechenmodelle für geschickte Greifaufgaben bei Nagetieren entwickelt wurden 44,45,51, eliminiert keypoint-MoSeq Rauschen, um eine präzise Quantifizierung von Bewegungs- und Greifposenzu ermöglichen 50. Die Aufgabenleistung und die motorische Lernstrategie wurden mit einer Hochleistungs-Bildverarbeitungskamera bei typischen und motorisch gestörten Ratten mit Harmaline52 rekonstruiert. Harmalin hyperaktiviert den Nucleus olivarus inferior und stört die Kleinhirnfunktion durch glutamaterge Kletterfasern53,54. Darüber hinaus wurde die Feinmotorik bei einer Untergruppe von TgF344-AD-Ratten untersucht. Daher wurde erwartet, dass die feinmotorische Aufgabe als Proof-of-Concept messbare Beeinträchtigungen bei Harmalin-behandelten und TgF344-AD-Ratten im Vergleich zu ihren typischen Artgenossen finden würde. Dieses Protokoll beschreibt die Konstruktion der feinmotorischen Aufgabe, das Training und Testen von Tieren und die Quantifizierung des Greifverhaltens mit SLEAP und keypoint-MoSeq.

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Protokoll

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Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Arizona State University genehmigt.

1. Aufbau und Konstruktion der Kammer

  1. Bereiten Sie die durchsichtigen Acrylplatten vor. Die Schaltpläne der Box befinden sich unter https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask. Schneiden Sie klare Acrylplatten auf folgende Maße zu (alle Platten sind 1 cm dick):
    1. Schneiden Sie zwei Seitenteile aus: 26 cm × 22 cm.
    2. Schneiden Sie eine obere Platte aus: 27 cm × 12 cm.
    3. Schneiden Sie die erste Bodenplatte aus: 26 cm x 10 cm
    4. Schneiden Sie die zweite untere Platte aus: 26 cm x 11 cm
    5. Schnitt einer Frontplatte: 20 cm × 11 cm.
    6. Ausschnitt einer Rückwand: 20 cm x 12 cm
    7. Schneiden Sie einen Schlitz für die Frontplatte (140 mm x 12 mm) aus. Positionieren Sie den Schlitz mittig, wobei die Unterkante mit der Unterseite der Blende ausgerichtet ist.
    8. Schneiden Sie eine innere Rille aus: 1 cm. Erstellen Sie an den Innenkanten der Seitenteile eine Vertiefung oder Nut, damit die Frontplatte sicher ein- und ausgleiten kann.
      HINWEIS: Wenn die Schiebefunktion nicht erforderlich ist, kann die Frontplatte dauerhaft verklebt werden, um die Konstruktion zu vereinfachen.
    9. Bohren Sie gleichmäßig verteilte Löcher (5 mm Durchmesser) in die zweite Bodenplatte, damit die Pellets beim Herunterfallen durchfallen können. Platzieren Sie die Löcher im Abstand von 1 cm in einem Gittermuster.
  2. Montieren Sie die Kammer mit Klebstoff (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Verwenden Sie einen starken, transparenten Klebstoff, der speziell für Acrylmaterialien entwickelt wurde.
    1. Seitenwände: Tragen Sie eine durchgehende Linie Klebstoff entlang der Kanten der Bodenplatte auf. Positionieren Sie die Seitenteile senkrecht und drücken Sie sie fest. Lassen Sie den Klebstoff gemäß den Herstellungsanweisungen aushärten.
    2. Rückwand: Tragen Sie Klebstoff auf die hinteren Kanten der Seiten- und Bodenwände auf. Positionieren Sie die Rückwand und drücken Sie sie fest.
    3. Oberteil: Tragen Sie Klebstoff auf die Oberkanten der Seiten- und Rückwände auf. Positionieren Sie die obere Blende und drücken Sie sie fest.
    4. Frontplatte: Schieben Sie die Frontplatte vorsichtig in die Rillen an den Seitenwänden, um einen festen, aber glatten Sitz zu gewährleisten, oder tragen Sie Klebstoff entlang der Kanten der Frontplatte auf und befestigen Sie ihn an der Seiten-, Ober- und Unterseite.
      1. Testen Sie die Bewegung des Paneels und bestätigen Sie, dass es genau mit dem Rest der Kammer ausgerichtet ist.
  3. Aufbau-Beleuchtung
    1. Positionieren Sie das Infrarotlicht (IR) am gegenüberliegenden Ende der Prüfkammer und zeigen Sie in Richtung der Kammer. Lege ein Blatt weißes Tonpapier auf die Kammer, um das Licht nach unten zu reflektieren.
      HINWEIS: Die Beleuchtung ist entscheidend für eine ordnungsgemäße Aufnahme, und alle Aufnahmen sollten unter IR-Licht in einem dunklen Raum gemacht werden.
  4. Bereiten Sie die Trainingsschale vor.
    1. Stellen Sie die Trainingsschale mit einem Radius von 31 mm und einer Verlängerung von 32 mm mit einem 3D-Drucker her. STL-Datei auf https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask verfügbar (Abbildung 1B: oben)
    2. Befestige die Trainingsschale am Boden der Kammer direkt vor dem Schlitz. Positioniere die Schüssel so, dass sich ihre Oberkante ungefähr über der Augenhöhe der Ratte in der Kammer befindet, und verwende einen stützenden Ständer, z. B. einen Holzblock.
  5. Bereiten Sie die Testschalen vor (Abbildung 1B: Mitte und Boden).
    1. Drucken Sie die Schalen mit den bereitgestellten STL-Dateien. Es werden zwei unterschiedliche Kopfdesigns angeboten: "Plain-Less" und "Plinko". (https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask)
      1. Prüfung auf Maßgenauigkeit und Haltbarkeit (Abmessungen: 50 mm tief x 40 mm breit).

