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Methodenartikel

Isolierung und Kultivierung von primären retinalen Müller-Zellen aus Sprague-Dawley (SD) Ratten

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DOI:

10.3791/68129

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17. Juni 2025

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1Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Sichuan Province Ophthalmopathy Prevention & Cure and Visual Function Protection with TCM Laboratory, Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Retinal Image Technology and Chronic Vascular Disease Prevention & Control and Collaborative Innovation Center, Eye School of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Ophthalmology, Ziyang Hospital of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Ophthalmology, Ineye Hospital of Chengdu University of TCM, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung primärer retinaler Müller-Zellen aus neonatalen Sprague-Dawley (SD) Ratten vorgestellt. Das Verfahren umfasst die Enukleation der Augäpfel, die Dissektion von Netzhautgewebe, die Extraktion und Identifizierung von Zellen sowie wichtige Überlegungen für die anschließende Zellkultur.

Zusammenfassung

Retinale Müller-Zellen (RMCs) spielen eine entscheidende Rolle bei der strukturellen Unterstützung und Regulierung verschiedener Funktionen in der Netzhaut. Als Kernkomponente der retinalen Mikroumgebung erfüllen RMCs mehrere lebenswichtige Funktionen. Durch ihre reichlich vorhandenen Ionenkanäle, Liganden, Rezeptoren, Transmembrantransporter und Enzymsysteme tragen diese Zellen zur Sekretion von Neurotransmittern und trophischen Faktoren bei, regulieren den Stoffwechsel der Netzhaut und halten die Wasser-Ionen-Homöostase aufrecht. Insbesondere wurden RMCs kürzlich als bedeutende Quelle für endogene regenerative Stammzellen der Netzhaut identifiziert und bieten neue therapeutische Ziele für die Behandlung von degenerativen Erkrankungen der Netzhaut. Daher ist die Untersuchung von RMCs unerlässlich, um die pathologischen Mechanismen zu verstehen, die Netzhauterkrankungen zugrunde liegen. In dieser Studie wird systematisch ein standardisiertes experimentelles Protokoll etabliert, das den Trypsinverdau und die Reinigung von primären RMCs, die morphologische Beobachtung mittels invertierter optischer Mikroskopie und Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung, die spezifische Proteinidentifizierung durch Immunfluoreszenzfärbung und die Zellreinheitsanalyse mittels Durchflusszytometrie umfasst. Dieses Protokoll dient als wertvolle Referenz sowohl für die Grundlagenforschung als auch für klinische Anwendungen im Zusammenhang mit RMCs, unterstützt die Erforschung ihrer Mechanismen bei Netzhauterkrankungen und treibt die Entwicklung therapeutischer Strategien voran.

Einleitung

Retinale Müller-Gliazellen (RMCs), die vorherrschenden Makroglia in der Netzhaut, bilden den Kern der retinalen neurovaskulären Einheit 1,2. RMCs erstrecken sich über fast die gesamte Netzhautdicke und umhüllen fast alle retinalen Neuronen und Mikrovaskulaturen. Ihre Fortsätze erstrecken sich nach oben bis zur inneren Grenzmembran (ILM), die apikale Endfüße bildet, und nach unten bis zur äußeren Grenzmembran (OLM), wo sie spezialisierte Mikrovillientwickeln 3. Diese einzigartige Architektur ermöglicht es RMCs, als primäres strukturelles Gerüst für die Netzhautorganisation zu fungieren 4,5.

RMCs sind mit Ionenkanälen, Liganden, Rezeptoren, Transmembrantransportern und Enzymenangereichert 6 und beteiligen sich über die Glykolyse am retinalen Glukosestoffwechsel7. Kaliumionenkanäle (Kir2.1, Kir4.1) und Wasserkanalproteine (AQP4, AQP9, AQP11) regulieren gemeinsam die Ionen- und Wasserhomöostase in der Zellmembran und halten so das physiologische Gleichgewicht der Netzhautaufrecht 7. Darüber hinaus absorbieren und beseitigen RMCs Neurotransmitter, die von Neuronen freigesetzt werden, darunter Glutamat, γ-Aminobuttersäure (GABA) und Glycin 7,8.

