Eine einfache und effiziente Methode zum Testen immunmodulatorischer Wirkstoffe zur Erzeugung tolerogener dendritischer Zellen aus humanen CD14+ -Monozyten

Summary

Wir beschreiben ein Verfahren zur Bewertung der Fähigkeit pharmakologischer Wirkstoffe, tolerogene dendritische Zellen aus naiven Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen in vitro zu generieren und ihre Wirksamkeit durch autologe regulatorische T-Zell-Generierung zu validieren.

Abstract

Tolerogene dendritische Zellen (tolDCs) sind eine Untergruppe der dendritischen Zellen (DCs), von denen bekannt ist, dass sie naive T-Zellen in Richtung eines regulatorischen T-Zell-Phänotyps (Treg) beeinflussen. TolDCs werden derzeit als Therapien für Autoimmunität und Transplantation untersucht, sowohl als Zelltherapie als auch als Methode zur Induktion von tolDCs aus endogenen DCs. Bisher ist die Anzahl der bekannten Wirkstoffe zur Induktion von tolDCs aus naiven DCs jedoch relativ gering und ihre Wirksamkeit zur Erzeugung von Tregs in vivo war inkonsistent, insbesondere bei Therapien, die tolDCs aus endogenen DCs induzieren. Dies bietet die Möglichkeit, neuartige Verbindungen zu erforschen, um Toleranz zu erzeugen.

Hier beschreiben wir eine Methode, um neuartige immunmodulatorische Verbindungen an Monozyten-abgeleiteten DCs (moDCs) in vitro zu testen und ihre Funktionalität zur Erzeugung autologer Tregs zu validieren. Zunächst erhalten wir PBMCs und isolieren CD14⁺ -Monozyten und CD3⁺ T-Zellen mit kommerziell erhältlichen magnetischen Trennkits. Als nächstes differenzieren wir Monozyten in moDCs, behandeln sie 24 h lang mit einem etablierten Immunmodulator wie Rapamycin, Dexamethason, IL-10 oder Vitamin D3 und testen ihre Veränderung in tolerogenen Markern als Validierung des Protokolls. Schließlich co-kultivieren wir die induzierten tolDCs mit autologen T-Zellen in Gegenwart einer anti-CD3/CD28-Stimulation und beobachten Veränderungen in den Treg-Populationen und der T-Zellproliferation. Wir stellen uns vor, dass dieses Protokoll verwendet wird, um die Wirksamkeit neuartiger immunmodulatorischer Wirkstoffe zu bewerten, um bereits differenzierte DCs in Richtung tolDC umzuprogrammieren.

Introduction

Dendritische Zellen (DCs) sind wichtige Vermittler zwischen angeborener und adaptiver Immunität. DCs, die sich hauptsächlich in Schleimhäuten, Haut und lymphatischem Gewebe befinden, sind die primären antigenpräsentierenden Zellen (APCs)¹. DCs nehmen fremde Proteine auf und verarbeiten sie und präsentieren sie auf Haupthistokompatibilitätsproteinen (MHC) für naive T-Zellen. DCs exprimieren spezifisch MHC-Klasse-II-Proteine, wie z. B. das humane Leukozytenantigen-DR (HLA-DR) beim Menschen. Der Aktivierungszustand der DCs nach Antigenexposition ist entscheidend für die nachgeschaltete T-Zell-Antwort

Protocol

Alle Proben von humanen mononukleären Blutzellen (PBMC) wurden aus dem Human Immunology Core der University of Pennsylvania von anonymisierten Spendern mit vorheriger Genehmigung des Institutional Review Board (IRB) der University of Pennsylvania mit Zustimmung des Patienten entnommen.

Optional: Während wir bei dieser Methode frisch isolierte PBMCs aus einem akademischen Labor verwendet haben, können PBMCs entweder aus Vollblut oder mit Leukapherese angereicherten Blutprodukten isoliert werden. Wir empfehlen die Verwendung der Dichtegradientenzentrifugationsmethode, da es sich um eine etabl....