2. Computer- und Kamerahardware

  1. Verwenden Sie ein Stativ, um die Kamera sicher zu befestigen.
  2. Positionieren Sie die Kamera ca. 15-20 cm von der Vorderseite der Kammer entfernt.
    1. Passen Sie die Höhe und den Winkel des Stativs so an, dass die Kamera eine isometrische 45°-Ansicht sowohl des Schlitzes als auch der Schüssel aufnimmt.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Sichtfeld der Kamera die Rattenpfote und die vollständige Reichweite, den Schlitz und die Trainings- oder Testschale umfasst. Testen Sie bei Bedarf verschiedene Winkel und Abstände, um eine optimale Sicht zu erreichen.
  3. Laden Sie die Software herunter, um sie mit der Kamera für Verhaltensaufzeichnungen (https://www.teledynevisionsolutions.com/products/spinnaker-sdk) zu koppeln, und öffnen Sie die Software, um die Kamera zum Aufzeichnen von Verhalten zu verwenden.
    1. Verwenden Sie die folgenden Kameraeinstellungen: Aufnahmemodus: kontinuierlich, Bildrate: 216 Hz, Belichtungsmodus: zeitgesteuert, automatische Belichtung: aus, Belichtungszeit: 4430 μs, Verstärkung automatisch: aus, Verstärkung: 16,85 dB, Gamma: 0,8.
    2. Die Aufnahmeeinstellungen lauten wie folgt: H264-Dateityp, 5 Millionen (5.000.000) Bitrate.
    3. Um 10 Minuten lang aufzunehmen, geben Sie 130.000 Bilder ein und verwenden Sie den Streaming-Modus zum Speichern.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, einen dedizierten Computer mit mindestens 16 GB RAM und einer internen Solid-State-Festplatte mit 1 TB zum Speichern von Daten zu verwenden.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der feinmotorischen Aufgabe. (A) Karikaturdarstellung der feinmotorischen Aufgabe, bei der eine Ratte durch einen Schlitz greift, um ein Zuckerpellet zu erhalten. Die Reichweiten werden für die Analyse des maschinellen Lernens aufgezeichnet. Es werden drei separate Schalen verwendet: eine (unten links) Trainingsschüssel, (unten Mitte) Plain/Less-Schüssel und die (unten rechts) Plinko-Schale mit rot eingekreisten Hindernissen. (B) Schemata jedes Schalendesigns, einschließlich (oberer) Trainingsschale, (mittlerer) Plain/Less-Schale und (unterer) Plinko-Schale. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Vorbereitung der Tiere