Pathologische Erkrankungen wie diabetische Retinopathie7, Glaukom9 und Retinitis pigmentosa10 können RMCs schädigen, die Blut-Netzhaut-Schranke stören, Entzündungen auslösen, die Gefäßpermeabilität erhöhen und die Netzhautfunktion beeinträchtigen. RMCs werden auch als latente intrinsische Quellen für regenerative Zellen der Netzhaut anerkannt11,12. Bei Fischen und bestimmten Amphibien können RMCs zu retinalen Vorläuferzellen dedifferenzieren, die durch Verletzungen verlorene Neuronen ersetzen13. In adulten Säugetiernetzhäuten exprimieren RMCs stammzellverwandte Markerproteine14,15, was ihnen das Potenzial verleiht, sich zu retinalen Neuronen zu differenzieren und geschädigte Zellen bei degenerativen Erkrankungen wie altersbedingter Makuladegeneration, Glaukom und diabetischer Retinopathie zu ersetzen16. Primäre RMCs ahmen ihren in vivo-Zustand genau nach und sind von großem Wert für die Erforschung und Behandlung degenerativer Netzhauterkrankungen. Die Literatur enthält jedoch nur wenige etablierte Methoden zur Isolierung und Kultivierung primärer RMCs, insbesondere von neonatalen Sprague-Dawley (SD)-Ratten.

Dieses Protokoll verwendet 3-5 Tage alte neonatale SD-Ratten ohne Geschlechtspräferenz. Unter sterilen Bedingungen werden die Augäpfel enukleiert und das Netzhautgewebe mit Trypsin verdaut. Primäre RMCs werden dann durch Zentrifugation und Reinigung isoliert, um sie anschließend zu kultivieren und zu übergeben. Die morphologische Analyse mittels invertierter optischer Mikroskopie in Kombination mit Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) zeigte, dass die isolierten Zellen charakteristische RMC-Merkmale aufwiesen. Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigte die Expression von RMC-spezifischen Proteinmarkern, einschließlich Glutaminsynthetase (GS), zellulärem Retinaldehyd-bindendem Protein (CRALBP), Vimentin, Aquaporin-4 (AQP4) und dem nach innen gerichteten Gleichrichter-Kaliumkanal 4.1 (Kir4.1). Die durchflusszytometrische Analyse nach Markierung mit GS- und CRALBP-Antikörpern zeigte eine Zellreinheit von ≥90%, was die etablierten Kriterien für RMC-basierte biologische Experimente erfüllt und die Eignung für nachfolgende funktionelle Studien sicherstellt. Während des experimentellen Prozesses zeigten die Zellen an der vierten Passage eine verminderte Adhärenz an der Kulturflasche, morphologische Veränderungen und Anzeichen von Seneszenz, die schließlich zum Zelltod führten. Daher wurden in den nachfolgenden Experimenten nur Zellen aus den ersten drei Passagen verwendet.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung durchgeführt und von der Tierethikkommission der Universität für Traditionelle Chinesische Medizin Chengdu genehmigt (Ethiknummer: 2024069). In der Studie wurden fünfzig spezifische pathogenfreie (SPF) Sprague-Dawley-Ratten (3-5 Tage alt, Geschlecht nicht spezifiziert, Körpergewicht 7-10 g) verwendet. Die Tiere wurden kommerziell beschafft und im Experimental Animal Center der Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Facility Use License No.: SYXK [Sichuan] 2024-049) unter Standardlaborbedingungen untergebracht. Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle enthalten.