Results

Wir haben ein Protokoll für humane PBMCs beschrieben, isolieren sowohl CD3⁺ T-Zellen als auch CD14⁺ Monozyten mit kommerziell erhältlichen magnetischen Trennkits, differenzieren Monozyten in CD14^-, HLA-DR⁺-, CD141⁺, CD1c⁺ moDCs mit GM-CSF und IL-4, behandeln sie für 24 h und co-kultivieren mit autologen T-Zellen mit Anti-CD3/CD28-Stimulation für 72 h. Ein experimentelles Schema ist in Abbildung 1 dargestellt.

Discussion

Hier beschreiben wir eine zuverlässige und vielseitige Methode, um die Funktionalität von immunmodulatorischen Wirkstoffen zur Induktion von tolDCs aus moDCs zu bewerten und ihre Funktionalität zur Erzeugung von Tregs aus autogenen T-Zellen ex vivo zu validieren. Dieses Protokoll umfasst mehrere kritische Schritte. Erstens sind Monozyten notorisch empfindliche Zellen und müssen aus frischen, nicht zuvor gefrorenen PBMCs gewonnen werden, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Mono.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1-10 &Mikro; L Gefilterte Pipettierspitzen	VWR	76322-158	Allgemeine Zellkultur
1,5 mL Zentrifugenröhrchen	VWR	77508-358	Allgemeine Zellkultur
10 mL Serologische Pipets	VWR	414004-267	Allgemeine Zellkultur
100-1000 & Mikro; L Gefilterte Pipettenspitzen	VWR	76322-164	Allgemeine Zellkultur
15 mL Konisches Röhrchen	VWR	77508-212	Allgemeine Zellkultur
20-200 & Mikro; L Gefilterte Pipettenspitzen	VWR	76322-160	Allgemeine Zellkultur
2-Mercaptoethanol	MP Biomedical	194834	T-Zellkultur
50 mL Konisches Röhrchen	VWR	21008-736	Allgemeine Zellkultur
60 x 15 mm Schale, Nunclon Delta	Thermo Fischer	150326	Allgemeine Zellkultur
96 Well Konische (V) Bodenplatte, unbehandelte Oberfläche	Thermo Fischer	277143	Allgemeine Zellkultur
96 Well flache Bodenplatte	Thermo Fischer	161093	Allgemeine Zellkultur
APC/Cyanin7 Anti-Human-CD272 (BTLA) Antikörper	Biolegend	344518	Durchflusszytometrie
Attune NxT (Roter/Blauer Laser, 7 Kanäle)	Thermo Fischer	A24863	Durchflusszytometrie
BSA	Thermo Fischer	15260-037	Allgemeine Zelle
Kultur CD14 Monoklonaler Antikörper (61D3), PE	Thermo Fischer	12-0149-42	Durchflusszytometrie
CD1c Monoklonaler Antikörper (L161), PE-Cyanin7	Thermo Fischer	25-0015-42	Durchflusszytometrie
CD209 (DC-SIGN) Monoklonaler Antikörper (eB-h209), PerCP-Cyanin5.5	Thermo Fischer	45-2099-42	Durchflusszytometrie
CD25 Monoklonaler Antikörper (CD25-4E3), APC	Thermo Fischer	17-0257-42	Durchflusszytometrie
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoklonaler Antikörper (MIH1), PE	Thermo Fischer	12-5983-42	Durchflusszytometrie
CD4 Monoklonaler Antikörper (RPA-T4), Alexa Fluor 488	Thermo Fischer	53-0049-42	Durchflusszytometrie
CD40 Monoklonaler Antikörper (5C3), APC	Thermo Fischer	17-0409-42	Durchflusszytometrie
CD40 Monoklonaler Antikörper (5C3), APC-eFluor 780	Thermo Fischer	47-0409-42	Durchflusszytometrie
CD69 Monoklonaler Antikörper (FN50), PE	Thermo Fischer	MA1-10276	Durchflusszytometrie