  1. Paarhaltung (mindestens) von Fisher 344 CDF-Ratten (männlich und weiblich, >3 Monate alt) in einem umgekehrten Hell-Dunkel-Zyklus, um Tests zu ermöglichen, wenn die Tiere am aktivsten sind.
  2. Wiegen Sie alle Nagetiere 1 Woche vor Beginn der Gewöhnung und geben Sie ~30 g Futter für ein Nagetier mit einem Gewicht von über 300 g und ~15 g für ein Nagetier 100-300 g, um die Tiere bei 90 % Körpergewicht zu halten.
    1. Wiegen Sie die Ratten täglich und passen Sie das Futter entsprechend an, indem Sie die Futtermenge um 1-2 g pro Tag reduzieren, bis das Nagetier 90 % Körpergewicht erreicht. Der tägliche Umgang trägt auch dazu bei, die Tiere an den Versuchsleiter zu gewöhnen.
    2. Setzen Sie diesen Vorgang während der Gewöhnung und des Tests fort und passen Sie das Futter um +/- 0,5 g an, wenn das Gewicht den Schwellenwert unter- oder überschreitet.
    3. Wiegen Sie die Tiere während des Versuchs vor Beginn der Aufgabe und stellen Sie das zugeteilte Futter sofort bereit, wenn Sie nach Beendigung der Aufgabe in den Käfig zurückkehren.
      HINWEIS: Jeder plötzliche Gewichtsverlust (>15%) über 1-2 Tage kann auf ein zugrunde liegendes Problem hinweisen, und ein Tierarzt sollte konsultiert werden.

4. Gewöhnung (2 Tage)

  1. Schalten Sie das IR-Licht, die Kamera und den Computer ein.
  2. Stellen Sie die Trainingsschale mit den Pellets in den Öffnungsschlitz und achten Sie darauf, dass die Spitze der Schüssel leicht in das Gerät hineinragt (anfangs ca. 2 cm).
  3. Bringen Sie die Käfige in den Testraum und lassen Sie die Ratten 5 Minuten lang akklimatisieren.
  4. Tag 1: Stellen Sie paarweise gehaltene Ratten in die Kammer und lassen Sie sie 20 Minuten lang erkunden. Legen Sie nach dem Test 3-5 Zuckerpellets in den Käfig, damit sich die Ratten mit den Pellets vertraut machen können.
    HINWEIS: Eine Pelletgröße von 45 mg ermöglicht eine einmalige Pellet-Entnahme.
  5. Reinigen Sie die Kammer mit einem Desinfektionstuch zwischen den Ratten. Am Ende des Tages zur Desinfektion mit Ethanol besprühen.
  6. Tag 2: Gewöhnen Sie die Nagetiere individuell an das Gerät mit dem gleichen Verfahren (20 min). Wenn Nagetiere ängstlich erscheinen oder die Vorderseite des Geräts und der Schüssel meiden, gewöhnen Sie sich weiter, bis dieses Verhalten nachlässt. Geben Sie weiterhin Pellets als Leckerli in den Heimkäfig (3-5 Pellets).
    1. Um die Vertrautheit und Annäherung an die Schüssel zu fördern, bewegen Sie das längliche Rohr während der Gewöhnung schrittweise weiter in den Apparationsverschluss hinein und bewegen Sie die Spitze jeweils 0,5 cm näher an das Nagetier heran, um das Erreichen zu erleichtern.
      HINWEIS: Gewöhnung, Tests und Training sollten alle am selben Ort unter rotem Licht durchgeführt werden, um die Auswirkungen neuartiger Umgebungen zu eliminieren.