1. Isolierung und Kultur primärer RMCs

  1. Vorbereitung von Versuchsgegenständen
    1. Sterilisieren Sie vor Gebrauch die folgenden Gegenstände mindestens 30 Minuten lang unter ultraviolettem Licht auf der Reinbank: T25-Kulturflaschen, Zentrifugenröhrchen und -gestelle, Pipetten und Ständer, Behälter für flüssige Abfälle, Feuerzeuge, Spirituslampen und Marker.
    2. Sterilisieren Sie die folgenden Gegenstände vor dem Gebrauch durch Autoklavieren: 1 ml Pipettenspitzen, Biegeplatte, Petrischalen aus Glas mit Deckeln, gebogene Pinzette, 45 μm Nylonnetz (300 mesh), Zahnpinzette, zahnlose Pinzette und Mikrohornhautschere.
  2. Vorbereitung auf die Umgebung: Desinfizieren Sie die Umgebung und den Operationstisch für die Dissektion des Augapfels mit ultraviolettem Licht für mehr als 30 Minuten. Sprühen Sie jedes Mal Alkohol auf die Hände des Experimentators, bevor Sie die Reinbank betreten und nachdem Sie sie verlassen haben. Stellen Sie den Inkubator auf 37 °C und 5 % CO2 ein. Besprühen Sie die Hände des Experimentators vor und nach dem Öffnen des Inkubators mit Alkohol.
  3. Lösungsvorbereitung: Bereiten Sie D-Hank-Lösung, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM mit hohem Glukosegehalt), fötales Rinderserum (FBS, hitzeinaktiviert), Penicillin/Streptomycin-Lösung (100x) und 0,25%ige Trypsin-EDTA-Lösung vor.
    HINWEIS: DMEM und FBS vor Gebrauch in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen.
    1. Bereiten Sie D-Hank- und PBS-Lösungen mit 1 % Penicillin/Streptomycin vor, indem Sie 100 μl Penicillin/Streptomycin-Lösung zu 10 ml D-Hank- bzw. PBS-Lösung hinzufügen.
    2. Bereiten Sie das vollständige Kulturmedium vor, indem Sie 100 μl Penicillin/Streptomycin-Lösung und 2 ml FBS zu 10 ml DMEM mit hohem Glukosegehalt hinzufügen.
      HINWEIS: Bereiten Sie Lösungen auf einem sauberen Labortisch vor und verwenden Sie sie nach Möglichkeit sofort. Lagern Sie das gesamte Kulturmedium bei 4 °C und erwärmen Sie es vor jedem Gebrauch auf 37 °C. Bei längerer Lagerung als eine Woche entsorgen.
  4. Entfernung der Augen
    1. Euthanasieren Sie neonatale SD-Ratten durch Gebärmutterhalsdislokation (ohne CO2 -Erstickung) auf einer sterilisierten Werkbank nach institutionell anerkannten Protokollen. Tauchen Sie die Körper zur Desinfektion 5 Minuten lang in 75%igen Alkohol und geben Sie sie dann in eine sterile, gebogene Schüssel.
    2. Gießen Sie die Lösung von D-Hank in zwei 10 cm große Glaskulturschalen.
    3. Reiße mit einer Zahnpinzette das Augenlid entlang der Lidspalte auf, um den Augapfel freizulegen.
    4. Verwenden Sie eine zahnlose Pinzette, die offen und parallel zur Lidspalte gehalten wird, um die Augenhöhle nach unten zu drücken. Sobald der Sehnerv erreicht und der Augapfel freigelegt ist, schließen Sie die Pinzette, um den Augapfel anzuheben und herauszuziehen.
    5. Legen Sie den Augapfel in eine Kulturschale aus Glas mit D-Hank-Lösung, spülen Sie sie aus und geben Sie sie in eine andere Schale mit frischer D-Hank-Lösung.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Augapfel intakt bleibt. Im Idealfall sollte ein Teil des Sehnervs befestigt bleiben, um die Trennung des Netzhautgewebes zu erleichtern.
  5. Disektion der Netzhaut
    1. Bereiten Sie eine sterilisierte leere Kulturschale mit Deckel vor und stellen Sie das Mikroskop ein.