CD86 Monoklonaler Antikörper (BU63), FITC	Thermo Fischer	MHCD8601	Durchflusszytometrie
CD8a Monoklonaler Antikörper (RPA-T8), PE-Cyanin7	Thermo Fischer	25-0088-42	Durchflusszytometrie
Konischer Boden (V-Well) 96-Well-Platte	Thermo Fischer	2605
Kryofläschchen für Durchflusszytometrie, 2 mL	Thermo Fischer	430488	T-Zellkultur
Dimethylsulfoxid (DMSO), Sequenzierqualität	Thermo Fischer	20688	Allgemeine Zellkultur
DPBS	Thermo Fischer	14200166	Allgemeine Zellkultur
EasySep Humanes Monozyten-Isolationskit	Stammzelltechnologien	19359	Zelltrennung
EasySep Humanes T-Zell-Isolationskit	Stammzelltechnologien	17951	Zelltrennung
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	18000	Zelltrennung
EDTA	Thermo Fischer	AIM9260G	Allgemeine Zellkultur
Falcon Polystyrolröhrchen mit rundem Boden, 5 ml	Stammzelltechnologien	38025	Zelltrennung
Fc-Rezeptor-Bindungsinhibitor Polyklonaler Antikörper	Thermo Fischer	14-9161-73	Durchflusszytometrie
Fötales Rinderserum	Thermo Fischer	A5670701	Allgemeine Zellkultur
Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor 780	Thermo Fischer	65-0865-18	Durchflusszytometrie
Foxp3 / Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-Set	Thermo Fischer	00-5523-00	Durchflusszytometrie
FOXP3 Monoklonaler Antikörper (PCH101), PE-Cyanin5.5	Thermo Fischer	35-4776-42	Durchflusszytometrie
HBSS	Thermo Fischer	14170-112	Allgemeine
Zellkultur Hitze inaktiviertes fötales Rinderserum	Thermo Fischer	A5670801	Allgemeine Zellkultur
HEPES (1 M)	Thermo Fischer	15630106	moDC Zelle Kultur
HLA-DR Monoklonaler Antikörper (L243), Alexa Fluor 488	Thermo Fischer	A51009	Durchflusszytometrie
Humaner CD3/CD28/CD2 T-Zell-Aktivator	StemCell Technologies	10970	T-Zellkultur
Humanes GM-CSF Rekombinantes Protein	Thermo Fischer	300-03	moDC Zellkultur
Humanes IL-10 ELISA-Kit, Hochempfindlichkeit	Thermo Fischer	BMS215-2HS	Elisa
Humanes IL-4, tierversuchsfreies rekombinantes Protein	Thermo Fischer	AF-200-04	moDC Zellkultur
Humanes PBMC (frisch isoliert)	UPenn HIC	N/A	Zellen
Humanes TNF alpha ELISA Kit	Thermo Fischer	BMS223-4	ELISA-Lichtmikroskop
(DMi1)	Lucia	391240	Allgemeine Zellkultur
Lipopolysaccharid (LPS)	Invivogen	tlrl-eblps	moDC Zellkultur
LIVE/DEAD Fixierbares Nah-IR-Färbekit für tote Zellen	Thermo Fischer	L34975	Durchflusszytometrie
MEM Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (100x)	Thermo Fischer	11140050	T-Zellkultur
Penicillin-Streptomycin (100x)	Thermo Fischer	15140122	Allgemeine Zellkultur-Pipettensteuerung
	VWR	77575-370	Allgemeine Zellkultur
Rapamycin, 98+%	Thermo Fischer	J62473. MF	moDC Zellkultur
RPMI 1640 mit Glutamax	Thermo Fischer	61870-036	Allgemeiner
Zellkultur-Trennpuffer	Stammzelltechnologien	20144	Zelltrennung
T-Zell-Stimulationscocktail (500x)	Thermo Fischer	00-4970-93	T-Zellkultur
UltraComp eBead Plus Kompensationsperlen	Thermo Fischer	01-3333-41	Flow Zytometrie
Variables Pipettenset	Fischer Scientific	05-403-152	Allgemeine Zellkultur