5. Formgebung (10 Tage)

  1. Schalten Sie das IR-Licht, die Kamera und den Computer ein.
  2. Bringen Sie die Käfige in den Raum und lassen Sie die Ratten 5 Minuten lang akklimatisieren.
  3. Geben Sie mit der Trainingsschale 1-5 Kugeln entlang der Extension, wobei die Extension am ersten Tag vollständig in das Gerät eingesetzt wird. Trainieren Sie Tiere in 10-minütigen Sitzungen. Die Aufzeichnung während der Formgebung ist optional.
    HINWEIS: Um die Nagetiere mit den Pellets vertraut zu machen, ist es wichtig, einige Zuckerpellets im Gerät selbst bereitzustellen, um die Abneigung gegen die Pellets in der Schüssel zu verringern. Nagetiere werden wahrscheinlich die Pellets im Gerät fressen, weil sie leicht zu beschaffen sind und diese Pellets in der Schüssel erkennen. Es ist wichtig, dass sie sich daran gewöhnen, in die richtige Richtung des Geräts zu schauen und sich daran zu gewöhnen, die Schüssel zu berühren.
  4. Beginnen Sie an den folgenden Trainingstagen mit dem Zurückziehen der Schüsselverlängerung aus dem Gerät. Dies erfordert, dass sich Nagetiere der Geräteöffnung an der Vorderseite nähern und die Interaktion mit der Verlängerung direkt außerhalb des Geräts fördern.
    1. Das Design ermöglicht eine spezifische Platzierung der Pellets. Platzieren Sie die Pellets beispielsweise am Ende der Schüssel, das dem Nagetier am nächsten ist, und entfernen Sie sich allmählich, um das Nagetier zu ermutigen, aus dem Gerät herauszugreifen.
  5. Wenn Nagetiere sich immer wohler dabei fühlen, Pellets vom Rand der Extensions zu nehmen, auch wenn es nur durch den Mund ist, beginnen Sie, Pellets über die Pinzette einzuführen, um das Greifverhalten zu fördern.
    1. Halten Sie ein Pellet in die Pinzette direkt außerhalb des Geräts, so dass Nagetiere die Pinzette einfach berühren können. Belohnen Sie dieses Verhalten sofort, um weiteres Greifen zu fördern.
    2. Wenn Nagetiere sich beim Berühren der Pinzette wohler fühlen, lassen Sie sie etwas weiter aus dem Gerät greifen, um das Pellet zu berühren oder zu greifen, indem Sie die Pinzette etwas weiter von der Geräteöffnung entfernt halten.
      HINWEIS: Machen Sie sich Notizen über alle Verhaltensweisen der Tiere, insbesondere wenn Tiere Angst vor dem Napf haben oder nicht greifen. Diese Tiere benötigen möglicherweise zusätzliche Formtage.
  6. Sobald Nagetiere mindestens 3 Tage lang kontinuierlich und unabhängig voneinander greifen (Abbildung 2A), wechseln Sie zur Plain-Schale, bis sich das Reichweitenverhalten etabliert hat (kontinuierliches Greifen für 3 Tage mit mindestens 10 unabhängigen Erreichen pro Tag).
    1. Wenn Sie die Nagetiere in die Plain-Schüssel einführen, stellen Sie sicher, dass die Schüssel so weit wie möglich mit Pellets gefüllt ist, damit die Nagetiere die Pellets über den Rand der Schüssel sehen können.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann es erforderlich sein, die Reichweite mit einer Pinzette zu fördern.
  7. Reinigen Sie die Kammer mit einem Desinfektionstuch zwischen den Ratten. Am Ende des Tages zur Desinfektion mit Ethanol besprühen.

6. Bereiten Sie sich auf den Test vor:

  1. Die Tests werden über 9 Tage abgeschlossen (Abbildung 2A), wobei jedes Nagetier 3 Versuche pro Schale durchführt, wobei jeder 10-minütige Versuch an aufeinanderfolgenden Tagen stattfindet.
    HINWEIS: Der Test wird am besten morgens durchgeführt.
  2. Wiegen Sie die Ratten an jedem Testtag. Nach Abschluss des Tests werden die Ratten 30-60 Minuten lang in häuslichen Käfigen belassen, da das Wiegen Stress auslösen und das Greifen beeinträchtigen kann.
  3. Schalten Sie den Computer ein und stellen Sie die Schüssel auf. Schließen Sie die Kamera und das Licht an. Öffnen Sie die Aufnahmesoftware und passen Sie die Kameraeinstellungen an, wie in Abschnitt 2 des Protokolls beschrieben.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, mindestens 200 Bilder pro Sekunde (fps) aufzunehmen, um alle Pfotenbewegungen zu erfassen.
  4. Richten Sie die Schüssel im Rahmen der Kamera aus und visualisieren Sie sie in der Aufnahmesoftware, indem Sie die Play-Taste drücken. Stellen Sie die Schüssel bündig mit dem Gerät und der Kamera in einem 45°-Winkel zur Seite der Schüssel auf.
    1. Bewegen Sie die Kamera, um das Greifen direkt frontal zu erfassen, um die Bewegung einzelner Finger und Handflächen sowie die Bewegung in Bezug auf die Höhe der Handfläche über der Schale während des Greifens zu untersuchen.
    2. Platzieren Sie die Kamera direkt senkrecht zur Schale, um Arm- und Handbewegungen zum und vom Schüssel zu erfassen, aber keine Ziffernplatzierung oder Details zum Greifverhalten.
      HINWEIS: Obwohl ein Winkel von 45° empfohlen wird, um Bewegungen entlang der x-, y- und z-Ebenen zu erfassen, können andere Konfigurationen Informationen für die gewünschte Studie leichter erfassen.