    2. Legen Sie die Glaskulturschale aus Schritt 1.4.5 unter das Mikroskop. Verwenden Sie eine gebogene ophthalmische Mikrozange, um den Bereich zwischen Hornhaut und Sehnerv sanft zu fixieren und die Hornhaut freizulegen.
    3. Durchstechen Sie den Hornhautübergang mit einer Mikrohornhautschere. Schneiden Sie kreisförmig entlang des Limbus und machen Sie dann symmetrische Skleraschnitte mit einer Länge von etwa 2 mm. Lösen Sie die Pinzette und klemmen Sie sie am Übergang von Sehnerv und Sklera wieder ein.
    4. Verwenden Sie eine zweite Pinzette, um sanft in die Nähe der Sehnervenwurzel zu drücken und den Druck auf die Schnittstelle zwischen Hornhaut und Sehnerv zu richten. Wenn das Linsengewebe zum Vorschein kommt, entfernen Sie es vorsichtig und drücken Sie weiter, bis das Netzhautgewebe herauskommt.
      HINWEIS: Entfernen Sie die Linse vorsichtig, um eine versehentliche Entnahme von Netzhautgewebe zu vermeiden.
    5. Übertragen Sie das abgetrennte Netzhautgewebe mit einer Pinzette in eine andere sterile Kulturschale. Decken Sie die Schüssel ab, besprühen Sie sie mit Alkohol und stellen Sie sie auf die saubere Bank.
  6. Extraktion von primären RMCs
    1. Schalten Sie den Schalter für die Lüftung der Reinbank ein.
    2. Öffnen Sie den Deckel der Kulturschale. Verwenden Sie eine Pipette mit einer 1-ml-Spitze, um das Netzhautgewebe etwa 15 Mal auf und ab zu pipettieren, um es in kleine Stücke zu brechen. 1 ml 0,25 % Trypsin zugeben und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
    3. Nehmen Sie die Kulturschale aus dem Inkubator und stellen Sie sie auf die Reinbank. Fügen Sie 2 ml vollständiges Medium hinzu und pipettieren Sie vorsichtig, um den Aufschluss zu stoppen.
      HINWEIS: Verwenden Sie das doppelte Volumen an Trypsin, um die Verdauung zu beenden. Wenn beispielsweise 1 ml Trypsin verwendet wurde, beenden Sie mit 2 ml vollständigem Medium.
    4. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 300-Mesh-Nylonsieb in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie das Geschirr mit vorbereitetem PBS und sammeln Sie die restliche Suspension.
    5. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 878 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Aspirieren Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn. Resuspendieren Sie das Pellet in 2 mL vollständigem Medium und zentrifugieren Sie es erneut bei 878 x g für 5 Minuten, um die Zellen zu reinigen.
    6. Nach dem Zentrifugieren ist der Überstand zu verwerfen. Resuspendieren Sie die Zellen in 2 mL vollständigem Medium. Zuvor werden 3 ml des vollständigen Mediums in jeden T25-Kolben gegeben, dann 1 ml der Zellsuspension. Schütteln Sie den Kolben in einem Kreuzmuster und stellen Sie ihn in den Inkubator.
    7. Führen Sie den ersten Mediumwechsel nach 48 Stunden Inkubation durch. Nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und stellen Sie ihn auf die Reinbank. Entsorgen Sie das verbrauchte Medium und waschen Sie die zellhaftende Oberfläche dreimal mit 1 mL PBS.
      1. Fügen Sie 5 ml frisches Alleinmedium hinzu. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag, bis die Zellkonfluation 90 % übersteigt, und fahren Sie dann mit der Subkultivierung fort.