7. Testen (9 Tage)

  1. Setzen Sie die Ratten 1 Stunde lang in den Raum, um sich daran zu gewöhnen.
  2. Stellen Sie die erste Schüssel auf die Schüsselplattform und befestigen Sie sie mit Zahnwachs. Stellen Sie sicher, dass die Vorderseite der Schüssel bündig und mittig mit der Geräteöffnung abschließt.
  3. Benennen Sie die Videodatei in Spinview mit der Rattenidentifikationsnummer, dem Datum der Aufnahme und der Uhrzeit der Aufnahme.
  4. Setze die Ratte in das Gerät. Schließen Sie den Deckel und legen Sie den weißen Cardstock darauf, um das Licht abzulenken.
  5. Überprüfen Sie an dieser Stelle den Kamerawinkel, um sicherzustellen, dass die richtige Szene aufgenommen wurde, und passen Sie die Schüssel an, wenn sie nicht zentriert ist.
  6. Gießen Sie die richtige Menge Pellets in die Schüssel und drücken Sie auf Aufnahme starten.
    Tag 1-3 Einfache Schüssel: ~100 Pellets
    Tag 4-6 Weniger Schüssel: ~50 Pellets
    Tag 7-9 Plinko-Schale: ~50 Pellets
  7. Bleiben Sie während des gesamten Tests im Raum, um die Ratte kontinuierlich zu überwachen, machen Sie sich Notizen zum Erreichen von Leistung und Verhalten und fügen Sie bei Bedarf Pellets hinzu, um die richtige Menge zu erhalten.
    1. Stellen Sie bei der einfachen Schüssel sicher, dass Nagetiere Pellets über den Rand der Schüssel sehen können und dass immer Pellets erhalten werden können (d. h. füllen Sie die Schüssel während des gesamten Versuchs, wenn die Pellets abnehmen, werden die Pellets geschichtet).
    2. Für die Less-Schüssel: Achten Sie darauf, dass die Pellets nicht übereinander gestapelt sind und zwischen den Pellets etwas Platz ist, damit sie sich verstreuen können, wenn die Ratte versucht, sie zu erreichen.
    3. Für die Plinko-Schale: Stellen Sie sicher, dass genügend Pellets vorhanden sind, um zwischen den Hindernissen zugänglich zu sein.
  8. Bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück und stellen Sie das zugewiesene Futter bereit. Reinigen Sie die Kammer mit einem Desinfektionstuch zwischen den Ratten.
  9. Am Ende des Tages mit Ethanol besprühen, um die gesamte Kammer zu desinfizieren und sich auf den nächsten Tag vorzubereiten.
    HINWEIS: Wenn Sie sowohl männliche als auch weibliche Nagetiere testen, stellen Sie sicher, dass die Geschlechter mit einigen Weibchen und einigen Männchen, die früher am Morgen getestet wurden, und einer ähnlichen Mischung, die später getestet wurde, ausgeglichen werden. Behalten Sie die Reihenfolge der Tester während des gesamten Experiments bei.

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Abbildung 2: Training und Test von Ratten, die die feinmotorische Aufgabe ausführen. (A) Zeitleiste des Experiments. Die Ratten wurden zwei Tage lang an das Gerät gewöhnt und dann 10 Tage lang Formgebungsverfahren unterzogen. Die Tiere wurden in allen drei Schüsseln drei Tage lang auf ihre Feinmotorik getestet. Dann wurde den Tieren Harmalin injiziert und drei Tage lang an jeder Schüssel erneut getestet. (B) Ratten (n = 6) wurden während der Formgebung zwei verschiedenen Schalen (Trainingsschale und Plain) unterzogen, und der Schalentyp wurde an Tag 5 gewechselt, um die Reichweite zu verbessern. Es gab eine signifikante Zunahme der Formgebung über 10 Tage, um die Kriterien zu erreichen (F(9, 45) = 13,5, p < 0,001). Der graue Balken kennzeichnet den Wechsel zwischen der ursprünglichen und der aktuellen länglichen Röhrentrainingsschale. (C) Beim Testen aller drei Bowls gab es einen signifikanten Unterschied in der Gesamtreichweite über die 9 Testtage (F(8, 32) = 3,74, p = 0,003). Hinweis: Ratte 2 wurde nach dem Formen entfernt. Die Plinko-Schale führte zu signifikanten Unterschieden zwischen der Less- (p = 0,001) und der Plain-Schale (p = 0,027). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

8. Modellierung feinmotorischer Störungen mit Harmaline

HINWEIS: Um die Auswirkungen motorischer Störungen auf die Feinmotorik und die Leistung bei der Feinmotorik zu identifizieren, wurde Ratten Harmalin (10 mg/kg) injiziert, ein β-Carbolin-Alkaloid, das ein reversibler Inhibitor der Monoaminoxidase-A ist und auf die untergeordnete Olive 52,55,56,57 abzielt. Harmalin in Nagetiermodellen beeinflusst die Haltung und das Gleichgewicht, schränkt die Feinmotorik ein und führt zu motorischen Störungen in den oberen Gliedmaßen.

  1. Wiegen Sie die Ratten, um die richtige Harmalin-Dosis zu berechnen.
  2. Lassen Sie die Ratten 1 Stunde lang im Testraum gewöhnen.
  3. Schalten Sie den Computer ein und stellen Sie die Schüssel auf. Schließen Sie die Kamera und das Licht an. Öffnen Sie die Aufnahmesoftware und passen Sie die Kameraeinstellungen an, wie in Abschnitt 2 des Protokolls beschrieben.
  4. Nagetieren Harmalin (10 mg/kg, i.p.) injizieren.
  5. Gießen Sie die Pellets nach 15 Minuten in die richtige Schüssel und beginnen Sie mit der Aufnahme. Testen Sie die Ratte an jeder Schüssel über 3 Tage.
    Tag 1 Einfache Schüssel: ~100 Pellets
    Tag 2 Weniger Schüssel: ~50 Pellets
    Tag 3 Plinko-Schale: ~50 Pellets
    HINWEIS: Überwachen Sie die Injektionsstelle bis zu 3 Stunden nach der Injektion auf Anomalien, einschließlich Hautreizungen, schmerzhaftes Verhalten, Ataxie, Unterkühlung und Haltungsveränderungen. Überwachen Sie nach den 3-Stunden-Fenstern weiterhin auf Verhaltensänderungen, einschließlich Latenzen beim Essen oder Trinken oder Restzittern.

9. Videoanalyse mittels maschinellem Lernen

HINWEIS: Nach der Datenerfassung und Videoaufzeichnung wurden die Reichweiten von Hand gezählt und wie folgt bewertet: Erfolg (Pellet abrufen und verbrauchen), Drops (holt das Pellet zurück, lässt es aber vor dem Verzehr fallen), Failure (Pellet kann nicht abgerufen werden). Diese handbewerteten Daten wurden als Ground-Truth-Daten für die Analyse des maschinellen Lernens verwendet.

  1. Unter Verwendung von benutzerdefiniertem Python-Code wurden https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask Vergleiche zwischen Baseline- und Harmalin-behandelten Tieren durchgeführt, um Veränderungen in der Reichweitenleistung zu identifizieren (Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5 und Abbildung 6).
  2. Um die Gelenkkinematik des Greifverhaltens zu analysieren, einschließlich der Reichweitenbahn, der Pfotenkonformität und -position sowie der Änderungen der Reichweitenstrategie über die verschiedenen Schüsseltypen hinweg, verwenden Sie die kostenlose und quelloffene maschinelle Lernsoftware Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP) (siehe https://sleap.ai/ für eine ausführlichere Erklärung und eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verwendung des Open-Source-Programms49).
    HINWEIS: SLEAP49 kann unter https://github.com/talmolab/sleap heruntergeladen werden.
  3. Öffnen Sie ein neues Projekt und fügen Sie 3 Videos der Zielaufgabe hinzu.
  4. Erstellen Sie ein Skelett, das aus 15 Knoten besteht: 1 Oberarm, 1 Handgelenk, 1 Handflächenmitte, 4 Basis-, 4 Knöchel- und 4 Fingerspitzenknoten (Skelett unter https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask herunterladen).
  5. Fügen Sie Kanten zwischen den Knoten hinzu, so dass der obere Arm mit dem Handgelenk und dann mit der Handflächenmitte verbunden ist. Verbinden Sie von der Handflächenmitte aus die Basis-, Knöchel- und Fingerspitzenknoten so, dass die Handflächenmitte immer der Startknoten ist (Abbildung 7A).
  6. Kennzeichnen Sie mindestens 50 Frames vor dem Ausführen. Hier kann man ein neues Modell trainieren oder die Modelle für zentriert und schwerpunktförmig auf dem github verwenden: https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask.
  7. Nachdem das Modell trainiert wurde, öffnen Sie ein neues Video, und führen Sie den Rückschluss aus: trackin.match: greedy, n_instances:1, tracking.clean_instance_count:1, tracking.target_instance_count:1, tracking.pre_cull_to_target:1.
    HINWEIS: Der Rückschluss kann als Bash-Skript auf einem lokalen Cluster ausgeführt werden. Für getrackte Videos muss möglicherweise ein Korrekturlesen durchgeführt werden (Anweisungen zum Korrekturlesen finden Sie unter https://sleap.ai/).
  8. Um die Knoten weiter zu analysieren und die Unterschiede zwischen den Gruppen in der Gelenkkinematik zu verstehen, verwenden Sie das kostenlose und quelloffene keypoint-MoSeq50 (siehe https://github.com/dattalab/keypoint-moseq für Details zum Download und Gebrauchsanweisungen).
  9. Erstellen Sie diskrete Silben des Verhaltens mit keypoint-MoSeq50 (Abbildung 7B). Führen Sie zusätzliche Analysen durch, um die Übergangshäufigkeit, die Wahrscheinlichkeit und Änderungen der Häufigkeit von Übergängen zwischen Harmalin- und Ausgangsbedingungen pro Schüssel abzubilden (Abbildung 7C, D). Für Analysecode finden Sie https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask.