2. Passieren von RMCs

HINWEIS: Passieren Sie die Zellen, wenn der Konfluenzgrad 90 % überschreitet. In diesem Protokoll müssen Primärkulturen in der Regel 5-6 Tage nach der Isolierung übergeben werden. Der Zeitpunkt des ersten Durchgangs kann je nach Beschichtungsdichte variieren. Die Zelldichte auf 4 x 103 Zellen/ml einstellen und die Zellen in T25-Kulturflaschen aussäen. Wenn die Konfluenz nach 3-4 Tagen >90% erreicht, fahren Sie mit der Passage fort.

  1. Nehmen Sie den Kulturkolben T25 aus dem Inkubator. Das Kulturmedium verwerfen und die Zellen dreimal mit 1 ml PBS-Lösung waschen, die 1 % Penicillin/Streptomycin enthält.
  2. 1 ml 0,25%ige Trypsin-EDTA-Lösung in den Kolben geben und 1 min und 30 s inkubieren.
  3. Der Kolben wird unter einem inversen Mikroskop betrachtet. Wenn die Zellen rund und losgelöst erscheinen und zu schweben beginnen, nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator. Übertragen Sie es auf die Reinbank und fügen Sie 2 ml vollständiges Kulturmedium hinzu, um die Verdauung zu beenden.
  4. Verwenden Sie eine Pipette, um die Zellsuspension zu aspirieren. Vorsichtig gegen die Kolbenwand pipettieren, um verbleibende anhaftende Zellen zu entfernen.
  5. Übertragen Sie die gesamte Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Kolbenwand mit 2 ml PBS mit 1 % Penicillin/Streptomycin und geben Sie es in dasselbe Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 878 x g für 5 min bei RT.
  6. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem geeigneten Volumen des vollständigen Mediums. Passieren Sie die Zellen je nach Bedarf in einem Verhältnis von 1:2 oder 1:3.
    HINWEIS: Verwenden Sie Zellen an Durchgang 2 (P2) für nachgelagerte Experimente (Abbildung 1).

3. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E)

  1. Seed Passage 2 (P2) Zellen in einer 6-Well-Platte mit vorplatzierten sterilen Deckgläsern mit einer Dichte von 2 x 105 Zellen pro Well. Geben Sie 2 ml vollständiges Kulturmedium in jede Vertiefung. Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen, verwerfen Sie das Kulturmedium und spülen Sie jede Vertiefung zweimal vorsichtig mit 1 ml PBS aus.
  2. Geben Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd-Fixiermittel in jede Vertiefung und inkubieren Sie 30 Minuten lang, um die Zellen zu fixieren. Entsorgen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 ml PBS.
  3. Geben Sie 1 ml Hämatoxylin-Färbung in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang. Entsorgen Sie die Färbelösung und spülen Sie die Vertiefungen 2-3 Mal mit 1 mL PBS aus.
  4. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Wenn der Hämatoxylin-Fleck zu dunkel erscheint, verwenden Sie 1%igen Salzsäurealkohol, um überschüssige zytoplasmatische Färbung zu unterscheiden und zu entfernen. 2-3 Mal mit 1 mL PBS waschen.
  5. Geben Sie 1 ml Eosin-Färbelösung in jede Vertiefung. Beobachten Sie die Färbung unter dem Mikroskop für ca. 30 s oder bis die gewünschte Farbintensität erreicht ist. Spülen Sie die Vertiefungen 2-3 Mal mit 1 mL PBS. Montieren Sie die Deckgläser mit neutralem Harz auf Objektträger.

4. Immunfluoreszenz-Färbung

  1. P2-Zellen werden in einer 6-Well-Platte mit vorplatzierten sterilen Deckgläsern mit einer Dichte von 2 x 105 Zellen pro Well geseedet. Geben Sie 2 ml vollständiges Kulturmedium in jede Vertiefung.
    1. Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen, verwerfen Sie das Kulturmedium. Entfernen Sie das Deckglas und legen Sie es in ein Beizglas. Waschen Sie den Deckglas dreimal mit 1 ml PBS, jeweils 5 Minuten.
  2. Fügen Sie ca. 50 μl Permeabilisierungslösung (Triton X-100: PBS = 1: 200) hinzu, um die Zellen zu bedecken. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dann dreimal mit 1 ml PBS waschen, jeweils 5 Minuten. Fügen Sie ca. 50 μl 3%ige BSA-Blockierungslösung hinzu und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  3. Entsorgen Sie die Blockierungslösung vorsichtig. Fügen Sie ca. 200 μl der in PBS hergestellten primären Antikörperlösung hinzu, um den Objektträger abzudecken: AQP4 (1:100), Kir4.1 (1:200), GS (1:200), CRALBP (1:50) oder Vimentin (1:200). Legen Sie das Deckglas in eine befeuchtete Kammer und inkubieren Sie es über Nacht bei 4 °C.
  4. Waschen Sie den Deckglas dreimal mit 1 ml PBS, jeweils 5 Minuten.
  5. Etwa 200 μl FITC-markierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper17 zugeben. Bei Raumtemperatur im Dunkeln 50 min inkubieren. Waschen Sie den Deckglas dreimal mit 1 ml PBS, jeweils 5 Minuten.
  6. Färben Sie die Zellkerne 10 min lang mit DAPI. Waschen Sie dreimal mit 1 mL PBS, jeweils 5 Minuten.
  7. Geben Sie einen Tropfen Anti-Fade-Montagemedium auf die Folie. Montieren Sie das Deckglas mit der Zellenseite nach unten. Versiegeln und unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachten.

5. Durchflusszytometrie

  1. Stellen Sie die Zellkonzentration mit einem Durchflusszytometrie-Färbepuffer auf 1,0 x 107 Zellen/ml ein.
  2. Aliquotieren Sie 100 μl der einzelligen Suspension in zwei separate Probenröhrchen pro Bedingung. Bestimmen Sie eine Röhre als negative (ungefärbte) Kontrolle.
  3. Geben Sie 100 μl Permeabilisierungsmedium A (aus dem kommerziell erhältlichen Kit, siehe Materialtabelle) in jedes Röhrchen. Vorsichtig mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
  4. Geben Sie 3 ml vorgekühlten Durchflusszytometrie-Färbepuffer in jedes Röhrchen. Bei 300 x g für 5 min bei RT zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
  5. Geben Sie 100 μl Permeabilisierungsmedium B (aus dem kommerziell erhältlichen Kit) in jedes Röhrchen und jeden Wirbel, um es zu mischen. Geben Sie 0,1 μl CRALBP-Antikörper in die dafür vorgesehenen Probenröhrchen und 0,8 μl GS-Antikörper in die entsprechenden Röhrchen. Geben Sie keine Antikörper in das Negativkontrollröhrchen. Bei 4 °C im Dunkeln 30-60 min inkubieren.
  6. Geben Sie 3 ml Durchflusszytometrie-Färbepuffer in jedes Röhrchen. Bei 300 x g für 5 min bei RT zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
  7. Jedes Röhrchen wird in 100 μl Färbepuffer für die Durchflusszytometrie resuspendiert. Geben Sie 1 μl FITC-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H&L) in jedes CRALBP-gefärbte Röhrchen und 1 μl PE-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H&L) in jedes GS-gefärbte Röhrchen. Geben Sie keine Antikörper in das Negativkontrollröhrchen. Bei 4 °C im Dunkeln 30-60 min inkubieren.
  8. Geben Sie 3 ml Durchflusszytometrie-Färbepuffer in jedes Röhrchen. Bei 300 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
  9. Jedes Röhrchen wird in 300 μl Durchflusszytometrie-Färbepuffer resuspendiert. Fahren Sie sofort mit der Durchflusszytometrie-Analyse fort. alternativ in 500 μl 1%-4% Paraformaldehyd resuspendieren, bei 2-8 °C im Dunkeln lagern und innerhalb von 24 h analysieren.
  10. Analysieren Sie negative und positive Proben mit der Durchflusszytometrie-Software.