figure-protocol-3
Abbildung 3: Veränderungen beim Greifen über Schalen und Behandlung. (A) Für den Ausgangstest (n = 5) gab es bei allen 3 Schalen einen signifikanten Unterschied in der Gesamtreichweite (H(df) = 8,48, p = 0,014, Kruskal-Wallis), wobei beim Plinko-Schalentyp mehr Reichweiten auftraten (p = 0,011, Post-hoc-Dunn-Test mit Bonferroni-Korrektur). (B) Die Harmalin-Störung (n = 5) führte nicht zu Unterschieden zwischen den Schalentypen. Fehler werden als S.E.M. *p < 0,05 gemeldet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-protocol-4
Abbildung 4: Vergleich der Leistung zwischen den Bedingungen und über die Trommeltypen hinweg. (A) Es gab eine signifikante Schüssel (F(2) = 5,78, p = 0,007) und einen Ergebnisunterschied (F(2) = 3,92, p = 0,029) während des Ausgangstests. Die Reichweitenversuche nahmen zu, als der Bowl-Typ schwieriger wurde, obwohl die Reachs bei allen Bowls im Harmalin-Zustand gegenüber der Grundlinie reduziert wurden. (B) Bei mit Harmalin behandelten Ratten wurden keine Unterschiede in Bezug auf die Reichweitenzahl in den Schalen gefunden. (C) Es gab einen signifikanten Ergebnisunterschied (F(2) = 2,07, p < 0,001) während des Ausgangstests, wenn er nach Leistung analysiert wurde. (D) Bei mit Harmalin behandelten Ratten wurden keine Unterschiede in Bezug auf die Schalen- oder Ergebnisleistung festgestellt. Fehler werden als S.E.M. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-protocol-5
Abbildung 5: Vergleich von Ausgangs- und Harmalinbedingungen. (A) Es gab keine Unterschiede im Leistungserfolg zwischen den Bedingungen. (B) Für die Fehlerzahlen gab es einen signifikanten Unterschied zwischen der Baseline- und der Harmalin-Bedingung (H(df) = 4,85, p = 0,028, Kruskal-Wallis), mit einem signifikanten Effekt in der Harmalin-Bedingung (p = 0,028, Post-hoc-Dunn-Test mit Bonferroni-Korrektur). Fehler werden als S.E.M. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-protocol-6
Abbildung 6: Lern- und Reichweitenquoten. (A) Harmalin-Tiere hatten eine gestörte Lernrate im Vergleich zur Ausgangsbedingung (t-stat = 2,833, p = 0,022). (B) Für die Gesamtreichweite pro Minute gab es eine signifikante Wechselwirkung zwischen Schüssel (weniger) und Zustand (Harmalin) (F(1,5) = 9,83, p = 0,002, gemischtes lineares Modell) und Schüssel (Plinko) und Zustand (Harmalin) (F(1,5) = 22,67, p < 0,001, gemischtes lineares Modell). Harmaline reduzierte die Gesamtreichweite pro Minute über alle Schüsseltypen hinweg (weniger: p = 0,01, Plinko: p < 0,001) im Vergleich zum Ausgangswert. Fehler werden als S.E.M. *p < 0,05, ***p < 0,001 gemeldet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 7: Maschinelles Lernen identifiziert einzigartige Posen und Aufgabenstrategien. (A) Knotenpositionen auf der Rattentatze, die mit SLEAP beschriftet sind. (B) Beispiele für Silben, die durch keypoint-MoSeq während des Erreichens identifiziert werden. (C) Matrix der Bigrammübergangshäufigkeiten zwischen aufeinanderfolgenden Silben. Übergangswahrscheinlichkeiten werden durch die Gesamtanzahl der Bigramme normalisiert. (D) Ein Übergangsdiagramm, das die Silbenübergangsunterschiede zwischen Harmalin und Grundlinie vergleicht. Knoten des Diagramms stellen Silben dar, und die Kanten zeigen Übergänge zwischen ihnen an. Markantere Kanten weisen auf Silbenübergänge mit höheren Frequenzen hin. Rote Verbindungen zeigen einen hochregulierten Übergang an, während eine blaue Verbindung einen herunterregulierten Übergang bei mit Harmalin behandelten Tieren anzeigt. Rote Kreise zeigen eine hochregulierte Verwendung an, während ein blauer Kreis eine herunterregulierte Verwendung der angegebenen Silbe bei mit Harmalin behandelten Tieren anzeigt. Silbenpaare mit Häufigkeiten kleiner als 0,005 wurden ausgeschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Ergebnisse

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Nachdem Ratten eine Nahrungsbeschränkung von 90 % ihres Körpergewichts erreicht hatten, wurden sie 2 Tage lang an die Kammer gewöhnt und dann 1-2 Wochen lang Formgebungsverfahren unterzogen. Die Anzahl der erfolgreichen, verworfenen und fehlgeschlagenen Erreichen wurde von einem geschulten Beobachter bewertet, der für jede Bedingung blind war. Über einen Zeitraum von 9 Tagen (Baseline) wurden Ratten an 3 verschiedenen Schalenkonfigurationen (Plain, Less und Plinko) auf ihre Feinmotorik g...

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Diskussion

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Das Erreichen von Aufgaben für Nagetiere ist in der Regel auf einzelne Pellets beschränkt und beinhaltet keine Obstruktionen oder selbststörenden Merkmale, die bei Patienten mit neurodegenerativer Pathologie häufig auftreten. Die hier vorgestellte Methode, die sowohl eine neu konzipierte Aufgabe zum Erreichen von Kugeln als auch maschinelles Lernen verwendet, kann sowohl Koordination als auch Strategie durch die Analyse von Posenmerkmalen und Übergängen sowie von individuellen Fingerbewe...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Institute for Mental Health Research, das Institute for Social Science Research, das Arizona Department of Health Sciences [ADHS14-052688], das US Department of Health and Human Services, die National Institutes of Health [P30AG019610], das Arizona Alzheimer's Disease Research Center REC Fellows Program, das Arizona Alzheimer's Consortium und den Nancy Eisenberg Junior Faculty Scholar Award. Die Figuren wurden mit Biorender.com erstellt. Wir danken Nelson Yamada, Akash Kuppravalli und Jeanne Kamau für ihre Unterstützung beim Design.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3D-DruckmaterialAmazon (Ouvertüre)B07PGY2JP1PLA Filament 1,75 mm PLA 3D Druckerfilament, Maßgenauigkeit +/- 0,03 mm
KameraEdmond-OptikBFS-U3-13Y3M-C1,3 MP, Mono, 170 FPS, AUF Semi PYTHON 1300 x2
KamerakabelEdmond-OptikACC-01-2300USB 3.1, 3 m, Type-A-zu-Micro-B (Verriegelungs-)Kabel
KameraobjektivThor LabsMVL5WA4,5 mm EFL, F/1,4, 1/2" Format Machine Vision Objektiv
Verbindung zwischen Kamera und StativEdmond-Optik88-210Verbindung von Kamera zum Stativ
ReinigungstücherAmazon (Sani-Stoff)B00KMZ7KMOAF3 Oberflächendesinfektionsmittel Reinigungsmittel Feuchttuch Dose Milder Geruch 160 Ct P13872
ComputerDellPräzisionIntel Core i7-13700 @ 2,1 GHz, NVIDIA T1000 8 GB, RAM 16 GB
IR-LichtAmazon (Serlium)B0BJFDBT44Kamera IR-Licht 48 LED IR-Beleuchtungslampen Wasserdichte Infrarot-Nachtsichtlampe für Sicherheits-CCTV-Kamera             
PlattenkleberAmazon (Sdintar)B0B1DLRPNZGlaskleber
PlexiglasAmazon (TOOLINHAND  USA)B0BRJ1L8TR12 & Times; 12" klare gegossene Acryl-/Plexiglasplatten – transparente 1/8" Dick (3 mm) 
Python  Python Software FoundationPython 3.7
SpinviewTeledyne TechnologiesVersion 3.1.0.79 
Zuckerpellets (45 mg)BioservF002345 mg, geschmacklos 50.000 pro Packung; Inhaltsstoffe: Saccharose, Dextrose, Magnesiumstearat, Kalziumsilikat, Mineralöl
TripodAmazon (YOUYI)B086PYJF9DAmazon Flexible Schreibtisch-Webcam-Stativ
PinzetteFeine wissenschaftliche Werkzeuge11064-07Iris-Zange
WachsAmazon (Orthomechanik)B00FKDC0UUGenuine Orthowax 

Referenzen

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