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Ergebnisse

Nachdem die Primärzellen in den Kulturkolben eingesät wurden, helfen nachfolgende Mediumwechsel und Passagen, schlecht haftende RMCs zu eliminieren und zelluläre Trümmer, die während der Passage entstehen, zu entfernen, wodurch die RMC-Population in der Kultur angereichert wird. RMCs wurden anhand ihrer Morphologie mit einem inversen optischen Mikroskop (Abbildung 1) und Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) (Abbildung 2) iden...

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Diskussion

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von primären RMCs aus neonatalen SD-Ratten. Das Protokoll deckt alle Stadien ab, einschließlich der vorexperimentellen Vorbereitungen, der Augapfel-Enukleation, der Isolierung von Netzhautgewebe und Schritt-für-Schritt-Verfahren für die RMC-Extraktion, Kultur, Passage und Identifizierung. Es betont auch wichtige Überlegungen, die während des gesamten Zellkulturprozesses beachtet werden sollten, und bietet standardisier...

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Offenlegungen

Alle Autoren haben keinen Interessenkonflikt in Bezug auf den Inhalt dieses Artikels.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Sichuan Provincial Nature Foundation Fund (2023NSFSC0690) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,1 % Triton X-100SolarbioT8200
0,25 % Trypsin-EDTA-HyklonSH30042.01B
1% SalzsäurealkoholBIOSYSTEMS3803651E
4% ParaformaldehydSolarbioP1110
45μ m Nylonnetz (300 mesh)SolarbioYA0926
6-Well-PlatteServicebioIMC202302001
6 cm Glas PetrischaleNormax5058541
75% AlkoholKESHIGEA004
Aquaporin-4 (AQP4)Proteintech Group, Inc16473-1-AP
BSAServicebioGC305010
Zellkultur-InkubatorThermoFORMA311
zelluläres Retinaldehyd-bindendes Protein (CRALBP)HUABOIHA721330
ZentrifugeHunan XiangyiTDZ5-WS
ReinbankZHICHENGZHJH-C12
HornhautschereJinzhongBXGJ
DAPISolarbioG1012
D-Hank-LösungSolarbioH1045
DMEM  Medium mit hohem GlukosegehaltGibcoC11995500BT
Fötales Kälberserum (FBS)Sbjbio life SciencesBC-SE-FBS01
FIX& PERM Medium AMultiSciencesGAS006/2
FIX& PERM Medium BMultiSciencesGAS006/2
Färbepuffer für DurchflusszytometrieMultiSciencesS1001
Fluormount-G Fluoreszierendes EindeckmediumSauererBiotech0100-01
Glutaminsynthetase Polyklonaler AntikörperProteintech Group, IncPTG-11037-2-AP-50ul
Ziege 324 Anti-Kaninchen-IgG H& L PEBiossbs-0295G-PE Ziege
Anti- 323 Kaninchen IgG H& L FITCBiossbs-0295G-FITC
Hämatoxylin-eosin (HE) FärbesetSolarbioG1120
Hochdruck-DesinfektionsgerätZealway (Xiamen) Instrument IncGI80DS
Inverses FluoreszenzmikroskopNikon 
Inverses PhasenkontrastmikroskopLeicaDMIL
innen gerichtete Gleichrichter-Kaliumkanal 4.1 (Kir4.1)Proteintech Group, Inc12503-1-AP
Neutrales HarzSolarbioG8590-100
Penicillin-Streptomycin-Lösung (100&mal;)HycloneSV30010
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS) (pH7,2-7,4)SolarbioP1020-500ml
Sekundärantikörper (FITC-markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen)ServicebioGB22303
Sprague-Dawley Ratten Chengdu Dashuo Versuchstier Co., Ltd.Produktionslizenz Nr.: SCXK [Sichuan] 2020-0030
T25 KulturflascheCornning  
Tornado-Röhrchen: 15 mlWhb WHB-15-1
Tornado-Röhren: 50 mlWHB WHB-50-1
UV-DesinfektionssterilisatorGEMEISIxd06
VimentinAbcamab92547
SMZ1500 nach 430639

Referenzen

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